CN1799625B

CN1799625B - 制备用于药用的白介素

Info

Publication number: CN1799625B
Application number: CN 200510113657
Authority: CN
Inventors: 马宁德·奥拉
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2025-10-13
Also published as: CN1799625A

Abstract

一种制备用于药用的阿德斯白细胞素的方法，其包括以下步骤：(a)向含有阿德斯白细胞素的组合物中加入SDS，以获得高SDS终浓度；(b)降低SDS水平以得到低SDS浓度的组合物。加入然后部分除去SDS得到了适于药用的阿德斯白细胞素和SDS的微聚集体。

Description

制备用于药用的白介素

将本文中引用的所有在线信息和文件完整地并入本文作为参考。

技术领域

本发明属于制备和配制用于药用的白介素-2的领域。

背景技术

白介素-2(IL-2)是一种细胞因子，其促进体内T细胞的生长和分化，还增强CD8+T细胞和天然杀伤细胞的细胞毒性。对患者给药以剂量依赖型方式产生多种免疫学效应，包括细胞免疫活化，伴随着深度的淋巴细胞增多、嗜曙红细胞增多、血小板减少，和产生细胞因子，包括TNF、IL-1和γ干扰素。IL-2的更多细节可以在其“GeneCard”中发现，登录号为GC04M123831。

在一些国家中IL-2已经被批准用于人类药用。所推荐的国际非产权的名称为ALDESLEUKIN(阿德斯白细胞素)，并且制剂由Chiron Corporation以商标名PROLEUKIN^TM上市。美国FDA已经批准PROLEUKIN^TM IL-2用于治疗患有转移性肾细胞癌(转移性RCC)或者转移性黑素瘤的治疗。

如在其美国处方信息中陈述的，PROLEUKIN^TM作为生物活性的、非共价结合的微聚集体存在，该微聚集体的平均大小为27个重组IL-2分子。PROLEUKIN^TM以单用小瓶中的无菌、白色到灰白色的冻干饼提供，其用于静脉内(IV)施用。当用1.2ml无菌注射用水重构时，每毫升含有1800万IU(1.1mg)PROLEUKIN^TM IL-2，50mg甘露糖醇，和0.18mg十二烷基磺酸钠(SDS)，用约0.17mg磷酸二氢钠和0.89mg磷酸氢二钠缓冲到pH7.5。然而，这些成分的简单混合不能得到与PROLEUKIN^TM产物中发现的IL-2的相同的微聚集体形式。

PROLEUKIN^TM产物中IL-2的微聚集体对于体内功效是重要的。非聚集(游离单体的)IL-2的药物动力学和药效学性质与小颗粒聚集的IL-2的那些性质极其不同，这两种形式具有不同的治疗指数：太小的聚集体被身体清除太快；太大的聚集体可能不溶和活性较小。因此小颗粒聚集是PROLEUKIN^TM产品的关键特征。

生物活性PROLEUKIN^TM微聚集体形成的方法以前未向公众提供，尽管现有技术中已经描述了制备药物IL-2制剂的许多方法[例如，见参考文献1-30]。参考文献9具体目的是公开PROLEUKIN^TM的生产方法，包括表达、回收、纯化、制剂和完工的细节，但是该公开在一些方面是不完全的。

知道怎样实现与PROLEUKIN^TM产品中发现的IL-2具有相同的活性小颗粒聚集形式将对于想要制备与PROLEUKIN^TM相似的IL-2产品的任何人都是有用的。因此本发明的目的是提供如在PROLEUKIN^TM产品中发现的微聚集体形式的IL-2，和提供这些小颗粒聚集的IL-2的制备方法。本发明的另一目的是提供用以补充参考文献9的公开内容的制备IL-2的方法。

发明内容

PROLEUKIN^TM产物制备的方法包括下面的关键步骤：(i)从细胞培养物纯化表达的IL-2；(ii)用SDS去污剂溶解IL-2；(iii)将IL-2还原成单体形式；(iv)纯化、氧化和沉淀IL-2；(v)用高水平SDS去污剂再溶解IL-2；(vi)纯化以除去寡聚体IL-2；(vii)渗滤以降低SDS去污剂水平(而不完全除去)到最佳范围以得到适宜的小颗粒聚集的IL-2制备物；(viii)用甘露糖醇和缓冲剂配制；和(ix)冻干和包装。

该方法的步骤(i)、(iv)、(vi)、(viii)和(ix)在参考文献9中公开，但是步骤(ii)、(iii)、(v)和(vii)没有公开，尽管公开了在步骤(vi)之前用未指明的去污剂再溶解IL-2。此外，参考文献9提出在步骤(vi)中纯化后将SDS加入IL-2，此时它实际上已经被除去。

在这9个步骤中，微聚集体形成的最关键的步骤是(v)和(vii)。下游步骤(viii)或者(ix)中任何一个都对小颗粒聚集没有任何重要影响，步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vi)中的纯化方法也几乎没有影响。然而，一旦SDS加入步骤(v)，IL-2就被溶解，步骤(vii)中SDS水平的随后降低导致形成最终PROLEUKIN^TM产品中存在的微聚集体。必须加入足够SDS以将沉淀的IL-2再溶解成基本上单体的可溶形式，然后必须将SDS除去(但不是完全除去)以得到所希望的微聚集体。

因此本发明提供了制备药用的白介素-2的方法，该方法包括下列步骤：(a)向含有白介素-2的组合物加入十二烷基硫酸钠(SDS)，以得到SDS终浓度为每mg IL-2至少500μg SDS；(b)从组合物除去一些但不是所有SDS以得到含有每mg白介素-295-250μg SDS的组合物。该加入SDS然后部分除去的方法为IL-2和SDS分子密切相互作用以形成如PROLEUKIN^TM产品中发现的IL-2和SDS的微聚集体提供了最佳条件并且，对于给定IL-2/SDS比例，通过SDS和IL-2的简单混合产生不同的产物。

SDS所加入的白介素-2通常具有分子内二硫键。

从该方法产生的水性组合物可以冻干后分发，可以用水性载体最终重构该冻干物质后施用于患者。重构后，该组合物优选具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)和/或含有平均流体动力学直径为8nm到20nm的SDS/IL-2聚集体。因此，本发明可以还包括冻干该组合物，然后任选地，用水性介质重构该组合物的步骤。该组合物还可以在冻干步骤之前具有这些τ和/或流体力学特性。

本发明提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，其中通过本发明的方法可以得到该聚集体。这些组合物适于如PROLEUKIN^TM产品所示的药用。

本发明还提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，其中该组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)。这些组合物适于如PROLEUKIN^TM产品所示的药用。

本发明还提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，其中这些聚集体具有8nm到20nm的平均流体动力学直径。这些组合物适合于药用，如PROLEUKIN^TM产品所示。

本发明还提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，其中每个聚集体的白介素-2的平均数为10到50。这些组合物适于如PROLEUKIN^TM产品所示的药用。

本发明提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物，其中该组合物可以重构得到水性溶液，该溶液中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体形式存在，该水性溶液具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)。此外，或者而且，考察τ，该聚集体具有8nm到20nm的平均流体动力学直径。这些组合物适于药用，如PROLEUKIN^TM产品所示。

本发明提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物的方法，其中：(i)该冻干的组合物可以重构得到水性组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，该水性组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)；和(ii)该方法包括步骤(a)向含有白介素-2的组合物加入十二烷基硫酸钠，其中加入足够十二烷基硫酸钠以得到单体的、溶解的白介素-2，(b)将十二烷基硫酸钠的浓度降低到白介素-2与十二烷基硫酸钠形成聚集体的水平，和(c)冻干该组合物。

本发明提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物的方法，其中：(i)该冻干的组合物可以重构得到水性组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以具有8nm到20nm的平均流体动力学直径的聚集体的形式存在；和(ii)该方法包括步骤(a)向含有白介素-2的组合物加入十二烷基硫酸钠，其中加入足够的十二烷基硫酸钠以得到单体的、溶解的白介素-2，(b)将十二烷基硫酸钠的浓度降低到白介素-2与十二烷基硫酸钠形成聚集体的水平，和(c)冻干该组合物。

本发明还提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物的方法，其中：(i)该冻干的组合物可以重构得到水性组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，并且该水性组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)；和(ii)该方法包括步骤(a)将十二烷基硫酸钠与白介素-2混合得到混合物，其中十二烷基硫酸钠以第一种浓度存在，(b)从该混合物除去十二烷基硫酸钠使其浓度减小到第二种浓度，和(c)冻干该组合物，由此提供所述组合物。所述第二种浓度低于第一种浓度。第一种浓度将通常为至少500μg SDS/mg混合物中IL-2，第二种浓度将为95-250μg SDS/mg IL-2。

