CN103710367B - 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人激肽释放酶1(Homo sapiens kallikrein1，hKLK1)及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。KLK1对心脑血管疾病、糖尿病并发症等多种疾病均具有治疗作用，但是动物组织及人体液中提取的KLK1产量较低，且可能涉及安全性问题。本发明采用大肠杆菌表达系统对密码子优化后的重组人激肽释放酶1基因进行异源表达。此外，针对原核表达体系中的人激肽释放酶1多以包涵体的形式表达的问题，本发明还提供了重组人激肽释放酶1包涵体复性和纯化的方法，经一步纯化人激肽释放酶1纯度达到95%以上，并且具有较高活力。

Description

一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组人激肽释放酶1及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

激肽释放酶－激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)作为一个复杂的内源性多酶系统，参与调控心血管、肾脏、神经系统等的生理功能，与心脏病、肾病、炎症反应、癌症等疾病的发生有着密切关系。KKS是体内主要的降压系统之一，由激肽原、激肽释放酶(kallikrein，KLK)和激肽组成。KLK分为两大类：血浆KLK和组织KLK，分别由前激肽释放酶和KLK前体转换而来。它们在分子量、底物、免疫学特性、基因结构和释放的激肽种类方面有很大差异。其中，组织KLK1分解高分子激肽原(High Molecular Weight Kininogen，LMWK)生成激肽，参与多种生理过程，对血压调节、电解质平衡、炎症反应等生理或病理过程进行调控，对心脑血管疾病、不孕不育症、糖尿病肾病、视网膜静脉阻塞都有疗效。

目前，市售的KLK1主要来源于猪的胰脏提取或是人尿液提取，猪KLK1用于人类疾病的治疗有较大的免疫原性，人尿提取的KLK1产量不高，而且可能带有一些人类疾病病原。市场上还没有重组KLK1产品，对于重组KLK1药品的开发还处于初级阶段，十分有必要进行重组KLK1的研究。虽然已有毕赤酵母菌株进行可溶表达KLK1蛋白的成功实例，但是酵母表达系统工艺复杂、耗时较长，且胞内表达不利于下游蛋白分离纯化。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组人激肽释放酶1表达系统和表达方法。

随着后基因组计划的进行，将不断地有新的功能基因被发现、克隆和表达，将会有越来越多的重组蛋白问世；在已有的重组蛋白表达体系中，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)原核表达系统因其操作方便、价格低廉、高效表达和稳定性好等优点而成为生产重组蛋白的首选表达体系，其中包括重组人干扰素α2b、重组人干扰素α1b、重组人干扰素γ、重组人白介素-2、重组人粒细胞刺激因子等重组蛋白药物。但若以人源KLK1(Homo sapiens kallikrein 1，以下简称hKLK1)的原始核苷酸序列直接用大肠杆菌进行表达，由于种属差异，是无法最有效的表达hKLK1的，因此仍然需要寻找到一个更适合于大肠杆菌表达的hKLK1核苷酸序列和表达方法。另一方面，由于外源基因在E.coli中的高效表达，常导致重组蛋白聚集形成不溶性、无活性的包涵体；要想得到具有生物活性的重组蛋白，必须进行包涵体的体外重折叠复性，而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白自身的性质。hKLK1蛋白具有5对二硫键，对于hKLK1蛋白复性具有十分高的技术难度，如果复性条件不适会导致分子内二硫键的错配，同时分子间共价结合或疏水结合易形成聚合体，造成产品质量不合格，易产生沉淀析出，影响蛋白回收率和蛋白活性。虽然已有大肠杆菌表达成功的hKLK1蛋白，但只是通过复性方法制备hKLK1蛋白作为抗原制备抗体，表达hKLK1蛋白也没有明确的活性(施伟庆，张磊，孙怀昌.人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达[J].农业生物技术学报，2003，11(2):169～172)。此外，有研究人员获得带His标签的大肠杆菌表达hKLK1蛋白，但是研究结果显示其表达的hKLK1蛋白活性极低，与猪胰腺激肽释放酶相比只有0.1IU/mL(李体远，杜珙，蔡筱彦，等.人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2003，19(3):312～316)。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是：使大肠杆菌表达的人激肽释放酶1包涵体复性为具有生物活性的蛋白酶，经过简单纯化使重组激肽释放酶1具有较高纯度和活性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，首先通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达且有活性的重组人激肽释放酶1的基因序列和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了一种重组人激肽释放酶1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了编码上述所述重组人激肽释放酶1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组人激肽释放酶1的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，优选为pET21b或pET28a，最优选为pET21b。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明还提供了重组人激肽释放酶1在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取上述所述重组人激肽释放酶1的大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；

