CN1169998A - 重组蛋白提取纯化新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物制药领域。凡由基因工程菌(大肠杆菌)表达,以包涵体形式存在,并从包涵体中提取纯化重组蛋白的均可适用此工艺。本工艺的特征在于采取两种变性溶解剂体系,进行两次变性溶解、纯化,及先复性后纯化的程序,因而本发明比已有技术可使重组蛋白的溶解度增加500—600倍,变性剂的用量减少100倍左右,工作效率相应提高上百倍,重组蛋白纯度提高30%左右,而产品总收率增加24%以上,因此本发明是工艺简单、产品纯度及收率均明显提高、成本则显著降低、经济效益甚高的提取纯化新工艺。
Description
本发明属于生物制药领域。
许多基因工程菌(大肠杆菌)所表达的重组蛋白多(均)以包涵体形式存在，如：白介素-2，人粒细胞集落刺激因子，白介素2-粒巨细胞集落刺激因子融合蛋白......等，因此从包涵体中提取纯化重组蛋白的工艺引起高度重视，因为纯化工艺的优劣直接影响产品的质量及效率，从而直接影响经济效益。
在重组蛋白提取纯化工艺中，必须先用蛋白变性剂(溶解剂)将包涵体中的重组蛋白变性溶解，以便纯化除去杂质，这是关键技术之一。然后于适宜条件下进行复性，以重获天然活性。因此重组蛋白由变性到复性是其关键技术之二。上述两个关键技术主要影响产品的纯度及效率。
目前已有技术对提取纯化蛋白存在以下问题。
1.重组蛋白在盐酸胍或尿素单一变性剂中溶解度有限，在降低变性剂＜4mol/L时，重组蛋白不能与杂蛋白、核酸解离而被析出，严重影响产品回收率。
2.为了提高重组蛋白的纯度，采取先纯化后复性的工艺程序，然而，由于变性剂的浓度高，粘稠度大、用量也大，因而操作难度很大，成本高。
3.由于重组蛋白长时间与高浓度变性剂作用，导致变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰，致使重组蛋白复性率降低，产品收率随之降低。
鉴于已有技术存在上述问题。其结果是：工艺复杂操作难度大，产品的纯度及收率均低，进而导致成本高，不利于工业化生产。
本发明的目的就是寻找一条工艺简单，产品的纯度及收率均高，而成本低的提取纯化工艺。本发明内容：附工艺流程示意图
凡由基因工程菌大肠杆菌表达的重组蛋白，是以包涵体形式存在，并从包涵体中提取纯化重组蛋白的，均可按本发明的提取纯化工艺流程进行生产。提取纯化程序是将工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性纯化，重组蛋白二次变性纯化，重组蛋白复性，离子交换层析，分子筛层析，即得重组蛋白，其具体工艺如下：
一、工程菌破碎
1.取工程菌，按每克湿菌加5-10倍缓冲液(1)(20mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0)，洗涤细菌，于4℃离心，7000(rpm)×10min(分钟)，弃上清液。
2.按每克湿菌加溶菌酶5毫克，同时加5-10倍量的缓冲液(2)(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0)，于4℃搅拌1.5-2.5小时，在-20℃放置过夜。
3.将过夜菌化冻后，用超声破碎，30秒×10次，每次间隔1-2min，至液体变稀薄、起泡为止，镜检细菌破碎率为98％以上。
二、包涵体洗涤
1.取超声破碎菌液，离心4000rpm×5min 4℃，留沉淀。
2.将沉淀物(包涵体)用以下缓冲液(3)(4)(5)(6)(7)(8)依次分别进行充分搅拌洗涤，于4℃离心12000rpm×20min，洗1-2次，留沉淀物(包涵体)备用。分别洗涤的目的在于除弃混合在包涵体的质脂体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。
各缓冲液成分如下：
缓冲液(3)：20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0缓冲液(4)：20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L2-ME
(二巯基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0
缓冲液(5)：与缓冲液(3)相同
缓冲液(6)：2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH8.0
缓冲液(7)：70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0
缓冲液(8)：20mmol/L Tris-HCl，pH8.0
三、重组蛋白变性纯化
1.将洗涤后的包涵体按湿重加5-10倍量的盐酸胍缓冲液(9)(6-8mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH7.0-8.5)，充分搅拌25-35分钟后，此时重组蛋白变性溶解，于4℃离心12000rpm×30min，取上清液得重组蛋白溶液。取盐酸胍溶解液，加入缓冲液(10)(10mmol/L DTT，1mmol/LEDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)将盐酸胍缓冲液浓度稀释到4-5mol/L，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液⑩将盐酸胍浓度稀释到2-3mol/L，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用缓冲液(11)(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，pH8.0)冲洗，离心10000rpm×10min，冲洗1-2次留沉淀物。四、重组蛋白二次变性纯化