本发明还提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物的方法，其中：(i)该冻干的组合物可以重构得到水性组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以具有8nm到20nm的平均流体动力学直径的聚集体的形式存在；和(ii)该方法包括步骤(a)将十二烷基硫酸钠与白介素-2混合得到混合物，其中十二烷基硫酸钠以第一种浓度存在，(b)从该混合物除去十二烷基硫酸钠使其浓度减小到第二种浓度，和(c)冻干该组合物，由此提供所述组合物。所述第二种浓度低于第一种浓度。第一种浓度将通常为至少500μg SDS/mg混合物中IL-2，第二种浓度将通常为95-250μg SDS/mg IL-2。

本发明还提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠(SDS)的冻干组合物的方法，其中：(i)该冻干的组合物可以重构得到水性组合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体的形式存在，该水性组合物的比浊度(τ)小于1.1cm²/g，其中SDS的浓度为“x”μg SDS/mg IL-2，其中x为95到250；和(ii)该方法包括以下步骤：(a)将SDS与白介素-2混合得到混合物，其中SDS的浓度至少为“x”的4倍，(b)从该混合物除去一些但不是所有SDS，以得到其中SDS浓度为“x”的组合物，和(c)冻干该组合物。所述浓度优选至少为“x”的5倍，更优选至少为8倍、10倍、15倍、或甚至20倍。

本发明还提供了制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠(SDS)的冻干组合物的方法，其中：(i)组合物中的白介素-2和SDS以聚集体的形式存在，其中该聚集体具有8nm到20nm的平均流体动力学直径，其中SDS的浓度为“x”μgSDS/mg IL-2，其中x为95到250；和(ii)该方法包括以下步骤：(a)将SDS与白介素-2混合得到混合物，其中SDS的浓度至少为“x”的4倍，(b)从该混合物除去一些但不是所有SDS，以得到其中SDS浓度为“x”的组合物，和(c)冻干该组合物。所述浓度优选至少为“x”的5倍，更优选至少为8倍、10倍、15倍、或甚至20倍。

当本发明的方法包括将SDS浓度减小到95-250μgSDS/mgIL-2时，可以在某些实施方案中将浓度减小到95μg/mg(例如50到95μg/mg)以下，然后将该浓度再次增加到95-250μg/mg范围。可以在重构冻干物质期间方便地进行该增加到95-250μg/mg范围，例如，该方法可以包括除去SDS到<95μg/mg，然后冻干，然后用水性SDS溶液重构使得SDS浓度在95-250μg/mg范围内。

去污剂

本发明的方法包括使用十二烷基硫酸钠(SDS)，其也称作月桂基硫酸钠。该阴离子去污剂的分子式为CH₃(CH₂)₁₁OSO₃ ^-Na⁺，其CAS号为151-21-3，EC号为205-788-1。

SDS是用于溶解蛋白质的标准试剂，如果在SDS加入前IL-2以沉淀形式存在，那么SDS用于本发明的方法的步骤(a)中的该目的。以含有沉淀的IL-2的组合物开始，将加入足够SDS以确保基本上所有沉淀的IL-2都可溶(除了沉淀中任何共价连接的IL-2多聚体之外，即使存在SDS，所述多聚体也将主要保持沉淀)。当SDS以高于约500μg/mg存在时，IL-2在1mg/ml的浓度下基本上不存在微聚集体，因此通常加入SDS以得到SDS终浓度为至少500μg SDS/mg IL-2(例如，至少500，至少600，至少700，至少800，至少900，至少1000，至少1200，至少1400，至少1600，至少1800，至少2000μg SDS/mg IL-2)。优选使用约910μgSDS/mg IL-2。

样品中SDS的起始浓度将通常是已知的，因为SDS不天然存在于细胞中，并且已经监视细胞来源的物质的处理期间加入的SDS的量。然而，对于SDS的浓度未知的情况，可以使用常规测定技术，对所述物质作为一个整体或者对该物质的样品实施SDS浓度的测量。例如：参考文献31公开用于分离和测定表面活性剂(包括SDS)的毛细管电泳方法；参考文献32公开使用电极-较少压电石英晶体测定0.2-100μM范围内十二烷基硫酸盐的单滴方法；参考文献33比较方便地确定水性溶液中SDS的三种方法，即使用离子-选择性电极或者浊度通过溴化十六烷基三甲基铵滴定以测量终点，或者在溴化十四烷基三甲基铵的存在下测量浊度；参考文献34公开了测定SDS的方法，该方法是基于SDS与荧光染料，如溴化乙锭的的相互作用。测量SDS水平的优选测定方法是基于与吖啶黄反应的分光光度测定法，如在35的实施例和参考文献中更详细描述的。

作为测量相对于IL-2质量的SDS含量的备选方法，可以相对于IL-2活性测量SDS含量。基于1.1mg IL-2中18x10⁶IU IL-2活性(如在PROLEUKIN^TM中发现)，100μg SDS/mg IL-2相当于6.111μgSDS/MIUIL-2。

本发明的方法和产物中除了使用SDS中外，还可以使用月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠(SLS)或者月桂基硫酸铵(ALS)。还可以使用SLS、ALS和/或SDS的混合物。然而，在本发明的优选实施方案中，使用SDS。

除去去污剂

在SDS加入IL-2组合物后，本发明的方法包括除去一些(但不是所有)SDS，从而，提供IL-2和SDS的微聚集体形式。

通过多种技术可以除去SDS。离子交换层析可以除去带负电荷的SDS，还可以使用凝胶过滤。然而，更优选地，通过渗滤除去SDS。在渗滤中，溶剂和/或微溶质(例如，盐)可以通过不同的溶剂和/或微溶质代替。通常，除去和代替可以以相同速度发生，溶液的体积由此可以基本上保持恒定，从而总体效果是将最初的溶剂/微溶质用新的溶剂/微溶质代替。

针对无SDS的缓冲液的渗滤是除去SDS的优选方法，例如，针对10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)除去SDS。

SDS去除持续到组合物含有95μg到250μg SDS/mg白介素-2，例如，118-210μg/mg、135-180μg/mg、或约160μg/mg。在该范围内IL-2的药物动力学性质基本上稳定，SDS的水平不会过高而产生相关毒性。然而，随着SDS浓度降低到约95μg/mg以下，微聚集体的大小显著升高(图1)，从95μg/mg时平均～60个IL-2分子/个微聚集体到75μg/mg时平均～180。

加入SDS然后不完全除去SDS导致在PROLEUKIN^TM产品中发现的生物活性IL-2微聚集体。以PROLEUKIN^TM产品中发现的浓度简单混合SDS和IL-2不产生微聚集体。参考文献36描述了这样的研究，其中像PROLEUKIN^TM产品，将SDS加入含有1.1mg IL-2的IL-2制剂。发现在去污剂浓度为0.02％-0.05％时SDS沉淀IL-2。相比之下，在根据本发明的SDS除去期间，在这些SDS浓度下IL-2不沉淀—甚至当SDS从1200μg/mg(基于1.1mg IL-2约0.1％SDS)降低到70μg(<0.01％)，也没有见到IL-2沉淀。

在SDS除去期间，可以如上述确定SDS浓度。当该除去方法经标准化并且是可以再现时，在SDS除去期间监视SDS水平可能不是必要的，因为该方法每次实施时，通常可以预期相同的结果(尽管可以实施最终证实性测量)。然而，当除去方法是可变的，或者由于其他原因需要定时监视时，可以实施SDS水平的定时或者连续测量直到达到所希望的最终浓度。

其他处理步骤

如上面提到的，形成IL-2/SDS微聚集体的关键处理步骤是(a)加入然后(b)随后除去SDS。尽管这两个步骤得到适于用作药物中活性成分形式的IL-2，但是仅这两个步骤不适于制备最终药物组合物，并且需要其他步骤。这些步骤可以在步骤(a)和(b)之前，步骤(a)和(b)之后，和/或步骤(a)和(b)之间发生。

制备药用的IL-2的方法中第一步将通常是表达蛋白质。这将通常包括使用含有编码目标IL-2基因的宿主细胞，如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞或者哺乳动物宿主细胞。然而，作为重组途径的备选方案，还可以活化或者上调宿主细胞基因组中内源IL-2基因的表达(例如，通过启动子活化)，或者从天然来源(例如，从血液)纯化激素。

在重组大肠杆菌中表达IL-2是得到IL-2的优选途径，其中IL-2形成内含体。适宜的大肠杆菌根据布达佩斯条约在1984年保藏在ATCC，保藏号为39452和39626。

