CN104558100A

CN104558100A - 包涵体的预处理方法

Info

Publication number: CN104558100A
Application number: CN201510056591.9A
Authority: CN
Inventors: 孙旸; 陈�光; 孙春玉; 迟惠; 王刚; 陈欢; 王聪; 孙宁宁; 张斯童
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明涉及一种包涵体的预处理方法，其包括一个细胞破碎的步骤、一个包涵体的洗涤步骤、一个包涵体的溶解步骤。将经过离心收集的细胞培养物在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀，再将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过3－10次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体，将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.01－0.2％PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。发明提供的一种包涵体的预处理方法，预处理时间短，工艺简单，试剂消耗少，成低且蛋白质的活性不易受损。

Description

包涵体的预处理方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种包涵体的预处理方法

背景技术

在基因工程重组菌中外源基因的过量表达是最容易形成包涵体。包涵体具有很多优点，它能够富集重组蛋白，提高表达量，并且不容易被宿主细胞中的蛋白酶降解，同时不需考虑提取重组蛋白时的蛋白变性问题，后期的纯化也比较简单，包涵体对宿主细胞的毒性小等优点。包涵体蛋白质密度比较高，而且不溶于水，复性效率也较低，所以要选择最适的复性方法，也是在获得有活性重组蛋白中最关键的一步。包涵体一般是指外源基因在宿主细胞中表达出的蛋白在细胞内聚集形成不规则无活性的蛋白质，即错误折叠结构的固体颗粒，颗粒中超过50％是重组蛋白，其余的一般是内毒素、细菌外膜蛋白、RNA聚合酶、核糖体元件、质粒DNA和脂多糖等成分。包涵体颗粒的大小一般在0.5－1.0μm之间，形状多为圆形或无定形，而且高疏水不易溶解，只能在盐酸胍或尿素等变性剂溶液中溶解。

对包涵体进行预处理可以提高纯化的纯度和减少纯化的步骤。包涵体的预处理包括了细胞破碎、洗涤和溶解这三个主要部分。经过离心收集的细胞培养物可以选择多种方法进行细胞破碎。细胞破碎的方法主要有机械破碎法、反复冻融法、化学处理法、溶菌酶处理法等。包涵体通常粘附着很多膜蛋白和核酸等杂质，利用不同的包涵体洗涤缓冲液对包涵体进行预处理清洗。洗涤缓冲液中需含有一定浓度的变性剂，如一定浓度的尿素。同时可以添加一些温和的去垢剂去除膜碎片和膜蛋白，还可以添加一些其他物质增强离子强度。包涵体的溶解通常采用强变性剂溶液进行溶解。

但是传统的包涵体预处理的工艺存在预处理时间长，工艺复杂，试剂消耗比较多，成本高，且蛋白质的活性受损等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包涵体的预处理方法，预处理时间短，工艺简单，试剂消耗少，成本低且蛋白质的活性不易受损。

为实现上述目的，本发明提供了一种包涵体的预处理方法，包括一个细胞破碎的步骤、一个包涵体的洗涤步骤、一个包涵体的溶解步骤；在所述的细胞破碎的步骤中，将经过离心收集的细胞培养物在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀；在所述包涵体的洗涤步骤，将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过3－10次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体；在所述的包涵体的溶解步骤，将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.01－0.2％PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。

所述的细胞破碎的步骤中，高压氮气的压力为2－3.5MPa，超声温度为10－20℃，絮凝剂为0.001－0.01％的聚丙烯酰胺，絮凝时间为30－60分钟。

所述的包涵体的洗涤步骤中，变性剂为0.1－2mol/l的尿素，除垢剂为质量分数为0.5－2％的TritonX－100、脱氧胆酸、Tween、Triton和NP40中的至少一种，电解质为质量分数为5－20％的氯化钠、氯化钾、氯化钙中的至少一种，缓冲剂中变性剂、除垢剂、电解质的质量比为0.1－0.3：0.2－0.4：0.3－0.7，浆化时缓冲剂与包涵体的质量比为1：0.1－0.2，浆化温度为10－25℃，浆化时间为30－60分钟，微孔过滤采用的动力为压缩氮气。

