CN111777676B - 一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法 - Google Patents
一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法，属于生物医药技术领域。本发明去游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法包括如下步骤：从重组白介素‑2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素‑2的色谱填料；用洗脱液对吸附有重组白介素‑2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，所述流出液即为重组白介素‑2复性浓缩液；本发明游离吸附浓缩重组白介素‑2复性液的方法方便易行，回收率和产品活性均较高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法。
背景技术
1976年，Morgrn等首次发现在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清或称条件培养基(Conditional medium，CM)中存在一种细胞因子，能选择性地维持T淋巴细胞在体外长期生长，人们将该因子称为T细胞生长因子(T cell growth factor，TCGF)。1979年瑞士召开的第二届国际淋巴因子会议上将联系白细胞间相互作用的因子统称为白细胞介素(Interleukin，IL)，并将由激活的T细胞产生的、在淋巴细胞间起相互作用的因子，即TCGF称为白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)。
IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，为一种糖蛋白，具有广泛生物活性，能使T细胞在试管内长期存活。随着研究的不断深入，尤其是1983年基因工程(重组)IL-2的问世，使得IL-2的研究取得了更大的进展。人们发现IL-2除了作用于T细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括B细胞，巨噬细胞，NK细胞。IL-2可刺激能产生抗体的B细胞增殖并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，故IL-2成为调控免疫应答的重要因子，具有抗病毒，抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒，细菌，原虫等感染的免疫应答，清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可以增进抗体和白介素-2的分泌，可刺激产生IFN-γ和TNF-α，β；促进Th的增殖和激活；活化中性粒细胞；刺激NK和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)增殖。目前，IL-2已被应用于治疗肿瘤，免疫缺陷和感染性疾病，并取得了显著的效果。
目前市售的lL-2主要以重组人白介素-2为主，以基因工程菌为基础，利用生物发酵法配合大规模的分离纯化技术，最终得到高纯度的重组人白介素-2蛋白质。由于重组蛋白质主要是经过发酵表达所得，发酵液中的成分往往很复杂，有活细胞、死细胞、细胞外产物、细胞内释放物、残余的底物等物质，因此要从如此复杂的环境中得到目的蛋白质，同时又要保持蛋白质的生物学活性，其分离纯化工作相对比较复杂。现有的分离纯化需要将包涵体溶解、复性，然后进行多步膜分离、层析，往往具有步骤繁杂、回收率相对较低等缺点。基因工程菌所表达的重组白介素-2通常以包涵体的形式存在，需要将其变性裂解、纯化再复性，在复性过程中二硫键易发生错配，导致白介素-2活性下降。变性裂解过程中往往需要使用变性剂，在后续工艺中如不去除，在产品进一步进行浓缩时，必然会影响产品活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性液的方法，方便易行，回收率和产品活性均较高。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法包括如下步骤：
S1、从重组白介素-2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；
S2、将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；
S3、在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；
S4、用洗脱液对吸附有重组白介素-2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，所述流出液即为重组白介素-2复性浓缩液。
作为优选，步骤S1所述提取包涵体的过程为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤。
作为优选，步骤S1所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/L PB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0。
作为优选，所述包涵体裂解的时间为5～7h。