从多种细胞型培养、收获、破坏，或者提取IL-2的方法是本领域中公知的，例如，见参考文献19-30和37-41。

表达后，或者当以表达的物质开始时，将使用IL-2纯化的最初步骤。如果IL-2存在于细胞中，那么纯化步骤将包括细胞破坏(例如，通过渗透休克、匀浆、超声处理，等等)以便释放所述蛋白质；如果IL-2已经存在于溶液中(例如，其在表达后分泌)，那么不需要破坏。还可以实施活细胞的失活，以及离心。在最初纯化步骤结束时，IL-2将通常为沉淀的形式，尤其如果从内含体纯化，但是将从细胞碎片分离以得到富含IL-2的浆料用于随后处理。

制备纯化的IL-2后，或者当以沉淀的物质开始时，可以溶解IL-2以便将其与其他宿主蛋白质等分离。通过加入去污剂如SDS，优选终浓度为4到4.5％，可以实现溶解。这可以方便地通过加入5％SDS溶液实现。

溶解后，或者以溶解的物质开始时，可以还原IL-2以便断裂该蛋白质中的任何二硫键，尤其断裂任何分子间二硫键。因此通过分子间二硫键形成的任何共价IL-2聚集体被转化成单体形式。用于还原二硫键的常用还原剂包括β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)。将通常保持去污剂的存在以便确保IL-2溶解度。

还原后，或者用起始物质开始时，然后可以将IL-2再氧化以得到具有分子内二硫键的单体IL-2。

再氧化后，或者用再氧化的物质开始时，然后可以进一步纯化IL-2以便除去试剂，如氧化剂，以除去内毒素，除去宿主细胞DNA和/或蛋白质，除去IL-2同工型或者构象异构体(例如，IL-2的氧化形式)，等等。使用反相HPLC可以方便地实现该纯化。

RP-HPLC纯化后，或者用可溶的RP-HPLC纯化的物质开始时，例如，通过加入0.8N氢氧化钠可以沉淀IL-2。除了沉淀IL-2，这还允许该蛋白质与RP-HPLC期间所用的任何有机溶剂分离。通过离心可以方便地收集沉淀的物质。

表达、纯化、溶解、还原、氧化、RP-HPLC和沉淀(如上文描述)后所得物质适于根据本发明的再溶解和渗滤，尽管通过其他纯化途径制备的IL-2也可以使用。然而，通常，SDS加入本发明方法的步骤(a)之前，IL-2将为沉淀的形式。溶解和渗滤的IL-2在溶解前将具有分子内二硫键。

如上文提到，即使存在SDS，共价连接的IL-2多聚体也保持沉淀。由于这些多聚体比SDS-溶解的IL-2蛋白质大得多(因为它们是不可解离的)，所以它们可以在步骤(a)和(b)之间(即，加入SDS后但是渗滤前)通过凝胶过滤方便地除去。应该在整个凝胶过滤期间保持SDS的存在以便防止IL-2沉淀。

渗滤除去SDS和形成微聚集体后，可以将IL-2溶液进行下面步骤之一或多个：稀释得到所希望的最终剂量；灭菌，通常通过无菌过滤，例如，通过0.22μm滤器；药物配制(见下文)；冻干；包装；等等。

微聚集体

通过本发明的方法实施的SDS溶解和渗滤的结果是形成SDS和IL-2的生物活性微聚集体，如PROLEUKIN^TM产品中所看到的。

还没有确定SDS/IL-2微聚集体的精确分子结构，但是认为它们是微团或者类似微团的结构。在～160μg/mg的SDS浓度下，常见的微团含有～30个IL-2分子和～150个SDS分子。微聚集体中SDS和IL-2非共价相互作用，IL-2的疏水尾部(残基121-133)可以与SDS的烷基主链相互作用以形成微团。一些SDS可以在溶液中保持游离。

通过光散射可以检测微聚集体，该技术还可以测量这些微聚集体的大小(见下文)。SDS浓度和平均微聚集体大小之间的关系(如通过常规光散射测量)已经按经验评估，如图1中所示。

随着SDS除去的进行，达到一种浓度，在该浓度下微聚集体的大小开始指数地增加(见图1)。根据本发明，除去SDS直到其浓度为95μg到250μg/mg IL-2。在该范围内，比浊度(τ)为～0.05到～1.00cm²/g，其暗示着平均小于50个IL-2分子/个微聚集体。在160μg SDS/mg IL-2时，比浊度(τ)为约0.48(约27个IL-2分子)。

技术人员将理解根据本发明的SDS/IL-2的给定组合物将很少(如果有的话)含有单一种类的微聚集体。相反，光散射测量揭示微聚集体具有分布内的多种大小，并且测量可以揭示平均大小。因此，当组合物含有所陈述的平均大小的微聚集体时，将通常有一些更小的微聚集体和一些更大的微聚集体。

本发明的优选的组合物包括SDS/IL-2微聚集体，从而该组合物的比浊度(τ)为0.3到0.6，例如，0.4到0.5，或者约0.45。这些组合物尤其应用于冻干后重构的组合物，冻干和重构前τ的值可以更低(图14)。

本发明的优选组合物包括流体动力学直径为11nm到13nm的SDS/IL-2微聚集体。

本发明的优选微聚集体含有10到50个IL-2分子，例如，20到35个，优选约27个。

在优选组合物中，基本上所有IL-2以微聚集体的形式存在。组合物可以基本上没有单体IL-2。

比浊度(τ)

因为本发明的SDS/IL-2微聚集体受到优势条件的影响，所以诸如大小排阻层析和分析性离心的技术不能用于评估它们的大小。而经典(或者静态)光散射(CLS)可以用于通过测量它们的浊度检测和分析微聚集体。可以使用动态光散射(DLS)。可以在特定仪器上测量，或者在荧光计上实施测量，荧光计的激发和发射单色仪设定在相同波长(例如，从氙灯467nm，或者从氩灯488nm，两者都远离分析物吸收的波长)和/或使用适宜的滤光器(例如，黄色滤光器)，从而荧光计作为90℃LS光度计。

当测量光散射时，标准光谱参数为“瑞利比”(R_Θ)。当在相对于入射光90°(即当Θ＝90°时)测量散射光时，已知瑞利比为R₉₀[例如，见参考文献42]，90°散射用作浊度测量。

可以相对于光学级甲苯归一化浊度测量值(90°时的散射强度)，即，标准甲苯样品的浊度测量值除以甲苯的R₉₀。通过以这种方法归一化，可以确定散射光强度的绝对值。

对于本发明的IL-2微聚集体，可以在467nm或488nm，25℃下测量浊度。评估浊度前，可以离心或过滤组合物以除去大颗粒(例如，沉淀的蛋白质)，否则其将扭曲数据。离心时，本发明的IL-2组合物优选在上清液中保留至少97％(例如，≥98％，≥99％或更多)总IL-2。

可以如下将SDS/IL2混合物的浊度测量值转化成绝对比浊度(τ)值：

τ = \frac{T_{t} - 0.98 T_{i}}{T_{t}} \times \frac{3.2 \times 10^{- 2}}{C}

其中T_i为IL-2组合物的浊度强度，

T_t为甲苯对照的浊度强度，

C为IL-2组合物中IL-2的浓度。

当T_i和T_t以cm^-1测量并且C以g/ml(即，g/cm³)测量时，τ的单位为cm²/g。这是评估本发明的IL-2组合物的浊度的优选测量值。

本发明的组合物可以具有小于1.1cm²/g，但是优选大于0.1cm²/g的比浊度(τ)。优选的组合物具有小于0.7cm²/g的τ。本发明组合物的τ优选为0.3-0.6cm²/g。

动态光散射

如参考文献43中，尤其第10章中描述的，可以用动态光散射(DLS)确定溶液中颗粒的流体动力学直径(或半径)。本发明的SDS/IL-2聚集体可以通过动态光散射(DLS)检测。使用DLS，优选的聚集体的平均流体动力学直径为8nm到20nm，优选10nm到15nm，更优选11nm到13nm，最优选约12nm。如图17中所示，聚集体将具有在该平均值周围分布的直径。

实践中，通过DLS可以检测到某些更大的颗粒(例如，图17中的54nm峰值)，但是上面所指的流体动力学直径为主要DLS峰的流体动力学直径，其将通常代表DLS光谱中按数目计至少90％(例如，至少95％，至少97％，至少99％，至少99.5％或以上)。从而，通过DLS检测的颗粒的按数目即至少90％将具有所指定的数目平均。

缓慢改变的组分，如灰尘颗粒或者混合现象的存在可以使DLS数据的解释变得复杂。为了避免这些复杂，用于DLS测量的本发明的IL-2组合物优选没有直径大于约1μm的颗粒(例如，没有灰尘)，并且这可以通过使用适宜的滤器，例如，0.22μm滤器来实现。还应该在DLS测量前充分混合该组合物。如果DLS测量揭示组合物中缓慢改变的组分，结果将被被拒绝并且应该对新样品实施测量。