2.取过夜培养物接入于LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期(OD₆₀₀＝1.5)；

3.在培养物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37℃，诱导表达2-5h后，于4℃离心处理并收集含有重组人激肽释放酶1的大肠杆菌菌体沉淀。

上述所述LB培养液中均含有氨苄青霉素80-120μg/mL。

本发明还提供了重组人激肽释放酶1的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组人激肽释放酶1大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃离心处理。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A 5-15mL。

3.按湿重每克菌体加入5-8μL的浓度为80mmol/L的PMSF，5-50μL的50mg/mL溶菌酶，重悬混匀后10-37℃保存。

4.超声或高压破碎菌体，并于4℃以离心处理，弃上清。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B重悬，并于4℃以离心处理，沉淀包涵体。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，25℃下搅拌10-60min。

7.充分重悬混匀后以4℃离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶1变性溶液。

该纯化方法优选步骤如下：

1.将收集得到的上述含有诱导重组人激肽释放酶1大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，4℃以6000rpm离心15min；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A 12mL，使菌体重悬。

3.按湿重每克菌体加入7μL浓度为80mmol/L的PMSF，8μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，重悬混匀后25℃保存。

4.超声破碎菌体，样品置于冰上，超声20min，每次3s间隔3s。超声结束，4℃以13000rpm高速离心15min，弃上清。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃以13000rpm高速离心15min，收集包涵体沉淀，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min，至溶液澄清。

7.充分混匀后室温下以13000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶1变性溶液。

本发明还提供了优化后的重组人激肽释放酶1的包涵体复性纯化方法，包括如下步骤：

取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的上述所述的重组人激肽释放酶1变性溶液，测定其浓度，然后用复性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.1mg/mL，4℃稀释复性。复性至16h时，将复性后重组蛋白溶液用0.22-0.45μm滤膜过滤，即得到低浓度的重组人激肽释放酶1复性溶液。用Buffer E为基础缓冲液，将低浓度的重组人激肽释放酶1复性溶液上亲和色谱柱纯化，用0.25-0.35M NaCl、Buffer E缓冲液洗脱收集目的峰，得到重组hKLK1纯品。并可进一步超滤脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组人激肽释放酶1冻干粉末。

本发明的经优化过的重组人激肽释放酶1的基因序列，更适于大肠杆菌表达系统的表达，所表达的重组人激肽释放酶1高于人激肽释放酶1天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量，表达的hKLK1为无糖基化修饰KLK1蛋白，而且表达的hKLK活性更高。尤其是本发明的上述所述表达、复性、纯化方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于大肠杆菌表达系统表达重组人激肽释放酶1的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。

附图说明

图1表示重组人激肽释放酶1密码子优化前后核苷酸序列比较

其中，奇数行(即上端基因序列)为人激肽释放酶1天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行(即下端基因序列)为本发明的重组人激肽释放酶1的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a、图2-b为重组人激肽释放酶1密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。

其中，图2-a表示人激肽释放酶1天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.70；图2-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶1密码子在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.88。

图3-a、图3-b为人激肽释放酶1密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中，图3-a表示人激肽释放酶1天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：人激肽释放酶1天然基因核苷酸序列的低利用率密码子(利用率低于50％的密码子)出现百分比为20％；图3-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶1密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的重组人激肽释放酶1密码子序列的低利用率密码子出现百分比为0。

图4-a、图4-b为重组人激肽释放酶1密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示人激肽释放酶1天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：56.06％；图4-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶1密码子在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：53.36％。