所述的包涵体的溶解步骤中，强变性剂中0.01－0.2％PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍的质量比为0.05－0.1：0.6－0.8：0.1－0.2，溶解温度为10－25℃，溶解时间60－180分钟，强变性剂与包涵体的质量比1：0.05－0.2，澄清时间为60－240分钟。

所述的微孔过滤中微孔的孔径为0.1－5um。

本发明的原理在于，采用高压氮气作用下的超声波破碎，在高压气体以及超声波的双重作用下，可高效的将破碎，破碎效率大大提高且不会损伤包涵体。通过加入絮凝剂来实现包涵体的絮凝沉降，即可减少包涵体沉淀的时间，提高生产效率，同时提高了包涵体的回收率。采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂来洗涤包涵体，即可除膜碎片、膜蛋白和核酸，又避免造成对包涵体造成影响，同时经过3－10次浆化－微孔过滤来分离包涵体和洗涤液，采用压缩氮气做为动力，分离效果好，缩短了包涵体和洗涤液的分离时间。同时采用PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，由于盐酸胍的效果要比用尿素的效果好，因为盐酸胍是比尿素强的变性剂，它能使在尿素中不溶解的包涵体溶解，但价格比较贵，而采用尿素与盐酸胍混合，即有高效的溶解效果，又可降低成本。

本发明的有益效果是：预处理时间短，工艺简单，试剂消耗少，成本低且蛋白质的活性不易受损。

具体实施方式

实施例1

1.细胞破碎。将离心收集的细胞培养物先进行细胞破碎，在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀，高压氮气的压力为2.5MPa，超声温度为15℃，絮凝剂为0.005％的聚丙烯酰胺，絮凝时间为40分钟。

2.包涵体的洗涤。将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过5次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体，变性剂为1.5mol/l的尿素，除垢剂为质量分数为0.8％的TritonX－100，电解质为质量分数为10％的氯化钠，缓冲剂中变性剂、除垢剂、电解质的质量比为0.2：0.3：0.5，浆化时缓冲剂与包涵体的质量比为1：0.15，浆化温度为20℃，浆化时间为40分钟，微孔过滤采用的动力为压缩氮气，微孔的孔径为2um。

3.将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.05％PMSF、4mol/l尿素和1.5mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。强变性剂中PMSF、尿素和盐酸胍的质量比为0.075：0.725：0.2，溶解温度15℃，溶解时间70分钟，强变性剂与包涵体的质量比1：0.08，澄清时间为80分钟。

最终包涵体的回收率97％，包涵体的纯度为96.5％，包涵体的预处理时间为400分钟。

实施例2

1.细胞破碎。将离心收集的细胞培养物先进行细胞破碎，在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀，高压氮气的压力为2.5MPa，超声温度为20℃，絮凝剂为0.005％的聚丙烯酰胺，絮凝时间为30分钟。

2.包涵体的洗涤，将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过4次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体，变性剂为1.8mol/l的尿素，除垢剂为质量分数为0.8％的TritonX－100，电解质为质量分数为10％的氯化钠，缓冲剂中变性剂、除垢剂、电解质的质量比为0.2：0.3：0.5，浆化时缓冲剂与包涵体的质量比为1：0.2，浆化温度为20℃，浆化时间为40分钟，微孔过滤采用的动力为压缩氮气，微孔的孔径为2um。

3.将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.05％PMSF、5mol/l尿素和1.2mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。强变性剂中PMSF、尿素和盐酸胍的质量比为0.075：0.725：0.2，溶解温度15℃，溶解时间80分钟，强变性剂与包涵体的质量比1：0.08，澄清时间为60分钟。