白介素-2

IL-2是熟知的蛋白质，本发明的方法和产物可以使用IL-2的任何适宜的形式。IL-2将通常为人IL-2，或者将是在人体中保持生物活性的IL-2衍生物。

IL-2在人体中天然翻译为前体蛋白质(例如，GenBank中登录号为NP_000577.2的153-mer)。前体经切割(例如，NP_000577.2中Ser-20后)得到具有N-末端丙氨酸的成熟产物(SEQ ID NO：4)。

当在大肠杆菌中表达时，通常将天然信号肽用单一N-末端甲硫氨酸残基替换(例如，SEQ ID NOS：3和4)。当表达时，该甲硫氨酸被无干预地切割，留下丙氨酸的天然人N-末端残基(例如，SEQ ID NO：3转化成SEQID NO：1)。

PROLEUKIN^TM中IL-2缺少天然Ala-1残基。通常N-末端丙氨酸的缺乏指PROLEUKIN^TM中IL-2通常称作IL-2的“去丙氨酰-1”形式。IL-2的去丙氨酰-1形式优选用于本发明。

PROLEUKIN^TM中IL-2也经设计具有两个内部半胱氨酸残基，而不是天然的三个残基。这将半胱氨酸残基的可能配对数(从而分子内二硫键)从三个减少到一个[46]，并改善了蛋白质再折叠的结果和保存稳定性。丝氨酸残基代替天然Cys-125残基[44]指PROLEUKIN^TM中IL-2正式称为IL-2的“丝氨酸-125”形式。IL-2的丝氨酸-125形式优选用于本发明。大肠杆菌中表达的人IL-2的Ser-125形式的三维晶体结构可以在结构数据库中以登录号‘3INK’得到。

可以进行IL-2氨基酸序列内的其他替换，尤其其中替换是保守的那些替换，即在侧链相关的氨基酸家族内发生的那些替换。可以将氨基酸分成四个家族：(1)酸性—天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性—赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性—丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电极性—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有时归类为芳香氨基酸家族。例如，可以合理地预测分别用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸的保守替换将不会对生物产生很大影响。技术人员基于天然变异、蛋白质活性形式的比对等等将容易确定可以耐受改变的IL-2的区域，例如，通过标准86/504可以实现所替换的蛋白质的生物活性。

关于通过残基替换、缺失或插入可以改变的IL-2蛋白质区域的指导可以在本领域中(例如，结构/功能关系和/或结合研究)中发现，如参考文献45-52等等。参考文献53公开了多种IL-2突变体，包括：Asn-26-Gln；Trp-121-Phe；Arg-120后所有残基的缺失；及其Met-1形式。参考文献44公开了具有Cys-125缺失或替换，有或者没有N-末端Ala的IL-2。参考文献54公开了残基的替换或缺失，所述残基包括2、3、4、5、6、104和125号残基。Met-104容易受到氧化，因此该残基的突变(例如，用Glu、Val、Ala等替换)可以提高稳定性[55]。参考文献56公开了在Asp-20(用His或Ile)、在Asn-88(用Arg、Gly、或Ile)、和/或在Gln-126(用Leu或Glu)处的IL-2替换，已经报导所述替换的IL-2具有更小的毒性和对高亲和力IL-2受体的选择性。参考文献57公开了替换Arg-38-Ala和Phe-42-Lys，它们为了减小毒性以在免疫治疗期间使用。参考文献58公开了天然Xaa¹-Asp-Xaa²三肽序列的突变，其中Xaa¹为Leu、Ile、Gly或Val，Xaa²为Val、Leu或Ser以便减小血管渗漏。参考文献59公开了具有与IL-的前30个残基融合的N-末端甲硫氨酸、任选具有Asp-20-Lys替换的肽，其据说保持类似IL-2的活性。

其他公知的替换包括：T7A、T7D、T7R、KSL、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K351、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L361、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M461、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P651、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I、和Q126V。

IL-2的生物活性变体将通常具有与参比IL-2多肽分子，如上面讨论的天然人IL-2的氨基酸具有至少约70％(例如，≥80％、≥90％、≥95％、≥98％、≥99％)氨基酸序列同一性。变体可以例如，相差少至1到15个氨基酸残基，少至1到10个残基，如6-10个，或少至5个，少至4、3、2或甚至仅1个氨基酸残基。

已经报导了IL-2的C-末端延伸[60]。用于本发明的IL-2优选不具有任何这种C-末端延伸。

可以使用的IL-2的其他形式包括非人序列。例如，IL-2可以来自：猕猴(Mucucu mulatto；GenBanK登录号P51498)；橄榄狒狒(Papio unubis；GenBank Q865Y1)；黑色白眉猴(Cercocebus torquatus atys；P46649)；吃蟹的猕猴(Macacafascicularis；Q29615)；普通长臂猿(Hylobates lar；ICGI2)；普通松树猴(Saimiri sciureus；Q8MKH2)；奶牛(Bos taurus；P05016或NP-851340；成熟序列由GenBank登录号NP-851340的残基24-158代表)；水牛(Bubalus bubalis；Q95KP3)；马(Equus caballus；P37997)；山羊(Caprahircus；P36835)；绵羊(Ovis aries；P19114)；猪(Sus scrofu；P26891)；赤鹿(Cervus elaphus；P51747)；狗(Canis familiaris；Q29416)；猫(Felis catus；407885)；兔(Oryctolagus cuniculus；077620)；虎鲸(Orcinus orca；097513)；北部海象(Miroungu angustirostris；062641)；家鼠(Mus musculus；NP-032392)；西部野生小鼠(Mus spretus；408867)；挪威大鼠(Rattusnorvegicus；P17108)；蒙古沙土鼠(Meriones unguiculatus；Q08081)。也可以使用这些Genbank条目中公开的任一种变体形式。这些Genbank条目通常公开前体序列，其如上面关于人序列描述的，经处理(例如通过切割前20个氨基酸)得到最终生物活性形式。

人IL-2的脱-丙氨酰-1，丝氨酸-125形式尤其优选用于本发明。IL-2的最优选形式具有图2中所示132-mer氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，如在PROLEUKIN^TM中发现的。组合物优选没有不具有N-末端Ala的IL-2。使用图4所示的核酸序列(SEQ ID NO：2)，切割所翻译的N-末端甲硫氨酸后，可以表达图2蛋白质。

PROLEUKIN^TM产物中的IL-2未被糖基化，这是由于大肠杆菌表达宿主的原因。未被糖基化的IL-2优选用于本发明。

检测组合物中IL-2的存在和其定量方法是本领域中公知。使用抗-IL-2抗体的免疫学检测(例如，ELISA)是最常用的检测方法，这些方法也可以定量使用。其他定量方法包括氨基酸分析、使用规章批准的蛋白质标准的Lowry蛋白质测定法、HPLC测定法和内在紫外吸收测量。

IL-2的标准定量测量是国际单位(IU)，其不是基于蛋白质质量而是基于生物学测定法中的活性。根据标准86/504，1IU是导致建立的IL-2依赖的细胞系[61]CTLL-2的最大增殖的50％的IL-2的量。使用平行线分析通过比较制备物与可得到的标准(例如，WHO IL-2标准安瓿，其重构后含有100IU/ml)的剂量反应曲线，或者通过计算机软件，如ALLFIT程序[62，63]可以实现其他制备物中IL-2活性的定量。实践中，当生产经标准化后，药物重量和IUs之间的转换是可能的。例如，对于PROLEUKIN^TM产品，该转换为1.1mg IL-2等于18x10⁶IU。

通过将活性除以存在的IL-2的质量可以将活性转换成比活(即，每单位质量IL-2的活性，例如，IU/mg)。本发明的优选组合物具有16到17MIU/mg的比活。

药物组合物

本发明的方法得到IL-2/SDS微聚集体，其适于人体中的药用，因此本发明提供了含有本发明的IL-2/SDS微聚集体的药物组合物。然而，不是简单地使用直接从渗滤得到的微聚集体，它们在施用于患者前通常经配制。

例如，可以稀释微聚集体以便得到标准浓度，同时保持IL-2/SDS比例。通常稀释得到IL-2浓度为约1.1mg/ml。

微聚集体(例如，稀释后)可以与稳定剂混合，尤其如果它们将被冻干时。加入糖(例如，蔗糖、海藻糖)通常在冻干期间得到稳定性，优选的稳定剂是甘露糖醇。可以加入该糖醇得到终浓度为40到50(例如，约45.5)mg/mg IL-2(对于1.1mg IL-2可以加入50mg)。也可以加入人血清白蛋白(优选重组的)作为稳定剂。还可以用糖的混合物，例如，蔗糖和甘露糖醇、海藻糖和甘露糖醇，等等。

