ES2318916B1

ES2318916B1 - Procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmaceutico.

Info

Publication number: ES2318916B1
Application number: ES200500241A
Authority: ES
Inventors: Maninder Hora
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2010-03-22
Anticipated expiration: 2025-02-07
Also published as: ES2318916A1

Abstract

Procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmacéutico.

Un procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmacéutico, que comprende las etapas de (a) añadir SDS a una composición que comprende aldesleukina, para dar una concentración final de SDS alta; (b) reducir los niveles de SDS para dar una composición con una concentración de SDS baja. La adición y a continuación eliminación parcial de SDS da microagregados de aldesleukina y SDS que son adecuados para uso farmacéutico.

Description

Procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmacéutico.

Toda los documentos e información en línea citados en la presente memoria se incorporan en su totalidad como referencia.

Campo técnico

Esta invención es en el campo de la preparación y formulación de interleucina-2 para uso farmacéutico.

Antecedentes de la técnica

La interleucina-2 (IL-2) es una citoquina que fomenta el crecimiento y diferenciación de las células T in vivo y también mejora la citotoxicidad de las células T CD8+ y las células asesinas naturales. La administración a pacientes produce múltiples efectos inmunológicos de una manera dependiente de la dosis, que incluyen activación de la inmunidad celular con linfocitosis profunda, eosinofilia, trombopenia, y la producción de citoquinas que incluye TNF, IL-1 e interferón-\gamma. Detalles adicionales de la IL-2 se pueden encontrar en su "GeneCard" bajo el número de acceso GC04M123831.

La IL-2 se ha aprobado para uso farmacéutico humano en varios países. El nombre común internacional recomendado es ALDESLEUKINA, y se comercializa una formulación de Chiron Corporation bajo la denominación comercial PROLEUKIN^{TM}. La FDA de Estados Unidos ha aprobado la IL-2 PROLEUKIN^{TM} para uso en el tratamiento de adultos con carcinoma de células renales metastásico (RCC metastásico) o melanoma metastásico.

Como se estipula en su información de prescripciones de EE.UU., la PROLEUKIN^{TM} existe como microagregados no covalentemente unidos biológicamente activos con un tamaño medio de 27 moléculas de IL-2 recombinantes. Se suministra como una torta liofilizada estéril de color blanco a blanquecino en viales de un solo uso previstos para administración intravenosa (IV). Cuando se reconstituye con 1,2 ml de agua estéril para inyección, cada mililitro contiene 18 millones de UI (1,1 mg) de IL-2 PROLEUKIN^{TM}, 50 mg de manitol, y 0,18 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS), tamponado con aproximadamente 0,17 mg de fosfato sódico monobásico y 0,89 mg de fosfato sódico dibásico a pH 7,5. Sin embargo, la mezcla simple de estos ingredientes no da la misma forma microagregada de IL-2 que la encontrada en el producto PROLEUKIN^{TM}.

La microagregación de IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} es importante para la eficacia in vivo. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la IL-2 no agregada (monomérica libre) son muy diferentes de las de la IL-2 microagregada, y las dos formas tienen índices terapéuticos diferentes: los agregados que son demasiado pequeños son depurados por el cuerpo demasiado rápidamente; los agregados que son demasiado grandes pueden ser insolubles y menos activos. La microagregación es así una característica clave del producto PROLEUKIN^{TM}

El procedimiento por el cual se forman los microagregados biológicamente activos de PROLEUKIN^{TM} no se ha hecho previamente disponible al público, aunque varios procedimientos para preparar formulaciones farmacéuticas de IL-2 se han descrito en la técnica anterior [por ejemplo véanse las referencias 1 a 30]. La referencia 9 en particular pretende describir el procedimiento de fabricación para la PROLEUKIN^{TM}, que incluye detalles de expresión, recuperación, purificación, formulación y terminación, pero esta descripción es incompleta en varios aspectos.

Saber como conseguir la misma forma activa de microagregados de IL-2 que la encontrada en el producto
PROLEUKIN^{TM} sería útil para cualquiera que quiera hacer un producto de IL-2 similar a PROLEUKIN^{TM}. Es por lo tanto un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 en forma de microagregados coma los encontrados en el producto PROLEUKIN^{TM}, y también proporcionar tal IL-2 microagregada. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 para complementar la descripción de la referencia 9.

Descripción de la invención

El procedimiento por el cual se prepara el producto PROLEUKIN^{TM} incluye las etapas clave siguientes: (i) purificación de la IL-2 expresada a partir del cultivo celular; (ii) solubilización de la IL-2 utilizando detergente SDS; (iii) reducción de la IL-2 a forma monomérica; (iv) purificación, oxidación y precipitación de la IL-2; (v) re-solubilización de la IL-2 utilizando un nivel alto de detergente SDS; (vi) purificación para quitar la IL-2 oligomérica; (vii) diafiltración para reducir los niveles de detergente SDS, sin eliminación completa, hasta un intervalo óptimo para obtener una preparación de IL-2 apropiadamente microagregada; (viii) formulación con manitol y tampón; y (ix) liofilización y envasado.

Las etapas (i), (iv), (vi), (viii) y (ix) de este procedimiento se describen en la referencia 9, pero las etapas (ii), (iii), (v) y (vii) no se describen, aunque se describe el uso de un detergente no especificado para re-solubilizar la IL-2 antes de la etapa (vi). Además, la referencia 9 sugiere que se añade SDS a la IL-2 después de la purificación en la etapa (vi), cuando de hecho se elimina.

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De las nueve etapas, las más críticas para que se formen los microagregados son la (v) y la (vii). Ninguna de las dos etapas posteriores (viii) o (ix) tienen efecto significativo alguno sobre la microagregación, y los procedimientos de purificación en las etapas (i), (ii), (iii), (iv) y (vi) también tienen poco efecto. Sin embargo, una vez que se añade el SDS en la etapa (v), se disuelve la IL-2, y es la posterior reducción de los niveles de SDS en la etapa (vii) la que causa la formación de los microagregados presentes en el producto final PROLEUKIN^{TM}. Se tiene que añadir suficiente SDS para resolubilizar la IL-2 precipitada sustancialmente en una forma soluble monomérica, y a continuación se debe eliminar (pero no completamente) para dar los microagregados deseados.

La invención por lo tanto proporciona un procedimiento para prepara interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecil sulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende interleucina-2, para dar una concentración final de SDS de por lo menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; (b) eliminar algo del SDS pero no todo de la composición, para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2. Este procedimiento de adición de SDS y después eliminación parcial rinde condiciones óptimas para la interacción íntima de moléculas de IL-2 y SDS para formar microagregados de IL-2 y SDS como los encontrados en el producto PROLEUKIN^{TM} y, para una relación IL-2/SDS dada, da lugar a un producto diferente del que se obtiene por simple mezcla de SDS e IL-2.