采用大肠杆菌基因工程菌生产IL-2时，由于IL-2存在于大肠杆菌工程菌的细胞内层膜，且其疏水性很强，IL-2基因在工程菌大肠杆菌中表达时，因大肠杆菌为原核表达系统，没有翻译后加工和修饰，IL-2在细胞内积累而形成不溶性的蛋白质聚合物，即包涵体，因此IL-2通常以包含体的形式存在于大肠杆菌工程菌细胞内。包涵体的外形为球形，为0.5～1μm的折光小体，包涵体中大部分(占50％以上)是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。包涵体经过溶解复性才能得到具有生物学活性的蛋白。包涵体的相对硬度比较大，一般条件下不溶于水，在有如盐酸胍、尿素等较强的变性剂存在的条件下能够发生溶解，此时的蛋白质自身的高级结构被打开，以变性状态存在，这给IL-2的分离纯化带来了较大的困难。因此在进行分离纯化时，首先要破碎菌体，提取包涵体，然后进行复性和分离纯化。
本发明的裂解剂中SDS能够有效打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构，使多肽伸展，DTT作为还原剂可以打开包涵体蛋白质中所有二硫键，从而使包涵体充分裂解，形成多肽链。
作为优选，步骤S2所述复性处理的步骤为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05～0.06wt％。
作为优选，所述复性剂为40～60mmol/L的PB缓冲液，PH为7.0～8.0。
SDS既是包涵体的裂解剂(即蛋白质的变性剂)也是IL-2的助溶剂，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷差异，从而增加了IL-2的溶解性。
本发明通过在复性处理过程中，先添加SDS对包涵体裂解液进行稀释到特定浓度(不超过4mg/ml)，从而在进一步添加复性剂时，将包涵体裂解液中的蛋白浓度和SDS浓度同时控制在特定范围内，以保证复性过程中IL-2不会聚合；如复性处理后包涵体裂解液中的蛋白浓度高于0.2mg/ml范围内，或SDS浓度低于0.05wt％时，均会导致IL-2复性过程中易聚合。
作为优选，步骤S3所述疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有疏水基团，所述疏水基团为苯基基团。
本发明采用键合有苯基基团的硅胶基质色谱填料对重组白介素-2进行吸附，苯基基团疏水作用强，对重组白介素-2具有优异的吸附性能。
作为优选，所述疏水高效液相色谱填料的颗粒度为16～25μm
本发明通过控制填料的颗粒度，使得填料在悬浮吸附复性液中lL-2后，能够快速有效自然沉降，无需等待时间过久，即可进行下一步操作，倾倒出上清液，进行洗脱。
作为优选，步骤S4所述洗脱包括采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：8～12v％乙醇、1.8～2.2mo1/L脲素、0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：30～50％乙醇，0.07～0.13％三氟乙酸(TFA)。
本发明采用两次洗脱的方式对吸附后有白介素-2的填料进行洗脱，其中第一次洗脱的洗脱液Ⅰ中添加有脲素，并匹配较低含量的乙醇，其目的是减弱SDS与填料的吸附作用，从而洗去吸附在填料上的SDS，并保留白介素-2，第一次洗脱的流出液经Lowry法检测，未检出蛋白含量，从而避免了残留在填料表面的SDS增加白介素-2在填料的保留强度，导致白介素-2的解离效果下降，进而降低白介素-2的回收率，同时去除了白介素-2中的SDS，避免了过高SDS浓度(超过0.1％)会影响白介素-2活性的稳定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：。
(1)本发明整个吸附-洗脱流程快速并操作简单，浓缩速度快，效率高，成本低；
(2)本发明通过两步洗脱程序可以去除不被填料吸附的大分子核酸等物质去除，从而大幅提高最终产品纯度；
(3)本发明通过在第一次洗脱程序中添加尿素，有效去除了影响下步分离的包涵体裂解剂和白介素-2助溶剂SDS，从而保证了最终产品回收率；
(4)本发明通过两步处理的复性方法，有效使变形裂解的白介素-2得到复性；
(5)本发明的方法制得的浓缩重组白介素-2的回收率可达90％以上，最高可达95％，比活与复性夜相比不受影响，活性回收率高。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例中游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法具有如下步骤：
(1)提取包涵体：对大肠杆菌基因工程菌生产的重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用50mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；
(2)包涵体裂解：在洗涤好的包涵体中加入裂解剂，裂解处理6h，获得包涵体裂解液；裂解剂的组分为：1.0wt％SDS、10mmol/L DTT、50mmol/L PB缓冲液，PB缓冲液的PH为7.5；
(3)复性处理：先采用1.0wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过3mg/ml，然后加入50mmol/L、PH为7.5的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到复性液；