可以向微聚集体组合物加入缓冲液，例如，Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或者优选地，磷酸盐缓冲液(例如，含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)。优选加入缓冲液得到7.2到7.8的pH，尤其约7.5的pH。

可以将含有微聚集体的组合物灭菌，优选通过过滤除菌，例如，通过0.22μm滤器。在这之前可以为使用具有更大孔的滤器过滤。

含有微聚集体的水性组合物可以直接包装到准备注射的注射器中。它们也可以包装到准备吸入的雾化器中。

含有微聚集体的水性组合物可以在分发前冻干。水性或冻干的物质可以包装到容器(例如，小瓶)中，其然后可以密封。冻干通常在小瓶中发生，冻干后密封。相当于22x10⁶IU的IL-2的冻干物质可以在单个小瓶中作为单位剂量包装，用于在约1.1ml的最终水性体积中重构，以得到约18x10⁶IU/ml。其部分量(例如，1/2、1/3、1/4、1/5、1/8)也可以作为单位剂量包装。具体地，可以使用约9x10⁶IU、约4.5x10⁶IU、和约14x10⁶IU的单位剂量。

对于冻干后重构，可以使用无菌注射用水。还可以用含有人血清白蛋白(优选重组的)的水性组合物重构冻干饼。优选重构成约1.0ml到1.2ml的水性体积(即，可以将IL-2稀释成与冻干前相同的浓度)。然后该重构的物质可以无菌稀释成更大液体体积以静脉输注到例如约50ml D5W溶液(5％右旋糖注射)。在D5W稀释期间比浊度保持基本上恒定，直到IL-2浓度降低到约0.1mg/ml以下。稀释可以在多种容器，例如，玻璃瓶、塑料(例如，聚氯乙烯)袋等中发生。应该避免将最终IL-2浓度稀释到30-70μg/ml范围之外。应该避免导致微聚集体改变的条件，例如，用抑菌注射用水或者用0.9％氯化钠注射液重构。

从而第一种优选的药物组合物为水性组合物，其pH约7.5，含有1.1mg/ml IL-2，0.18mg SDS，50mg/ml甘露糖醇和磷酸盐缓冲液，其中IL-2和SDS形成微聚集体，其中每个聚集体IL-2分子的平均数为10到50。这些组合物可以从冻干的物质重构。

第二种优选的药物组合物为将第一种优选的药物组合物稀释到D5W溶液的产物。

优选组合物不含防腐剂，不含抗生素，不含除IL-2之外的蛋白质(包括不含HSA)，即这些物质是检测不到的。

药物方法和应用

本发明提供了治疗患者的方法，其包括对所述患者施用本发明的药物组合物。患者优选为人，可以为儿童(例如，学走路的儿童或者婴儿)、青少年或者成年人，但是将通常为成年人。

本发明还提供了用作药物的本发明的SDS/IL-2微聚集体。

本发明还提供了本发明的微聚集体在制备用于治疗患者的药物中的应用。

这些应用、方法和药物优选用于治疗癌症，尤其实体瘤，如肾细胞癌或黑素瘤，该癌症可以是转移性的。所述应用、方法和药物还可用于治疗接受组织或者器官移植，或者将要接受组织或者器官移植的患者。所述应用、方法和药物还可以用于治疗感染HIV，包括患有或未患有AIDS的那些患者。

因此，用本发明治疗的患者将已经诊断为癌症。然而，不应根据本发明治疗的患者可以包括：(1)对IL-2或者药物组合物的任何其他组分超敏的患者；(2)ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group)性能状态≥2的患者；(3)同时存在ECOG>1的性能状态和一个以上器官具有转移性疾病部位和最初诊断为原发性肿瘤和患者经评估需要IL-2治疗的日期之间<24个月的患者；(4)具有严重心脏病的重要病史或当前证据的患者；(5)证明需要抗生素治疗的活性感染的患者；(6)静息期间PaO₂<60mm Hg的患者；(7)预先存在的严重主要器官功能异常的患者；和(8)具有中枢神经系统转移或者抽搐病症的患者，排除脑转移成功治疗的患者。

检查治疗性IL-2治疗的功效的方法是本领域中公知的。

静脉大丸剂给药或输注后人中IL-2的血清半衰期曲线可以描述为双指数的。对于大丸剂，T_1/2α为8分钟，T_1/2β为88分钟；对于输注，T_1/2α为15分钟，T_1/2β为96分钟。所观察到的血清水平与IL-2剂量成比例。

在上面标题为“药物组合物”的章节中给出了适宜药物的特性。这些组合物将通常直接施用于患者。直接递送可以通过肠胃外注射(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内、或者施用于组织的胞间隙)，或者通过经直肠、口、阴道、局部、透皮、鼻内、经眼、耳、肺或者其他粘膜施用。然而，通常，通过静脉注射(例如，连续输注或者大丸剂)或者通过皮下注射(例如，连续输注或大丸剂)施用IL-2。

IL-2给药通常按患者的身体大小调节，所述身体大小是通过体重(kg)或者体表面积测量(BSA；以m²测量，通过患者的身高和体重的组合测量或者估计)。尽管在体重和BSA给药之间没有精确转换，但是存在良好的近似：对于一般体重和身高(每个50百分位数)，25000IU/kg＝1MIU/m²。

治疗可以是单剂量方案或者多剂量方案。可以通过大丸剂或者输注施用剂量。IL-2的通常的治疗方案是以连续输注施用18x10⁶IU/m²/24-小时，共5天，接着不接受IL-22-6天，然后如前以连续输注静脉内施用IL-2另外5天，然后3周不接受IL-2。这是IL-2的单一“诱导循环”。第一循环的3周静息期后，可以开始第二次诱导周期。可以对应答治疗或者疾病稳定的患者以4周间隔进行长达4个维持循环。然而，如果患者不能耐受该剂量方案，将减小剂量或者施用中断直到毒性缓和。IL-2的另一种治疗方案是通过静脉内大丸剂每8小时施用6×10⁵IU/kg，在5天内施用14剂，9天静息期后给予第二次治疗。

优选施用包括：静脉内输注以治疗转移性肾细胞癌；静脉内输注以治疗转移性黑素瘤；皮下大丸剂以治疗转移性肾细胞癌；皮下输注以治疗转移性肾细胞癌；通过吸入经肺施用以治疗患有肺转移的转移性肾细胞癌。联合治疗

本发明的IL-2微聚集体可以用作药物的活性成分。这些药物可以自身使用以治疗患者，或者它们可以与其他活性成分组合使用。通常，IL-2在施用前不与其他活性成分混合；相反，IL-2和其他活性成分将作为组合方案中独立的药物施用。联合治疗尤其适于治疗癌症，包括恶性和转移性癌。

从而，本发明提供了(a)本发明的IL-2微聚集体，和(b)第二种药剂，其用于同时单独或者顺序给药。

本发明还提供了药物制剂或者系统，其含有(a)第一种药剂，其含有本发明的IL-2微聚集体；和(b)第二种药剂，其中所述第一种和第二种试剂混合或者为单独的组合物，例如，用于单独或者顺序给药。

本发明还提供了试剂盒，其含有(a)第一种药剂，其含有本发明的IL-2微聚集体；和(b)第二种药剂。

本发明还提供了(a)本发明的IL-2微聚集体和(b)第二种药剂在制备组合药物中的应用。

本发明还提供了本发明的IL-2微聚集体在制备药物中的应用，其中该药物用于施用于已经用第二种药剂预先治疗的患者。类似地，本发明提供了第二种药剂在制备药物中的应用，其中该药物用于施用于已经用本发明的IL-2微聚集体预先治疗的患者。预处理可以是最近的(例如，施用所述药物前24小时)，中等的(例如，之前超过24小时，但是不长于4周)，更远(例如，之前至少4周)，或者非常远(例如，之前至少6个月)，这些时间期限指最近的治疗前剂量。通过在预先治疗中施用的药剂的治疗可能难以治疗该患者。

本发明还提供了本发明的IL-2在制备药物中的应用，其中该药物与第二种药剂共同施用。类似地，本发明提供了第二种药剂在制备药物中的应用，其中该药物与本发明的IL-2微聚集体共同施用。两种试剂优选相互在4小时以内施用。