La composición acuosa que surge del procedimiento se puede liofilizar para distribución, y el producto liofilizado se puede eventualmente reconstituir con un vehículo acuoso para al administración a los pacientes. Después de la reconstitución, la composición preferentemente tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g y/o contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Así el procedimiento puede además comprender las etapas de liofilizar la composición y a continuación, opcionalmente, reconstituir la composición con un medio acuoso. La composición puede también tener estas 2 y/o características hidrodinámicas antes de la etapa de liofilización.

La invención proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados son obtenibles por los procedimientos de la invención. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención también proporciona una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que el número medio de moléculas de interleucina-2 por agregado está entre 10 y 50. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención proporciona una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la composición se puede reconstituir para dar una disolución acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g. En lugar de, o además de, considerar \tau, los agregados pueden tener un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar una disolución acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecil sulfato de sodio a una composición que comprende interleucina-2, en la que se añade suficiente dodecil sulfato de sodio para dar interleucina-2 monomérica solubilizada, (b) reducir la concentración de dodecil sulfato de sodio a un nivel en el que la interleucina-2 forma agregados con dodecil sulfato de sodio, y (c) liofilizar la composición.

La invención proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecil sulfato de sodio a una composición que comprende interleucina-2, en la que se añade suficiente dodecil sulfato de sodio para dar interleucina-2 monomérica solubilizada, (b) reducir la concentración de dodecil sulfato de sodio a un nivel en el que la interleucina-2 forma agregados con dodecil sulfato de sodio, y (c) liofilizar la composición.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar dodecil sulfato de sodio e interleucina-2 para dar una mezcla en la que el dodecil sulfato de sodio está presente en una primera concentración, (b) eliminar el dodecil sulfato de sodio de la mezcla para reducir su concentración a una segunda concentración, y (c) liofilizar la composición, proporcionando de ese modo dicha composición. La segunda concentración es más baja que la primera concentración. La primera concentración generalmente será por lo menos 500 \mug de SDS por miligramo de IL-2 en la mezcla, y la segunda concentración generalmente estará entre 95-250 \mug de SDS por miligramo de IL-2.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar dodecil sulfato de sodio e interleucina-2 para dar una mezcla en la que el dodecil sulfato de sodio está presente en una primera concentración, (b) eliminar el dodecil sulfato de sodio de la mezcla para reducir su concentración a una segunda concentración, y (c) liofilizar la composición, proporcionando de ese modo dicha composición. La segunda concentración es más baja que la primera concentración. La primera concentración generalmente será por lo menos 500 \mug de SDS por miligramo de IL-2 en la mezcla, y la segunda concentración generalmente estará entre 95-250 \mug de SDS por miligramo de IL-2.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio (SDS), en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar una composición acuosa en la que la interleucina-2 y el SDS están presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g, y en la que la concentración de SDS es "x" \mug de SDS por miligramo de IL-2, en la que x está entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar SDS e interleucina-2 para dar una mezcla en la que la concentración de SDS es por lo menos 4 veces más alta que "x", (b) eliminar algo de SDS pero no todo de la mezcla, para dar una composición en la que la concentración de SDS es "x", y (c) liofilizar la composición. La concentración es preferentemente al menos 5 veces más alta que "x", más preferentemente al menos 8 veces más alta, 10 veces más alta, 15 veces más alta, o incluso 20 veces más alta.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio (SDS), en la que: (i) la interleucina-2 y el SDS en la composición están presentes en forma de agregados, en la que los agregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm, y en la que la concentración de SDS es "x" \mug de SDS por miligramo de IL-2, en la que x está entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) mezclar SDS e interleucina-2 para dar una mezcla en la que la concentración de SDS es por lo menos 4 veces más alta que "x", (b) eliminar algo de SDS pero no todo de la mezcla, parar dar una composición en la que la concentración de SDS es "x", y (c) liofilizar la composición. La concentración es preferentemente al menos 5 veces más alta que "x", más preferentemente al menos 8 veces más alta, 10 veces más alta, 15 veces más alta, o incluso 20 veces más alta.

Mientras un procedimiento de la invención implica reducir la concentración de SDS dentro del intervalo de 95-250 \mug de SDS por miligramo de IL-2, es posible en algunas realizaciones reducir la concentración por debajo de 95 \mug/mg (por ejemplo entre 50 y 95 \mug/mg) y a continuación aumentar la concentración otra vez para estar dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg. Este aumento hasta dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg puede tener lugar convenientemente durante la reconstitución del producto liofilizado, por ejemplo el procedimiento puede implicar eliminación de SDS a < 95 \mug/mg, seguido por liofilización, seguido por reconstitución con una disolución acuosa de SDS tal que la concentración de SDS cae dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg.

El detergente

Los procedimientos de la invención implican el uso de dodecil sulfato de sodio (SDS), que también se conoce como lauril sulfato de sodio. La fórmula de este detergente aniónico es CH_{3}(CH_{2})_{11}OSO_{3}^{-}Na^{+}, y tiene el número CAS 151-21-3 y el número EC 205-788-1.

El SDS es un reactivo estándar utilizado para solubilizar proteínas y si la IL-2 está en forma precipitada antes de que se añada el SDS entonces se utiliza para este propósito en la etapa (a) del procedimiento de la invención. Comenzando con una composición que comprende IL-2 precipitada, se añadirá suficiente SDS para asegurar que sustancialmente toda la IL-2 precipitada se hace soluble (a excepción de cualquier multímero covalentemente unido de IL-2 en el precipitado, que quedará predominantemente precipitado incluso en presencia de SDS). La microagregación de IL-2 a una concentración de 1 mg/ml está sustancialmente ausente cuando está presente SDS en más que aproximadamente 500 \mug/mg, así que es típico añadir SDS para dar una concentración final de SDS de por lo menos 500 \mug de SDS por miligramo de IL-2 (por ejemplo por lo menos 550, por lo menos 600, por lo menos 700, por lo menos 800, por lo menos 900, por lo menos 1000, por lo menos 1200, por lo menos 1400, por lo menos 1600, por lo menos 1800, o por lo menos 2000 \mug de SDS por miligramo de IL-2). Se prefiere utilizar aproximadamente 910 \mug de SDS por miligramo de IL-2.