取第一次纯化的沉淀物用尿素缓冲液(12)(6-8mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/2-ME，20mmol/L NaAc(醋酸钠)，pH3.5-7.0)变性溶解，于4℃离心12000rpm×20min，离心弃不溶物，留上清液调整蛋白浓度为8-10mg/克备用。在此工艺程序上，本发明与已有技术质的区别，在于对重组蛋白采取了两种变性溶解体系，进行交替变性溶解纯化处理，可显著地提高重组蛋白的溶解度(500-600倍)，并充分利用其溶解度大大增加这一特性，刻意降低(稀释)变性剂的浓度(0.1mol/L)，其目的在于使重组蛋白与杂蛋白、核酸自行解离，以达纯化，提高收率。而已有技术采取单一变性剂的处理，只能将变性剂的浓度降到＞4mol/L，此浓度不能使重组蛋白与杂蛋白、核酸等有效地自行解离，因而重组蛋白与杂质一起析出，弃掉，故收率显著降低。五、重组蛋白复性
将尿素液调整蛋白浓度为8-10mg/ml溶液，缓慢加入复性缓冲液(13)(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽，20mmol/L醋酸钠，pH4.0)，即在80-100分钟内将6-8mol/L尿素缓冲液的浓度逐步(梯度)稀释到0.1mol/L，于4℃过夜，然后用缓冲液(14)(10mmol/L醋酸钠，pH4.0)透析，或经超滤平衡去除复性缓冲液，得重组蛋白。
本发明在此工艺环节上的重大技术特征，在于采用复性缓冲液梯度稀释变性剂的同时，进行逐步还原复性的方法，其结果：
1.简化了整个后续的纯化工艺。
2.极大的减少了变性剂的用量，从而减少了在变性剂条件下进行色谱分离的麻烦。
3.在整个操作中重组蛋白与变性剂作用时间很短，因而可避免变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰馁，重组蛋白复性率可达95％以上。
六、离子交换层析(去除核酸热原)
1.将CM Sepharose FastFlow(一种阳离子交换层析填料)装入玻璃层析柱，用2倍柱床体积的0.5mol/L氢氧化钠洗脱一次，用无热原水洗涤层析柱，以除去氢氧化钠，至流出液的pH7.0止，然后用2-3倍柱床体积的20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0缓冲液平衡层析柱。
2.取复性的重组蛋白加入缓冲液(15)(20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)，然后以每小时50-70毫升的流速上层析柱。再用2倍柱体积的缓冲液(15)洗脱，流速为25-30ml/小时，最后用氯化钠缓冲液(16)(0.3mol/L氯化钠，20mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)洗脱，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集。
七、分子筛层析(去除异构体、热原)
1.将凝胶排阻层析填料(Sephacryl S-200)装玻璃层析柱，用0.5mmol/L氯氧化钠冲洗进行去热原处理。然后用2倍柱体积的缓冲液(17)(0.004％吐温-80，10mmol/L醋酸钠-醋酸，pH4.0)平衡层析柱。
2.取经离子交换层析处理的重组蛋白，加入缓冲液(17)，按10％柱体积上样并洗脱，流速为50-60ml/小时，收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收为零时停止收集，即可获得重组蛋白。
本发明与已有技术比较具有以下优点见下表
本发明与已有技术比较变性剂用量变性剂作用时间重组蛋白纯度OD280/260成品
(ml) (小时) (％) (吸光度)* (％已有技术 1500 85 60 1.0 1本发明 150 2 ＞90 1.5 3差异 100倍 80以上 30 0.5 2*OD280/260值越大，产品纯度越高，含核酸等杂质越少。
从上表可以看出
1.本发明比已有技术，在使用变性剂量少100倍，而清除变性剂的工作效率将提高100倍，其成本显著降低。
2.本发明比已有技术变性剂与重组蛋白作用时间少80小时以上，导致重组蛋白共价修饰大大减少，因而产品总收率提高。
3.本发明比已有技术对重组蛋白在纯度上提高30％。
4.本发明与已有技术在重组蛋白总收率分别为34％，10％，若将纯度计算在内，则分别为30.6％和6％，就产品收率而言，其经济效益本发明比已有技术增加25％，或降低成本25％以上。
实施例一、重组人粒细胞集落刺激因子的提取纯化工艺1.菌体破碎
(1)取工程菌100克加1000ml 20mmol/L Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0，洗涤细菌，于4℃离心7000rpm×10min(分钟)，弃上清。
(2)湿菌加入溶菌酶500mg，50mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0缓冲液1000ml，于4℃搅拌2h(小时)，在-20℃放置过夜。
(3)将上述细菌化冻后超声，30sec(秒)×10次，每次间隔1min，至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破碎率＞98％。2.包涵体的洗涤
(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCL，2mmol/L EDTA，，pH8.0液洗涤。