优选地，第二种药物药剂选自下表，其还包括所述联合治疗可用于治疗的疾病的细节(和适宜时，该联合治疗可以怎样施用的基本细节)。

第二种试剂	用于治疗
		抗-CD20抗体，如利妥昔单抗、替伊莫单抗或托西莫单抗，例如Rituxan^TM，Mabthera^TM，Zevalin^TM，HuMax-CD20^TM，Bexxar^TM	非何杰金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病，尤其当利妥昔单抗治疗难以治疗NHL患者时。
抗-CD40抗体	非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病
		抗-Her2抗体，如曲妥单抗，例如Herceptin^TM	乳腺癌。尤其当曲妥单抗治疗难以治疗患者时。
抗-EGFR抗体，如西妥昔单抗例如Erbitux^TM	非小细胞肺癌，或者结肠癌。尤其当肿瘤过表达EGFR时。尤其西妥昔单抗治疗难以治疗患者时。
		抗-VEGF抗体，如贝伐单抗例如Avastin^TM	结直肠癌。
抗-CD52抗体，如阿仑单抗例如Campath^TM	慢性淋巴细胞白血病。
		抗-CD33抗体，如吉姆单抗例如Mylotarg^TM	急性骨髓白血病
H2受体激动剂，如组胺或组胺的药学上可接受的盐，例如二盐酸组胺	晚期恶性黑素瘤(例如，IV期)，急性髓性白血病或者肾细胞癌。尤其当患者患有肝转移时。两种试剂都可以通过皮下注射施用。对于黑素瘤：在第1和3周的第1和2天和第2和4周的1-5天皮下施用IL-2，每天2次(BID)；在所有4周的1-5天10-30分钟内皮下施用组胺diHCl。对于急性髓性白血病，自体干细胞移植或者化疗后开始。
		卡介苗(BCG)	膀胱癌。IL-2可以通过Foley导管施用。
沙利度胺	非何杰金淋巴癌
		Lenalidomide	多发性骨髓瘤
蛋白酶体抑制剂，如bortezomib例如Velcade^TM	非何杰金淋巴癌
		‘CVP’，其是环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合。	非何杰金淋巴癌。通过静脉内注射施用。

‘CHOP’，其是环磷酰胺、羟基多柔比星、长春新碱和泼尼松的组合。	非何杰金淋巴癌。磷酰胺、羟基多柔比星、长春新碱通过静脉内注射；泼尼松通过口服片剂施用。
		‘CHOP-R’，其是“CHOP”与利妥昔单抗的组合。	非何杰金淋巴癌。尤其对于“CHOP”或者仅“R”难以治疗的患者。
‘CVP-R’，其是“CVP”与利妥昔单抗的组合。	非何杰金淋巴癌。尤其对于“CVP”或者仅“R”难以治疗的患者。
		α干扰素(‘IFNα’)	乳腺癌、结肠癌或者肾细胞癌。
γ干扰素(‘IFNγ’)	癌
		5-氟尿嘧啶(‘5-FU’)	乳腺癌、结肠癌或者肾细胞癌。
5-FU&IFNα的组合	乳腺癌、结肠癌或者肾细胞癌。
		抗逆转录病毒化合物	HIV.
酪氨酸激酶抑制剂，如Bay43-9006或SU11248	肾细胞癌或黑素瘤。
		脱氧氮杂胞苷	甲状腺癌、脊髓发育不良综合征、黑素瘤或者肾细胞癌。

当第二种试剂为抗体时，其优选为单克隆抗体，更优选人源化或者人抗体。通常通过例如皮下或静脉内注射施用抗体。抗体可以偶联其他活性试剂，例如，tiuxetan、奥佐米星、放射性核素、¹³¹I等，尤其用于癌症治疗。

通常，第二种试剂可以是提供ADCC(依赖抗体的细胞毒性)的任何抗体。基于IL-2的联合治疗与介导ADCC以治疗癌症的抗体一起使用比与通过抑制血管形成或者通过改变细胞信号转导治疗癌症的试剂一起使用更有效。

定义

术语“包含”包括“包括”以及“组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或者可以包括额外的事物，例如X+Y。

术语“约”与数值x相关时指例如，x+10％。必要时，术语“约”可以省略。

词语“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义省略。

用Smith-Waterman同源性搜索算法，使用亲和缺口搜索，用缺口打开罚分12，缺口延长罚分2，BLOSUM矩阵62百分数序列同一性可以确定序列同一性百分数。Smith-Waterman同源性搜索算法在参考文献64中教导。

附图简述

图1显示了渗滤期间随着SDS的除去比浊度(τ)的增加。

图2和3显示了PROLEUKIN^TM产品中IL-2的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)。该序列(i)缺少SEQ ID NO：3的N-末端甲硫氨酸，(ii)缺少如在SEQ ID NO：4中看到的天然成熟人IL-2的N-末端的丙氨酸残基，和(iii)具有在SEQ ID NO：4中看到的Cys-125残基处的丝氨酸替换。

图4显示了编码图2序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：2，其包括起始和终止密码子，并且在N-末端甲硫氨酸切割前表达为SEQ ID NO：3)。左边的编号表示从IL-2基因的(+)DNA链的5’末端计数每一行中第一个碱基的编号。氨基酸序列下的数字指出从天然人IL-2的N-末端计数的残基数。箭头指出相对于人IL-2的核苷酸差异(即，SEQ ID NO：2和5之间的差异)。

图5显示了用于药物动力学试验的7种样品的比浊度(τ，cm²/g)，使用不同的SDS浓度(μgSDS/mg IL-2)，图6显示通过7种样品的离心可以沉淀的总IL-2的比例。

图7显示了7种样品的6种的血浆生物活性。图8比较了160μg/mg和25μg/mg样品，图9是图7和8的综合。X轴显示注射后时间(小时)；Y轴显示血浆生物活性(ng/ml)。

图10显示渗滤期间针对SDS浓度(mg/μg)的τ(cm²/g)，图11将τ转化成MW(kDa)。

图12显示渗滤期间SDS浓度的下降。

图13将图10的浊度结果叠加在图12的SDS除去曲线上。

图14显示了冻干对τ(cm²/g)的影响。正方形显示冻干前值，圆形显示冻干后值。X轴显示样品的SDS浓度(μg/mg)。

图15显示用血清稀释之前和之后IL-2微聚集体的生物活性，和与单体IL-2的比较。

图16和17显示IL-2的微聚集体的动态光散射光谱。图16是溶液组分的质量分布，图17是数字分布。

实施本发明的方式

1.IL-2微聚集体的制备

用含有图4核苷酸序列的质粒转化的大肠杆菌培养在标准条件下，从而具有图2序列的IL-2蛋白质得到表达。培养后，IL-2主要为内含体的形式。

IL-2的初级回收包括浓缩、细胞破碎、渗滤、失活、再破碎和蔗糖悬浮。用正交流动滤器实施收获细胞的浓缩以便将工作体积降低到约1/5。通过匀浆破坏细胞以方便分离IL-2内含体。通过渗滤除去发酵培养基盐，并通过加入乙醇杀死渗滤溶液中的宿主细菌。乙醇处理后，通过匀浆破坏细胞。加入蔗糖得到更高密度的混合物，以便允许离心期间IL-2内含体与细胞碎片分离。通过离心收集IL-2颗粒糊状物，等分试样并在—70℃或更低温度下保存，直到进一步处理。

将IL-2颗粒糊状物用SDS溶解并用二硫苏糖醇(DTT)还原以便得到没有任何二硫键的可溶性IL-2的单体形式。实施该加工步骤以增加下一个步骤中层析的IL-2的产率。

通过包括大小排阻层析(SEC)、氧化、浓缩、RP-HPLC、沉淀和离心步骤的方法纯化IL-2的单体可溶形式。实施SEC的第一个层析步骤以将IL-2与宿主蛋白质和核酸分离。收集并合并含有IL-2的级分。氧化IL-2以便得到分子内二硫键。用超滤实施IL-2溶液的浓缩以便减小工作体积。实施第二个层析步骤：制备性RP-HPLC以便将IL-2与细菌内毒素、核酸和宿主蛋白质分离，和除去IL-2同工型，包括氧化的形式。收集并合并含有IL-2的级分。通过加入氢氧化钠(NaOH)沉淀IL-2并通过离心收集。实施该步骤以除去用于RP-HPLC纯化中的溶剂。该阶段的所述物质称作“HPLC糊状物”。

然后通过加入0.05M Na₂HPO₄+1％SDS的溶液再溶解HPLC糊状物。当SDS加到足够浓度时，该组合物主要含有单体溶解了的IL-2，但是纯化期间可以形成少量寡聚体化IL-2(即寡聚体形式的共价交联的IL-2分子)。通过凝胶过滤除去这些寡聚体，该凝胶过滤也从前面的步骤除去了任何残留的有机溶剂。