La concentración de partida de SDS en una muestra generalmente será conocida, porque el SDS no está presente de forma natural en las células y la cantidad de SDS que se añadió durante el procesado del material derivado de las células se habrá controlado. Sin embargo, en el caso de que la concentración de SDS no se conozca, se puede medir utilizando técnicas de análisis convencionales, o realizadas sobre el material en su totalidad o sobre una muestra del material. Por ejemplo: la referencia 31 describe un método de electroforesis capilar para la separación y determinación de tensioactivos, que incluye el SDS; la referencia 32 describe un método de gota única para la determinación de ion dodecilsulfato sobre el intervalo de 0,2-100 \muM utilizando un cristal piezoeléctrico de cuarzo sin electrodo; la referencia 33 compara tres métodos para la determinación conveniente de SDS en disoluciones acuosas, concretamente la valoración mediante bromuro de cetiltrimetilamonio utilizando o un electrodo selectivo de iones o la turbidez para medir el punto final, o la medida de la turbidez en presencia de bromuro de miristiltrimetilamonio; la referencia 34 describe un método para la determinación de SDS, basado en su interacción con colorantes fluorescentes tales como el bromuro de etidio; etc. El método de análisis preferido para medir los niveles de SDS es un análisis espectrofotométrico basado en la reacción con naranja de acridina, como se describe en más detalle en los ejemplos y en la ref. 35.

Como una alternativa a medir el contenido de SDS relativo a la masa de la IL-2, se puede medir relativo a la actividad de la IL-2. Basado en una actividad de IL-2 de 18x10^{6} Ul en 1,1 mg de IL-2 (según lo encontrado en la PROLEUKIN^{TM}), 100 \mug de SDS por miligramo de IL-2 es equivalente a 6,111 \mug de SDS por MUI de IL-2.

En lugar de utilizar SDS en los procedimientos y productos de la invención, también es posible utilizar lauril éter sulfato de sodio (SLS) o lauril sulfato de sodio (ALS). También se pueden utilizar mezclas de SLS, ALS y/o SDS. Sin embargo, en las realizaciones preferidas de la invención se utiliza SDS.

Eliminación del detergente

Después de que se haya añadido SDS a la composición de IL-2, el procedimiento de la invención implica la eliminación de algo (pero no todo) del SDS, proporcionando de ese modo una forma microagregada de IL-2 y SDS.

El SDS se puede eliminar mediante diversas técnicas. La cromatografía de intercambio iónico puede eliminar SDS cargado negativamente, y la cromatografía de filtración en gel también se puede utilizar. Sin embargo, el SDS se elimina más preferentemente por diafiltración. En la diafiltración, el disolvente y/ los microsolutos (por ejemplo sales) se reemplazan por un disolvente y/o microsolutos diferentes. En general, la eliminación y sustitución ocurren a la misma velocidad y el volumen de la disolución puede así permanecer sustancialmente constante, y de este modo el efecto total es la sustitución de los disolventes/microsolutos originales con nuevos disolventes/microsolutos.

La diafiltración contra un tampón sin SDS es el camino preferido de eliminar SDS por ejemplo contra un tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,5.

La eliminación de SDS continúa hasta que la composición contiene entre 95 \mug y 250 \mug de SDS por cada miligramo de interleucina-2 por ejemplo entre 118-210 \mug/mg, entre 135-180 \mug/mg, o aproximadamente 160 \mug/mg. Las propiedades farmacocinéticas de la IL-2 son sustancialmente consistentes sobre este intervalo, y el nivel de SDS no es tan alto como para dar lugar a preocupaciones de toxicidad. Sin embargo, cuando la concentración de SDS cae por debajo de aproximadamente 95 \mug/mg, el tamaño de los microagregados aumenta bruscamente (Figura 1), aumentando desde una media de \sim 60 moléculas de IL-2 por agregado a 95 \mug/mg a una media de \sim 180 a 75 \mug/mg.

La adición y a continuación eliminación incompleta del SDS da como resultado los microagregados biológicamente activos de IL-2 que se encuentran en el producto PROLEUKIN^{TM}. La mezcla simple de SDS e IL-2 a las concentraciones encontradas en el producto PROLEUKIN^{TM} no dan microagregados. La referencia 36 describe un estudio en el que se añadió SDS a preparaciones de IL-2 que contenían, como el producto PROLEUKIN^{TM}, 1,1 mg de IL-2. Se encontró que el SDS precipita la IL-2 a concentraciones de detergente entre 0,02%-0,05%. En contraste, la IL-2 no precipita a estas concentraciones de SDS durante la eliminación de SDS de acuerdo con la invención - incluso cuando el SDS disminuye desde 1200 \mug/mg (aproximadamente 0,1% de SDS basado en 1,1 mg de IL-2) hasta 70 \mug (< 0,01%), no se observa precipitación de IL-2.

Durante su eliminación, la concentración de SDS se puede determinar según se describe más arriba. En le caso de que el método de eliminación sea estandarizado y reproducible entonces el control de los niveles de SDS durante la eliminación de SDS puede no ser necesario, ya que generalmente se puede esperar el mismo resultado cada vez que se realiza el procedimiento (aunque se pueden realizar medidas confirmatorias finales). Sin embargo, en el caso de que un método de eliminación sea variable, o si se requiere control regular por otras razones, se pueden realizar la medida continua o regular de los niveles de SDS hasta que se alcance la concentración final deseada.

Etapas adicionales del procedimiento

Como se menciona más arriba, las etapas clave del procedimiento para la formación de microagregados de IL-2/SDS son (a) la adición y a continuación (b) posterior eliminación de SDS. Mientras que estas dos etapas dan IL-2 en una forma adecuada para el uso como un ingrediente activo en un producto farmacéutico, ellas solas no son adecuadas para preparar una composición farmacéutica final, y se requieren otras etapas. Estas etapas pueden tener lugar antes de las etapas (a) y (b), después de las etapas (a) y (b), y/o entre las etapas (a) y (b).

La primera etapa en un procedimiento para preparar IL-2 para uso farmacéutico generalmente será la expresión de la proteína. Esto generalmente implicará el uso de una célula anfitriona que contiene un gen que codifica la IL-2 de interés, tal como una célula anfitriona bacteriana, una célula anfitriona de levadura o una célula anfitriona de mamífero. Sin embargo, como una alternativa a la ruta recombinante, también es posible activar o favorecer la expresión de un gen de IL-2 endógeno en un genoma de la célula anfitriona (por ejemplo por activación del promotor), o purificar la hormona a partir de una fuente natural (por ejemplo de la sangre).

La expresión de la IL-2 en una E. coli recombinante es una ruta preferida para obtener IL-2, con la IL-2 formando cuerpos de inclusión. E. coli adecuadas se depositaron bajo la provisión del Tratado de Budapest en el ATCC en 1984 con el número de acceso 39452 y 39626.

Se conocen en la técnica procedimientos para cultivar, cosechar, romper, o extraer la IL-2 a partir de diversos tipos de células, por ejemplo véanse las referencias 19 -30 y 37-41.