(4)吸附处理：在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有苯基基团，疏水高效液相色谱填料的颗粒度为20μm；
(5)洗脱处理：采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为白介素-2浓缩液，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：10v％乙醇、2mo1/L脲素、0.1v％TFA，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：40％乙醇，0.1％TFA。
实施例2
本实施例中游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法具有如下步骤：
(1)提取包涵体：对大肠杆菌基因工程菌生产的重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；
(2)包涵体裂解：在洗涤好的包涵体中加入裂解剂，裂解处理5h，获得包涵体裂解液；裂解剂的组分为：1.2wt％SDS、13mmol/L DTT、60mmol/L PB缓冲液，PB缓冲液的PH为8.0；
(3)复性处理：先采用1.2wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度4mg/ml，然后加入40mmol/L、PH为8.0的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.19mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到复性液；
(4)吸附处理：在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有苯基基团，疏水高效液相色谱填料的颗粒度25μm；
(5)洗脱处理：采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为白介素-2浓缩液，洗脱液Ⅰ包括以下组分：8v％乙醇、1.5mo1/L脲素、0.07v％TFA，洗脱液Ⅱ包括以下组分：30v％乙醇，0.07v％TFA。
实施例3
本实施例中游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法具有如下步骤：
(1)提取包涵体：对大肠杆菌基因工程菌生产的重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用45mmol/L、PH8.5的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；
(2)包涵体裂解：在洗涤好的包涵体中加入裂解剂，裂解处理6h，获得包涵体裂解液；裂解剂的组分为：1.1wt％SDS、12mmol/L DTT、55mmol/L PB缓冲液，PB缓冲液的PH为8.0；
(3)复性处理：先采用1.1wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度3mg/ml，然后加入55mmol/L、PH为8.0的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.18mg/ml，且SDS浓度至0.06wt％，得到复性液；
(4)吸附处理：在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有苯基基团，疏水高效液相色谱填料的颗粒度为23μm；
(5)洗脱处理：采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为白介素-2浓缩液，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：9v％乙醇、2.2mo1/L脲素、0.11v％TFA，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：43v％乙醇，0.11v％TFA。
实施例4
本实施例中游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法具有如下步骤：
(1)提取包涵体：对大肠杆菌基因工程菌生产的重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用60mmol/L、PH9.0的PBS缓冲液进行洗涤，获得包涵体；
(2)包涵体裂解：在洗涤好的包涵体中加入裂解剂，裂解处理7h，获得包涵体裂解液；裂解剂的组分为：0.8wt％SDS、8mmol/LDTT、40mmol/L PB缓冲液，PB缓冲液的PH为7.5；
(3)复性处理：先采用0.8wt％SDS将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度2mg/ml，然后加入60mmol/L、PH为7.5的PB缓冲液，搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.15mg/ml，且SDS浓度至0.05wt％，得到复性液；
(4)吸附处理：在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有苯基基团，疏水高效液相色谱填料的颗粒度为20μm；