由于SDS对细胞有毒，所以将其从溶解的IL-2除去。将该溶液针对10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)渗滤，直到SDS水平达到约160μg/mg IL-2。IL-2和SDS的微聚集体开始在约500-600μg/mg时形成，当SDS的水平进一步减小到目标160μg/mg水平时，微聚集体的大小逐渐增加(图1)。该SDS除去对于微聚集体的形成是关键的，SDS除去是配制前IL-2的纯化方法的最后步骤。

2.用于药用的IL-2微聚集体的制剂

将含有微聚集体的渗滤SDS/IL-2混合物通过将其在280nm的吸光度除以IL-2消光系数(0.79)来检验蛋白质浓度(mg/ml)。还测量渗滤的IL-2溶液的体积(ml)。通过将渗滤的IL-2溶液的体积乘以蛋白质浓度计算IL-2蛋白质的总量(mg)。通过将蛋白质的总mg乘以因数0.909计算制剂的最终工作体积(ml)。该因数考虑过滤期间IL-2损失。

为了稳定冻干期间IL-2，加入1/4体积的20％甘露糖醇溶液以得到5％的最终甘露糖醇浓度(即50mg/ml)。将10mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)也加到最终工作体积。加入甘露糖醇和缓冲液后，通过测量280nm处的吸光度确定配制的溶液中IL-2浓度。

配制后的最终结果为pH7.5时的本体溶液，其含有：终浓度1.1±0.05mg/ml的IL-2；0.18mg/ml SDS；50mg/ml甘露糖醇；0.17mg/ml磷酸二氢钠；和0.89mg/ml磷酸氢二钠。

将配制的IL-2本体溶液过滤除菌到无菌集液罐中。将物质从该罐转移到无菌小瓶中。每只小瓶装入1.2ml本体溶液。然后将小瓶置于冻干机中冻干。然后使用塞子，并且塞子密封。然后标记并包装小瓶。

3.SDS浓度对浊度的影响

达到SDS的优选浓度范围前，通过上述方法制备IL-2，只是为了研究浊度在渗滤期间的多个点除去大样品(～300mg IL-2)，以便确定SDS对IL-2聚集的影响。

图12显示起始物质的渗滤期间SDS浓度。浓度在对数轴上直线下降。在下面的SDS浓度(μg/mg IL-2)下除去样品：1195、536、351、217、173、137、123、104和72。

IL-2纯度在每种样品中相同(SDS-PAGE测量为100％，HPLC测量为≥98.5％)。在488nm测量浊度并基于样品中IL-2浓度将其转化成如上述的绝对比浊度。结果在图10中显示，图13将浊度结果叠加在图12的SDS除去曲线上。

在约300μg/mg以下，浊度逐渐增加，在约95μg/mg时增加变得非常急剧。

通过下面的公式可以将τ值转换成推理的分子量：

MW = \frac{τ \times 10^{7}}{8.1 + 2 τ}

对冻干前样品的转换结果在图11中显示。这些和其他数据表明在约600μg/mg以上看到相应于单体IL-2的MW，当SDS低于约300μg/mg时MW开始显著增加，当SDS降低到约100μg/mg以下时该增加变得非常急剧。

基于单体IL-2的MW(天然IL-2为15.3kDa)，可以将聚集体的分子量转换成每个聚集体IL-2单体的推导数。

4.冻干和比浊度

在用以除去SDS的渗滤期间，在下面的SDS浓度下除去15ml样品：1155；840；585；400；190；和155μg/mg IL-2。在配制之前和之后确定这些样品的浊度(即，加入甘露糖醇、磷酸盐缓冲液、冻干和重构之后)。在两种情况中，浊度测量在通过0.2μm滤器过滤之前以便除去任何大聚集体。

图14显示了冻干对这些样品的τ(对数尺度)的影响。该图表明冻干不破坏微聚集体，但是其可以通常稍微增加比浊度(即，聚集体大小增加)，而不影响对SDS浓度的依赖。在优选的SDS范围内该影响通常是微小的。

5.动态光散射

使用160μg/mg的SDS浓度如上描述的测量IL-2微聚集体，并将其通过DLS分析。结果在图16和17中显示。图16显示了通过溶液组分的质量分布的DLS结果，图17显示了通过数目分布的DLS结果。

在图16中，主峰的平均流体动力学直径为12.7nm，代表总质量的90.22％。还有平均直径55.6nm的下游峰，代表质量的0.98％。在图17中，主峰的平均流体动力学直径为11.7nm，代表总数目的99.99％。还有平均直径53.7nm的下游峰，代表剩余的0.01％颗粒。

6.比较微聚集体与单体IL-2

在多种试验中比较微聚集体IL-2与单体IL-2。如上描述的制备IL-2微聚集体。为了比较，以单体形式制备IL-2，其中吐温80用作去污剂代替SDS。该去污剂不与IL-2形成微聚集体，但是该去污剂溶解IL-2并得到生物活性单体产物。

IL-2的两种形式都证实是有生物活性的。聚集的IL-2具有约20MIU/mg的活性。当用血清体外稀释时，活性稍微下降。在两种情况中，活性稍微高于单体IL-2的活性(图15)。从而本发明的IL-2微聚集体能够解离而得到生物活性产物，并且生物活性等价于没有聚集的的IL-2的。

以SDS-微聚集体形式或者单体形式静脉内施用放射标记的IL-2后比较该放射标记的IL-2的体内分布。微聚集体形式优先在肺、肝和肾中分布，而单体产物几乎100％在肾中分布。因此，微聚集体对体内分布具有影响。

还在肿瘤转移模型中比较了微聚集体和单体IL-2。将B16F10肿瘤细胞静脉内注射到小鼠的尾部，14天后，检查肺中肿瘤。所治疗的动物从第3-10天每天接受IL-2。第14天时肺转移的中位数如下：

剂量(mg/kg)	IL-2/SDS微聚集体	IL-2/吐温80单体的
			15	1	16
10	3	26
			7.5	4.5	49
5	24	53.5
			1	60	59.5
0.1	88.5	72

因此IL-2的微聚集体形式在肿瘤模型中比单体形式更有效，这是因为使用低得多的剂量的IL-2可以预防肿瘤。然而，因为IL-2自身可以是有毒的，数据不能直接比较，例如，10mg/kg IL-2微聚集体可以杀死约1/2试验群体。从而最有意义的比较是在最高的非致死剂量，即在7.5mg/kg剂量下。在该等毒(equitoxic)剂量下，用微聚集体看到的转移中位数为4.5(范围1-18)，相比用单体IL-2的为16(范围4-57)，差异是统计学上显著的。该差异代表IL-2微聚集体形式的3到5倍更好的治疗指数。

使用B16人工转移模型的其他研究揭示终产物中SDS的水平似乎不影响功效。例如，含有160μg/mg SDS的组合物与含有181μg/mg SDS的组合物性能相同。因此，SDS在95-250μg/mg范围内时，抗肿瘤活性保持最佳，同时避免的SDS相关的毒性。

7.SDS终浓度的药物动力学效果

如上文所示，IL-2/SDS混合物的浊度随着渗滤期间SDS水平降低而增加。在药物动力学试验中，在160μg/mg的典型目标直到下降到25μg/mg时，渗滤仍然保持良好。在渗滤过程的多个阶段：1090μg/mg；200μg/mg；160μg/mg；125μg/mg；95μg/mg；65μg/mg；和25μg/mg时采集样品。

可看到除了最稀(25μg/mg)的样品之外的所有样品都是澄清的，图5显示了7种样品的比浊度(τ)。最低浓度下τ的下降反映了在25μg/mg下蛋白质沉淀的显著增加，该沉淀是眼睛可见的。图6显示了通过7种样品中离心可以沉淀的总IL-2的比例，在最低SDS浓度下看到显著增加，而较高的浓度基本上是恒定的。该沉淀的物质沉淀出来并且不导致混浊，解释了图5中的低τ值。

与不同的浊度和沉淀相比，对于7种样品生物活性(IU)基本上是恒定的(约19IU/mg)。

为了研究药物动力学，基于人剂量的比速增长外推，除了最稀的样品外的所有样品都作为大丸剂以0.2mg IL-2/kg体重注射到大鼠的尾静脉(每种SDS剂量一式三份，总共18只大鼠)。注射后1、3、5、7.5、10、15、20、25、30、45和60分钟时采集血样，并分析IL-2生物活性。图7显示了这些样品的血浆生物活性(ng/ml)。0.5小时到1小时之间，顶线为160μg/mg剂量(■)，最低线为65μg/mg(Δ)，尽管所有线都非常相似。