Después de la expresión, o cuando se empieza con el material expresado, se utilizará una etapa inicial de purificación de IL-2. Si la IL-2 está presente dentro de las células entonces la etapa de purificación implicará la ruptura celular (por ejemplo por choque osmótico, homogeneización, sonicación, etc.) para liberar la proteína; si la IL-2 ya está presente en disolución (por ejemplo se secretó después de la expresión) entonces no se requiere la ruptura. También se puede llevar a cabo la inactivación de células vivas, como la centrifugación. Al final de la etapa inicial de purificación, la IL-2 estará típicamente en forma precipitada, particularmente si se purifica a partir de cuerpos de inclusión, pero se habrá separado de los residuos celulares para dar una pasta rica en IL-2 para posterior tratamiento.

Después de la preparación de la IL-2 purificada precipitada, o cuando se empieza con el material precipitado, la IL-2 se puede solubilizar para separarla de otras proteínas del anfitrión etc. La disolución se puede conseguir añadiendo un detergente tal como el SDS, preferentemente para dar una concentración final de entre el 4 y el 4,5%. Esto se puede conseguir convenientemente añadiendo una disolución de SDS al 5%.

Después de la solubilización, o cuando se empieza con el material solubilizado, la IL-2 se puede reducir, para romper cualquier puente disulfuro en la proteína, y en particular para romper cualquier puente de disulfuro intermolecular. Cualquier agregado covalente de IL-2 formado por puentes disulfuro intermoleculares se convierten por lo tanto en la forma monomérica. Los agentes reductores comúnmente utilizados para reducir puentes disulfuro incluyen \beta-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT). Generalmente se mantendrá la presencia del detergente para asegurar la solubilidad de la IL-2.

Después de la reducción, o cuando se empieza con el material reducido, la IL-2 se puede a continuación re-oxidar para dar IL-2 monomérica con puentes disulfuro intramoleculares.

Después de la re-oxidación, o cuando se empieza con el material re-oxidado, la IL-2 se puede a continuación purificar adicionalmente para eliminar reactivos tales como el agente oxidante, para eliminar endotoxina, para eliminar proteínas y/o ADN de la célula anfitriona, para eliminar isoformas o confórmeros de IL-2 (por ejemplo formas oxidadas de IL-2), etc. Esta purificación se puede conseguir convenientemente utilizando HPLC en fase reversa.

Después de la purificación por RP-HPLC, o cuando se empieza con el material purificado por RP-HPLC disuelto, la IL-2 se puede precipitar por ejemplo añadiendo hidróxido sódico 0,8 N. Además de la precipitación de la IL-2, esto permite que la proteína se separé de cualquier disolvente orgánico utilizado durante la RP-HPLC. El material precipitado se puede recoger convenientemente por centrifugación.

El material obtenido después de la expresión, purificación, disolución, reducción, oxidación, RP-HPLC y precipitación (como se describe más arriba) es ideal para la redisolución y diafiltración de acuerdo con el procedimiento de la invención, aunque también se puede utilizar la IL-2 preparada por otras rutas de purificación. Típicamente, sin embargo, la IL-2 estará en forma precipitada antes de que se añada el SDS en la etapa (a) del procedimiento de la invención.

Como se menciona más arriba, los multímeros covalentemente unidos de IL-2 permanecen precipitados incluso en presencia del SDS. Como estos multímeros son mucho más grandes que las proteínas de IL-2 disueltas con SDS (porque no son disociables) se pueden eliminar convenientemente entre las etapas (a) y (b) (es decir después de la adición de SDS pero antes de la diafiltración) mediante cromatografía de filtración en gel. La presencia de SDS se debe mantener a través de la cromatografía de filtración en gel para impedir la precipitación de la IL-2.

Después de la diafiltración para eliminar el SDS y formar los microagregados, se puede someter una disolución de IL-2 a una o más de las etapas siguientes: dilución para dar una dosis final deseada; esterilización, típicamente mediante filtración esterilizante por ejemplo a través de un filtro de 0,22 \mum; formulación farmacéutica (véase más abajo); liofilización; envasado; etc.

Microagregados

El resultado de la solubilización y diafiltración del SDS mediante el procedimiento de la invención es la formación de microagregados biológicamente activos de SDS e IL-2, como los vistos en el producto PROLEUKIN^{TM}.

La estructura molecular precisa de los microagregados de SDS/IL-2 no se ha determinado, pero se cree que son estructuras micelares o similares a micelas. A una concentración de SDS de \sim 160 \mug/mg, una micela típica contiene \sim 30 moléculas de IL-2 y \sim150 moléculas de SDS. El SDS y la IL-2 en los microagregados interactúan de forma no covalente, y la cola hidrófoba de la IL-2 (restos 121-133) puede interactuar con la cadena principal alquílica del SDS para formar las micelas. Algunos SDS pueden permanecer libres en disolución.

Los microagregados se pueden detectar por dispersión luminosa, y esta técnica también permite que se mida su tamaño (véase más abajo). La relación entre la concentración de SDS y el tamaño medio de los microagregados, como se mide mediante dispersión luminosa clásica, se ha determinado empíricamente, como se muestra en la Figura 1.

A medida que procede la eliminación de SDS, se alcanza una concentración por debajo de la cual el tamaño de los agregados comienza a aumentar exponencialmente (véase la Figura 1). Según la invención, se elimina SDS hasta que su concentración está entre 95 \mug y 250 \mug por miligramo de IL-2. En este intervalo, la turbidez específica (\tau) está entre \sim0,05 y \sim1,00 cm^{2}/g, lo que implica un promedio de menos de 50 moléculas de IL-2 por agregado. A 160 \mug de SDS por mg de IL-2 la turbidez específica (\tau) es aproximadamente 0,48 (aproximadamente 27 moléculas de IL-2).

La persona experta entenderá que una composición dada de SDS/IL-2 según la invención rara vez, si es que alguna vez, contiene una sola especie de microagregado. Es decir, las medidas de dispersión luminosa revelan que los microagregados tienen una variedad de tamaños que caen dentro de una distribución, y las medidas pueden revelar un tamaño medio. Cuando una composición comprende microagregados con un tamaño medio establecido, por lo tanto, generalmente habrá algunos microagregar dos más pequeños y algunos microagregados más grandes.

Las composiciones preferidas de la invención incluyen microagregados de SDS/IL-2 tales que la composición tiene una turbidez específica (\tau) de entre 0,3 y 0,6 por ejemplo entre 0,4 y 0,5, o aproximadamente 0,45. Estas composiciones aplican particular a composiciones que se han reconstituido después de la liofilización, y el valor de \tau puede ser más bajo antes de la liofilización y reconstitución (Figura 14).

Las composiciones preferidas de la invención incluyen microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico entre 11 nm y 13 nm.

Los microagregados preferidos de la invención contienen entre 10 y 50 moléculas de IL-2 por ejemplo entre 20 y 35, y preferentemente aproximadamente 27.

En las composiciones preferidas, sustancialmente toda la IL-2 está presente en forma de microagregados. Las composiciones pueden estar sustancialmente libres de IL-2 monomérica.