图5-a、图5-b为重组人激肽释放酶1密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。

图5-a人激肽释放酶1天然基因mRNA的二级结构预测图，图5-b为密码子优化后的本发明的人激肽释放酶1的二级结构预测图。

图6-a为重组人激肽释放酶1表达质粒pET21b-hKLK1的构建过程图。图6-b为重组人激肽释放酶1表达质粒pET28a-hKLK1的构建过程图。

图7-a为重组人激肽释放酶1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为Nde I和Xho I酶切pET21b载体；泳道2为500bp DNA Ladder；泳道3为两端含有Nde I和Xho I酶切位点的重组人激肽释放酶1基因PCR产物。

图7-b为重组人激肽释放酶1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为Nde I和Xba I酶切pET28a载体；泳道2为500bp DNA Ladder；泳道3为两端含有Nde I和Xba I酶切位点的重组人激肽释放酶1基因PCR产物。

图8-a、图8-b为重组人激肽释放酶1的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图8-a为重组人激肽释放酶1的SDS-PAGE凝胶电泳图。将pET21b-hKLK1转入大肠杆菌BL21(DE3)中，检测重组人激肽释放酶1的表达情况。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围预染蛋白上样Marker；泳道2为未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液。

图8-b为重组人激肽释放酶1的SDS-PAGE凝胶电泳图。将pET28a-hKLK1转入大肠杆菌BL21(DE3)中，检测重组人激肽释放酶1的表达情况。

其中，泳道1(10-230KDa)宽范围预染蛋白上样Marker，泳道2为加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液：泳道3为未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液。

图9为重组人激肽释放酶1的免疫印迹图。

其中，泳道1(10-230KDa)宽范围预染蛋白上样Marker，泳道2为：未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液，泳道3未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液。

图10重组人激肽释放酶1高效表达诱导条件优化的SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围预染蛋白上样Marker；泳道2为0.5mmol/L IPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道6为08mmol/L IPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道7为0.8mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道8为0.8mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道9为0.8mmol/LIPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道10为1.2mmol/L IPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道11为1.2mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道12为1.2mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液；泳道13为1.2mmol/L IPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶1大肠杆菌裂解液。

图11为复性后的重组人激肽释放酶1包涵体SDS-PAGE电泳图。

其中，泳道1为(10-230KDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为用Buffer A超声破碎后的重组人激肽释放酶1包涵体沉淀；泳道3为Buffer B第一次清洗后重组人激肽释放酶1包涵体沉淀；泳道4为Buffer B第二次清洗后重组人激肽释放酶1包涵体沉淀；泳道5为Buffer C变性后的重组人激肽释放酶1溶液；泳道6为稀释法复性后的重组人激肽释放酶1；泳道7为复性后重组蛋白溶液过0.22μm滤膜，即得到重组人激肽释放酶1复性溶液；泳道8为hKLK1复性蛋白经亲和色谱柱纯化得到的重组人激肽释放酶1蛋白样品。

图12为重组人激肽酶1复性蛋白亲和色谱柱纯化样品UPLC检测效果图。检测结果显示重组人激肽释放酶1纯化后的蛋白纯度95％以上。

其中，在检测时间为10.5min时出现的单一蛋白洗脱峰为重组人激肽释放酶1纯化蛋白样品。

图13为重组人激肽酶1蛋白样品N端氨基酸检测效果图。

其中，图13-a为重组人激肽释放酶1纯化蛋白样品N端的第一个氨基酸为蛋氨酸(Met)，图13-b为第二个氨基酸为异亮氨酸(Ile)，图13-c为第三个氨基酸为缬氨酸(Val)，图13-d为第四个氨基酸为甘氨酸(Gly)，图13-e为第五个氨基酸为甘氨酸(Gly)。

图14为重组人激肽酶1蛋白样品质谱高分辨分子量检测效果图。

其中，图14为重组人激肽酶1蛋白样品的质谱高分辨分子量检测峰。质谱图显示重组人激肽酶1蛋白为单一主峰，分子量为26526Da。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1重组人激肽释放酶1基因优化设计

1.密码子优化

发明人根据GenBank已公开的人激肽释放酶1(Homo sapiens kallikrein 1)的cDNA序列(GenBank登录号：NM_002257.3)和GenBank已公开的人激肽释放酶1(Homo sapienskallikrein)的氨基酸序列(GenBank登录号：AAA59455.1)，由于hKLK1存在氨基酸多态性，结合已公开的中国人胰组织激肽释放酶基因(戴勇，彭武建，李体远，等.人胰激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达[J].中国现代医学杂志，2005，15(16):2405～2409)，去除天然表达hKLK1的信号肽和前肽氨基酸序列，确定本发明基因优化前的hKLK1基因序列，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组人激肽释放酶1基因，如SEQ ID NO：1所示。