在第二个研究中，将来自第一个实验具有最高线(160μg/mg)的样品与最稀释的样品(25μg/mg)比较。该第二个研究中160μg/mg样品的药物动力学参数与第一个研究的那些参数匹配。而图7中的线相互都具有相似形状，然而，最稀释的样品给出非常不同的结果(图8)。从这些曲线计算的清除率差异达～30倍：160μg/mg剂量为12.7ml/min/kg，25μg/mg剂量为362ml/min/kg。

当比较来自两个实验的结果时，最稀释的样品与其他6种样品明显不同(图9)。

因此，IL-2的聚集体状态对其体内药物动力学具有明显影响。

8.游离SDS

上面的实验测量SDS/IL-2混合物中的总SDS浓度。进行实验以观察总SDS中有多少与IL-2结合，和有多少在溶液中保持游离。

如所教导的将PROLEUKIN^TM产品的小瓶重构并通过以3000转/分钟两次离心，每次30分钟通过Centricon10膜(10kDa截留值)超滤。检测起始样品和滤液的SDS和IL-2水平。通过吖啶橙[35]测量SDS。简言之，该测定法包括：采集0.5ml样品；加入0.1ml1.75M NaHSO₄溶液；加入0.1ml1％(w/v)吖啶橙溶液；加入1.5ml甲苯；密封；涡旋3分钟；分离有机相和水相(例如，通过环境温度下以3000转/分钟离心5分钟)；在499nm下测量上层有机层的吸光度。可以在测定前将样品稀释(例如，用纯水)以使它们在标准曲线的范围内，例如，如果标准曲线是基于高达25μg/mg的已知SDS浓度，那么应该稀释样品以使其SDS浓度在该范围内。分光光度法步骤的空白应该是不含有SDS的标准，其已经以与试验样品相同的方式进行处理。

结果表明通过超滤膜完全保留IL-2(在滤液中检测不到)，而约35％SDS能够穿过该膜。

应当理解仅通过举例的方式描述了本发明，可以在不背离本发明的精神和范围下对细节作出修改。

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[64]Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-9.

序列表

<110> 凯荣公司

<120> 制备用于药用的白介素

<130> FILE-REF

<150> US 60/635,622

<151> 2004-12-14

<160> 5

<170> SeqWin99，version1.02

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 成熟的人白介素-2脱丙氨酰-1丝氨酸-125变体

<400> 1

<210> 2

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人白介素-2的脱丙氨酰-1丝氨酸-125变体

<400> 2

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 未成熟的人白介素-2脱丙氨酰-1丝氨酸-125变体

<400> 3

<210> 4

<211> 133

<212> PRT

<213> 人类

<400> 4

<210> 5

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Met替代信号的人IL-2序列

<400> 5

Claims

1.一种制备含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物的方法，其中：(i)所述组合物中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体形式存在；和(ii)该方法包括以下步骤：(a)向含有白介素-2的组合物中加入十二烷基硫酸钠，其中加入足够的十二烷基硫酸钠以得到单体的、溶解了的白介素-2，和(b)将十二烷基硫酸钠的浓度降低到白介素-2与十二烷基硫酸钠形成聚集体的水平，以致于该组合物在冻干和重构后具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)。

2.权利要求1的方法，其中所述聚集体具有8nm到20nm之间的平均流体动力学直径。

3.前面任一项权利要求的方法，其中通过渗滤降低SDS浓度。

4.权利要求1的方法，其包括在步骤(a)和(b)之间的凝胶过滤步骤以便除去任何沉淀的IL-2共价多聚体。

5.权利要求1的方法，其还包括步骤：加入甘露糖醇。

6.权利要求1的方法，其还包括步骤：冻干。

7.一种含有白介素-2与十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2与十二烷基硫酸钠以聚集体形式存在，并且其中通过前面任一项权利要求的方法得到该聚集体。

8.一种含有白介素-2与十二烷基硫酸钠的组合物，其中白介素-2与十二烷基硫酸钠以聚集体形式存在，并且其中该组合物具有一个或多个下列特性：

(i)该组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)；

(ii)该组合物含有平均流体动力学直径为8nm到20nm之间的SDS/IL-2聚集体；和/或

(iii)该组合物含有95-250μg SDS/mg白介素-2。

9.一种含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的冻干组合物，其中该组合物若用水性介质重构，则得到权利要求8的组合物。

10.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中所述组合物的比浊度小于0.7cm²/g。

11.权利要求10的方法或组合物，其中所述组合物的比浊度为0.3cm²/g到0.6cm²/g。

12.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中所述组合物含有流体动力学直径为11nm到13nm的SDS/IL-2微聚集体。

13.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中所述组合物包括浓度为40到50mg甘露糖醇/mg IL-2的甘露糖醇。

14.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2为人IL-2。

15.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2为脱丙氨酰-1IL-2。

16.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2为丝氨酸-125IL-2。

17.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2为脱-丙氨酰-1，丝氨酸-125人IL-2。

18.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。

19.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2为非糖基化的。

20.权利要求1的方法或权利要求8的组合物，其中IL-2是在重组原核宿主中表达后纯化的。

21.权利要求7到20中任一项的组合物，其中IL-2浓度为约1.1mg/ml。

22.一种冻干的药物组合物，其当用1.2ml无菌注射用水重构时，每毫升含有：1.1mg非糖基化脱-丙氨酰-1，丝氨酸-125人IL-2；50mg甘露糖醇；0.18mg十二烷基硫酸钠(SDS)；0.17mg磷酸二氢钠；和0.89mg磷酸氢二钠至pH 7.5，其中IL-2和SDS为通过权利要求1的方法得到的聚集体形式使得所述重构的组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)。

23.一种通过用1.2ml无菌注射用水重构权利要求22的冻干组合物得到的水性药物组合物。

24.权利要求8的组合物，和第二种药剂，它们用于同时分开或者顺序给药。

25.含有(a)权利要求8的组合物；和(b)第二种药剂的试剂盒。

26.权利要求8的组合物，其用于医药。

27.(a)白介素-2和(b)十二烷基硫酸钠的微聚集体在制备施用于患者的用于治疗癌症的药物中的应用，其中所述微聚集体具有8nm到20nm的平均流体动力学直径，其中所述的微聚集体是通过权利要求1的方法而得到的。

28.含有白介素-2和十二烷基硫酸钠的组合物在制备施用于患者的用于治疗癌症的药物中的应用，其中白介素-2和十二烷基硫酸钠以聚集体形式存在，并且其中该组合物具有一种或多种下列特性：

(i)该组合物具有小于1.1cm²/g的比浊度(τ)；

(iii)该组合物含有95-250μgSDS/mg白介素-2。

29.权利要求27的应用，其中癌症为肾细胞癌。

30.权利要求28的应用，其中癌症为肾细胞癌。

31.权利要求27的应用，其中癌症为黑素瘤。

32.权利要求28的应用，其中癌症为黑素瘤。

33.权利要求27到32中任一项的应用，其中患者已经用第二种药剂预先治疗。

34.权利要求27到32中任一项的应用，其中所述药物与第二种药剂共同施用。

35.第二种药剂在制备施用于患者的用于治疗癌症的组合药物中的应用，其中该药物与权利要求7到23中任一项的组合物共同施用。

36.(a)白介素-2和十二烷基硫酸钠的微聚集体，和(b)第二种药剂在制备用于治疗癌症的组合药物中的应用，其中所述微聚集体具有8nm到20nm的平均流体动力学直径，其中所述的微聚集体是通过权利要求1的方法而得到的。

37.权利要求24的组合物，权利要求25的试剂盒，或者权利要求33到36中任一项的应用，其中所述第二种药剂为单克隆抗体。

38.权利要求24的组合物，权利要求25的试剂盒，或者权利要求33到36中任一项的应用，其中所述第二种药剂为提供ADCC的抗体。

39.权利要求24的组合物，权利要求25的试剂盒，或者权利要求33到36中任一项的应用，其中所述第二种药剂选自由下列各项组成的组：抗-CD20抗体；抗-CD40抗体；抗-Her2抗体；抗-EGFR抗体；抗-VEGF抗体；抗-CD52抗体；抗-CD33抗体；H2受体激动剂；卡介苗；沙利度胺；Lenalidomide；蛋白酶体抑制剂；环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合；环磷酰胺、羟基多柔比星、长春新碱和泼尼松的组合；细胞因子；α干扰素；γ干扰素5-氟尿嘧啶；抗-逆转录病毒化合物；酪氨酸激酶抑制剂；和脱氧氮杂胞苷。

40.权利要求39的组合物、试剂盒或者应用，其中所述H2受体激动剂为组胺或者组胺的药学上可接受的盐。

41.权利要求40的组合物、试剂盒或者应用，其中所述H2受体激动剂为二盐酸组胺。