最终包涵体的回收率96.5％，包涵体的纯度为97.5％，包涵体的预处理时间为300分钟。

实施例3

1.细胞破碎。将离心收集的细胞培养物先进行细胞破碎，在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀，高压氮气的压力为2.0MPa，超声温度为18℃，絮凝剂为0.005％的聚丙烯酰胺，絮凝时间为30分钟。

2.包涵体的洗涤，将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过6次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体，变性剂为1.8mol/l的尿素，除垢剂为质量分数为0.8％的TritonX－100，电解质为质量分数为10％的氯化钠，缓冲剂中变性剂、除垢剂、电解质的质量比为0.2：0.2：0.6，浆化时缓冲剂与包涵体的质量比为1：0.2，浆化温度为20℃，浆化时间为30分钟，微孔过滤采用的动力为压缩氮气，微孔的孔径为2um。

3.将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.05％PMSF、4mol/l尿素和1.2mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。强变性剂中PMSF、尿素和盐酸胍的质量比为0.075：0.725：0.2，溶解温度15℃，溶解时间60分钟，强变性剂与包涵体的质量比1：0.08，澄清时间为60分钟。

最终包涵体的回收率96％，包涵体的纯度为94.8％，包涵体的预处理时间为350分钟。

比较例1

其他条件同实施例1，仅仅絮凝时间变为10分钟，最终包涵体的回收率为89.5％。

比较例2

其他条件同实施例2，仅仅溶解时间变为20分钟，最终包涵体的纯度为90.2％。

Claims

1.一种包涵体的预处理方法，其特征在于：包括一个细胞破碎的步骤、一个包涵体的洗涤步骤、一个包涵体的溶解步骤；在所述的细胞破碎的步骤中，将经过离心收集的细胞培养物在高压氮气的作用下采用超声波破碎，再加入絮凝剂澄清，弃去上清液得到富集包涵体的沉淀；在所述包涵体的洗涤步骤，将得到的富集包涵体的沉淀采用由变性剂、除垢剂、电解质组成的缓冲剂经过3－10次浆化－微孔过滤得到洗涤后的包涵体；在所述的包涵体的溶解步骤，将洗涤后的包涵体采用由质量分数0.01－0.2％PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍配制的强变性剂进行溶解，溶解完毕后经过澄清，将上清液倒去即可得到纯净的包涵体。

2.根据权利要求1所述的一种包涵体的预处理方法，其特征在于，所述的细胞破碎的步骤中，高压氮气的压力为2－3.5MPa，超声温度为10－20℃，絮凝剂为0.001－0.01％的聚丙烯酰胺，絮凝时间为30－60分钟。

3.根据权利要求1所述的一种包涵体的预处理方法，其特征在于，所述的包涵体的洗涤步骤中，变性剂为0.1－2mol/l的尿素，除垢剂为质量分数为0.5－2％的TritonX－100、脱氧胆酸、Tween、Triton和NP40中的至少一种，电解质为质量分数为5－20％的氯化钠、氯化钾、氯化钙中的至少一种，缓冲剂中变性剂、除垢剂、电解质的质量比为0.1－0.3：0.2－0.4：0.3－0.7，浆化时缓冲剂与包涵体的质量比为1：0.1－0.2，浆化温度为10－25℃，浆化时间为30－60分钟，微孔过滤采用的动力为压缩氮气。

4.根据权利要求1所述的一种包涵体的预处理方法，其特征在于，所述的包涵体的溶解步骤中，强变性剂中0.01－0.2％PMSF、3－6mol/l尿素和1－3mol/l盐酸胍的质量比为0.05－0.1：0.6－0.8：0.1－0.2，溶解温度为10－25℃，溶解时间60－180分钟，强变性剂与包涵体的质量比1：0.05－0.2，澄清时间为60－240分钟。

5.根据权利要求1所述的一种包涵体的预处理方法，其特征在于，所述的微孔过滤中微孔的孔径为0.1－5um。