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Turbidez específica (\tau)

Porque los microagregados de SDS/IL-2 de la invención se afectan por las condiciones reinantes, no se pueden utilizar técnicas tales como la cromatografía de exclusión por tamaño y la centrifugación analítica para determinar su tamaño. En su lugar, se puede utilizar la dispersión luminosa clásica (o estática) (CLS) para detectar y analizar tos microagregados midiendo su turbidez. También se puede utilizar la dispersión luminosa dinámica (DLS). Las medidas se pueden realizar en la instrumentación específica, o se pueden realizar en un fluorímetro con los monocrómetros de excitación y emisión puestos en la misma longitud de onda (por ejemplo 467 nm de una lámpara de xenón, o 488 nm de una lámpara de argón, que están alejadas de las longitudes de onda que son absorbidas por el analito) y/o utilizando filtros adecuados (por ejemplo filtros amarillos), por que el fluorímetro actúa como un fotómetro CLS a 90º.

Cuando se mide la dispersión luminosa, un parámetro espectroscópico estándar es la "relación de Rayleigh" (R_{\Theta}). Cuando se mide la luz dispersada a 90º relativa a la luz incidente (es decir cuando \Theta = 900), la relación de Rayleigh se conoce como R_{90} [por ejemplo véase la ref. 42], y se utiliza la dispersión a 90º para las medidas de turbidez.

Las medidas de turbidez (intensidad dispersada a 90º) se pueden normalizar relativas a tolueno de calidad óptica, es decir, las medidas de turbidez para una muestra estándar de tolueno se divide por el R_{90} del tolueno. Normalizando de esta forma se puede determinar a continuación los valores absolutos de la intensidad de luz dispersada.

Para los microagregados de IL-2 de la invención, la turbidez se puede medir a 467 nm o 488 nm, 25ºC. Antes de determinar la turbidez, las composiciones se pues den centrifugar o filtrar para eliminar partículas grandes (por ejemplo proteína precipitada) que, de lo contrario, distorsionarían los datos. Cuando se centrifugan, las composiciones de IL-2 de la invención retienen por lo menos el 97% (por ejemplo \geq 98%, \geq 99% o más) del total de IL-2 en el sobrenadante.

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Las medidas de turbidez para mezclas de SDS/IL-2 se pueden convertir en valores de turbidez específica absoluta (\tau) como sigue:

1

en la que:

T_{i} es la intensidad de turbidez de la composición de IL-2,

T_{t} es la intensidad de turbidez de un control de tolueno,

C es la concentración de IL-2 en la composición de IL-2.

Cuando T_{i} y T_{t} se miden en cm^{-1} y C se mide en g/ml (es decir g/cm^{3}) entonces las unidades de \tau son cm^{2}/g. Esta es la medida preferida para determinar la turbidez de las composiciones de IL-2 de la invención.

Las composiciones de la invención pueden tener una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g, pero preferentemente mayor de 0,1 cm^{2}/g. Las composiciones preferidas tienen ti menor de 0,7 cm^{2}/g. Las composiciones de la invención preferentemente tienen T en el intervalo de 0,3-0,6 cm^{2}/g.

Dispersión luminosa dinámica

Como se describe en la referencia 43, en particular el capítulo 10, la dispersión luminosa dinámica (DLS) se puede utilizar para determinar el diámetro hidrodinámico (o el radio) de las partículas dentro de la disolución. Los agregados de SDS/IL-2 de la invención se pueden detectar por dispersión luminosa dinámica (DLS). Utilizando DLS, los agregados preferidos tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm, preferentemente entre 10 nm y 15 nm, más preferentemente entre 11 nm y 13 nm, y más preferentemente aproximadamente 12 nm. Como se muestra en la Figura 17, los agregados tendrán diámetros distribuidos alrededor de esta media.

En la práctica, algunas partículas más grandes se pueden detectar por DLS (por ejemplo el pico de 54 nm en la Figura 17), pero el diámetro hidrodinámico aludido más arriba es el del pico principal de DLS, que típicamente representará por lo menos el 90% en número (por ejemplo por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 99% o más) en el espectro de DLS. Así por lo menos el 90% en número de las partículas detectadas por DLS tendrán la media numérica especificada.

La interpretación de los datos de DLS se puede complicar por la presencia de, componentes que varían lentamente, tales como partículas de polvo o fenómenos de mezcla. Para evitar estas complicaciones, las composiciones de IL-2 de la invención para la medida de DLS están preferentemente libres de partículas con un diámetro mayor de aproximadamente 1 \mum (por ejemplo libre de polvo), y esto se puede conseguir mediante el uso de filtros adecuados por ejemplo filtros de 0,22 \mum. Las composiciones deben también estar bien mezcladas antes de la medida de DLS. Si la medida de DLS revela un componente que varía lentamente en la composición, los resultados se deben rechazar y la medida se debe repetir en una muestra nueva.

La interleucina-2

La IL-2 es una proteína bien conocida, y los procedimientos y productos de la invención pueden utilizar cualquier forma adecuada de IL-2. La IL-2 será usualmente IL-2 humana, o será un derivado de IL-2 que conserva actividad biológica en seres humanos.

La IL2 se traduce de manera natural en seres humanos como una proteína precursora (por ejemplo el 153-mero en el GenBank bajo el número de acceso NP_000577.2). El precursor se separa (por ejemplo después de la Ser-20 en el NP_000577.2) para dar un producto maduro con una alanina en el extremo N (SEQ ID NO: 4).

Cuando se expresa en E. coli, es habitual reemplazar el péptido señal natural con un residuo de metionina en el extremo N (por ejemplo SEQ ID NOS: 3 y 4). Cuando se expresa, esta metionina se rompe sin intervención, dejando el residuo humano natural en el extremo N de alanina (por ejemplo SEQ ID NO: 3 se convierte en la SEQ ID NO: 1).

La IL-2 en la PROLEUKIN^{TM} carece del residuo Ala-1 natural. La ausencia de la alanina usual en el extremo N significa que la IL-2 en la PROLEUKIN^{TM} es formalmente referida como una forma "des-alanil-1" de IL-2. Se prefieren las formas des-alanil-1 de IL-2 para el uso con la invención.

La IL-2 en la PROLEUKIN^{TM} también se diseño para tener dos residuos internos de cisteina, en lugar de los tres naturales. Esto reduce el número de posibles apareamientos de los residuos de cisteina (y así los puentes disulfuro intra-moleculares) de tres a uno [46], y mejora el resultado del re-plegado de la proteína y la estabilidad de almacenamiento. La sustitución de un residuo de serina por el residuo natural de Cys-125 [44] significa que la IL-2 en la PROLEUKIN^{TM} es formalmente referida como una forma "serina-125" de IL-2. Se prefieren las formas serina-125 de IL-2 para el uso con la invención. La estructura cristalina tri-dimensional de una forma Ser-125 a partir de IL-2 humana expresada en E. coli está disponible en las bases de datos de estructuras bajo el registro "3INK".