下面是对重组人激肽释放酶1进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，人激肽释放酶1天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.70。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得本发明的重组人激肽释放酶1基因在大肠杆菌中CAI指数为0.88。通常CAI＝1时被认为目的基因在表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出密码子优化后得到的hKLK1基因序列可以提高hKLK1基因在大肠杆菌中的表达水平。

2.最优密码子使用频率(Frequency of Optimal Codons，FOP)

由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，人激肽释放酶1天然基因序列的低利用率密码子出现百分比为20％。这条未进行优化的基因含有串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物，导致目的基因无表达或表达量不高。由图3-b可知，通过密码子优化后，本发明的重组人激肽释放酶1基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量(GC curve)

GC含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的人激肽释放酶1基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示人激肽释放酶1天然基因中在优化前GC碱基平均含量为56.06％，由图4-b中显示出优化后的序列消除了GC含量在30％-70％区域外所有碱基，最终得到优化后重组人激肽释放酶1的GC碱基平均含量为53.36％。

4.优化前后顺式作用元件情况如下：

顺式作用元件	优化前	优化后
			E.coli_RBS(AGGAGG)	0	0
PolyT(TTTTTT)	0	0
			PolyA(AAAAAAA)	0	0
Chi_sites(GCTGGTGG)	0	0
			T7Cis(ATCTGTT)	0	0
SD_like(GGRGGT)	1	0

5.优化前后回文以及重复序列情况如下：

6.mRNA的二级结构预测图

在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5＇发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b人激肽释放酶1密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5＇发卡结构和解链所需的能量更适于目的蛋白的表达。

实施例2：重组人激肽释放酶1基因的表达质粒构建

1.将优化后的重组人激肽释放酶1全基因(如SEQ ID NO：1所示)合成的片段，构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-hKLK1质粒。以pUC57-hKLK1质粒为模板，上、下游引物分别引入Nde I和Xho I酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1:GGAATTCCATATGATCGTGGGTGGTTGGGAAT

下游引物：

P2:CCGCTCGAGTTAGGAGTTTTCGGCAATCGTAT

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase(购自Theromo-Fisherscientific)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃10s、56℃20s、72℃40s，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(736bp)一致。(如图7-a所示)

将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)纯化。纯化后，用Nde I和Xho I(购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶(购自New England Biolabs公司)连接到pET21b质粒(购自Merck公司)中(如图6-a所示)，转化到DH5α感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素(购自Amresco公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆单菌落，进行基因测序比对，与理论序列完全一致，即得到重组人激肽释放酶1一种形式的表达质粒，记为pET21b-hKLK1。

2.将优化后的重组人激肽释放酶1全基因(如SEQ ID NO：1所示)合成的片段，构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-hKLK1质粒。以pUC57-hKLK1质粒为模板，上、下游引物分别引入Nde I和Xba I酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1:GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATCGTGGGTGGTTGGGAAT

下游引物：

P2:CCGCTCGAGTTAGGAGTTTTCGGCAATCGTAT

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase(购自Theromo-Fisherscientific)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃10s、58℃20s、72℃40s，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(772bp)一致。(如图7-b所示)

将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)纯化。纯化后，用Nde I和Xba I(购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶(购自New England Biolabs公司)连接到pET28a质粒(购自Merck公司)中(如图6-b所示)，转化到DH5α感受态细胞(购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素(购自Amresco公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆单菌落，进行基因测序比对，与理论序列完全一致，即得到重组人激肽释放酶1一种形式的表达质粒，记为pET28a-hKLK1。

实施例3重组人激肽释放酶1在大肠杆菌中的表达和鉴定

具体步骤如下：

1.将实施例2中测序比对正确的pET21b-hKLK1或pET28a-hKLK1质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株(购自北京天根生化科技有限公司)中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2.第二天挑1-5个含有pET21b-hKLK1或pET28a-hKLK1质粒的重组单菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。