(3)用20mmol/L Tris-HCL，10mmol/L EDTA，2mmol/L2-ME(2-巯基乙醇)，0.5％Tritonx-100(曲通X-100，一种去垢剂)，pH8.0液洗1次，去脂质。
(4)用20mmol/L Tris-HCL，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗2次，以去除Tritonx-100。
(5)用2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCL，2mmol/LEDTA，pH8.0液洗1次，去除杂蛋白。
(6)70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0洗一遍，去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCL，pH8.0洗2次去除异丙醇。
以上步骤加缓冲液500ml，于4℃离心12000rpm×20min后，弃上清。3.重组蛋白变性纯化
(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入7mol/L盐酸胍，10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0，浓度为20％。充分搅拌溶解30min后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白初提物，并将其稀释到50μg/ml。
(2)向7mol/L盐酸胍溶解的包涵体中加入含10mmol/LDTT，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0缓冲液，将盐酸胍浓度分两次降低，至重组蛋白全部析出，4℃离心12000rpm×20min，弃上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCL，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，pH8.0的缓冲液洗2次，10000rpm×10min离心得沉淀4.重组蛋白二次变性纯化
8.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L 2-ME，20mmol/L NaAc，pH4.0溶解上述沉淀，离心(12000rpm×20min)去不溶物，调整蛋白浓度为8-10毫克/毫升。5.重组蛋白复性
在尿素缓冲液中缓慢加入复性液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L NaAc，pH4.0)，即在80min内降低尿素浓度至1.0mol/L，再一次稀释到0.1mol/L，复性物4℃过液，然后用10mmol/L NaAc，pH4.0中透析或超滤平衡去除复性剂。6.离子交换层析(去核酸、热源)
(1)装JCM Sepharose FF(一种阳离子交换层析填料)层析柱，用2倍柱床体积0.5mol/L NaoH(氢氧化钠)洗脱一次(无热原处理)，以无热原水洗至流出液的pH7.0，然后用20mmol/L NaAc-HAC(醋酸钠-醋酸)pH4.0平衡。
(2)60ml/h将样品上于层析柱，再用2倍柱体积的20mmol/L NaAc-HAC pH4.0洗脱，流速30ml/h，再用含1.0mol/L NaCl(氯化钠)的20mmol/L NaAc-HAC，pH4.0梯度洗脱，收集主蛋白峰。在紫外监测仪的紫外吸收值为零时停止收集。7.分子筛层析(去除异构体、热原，换体系)
(1)Sephacryl S-200(一种凝胶排阻层析填料)层析柱去热原处理。
(2)用2倍柱体积0.004％Tween-80，10mmol/LNaAc-HAC，pH4.0平衡层析柱。
(3)按10％柱体积在上述缓冲体系中上样并洗脱，流速60ml/h。收集蛋白峰，在紫外监测仪的紫外吸收值为零时，停止收集。实施例二、rhIL2-PE66(基因重组人白细胞介素II-绿脓杆菌
外毒素66，分子量80KD)提取纯化工艺1.菌体破碎
(1)取工程菌100克加1000毫升20mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)，PH8.0，洗涤细菌，于4℃离心7000rpm×10min(分钟)，弃上清。
(2)加入溶菌酶500mg；50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0缓冲液1000ml，于4℃搅拌2h，在-20℃放置过夜。
(3)将上述细菌化冻后超声，30sec(秒)×10次，每次间隔1min，至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破解率＞98％。2.包涵体的洗涤
(1)上清离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗涤。
(3)用20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(2-巯基乙醇)，0.5％TritonX-100(曲通X-100，一种去垢剂)，pH8.0液洗1次，去脂质。
(4)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗2次，以去除TritonX-100。
(5)用2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH8.0液洗1次，去除杂蛋白。