Se pueden hacer otras sustituciones dentro de una secuencia de aminoácidos de IL-2, particularmente esas en las que la sustitución es conservativa, es decir, las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos se pueden dividir en cuatro familias: (1) ácido-aspartato, glutamato; (2) básico-lisina, arginina, histidina; (3) no polar-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) polar no cargado - glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, triptófano, y tirosina algunas veces se clasifican como la familia de aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución conservativa similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. La persona experta puede fácilmente determinar regiones de la IL-2 que pueden tolerar cambios, basados en la variación natural, alineamiento de formas activas de proteínas, etc., y se pueden probar para su actividad biológica proteínas sustituidas por ejemplo mediante el estándar 86/504.

Orientación en cuanto a las regiones de la proteína IL-2 que se pueden alterar o vía sustituciones, deleciones, o inserciones de residuos se pueden también encontrar en la técnica (por ejemplo relaciones estructura/función y/o estudios de unión), tales como las referencias 45 a 52, etc. La referencia 53 describe una variedad de mutantes de IL-2, que incluyen: Asn-26-Gln; Trp-121-Phe; deleción de todos los residuos que siguen a Arg-120; y las formas Met-1 de la misma. La referencia 44 describe la IL-2 con deleción o sustitución de la Cys-125, con o sin Ala en el extremo N. La referencia 54 describe la sustitución o deleción de residuos que incluyen los números 2, 3, 4, 5, 6, 104 y 125. La Met-104 es susceptible de oxidación, así la mutación de este residuo (por ejemplo sustitución con Glu, Val, Ala, etc.) puede mejorar la estabilidad [55]. La referencia 56 describe sustituciones de IL-2 en la Asp-20 (con His, o Ile), en Asn-88 (con Arg, Gly, o Ile), y/o en Gln-126 (con Leu o Glu), que según los informes han reducido la toxicidad y selectividad por los receptores de IL-2 de alta afinidad. La referencia 57 describe sustituciones de Arg-38-Ala y Phe-42-Lys para reducir la toxicidad para el uso durante la inmunoterapia. La referencia 58 describe la mutación de una secuencia tripéptida natural Xaa^{1}-Asp-Xaa^{2} en la que Xaa^{1} es Leu, Ile, Gly o Val, y Xaa^{2} es Val, Leu o Ser, para reducir la filtración vascular. La referencia 59 describe péptidos con una metionina en el extremo N fusionada a los 30 primeros residuos de la IL-2, opcionalmente con una sustitución Asp-20-Lys, que se dice que retiene la actividad similar a la IL-2.

Otras sustituciones conocidas incluyen: T7A, T7D, T7R, K5L, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, Q11A, Q11R, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K351, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L361, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41 E, T41 G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M461, E61 K, E61 M, E61 R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P651, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81 E, R81 K, R81 L, R81 M, R81 N, R81 P, R81 T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91 A, V91 D, V91 E, V91 F, V91 G, V91 N, V91 Q, V91 W, L94A, L941, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q1261, y Q126V.

Las variantes biológicamente activas de IL-2 tendrán generalmente por lo menos aproximadamente el 70%, (por ejemplo \geq 80%, \geq 90%, \geq 95%, \geq 98%, \geq 99%) identidad de la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la molécula polipeptídica de IL-2 de referencia, tal como la IL-2 humana natural tratada más arriba. Una variante puede, por ejemplo, diferir en solamente 1 a 15 residuos de aminoácidos, solamente 1 a 10 residuos, tal como 6-10, solamente 5, solamente 4, 3, 2, o incluso sólo 1 residuo de aminoácido.

Se ha divulgado la extensión del extremo C de la IL-2 [60]. La IL-2 utilizada con la invención no tiene preferentemente ninguna de tales extensiones en el extremo C.

Otras formas de IL-2 que se pueden utilizar incluyen secuencias no humanas. Por ejemplo, la IL-2 puede ser de: mono rhesus (Macaca mulatto; Registro de GenBank P51498); papión olivo (Papio anubis; GenBank Q865Y1); mangabeye ceniciento (Cercocebus torquatus atys; P46649); macaco cangrejero (Macaca fascicularis; Q29615); gibón común (Hylobates lar, ICGI2); mono ardilla común (Saimiri sciureus; Q8MKH2); vaca (Bos taurus; P05016 o NP-851340; la secuencia madura representada por los residuos 24-158 del Registro del GenBank Nº NP-851340); búfalo de agua (Bubalus bubalis; Q95KP3); caballo (Equus caballus; P37997); cabra (Capra hircus; P36835); oveja (Ovis aries; P19114); cerdo (Sus scrofu; P26891); ciervo rojo (Cervus elaphus; P51747); perro (Canis familiaris; Q29416); gato (Fells catus; 407885); conejo (Oryctolagus cuniculus; 077620); orca (Orcinus orca; 097513); elefante marino del norte (Mirounga angustirostris; 062641); ratón casero (Mus musculus; NP-032392); ratón moruno (Mus spretus; 408867); rata Noruega (Rattus norvegicus; P17108); gerbo de Mongolia (Meriones unguiculatus; Q08081). También se pueden utilizar cualquiera de las formas variantes descritas en estas entradas del GenBank. Estas entradas del GenBank generalmente describen las secuencias precursoras que, como se describe más arriba para la secuencia humana, se transforman para dar una forma final biológicamente activa por ejemplo por separación de los 20 primeros aminoácidos.

Se prefieren particularmente las formas des-alanil-1, serina-125 de la IL-2 humana para el uso con la invención. La forma más preferida de IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos 132-mero mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 1), como la encontrada en la PROLEUKIN^{TM}. Las composiciones están preferentemente libres de IL-2 que no tenga Ala en el extremo N. La proteína de la Figura 2 se puede expresar utilizando la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 2), después de la ruptura (separación) de la metionina traducida en el extremo N.

La IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} es no glicosilada, como consecuencia del anfitrión de expresión E. coli. Se prefiere IL-2 no glicosilada para el uso con la invención.

Los métodos para detectar la presencia de IL-2 en una composición y para cuantificarla son conocidos en la técnica. La detección inmunológica utilizando anticuerpos anti-IL-2 (por ejemplo ELISA) es el método de detección más común, y estos métodos también se pueden utilizar cuantitativamente. Otros métodos cuantitativos incluyen el análisis de aminoácidos, el ensayo de proteínas de Lowry con un estándar de proteína reglamentariamente aprobado, análisis de HPLC, y medidas intrínsecas de absorbancia ultravioleta.