(5)洗脱处理：采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，即为白介素-2浓缩液，所述洗脱液Ⅰ包括以下组分：12v％乙醇、2.5mo1/L脲素、0.13v％TFA，所述洗脱液Ⅱ包括以下组分：50v％乙醇，0.13v％TFA。
对比例1
采用超滤浓缩的方法对复性液进行浓缩，仪器采用Millipore公司的Lab ScableTFF超滤系统，滤膜采用截留相对分子质量为5000的滤膜，浓缩至蛋白浓度为6mg/ml。
对比例2
采用键合有丁基基团的硅胶填料进行吸附处理，填料使用量较实施例1增加50％，其他与实施例1相同。
对比例3
复性处理时不先加SDS稀释，直接加入复性剂进行处理，其他与实施例1相同。
对比例4
第一次洗脱不添加脲素，其他与实施例1相同。
对比例5
吸附时在复性液中添加脲素至脲素的含量为2mo1/L，第一次洗脱不添加脲素，其他与实施例1相同。
将本发明实施例1～4、对比例1～5中制得的白介素-2浓缩液的特征进行比较，比较结果如表1所示。其中比活采用CTLL-2依赖细胞株/MTT比色法进行测定，蛋白含量采用Lowry微量法进行测定，蛋白回收率＝洗脱收集的流出液的总蛋白含量/复性液中总蛋白含量×100％，洗脱液中白介素-2纯度的测定采用SDS-PAGE电泳法进行。
表1：实施例1～4、对比例1～5中浓缩液特征的比较
由对比例1和实施例1比较可知，本发明的浓缩方法与超滤浓缩的方法相比，白介素-2的浓缩速度快，成本低，活性回收率高。
由对比例2和实施例1比较可知采用其它疏水基团对白介素-2进行吸附，在填料量增加50％的情况下，才能将与实施例1相同的复性液蛋白量吸附完全，使白介素-2的回收率不至明显降低，明显增加了成本，表明本发明使用的键合苯基基团的硅胶填料对白介素-2有明显优异的吸附性能。
由对比例3和实施例1比较可知，对比例3较实施例1的回收率和活性均有降低，这是由于未添加助溶剂SDS，白介素-2在复性过程中容易聚合，导致回收率和活性的丧失。
由对比例4和实例l的比较可知，第一次洗脱不添加脲素，白介素-2浓缩液的回收率有明显下降，这是因为残留在填料表面的SDS增加了白介素-2在填料的保留强度，在不增加洗脱液Ⅱ中溶剂浓度的情况下，解离效果会下降，从而降低白介素-2的回收率。
由对比例4、对比例5和实施例l比较可知，在复性液中添加脲素最终白介素-2浓缩液的回收率对比实施例1有所下降，但比完全不添加脲素进行第一次洗脱的对比例4，回收率有所提高，说明在复性液中添加脲素，能够减弱部分SDS与填料的吸附，但无法较好避免SDS与填料的吸附，在后续仅用洗脱液Ⅱ进行洗脱的情况下残留在填料表面的这部分SDS增加了白介素-2在填料的保留强度，使白介素-2的解离效果下降。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法包括如下步骤：
S1、从重组白介素-2发酵液中提取包涵体，将包涵体裂解，获得包涵体裂解液；
S2、将包涵体裂解液进行复性处理，得到复性液；
S3、在复性液中加入疏水高效液相色谱填料进行搅拌游离吸附，待填料沉降后去掉上层液，收集吸附有重组白介素-2的色谱填料；
S4、用洗脱液对吸附有重组白介素-2的色谱填料进行洗脱，并收集流岀液，所述流出液即为重组白介素-2浓缩液；
步骤S1所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8~1.2wt％十二烷基硫酸钠（SDS）、8~13mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、40~60mmol/L PB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0~8.0；
步骤S4所述洗脱包括采用洗脱液Ⅰ进行第一次洗脱，然后采用洗脱液Ⅱ进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的流出液，所述洗脱液Ⅰ由以下组分组成：8~12v%乙醇、1.8~2.2mo1/L脲素、0.07~0.13v%三氟乙酸（TFA），所述洗脱液Ⅱ由以下组分组成：30~50%乙醇，0.07~0.13%三氟乙酸（TFA）；
步骤S2所述复性处理的步骤为：先采用0.8~1.2wt％十二烷基硫酸钠（SDS）将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1~0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05~0.06wt％；
步骤S3所述疏水高效液相色谱填料为硅胶基质，其表面键合有疏水基团，所述疏水基团为苯基基团。
2.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，步骤S1所述提取包涵体的过程为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40~60mmol/L、PH8.5~9.0的PBS缓冲液进行洗涤。
3.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，所述复性剂为40~60mmol/L的PB缓冲液，pH为7.0~8.0。
4.根据权利要求1所述游离吸附浓缩重组白介素-2复性剂的方法，其特征在于，所述疏水高效液相色谱填料的颗粒度为16~25μm。
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