(6)70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗一遍，去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗2次去除异丙醇。
以上步骤均加500ml缓冲液洗涤，于4℃离心12000rpm×20min后弃上清。3.重组蛋白变性纯化
用8mol/L盐酸胍溶解包涵体，然后加入含10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，的20mmol/L Tris-HCl，PH8.0缓冲液，将盐酸胍浓度分两次降至2mol/L，搅拌10min后离心12000rpm×20min，重组蛋白全部析出，12000rpm×20min，弃上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(含10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA)，pH8.0的缓冲液洗2次，10000rpm×10min离心得沉淀。4.重组蛋白二次变性纯化
用8.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L 2-ME，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶解，离心(12000rpm×20min)，留上清液，并调整蛋白浓度为8-10mg/ml备用。5.重组蛋白的复性
将上述重组蛋白2次变性溶解液缓慢加入复性液(1mmol/LEDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽(CSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，在90min内降低尿素浓度至1.0mol/L，再一次稀释到0.1mol/L，复性物4℃过夜，然后用20mmol/L Tris-HCl，pH8.0透析或超滤平衡去除复性剂。6.离子交换层析(去核酸、热源)
(1)将CM Sepharose FastFlow(一种阳离子交换层析填料)装入玻璃层析柱，记录装填体积，用2倍柱床体积的0.5mol/L NaoH(氢氧化钠)洗脱一次(去除体系内的热原质污染)、以无热原水洗涤层析柱(去除NaOH)至流出液的pH7.0，然后用2-3倍柱床体积的20mmol/L NaAc-HAC(醋酸钠-醋酸)pH4.0缓冲液平衡层析柱。
(2)以60ml/h的流速将样品于20mmol/L NaAc-HAC pH4.0缓冲液上于层析柱，再用2倍柱体积的20mmol/L NaAc-HACpH4.0洗脱，流速30ml/h，再用含0.3mol/LNaCl(氯化钠)的20mmol/L NaAc-HAC，pH4.0洗脱，目的是用具有相当离子强度的NaCl置换被吸附于阳离子层析柱上的hG-CSF重组蛋白。在紫外监测条件下，收集蛋白峰于0.3mol/L NaCl洗脱时呈一对称的单一峰，紫外吸收值为零时停止洗脱。7.分子筛层析(去除异构体、热原，换体系)
(1)将凝胶排阻层析填料(Sephacryl S-200)，同上述方法装入玻璃层析柱层析柱，并经0.5mol/L NaoH进行去热原质处理。
(2)用2倍柱体积0.004％Tween-80，10mmol/L NaAc-HAC，pH4.0平衡层析柱。
(3)按10％柱体积在上述缓冲体系中上样并洗脱，流速60ml/h。收集蛋白峰，紫外监测吸收零时停止洗脱。
Claims (8)
1.一种基因工程菌所表达的重组蛋白，是以包涵体形式存在的提取、纯化工艺，其特征在于将工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性纯化，重组蛋白二次变性纯化，重组蛋白复性，离子交换层析，分子筛层析即得纯化的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的工程菌破碎，其特征在于将工程菌用缓冲液(1)洗涤、离心，留沉淀，加溶菌酶缓冲液(2)，于4℃搅拌，放置-20℃过夜，化冻后用超声破碎至镜菌破解率大于98％，可得包涵体混合液。
3.根据权利要求1所述的包涵体洗涤，其特征在于将包涵体混合物于4℃离心，其沉淀物分别用以下缓冲液(3)(4)(5)(6)(7)(8)依次进行洗涤，4℃离心1-2次，得包涵体沉淀物。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白变性纯化，其特征在于将包涵体溶于6-8mol/L盐酸胍缓冲液(9)中，离心，取上清液加缓冲液(10)将盐酸胍浓度，稀释到4-5mol/L，离心，取上清液，再加缓冲液(10)将盐酸胍稀释至2-3mol/L，离心，沉淀物用缓冲液(11)冲洗两次，留沉淀物。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白二次变性纯化，其特征在于将沉淀物加6-8mol/L尿素缓冲液(12)变性溶解，离心，留上清液。
6.根据权利要求1所述的重组蛋白复性，其特征在于将变性溶于尿素缓冲液的重组蛋白，调正浓度为8-10毫克/毫升、然后缓慢加入复性缓冲液(13)，即在80-100分钟内，将尿素浓度稀释至0.1mmol/L，最后于4℃用缓冲液(14)透析或超滤平衡除去复性缓冲液。
7.根据权利要求1所述的离子交换层析，其特征在于将复性重组蛋白加入缓冲液(15)上层析柱，然后用缓冲液(15)洗脱，最后用缓冲液(16)洗脱至紫外吸收值零时为止。
8.根据权利要求1所述的分子筛层析，其特征在于将经离子交换层析的重组蛋白加入缓冲液(17)后上柱并洗脱，至紫外吸收值零时即停止。
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