3.取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。

4.接种后每隔1h测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀＝1.5时，用0.8mmol/L的IPTG(Amresco公司)进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。

5.4h后收集菌液，高速离心(转速：13000rpm)3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心(转速：13000rpm)1min，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。

6.各取10μL步骤5所得的未加入IPTG和加入IPTG诱导的培养物样品，12％SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7.8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8.考马斯亮蓝R-250(购自sigma公司)染色，见图8-a和图8-b。根据检测结果，重组人激肽释放酶1基因通过载体pET21b或pET28a构建，均可以在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

9.免疫印迹检测，见图9。

实施例4重组人激肽释放酶1高效表达诱导条件优化

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、培养温度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。运用三因素四水平，建立IPTG浓度和诱导时间正交表，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析诱导重组人激肽释放酶1表达量。

具体步骤如下：

1.将实施例2中测序比对正确的pET21b-hKLK1质粒转化到BL21(DE3)感受态菌株中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2.第二天挑选含有pET21b-hKLK1重组质粒的BL21(DE3)菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。

3.取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。

4.接种后测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀＝1.5时，按照表1分别加入0.5，0.8，1.2mmol/L IPTG浓度和时间进行诱导表达。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液做阴性对照。

表1表达IPTG浓度和时间条件

分组	诱导剂IPTG浓度(mmol/L)	诱导时间T(h)
			1	0.5	2
2	0.5	3
			3	0.5	4
4	0.5	5
			5	0.8	2
6	0.8	3
			7	0.8	4
8	0.8	5
			9	1.2	2
10	1.2	3
			11	1.2	4
12	1.2	5

5.分别于2，3，4，5h后依次收集重组人激肽释放酶1菌液，高速离心(转速：13000rpm)3min，用预冷的PBS清洗沉淀，得含有诱导重组人激肽释放酶1的大肠杆菌沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温以13000rpm高速离心1min，取上清。未加入IPTG的大肠杆菌培养液也按此步骤处理。

6.各取10μL步骤5处理的未加入IPTG和加入不同浓度IPTG，不同诱导时间条件下表达的重组人激肽释放酶1样品，10％SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7.8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8.考马斯亮蓝R-250染色，观察重组人激肽释放酶1表达产物条带。见图10。

凝胶成像系统薄层扫描分析表达重组人激肽释放酶1含量鉴定重组人激肽释放酶1的表达量。最终确定适合本实施的诱导条件为0.8mmol/L IPTG，诱导时间为4h。

实施例5重组人激肽释放酶1包涵体纯化及复性

1.将实施例4步骤5中经预冷的PBS清洗沉淀得到的含有诱导重组人激肽释放酶1的大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃以6000rpm离心15min；重复一次。

2.吸去上清，根据菌体沉淀重量，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A 12mL，25℃重悬菌体。

3.按湿重每克菌体加入7μL 80mmol/L PMSF，8μL 50mg/mL溶菌酶，重悬混匀后25℃保存。

4.用JY92-IIDN型超声波细胞粉碎机(购自宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎菌体，样品置于冰上，超声20min，每次3s间隔3s，超声结束，4℃以13000rpm高速离心15min。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃以13000rpm高速离心15min，沉淀包涵体，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min，至溶液澄清。

7.充分混匀后4℃以13000rpm高速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶1变性溶液。

8.采用稀释复性法对步骤7中的重组人激肽释放酶1变性溶液进行稀释复性。

稀释复性方法：取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组人激肽释放酶1变性溶液，用Quick Start Bradford 1×Dye Reagent(购自美国Bio-Rad公司)测其蛋白浓度，然后用复性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.1mg/mL，4℃复性至16h时，将复性后重组蛋白溶液过0.22μm滤膜(购自Merck Millipore公司)，即得到低浓度的重组人激肽释放酶1复性蛋白溶液。用Buffer E为基础缓冲液，将hKLK1复性蛋白上亲和色谱柱纯化，用0.25-0.35M NaClBuffer E缓冲液洗脱收集目的峰，得到重组hKLK1纯品。用截留分子量10KDa的超滤膜包(购自PALL公司)超滤脱盐、浓缩，于ALPHA 2-4LD冻干机(购自Christ公司)低温真空干燥，即获得重组人激肽释放酶1冻干粉末。