La medida cuantitativa estándar para la IL-2 es la Unidad Internacional (UI) que se basa no en la masa de proteína sino en la actividad en un ensayo biológico. Según el estándar 86/504, 1 UI es la cantidad de IL-2 que produce el 50% de proliferación máxima de una línea celular dependiente de IL-2 establecida [61] CTLL-2. La cuantificación de la actividad de la IL-2 en otras preparaciones se consigue comparando las curvas dosis respuesta de la preparación con los estándares disponibles (por ejemplo la ampolla estándar de IL-2 WHO, que contiene 100 UI/ml después de la reconstitución) utilizando un análisis de líneas paralelas, o mediante programas computerizados tal como el programa ALLFIT [62,63]. En la práctica, cuando la fabricación está estandarizada entonces es posible una conversión entre el peso del fármaco y la Uls. Para el producto PROLEUKIN^{TM}, por ejemplo, la conversión es 1,1 mg de IL-2 es igual a 18x10^{6} Ul.

La actividad se puede convertir en actividad específica (es decir actividad por unidad de masa de IL-2 por ejemplo UI/mg) dividiéndola por la masa de IL-2 presente. Una composición preferida de la invención tiene una actividad específica de entre 16 y 17 MUl/mg.

Composiciones farmacéuticas

Los procedimientos de la invención dan microagregados de IL-2/SDS que son adecuados para uso farmacéutico en seres humanos, y así la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende los microagregados de IL-2/SDS de la invención. Sin embargo, en lugar de utilizar simplemente microagregados directamente de la diafiltración, típicamente se formularán antes de la administración a pacientes.

Por ejemplo, los microagregados se pueden diluir para dar una concentración estándar, mientras que se mantiene la relación IL-2/SDS. La dilución para dar una concentración de IL-2 de aproximadamente 1,1 mg/ml es típica.

Los microagregados (por ejemplo después de la dilución) se pueden mezclar con estabilizadores, particularmente si van a ser liofilizados. Es típica la adición de azúcares (por ejemplo, sacarosa, trehalosa) para dar estabilidad durante la liofilización, y un estabilizador preferido es el manitol. Este alcohol de azúcar se puede añadir para dar una concentración final de entre 40 y 50 (por ejemplo 45,5) mg de manitol por miligramo de IL-2 (50 mg por 1,1mg de IL-2). También se puede añadir seroalbúmina humana (preferentemente recombinante) como un estabilizador. También se pueden usar mezclas de azúcares por ejemplo sacarosa y manitol, trehalosa y manitol, etc.

Se puede añadir tampón a la composición de microagregado por ejemplo un tampón Tris, un tampón de histidina, un tampón de glicina o, preferentemente, un tampón fosfato (por ejemplo que contenga dihidrogeno fosfato de sodio e hidrogeno fosfato de disodio). Se prefiere la adición de un tampón para dar un pH entre 7,2 y 7,8, y en particular un pH de aproximadamente 7,5.

Las composiciones que comprenden los microagregados se pueden esterilizar, típicamente mediante esterilización por filtración por ejemplo a través de un filtro de 0,22 \mum. Esta puede estar precedida por la filtración a través de un filtro con poros más grandes.

Las composiciones acuosas que comprenden los microagregados se pueden envasar directamente en jeringas, listas para inyección. También se pueden envasar en nebulizadores, listos para inhalación.

Las composiciones acuosas que comprenden los microagregados se pueden liofilizar antes de la distribución. El producto acuoso o liofilizado se puede envasar en contenedores (por ejemplo viales), que a continuación se pueden sellar herméticamente. La liofilización tendrá lugar típicamente en viales, con el sellado después de la liofilización. El producto liofilizado equivalente a 22x10^{6} Ul de IL-2 se puede envasar en un único vial como una dosis unitaria, para la reconstitución en un volumen acuosos final de aproximadamente 1,1 ml, para dar aproximadamente 18x10^{6} Ul/ml. Por lo tanto, también se pueden envasar cantidades fraccionarias (por ejemplo ^{1}/_{2}, ^{1}/_{3}, ^{1}/_{4}, ^{1}/_{5}, ^{1}/_{8}) como dosis unitarias. En particular, se pueden utilizar dosis unitarias de aproximada- mente 9x10^{6} Ul, aproximadamente 4,5x10^{6} Ul y aproximadamente 14x10^{6} Ul.

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Para la reconstitución después de la liofilización, se puede utilizar agua estéril para inyección. También es posible reconstituir una torta liofilizada con una composición acuosa que comprende seroalbúmina humana (preferentemente recombinante). Se prefiere la reconstitución en un volumen acuosos de entre 1,0 ml y 1,2 ml (es decir la IL-2 se puede diluir para dar la misma concentración que antes de la liofilización). Este producto reconstituido a continuación se puede diluir asépticamente en un volumen más grande de líquido para infusión intravenosa por ejemplo en aproximadamente 50 ml de una solución D5W (Inyección de Dextrosa al 5%). La turbidez específica permanece sustancialmente constante durante la dilución con D5W, hasta que la concentración de IL-2 cae por debajo de aproximadamente 0,1 mg/ml. La dilución puede tener lugar en diversos contenedores por ejemplo botellas de vidrio, bolsas de plástico (por ejemplo cloruro de polivinilo), etc. Se debe evitar la dilución para dar una concentración final de IL-2 fuera del intervalo 30-70 \mug/ml. Se deben evitar las condiciones que causan cambios en la microagregación por ejemplo la reconstitución con Agua Bacteriostática para Inyección o con Inyección de Cloruro Sódico al 0,9%.

Una primera composición farmacéutica preferida es así una composición acuosa con un pH de aproximadamente 7,5, que comprende 1,1 mg/ml de IL-2, 0,18 mg de SDS, 50 mg/ml de manitol y tampón fosfato, en la que la IL-2 y el SDS forman microagregados en los cuales el número medio de moléculas de IL-2 por agregado está entre 10 y 50. Estas composiciones se pueden reconstituir a partir del material liofilizado.

Una segunda composición farmacéutica preferida es el producto de diluir la primera composición farmacéutica preferida en una solución D5W.

Las composiciones preferidas están libres de conservantes, libres de antibióticos, y libres de proteínas distintas de IL-2 (incluyendo libres de HSA) es decir estos productos son indetectables.

Métodos y usos farmacéuticos

La invención proporciona un método para tratar a un paciente, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al paciente. El paciente es preferentemente un ser humano, y puede ser un niño (por ejemplo un niño pequeño o bebé), un adolescente o un adulto, pero generalmente será un adulto.

La invención también proporciona los microagregados de SDS/IL-2 de la invención para uso como un medicamento.

La invención también proporciona el uso de los microagregados de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un paciente.