各缓冲液按下表配制：

表2各缓冲液配制

9.分别以步骤5中洗涤缓冲液Buffer B两次洗涤产物和复性方法所得的产物进行SDS-PAGE电泳分析。(如图11所示)在目的范围可见明显条带。

10.分别以步骤8中hKLK1复性蛋白纯化所得的产物进行SDS-PAGE电泳分析，可见经0.25-0.35M NaCl洗脱得hKLK1蛋白在目的范围可见明显单一蛋白条带(如图11中泳道8所示)。

实施例6重组人激肽释放酶1生物学活性测定

配制Buffer F和标准品猪胰腺激肽释放酶(购自常州千红生化制药股份有限公司)100U/mL，用Buffer F将标准品稀释5个浓度梯度10U/mL，5U/mL，2.5U/mL，1.25U/mL，0.625U/mL，底物为D-Val-Leu-Arg p-nitroanilide(购自sigma公司)，使用时用Buffer F稀释100倍。样品用Buffer F稀释适当倍数，于96孔板中先每孔加稀释好的底物80μL，然后立即加入稀释好的标准品80μl及各样品，Synergy H1GEN酶标仪(购自BioTek公司)37℃，405nm处进行吸光度检测，1min检测一次，连续检测15min。

实验结果显示，与标准品对照相比，本发明重组人激肽释放酶1复性前的包涵体蛋白无明显活性，重组人激肽释放酶1复性纯化样品具有明显的活性，其中90％纯度的hKLK1活性约为120IU/mg，99％纯度的hKLK1活性约为1000IU/mg。由此可见，本发明制备的hKLK1为活性较高，且制备工艺简单，为工业化生产基因工程重组人激肽释放酶1的奠定了基础，使其在临床疾病治疗应用成为了可能。

实施例7重组人激肽释放酶1纯化样品的UPLC测定

将实例5中获得重组人激肽释放酶1纯化样品用UPLC系统进行分析，所使用的SEC柱子为Acquity UPLC BEH125(4.6×300mm)分析柱(购自Waters公司)，基础缓冲液为20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)，其中含0.1mol/L的硫酸钠，对SEC柱充分平衡后上样，以0.3mL/min的流速洗脱，检测波长为280nm，样品检测时长为18min。

实验结果显示，在检测时间为10.5min时，出现单一蛋白洗脱峰，峰形均匀对称，无其他洗脱峰(如图12所示)，说明重组人激肽释放酶1纯化样品纯度较高，基本上无杂蛋白，蛋白纯度为95％以上。本发明制备工艺制备的hKLK1蛋白具有较高的纯度，纯度可达95％以上，可满足样品的进一步纯化制备，同时完全满足N端氨基酸测定的纯度要求与质谱高分辨分子量检测的纯度要求。

实施例8重组人激肽释放酶1纯化样品的N端氨基酸测定

将实例5中获得重组人激肽释放酶1纯化样品用PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪(购自岛津公司)进行N端氨基酸序列检测，通过Edman降解法逐个对重组人激肽释放酶1纯化样品的N端氨基酸进行降解，使用PVDF膜对样品进行处理，处理后样品经岛津PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪检测，PPSQ-33A产生的原始数据及图谱由PPSQ-30DataProcessing软件识别标峰，导出图谱。

实验结果显示，重组人激肽释放酶1纯化样品的N端第一个氨基酸为蛋氨酸(Met)(如图13-a所示)，第二个氨基酸为异亮氨酸(Ile)(如图13-b所示)，第三个氨基酸为缬氨酸(Val)(如图13-c所示)，第四个氨基酸为甘氨酸(Gly)(如图13-d所示)，第五个氨基酸为甘氨酸(Gly)(如图13-e所示)，综上所述，供试品重组人激肽释放酶1纯化样品的N端序列为：NH2-Met-Ile-Val-Gly-Gly。N端氨基酸序列检测结果显示，本发明制备的hKLK1蛋白样品的N端氨基酸序列与天然hKLK1N端氨基酸序列一致，说明本发明的hKLK1基因核苷酸序列正确无误，本发明的蛋白制备工艺成熟稳定，可以制备高纯度的hKLK1蛋白样品。

实施例9重组人激肽释放酶1纯化样品的质谱高分辨分子量测定

用Triple TOFTM 5600+质谱仪(购自AB SCIEX公司)进行对实例5中获得重组人激肽释放酶1纯化样品进行质谱高分辨分子量检测。主要使用材料和试剂为：乙腈、FA，分析时长：30min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：350-4000m/z。原始数据由ProMass 2.8软件处理，光宽度：7，信噪比：2，获得测试样品本发明制备的hKLK1相对分子质量图谱(如图14所示)。

实验结果显示，质谱图上显示单一主峰，分子量为26526Da，实例5中获得重组人激肽释放酶1纯化蛋白样品的相对分子质量为26526Da，26569Da等，与人激肽释放酶1理论分子量一致。重组人激肽释放酶1纯化样品的质谱高分辨分子量测定检测结果显示，本发明制备的hKLK1蛋白样品的分子量与hKLK1的理论分子量一致，本发明的蛋白制备工艺成熟稳定，可以准确制备高纯度的hKLK1蛋白样品。

Claims (8)

1.一种人激肽释放酶1的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有如权利要求1所述的编码基因的原核表达质粒。

3.如权利要求2所述的原核表达质粒，其特征在于，所述质粒为pET21b或pET28a。

4.一种含有如权利要求1所述的编码基因的大肠杆菌菌株。

5.如权利要求4所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

6.一种重组人激肽释放酶1在大肠杆菌中的表达方法，包括如下步骤：

(1)将如权利要求5所述的大肠杆菌菌落接入LB培养液，于37℃培养过夜；

(2)取过夜培养物接入于LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期；

(3)在培养物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37℃，诱导表达2-5h后，于4℃离心处理并收集含有重组人激肽释放酶1的大肠杆菌菌体沉淀。

7.如权利要求6所述重组人激肽释放酶1在大肠杆菌中的表达方法，其特征是所述LB培养液中含有氨苄青霉素80-120μg/mL。

8.一种重组人激肽释放酶1在大肠杆菌表达后的纯化与复性方法，包括如下步骤：

(1)将含有诱导重组人激肽释放酶1的大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃离心处理；所述的含有诱导重组人激肽释放酶1的大肠杆菌菌体沉淀为使用权利要求6所述方法获得/得到/产生的大肠杆菌菌体沉淀；

(2)吸去上清，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A 5-15mL；

(3)按湿重每克菌体加入5-8μL的80mmol/L PMSF，5-50μL的50mg/mL溶菌酶，重悬混匀后10-37℃保存；

(4)超声或高压破碎菌体，并于4℃离心处理，弃上清；

(5)沉淀用洗涤缓冲液Buffer B重悬，并于4℃以离心处理，沉淀包涵体；

(6)包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，25℃下搅拌10-60min；

(7)充分重悬混匀后以4℃离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶1变性溶液；

(8)继续用复性缓冲液Buffer D将上述所述的重组人激肽释放酶1变性溶液溶解并稀释到蛋白浓度0.1mg/mL，4℃稀释复性，复性至16h时，将复性后重组蛋白溶液用滤膜过滤，即得到低浓度的重组人激肽释放酶1复性溶液；

(9)用Buffer E为基础缓冲液，将所述低浓度的重组人激肽释放酶1复性溶液上亲和色谱柱纯化，用含有0.25-0.35M NaCl的Buffer E缓冲液洗脱收集目的峰，得到重组hKLK1纯品；

所述Buffer A配比为：35mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，以及0.1mmol/L PMSF，溶液基质为蒸馏水，pH为7.4；

所述Buffer B配比为：35mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1％TritonX-100，以及1.5mol/L尿素，溶液基质为蒸馏水，pH为7.4；

所述Buffer C配比为：45mmol/L Tris-HCl，0.20mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.1mmol/LPMSF，8mol/L尿素，以及10mmol/L DTT，溶液基质为蒸馏水，pH为7.8；

所述Buffer D配比为：35mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，摩尔比为5:1的GSH和GSSG，0.5mol/L L-精氨酸，25％甘油，0.30mol/L NaCl，溶液基质为蒸馏水，pH为7.8；

所述Buffer E配比为：20mmol/L Tris-HCl，溶液基质为蒸馏水，pH为7.3。