Estos usos, métodos y medicamentos son preferentemente para el tratamiento de un cáncer, particularmente esos con tumores sólidos, tales como carcinoma de células renales o melanoma, en los que el cáncer puede ser metastásico. Los usos, métodos y medicamentos también ser pueden utilizar para el tratamiento de pacientes que han recibido un transplante de tejido u órgano, o que están listos para recibir uno. Los usos, métodos y medicamentos también se pueden utilizar para el tratamiento de pacientes que están infectados con VIH, incluyendo esos con y sin SIDA.

Los pacientes para tratamiento con la invención, por lo tanto, habrán sido diagnosticados con un cáncer. Los pacientes que no deben ser tratados de acuerdo con la invención, sin embargo, pueden incluir: (1) pacientes con hipersensibilidad a la IL-2 o a cualquier otro componente de la composición farmacéutica; (2) pacientes con un estado general del ECOG (Grupo de Oncología Cooperativa del Este) \geq 2; (3) pacientes con una presencia simultánea de un estado general del ECOG >1 y más de un órgano con sitios de enfermedad metastásica y un periodo de <24 meses entre el diagnóstico inicial del tumor primario y la fecha en que el paciente es evaluado para el tratamiento con IL-2; (4) pacientes con una historia significativa o evidencia concurrente de enfermedad cardiaca grave; (5) pacientes con evidencia de infección activa que requiere terapia antibiótica; (6) pacientes con un PaO_{2} < 60 mm Hg durante el descanso; (7) pacientes con disfunción pre-existente grave de órgano principal; y (8) pacientes con metástasis en el sistema nervioso central o trastornos epilépticos, con la excepción de pacientes con metástasis cerebral tratada con éxito.

Los métodos para comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico de IL-2 son conocidos en la técnica.

Las curvas de suero semivida de la IL-2 en seres humanos que siguen a la administración intravenosa en una embolada o a la infusión intravenosa se pueden describir como bi-exponenciales. Para una embolada, el T_{1/2}\alpha es 8 minutos y el T_{1/2}\beta es 88 minutos; para una infusión, el T_{1/2}\alpha es 15 minutos y el T_{1/2}\beta es 96 minutos. Los niveles en suero observados son proporcionales a la dosis de IL-2.

Las características de los medicamentos adecuados se dan más arriba en la sección titulada "Composiciones farmacéuticas". Estas composiciones generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa se puede conseguir mediante inyección parenteral (por ejemplo de manera intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, o en el espacio intersticial de un tejido), o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar o en otra mucosa. En general, sin embargo, la IL-2 se administra por inyección intravenosa (por ejemplo infusión continua o en una embolada) o por inyección subcutánea (por ejemplo infusión continua o en una embolada).

La dosificación de IL-2 generalmente se dimensiona al tamaño del cuerpo del paciente, medido o por el peso corporal (kg) o por la superficie corporal (BSA; medida en m^{2}, medida, o estimada por una combinación de peso y altura del paciente). Aunque no hay una conversión exacta entre la dosificación por peso y por BSA, hay una buena aproximación: para una persona de peso y altura medios (50º percentil para cada uno), 25000 Ul/kg = 1 MUl/m^{2}.

El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Las dosis se pueden dar por embolada o por infusión. Un régimen típico de tratamiento por IL-2 es administrar 18x10^{6} Ul por m^{2} por 24 horas como una infusión continua durante 5 días, seguido por 2-6 días sin recibir IL-2, a continuación 5 días adicionales de IL-2 intravenosa como una infusión continua como antes, y después 3 semanas sin recibir IL-2. Este es un "ciclo de inducción" único para IL-2. Después del periodo de descanso de 3 semanas del primer ciclo, puede comenzar un segundo ciclo de inducción. Se pueden dar hasta 4 ciclos de mantenimiento con intervalos de 4 semanas a pacientes que responden o tienen estabilización de la enfermedad. Sin embargo, si un paciente no puede tolerar este régimen de dosificación, la dosis se debe reducir o interrumpir la administración hasta que la toxicidad se haya moderado. Otro régimen de tratamiento por IL-2 es administrar 6x10^{5} Ul por kg mediante una embolada intravenosa cada 8 horas, durante 14 dosis en un periodo de 5 días, con un segundo tratamiento que se da después de un periodo de descanso de 9 días.

Las administraciones preferidas incluyen: infusión intravenosa para el tratamiento de carcinoma metastásico de células renales; infusión intravenosa para el tratamiento de melanoma metastásico; embolada subcutánea para el tratamiento de carcinoma metastásico de células renales; infusión subcutánea para el tratamiento de:. carcinoma metastásico de células renales; administración pulmonar por inhalación para el tratamiento de carcinoma metastásico de células renales con metástasis pulmonar.

Politerapia

Los microagregados de IL-2 de la invención se pueden utilizar como el ingrediente activo de productos farmacéuticos. Tales productos farmacéuticos se pueden utilizar por si mismos para tratar pacientes, o se pueden utilizar conjuntamente con otros ingredientes activos. Típicamente, la IL-2 no se mezclará con el otro ingrediente activo antes de la administración; en su lugar, la IL-2 y el otro ingrediente activo se administrarán como medicinas separadas independientes en un protocolo combinado. La politerapia es particularmente idónea para tratar cánceres, incluyendo cánceres malignos y metastásicos.

Así la invención proporciona (a) microagregados de IL-2 de la invención, y (b) un segundo agente farmacéutico, para administración separada simultánea o secuencial.

La invención también proporciona una preparación o sistema farmacéuticos, que comprende (a) un primer agente farmacéutico, que comprende microagregados de IL-2 de la invención; y (b) un segundo agente farmacéutico, en el que dichos primer y segundo agentes están o en mezcla o son composiciones separadas por ejemplo para administración separada simultánea o secuencial.

La invención también proporciona un kit que comprende (a) un primer agente farmacéutico, que comprende los microagregados de IL-2 de la invención; y (b) un segundo agente farmacéutico.

La invención también proporciona el uso de (a) los microagregados de IL-2 de la invención y (b) un segundo agente farmacéutico, en la fabricación de un medicamento combinado.

La invención también proporciona el uso de los microagregados de IL-2 de la invención en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para la administración a un paciente que ha sido pre-tratado con un segundo agente farmacéutico. Igualmente, la invención proporciona el uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para la administración a un paciente que ha sido pre-tratado con los microagregados de IL-2 de la invención. El pre-tratamiento puede ser reciente (por ejemplo dentro de las 24 horas que preceden a la administración de dicho medicamento), intermedio (por ejemplo más de 24 horas previas, pero no más de 4 semanas), más distante (por ejemplo por lo menos 4 semanas previas), o muy distante (por ejemplo por lo menos 6 meses previos), con estos periodos de tiempo referidos a la dosis de pre-tratamiento más reciente. El paciente puede ser refractario al tratamiento por el agente farmacéutico que se administró en el pre-tratamiento.

La invención también proporciona el uso de los microagregados de IL-2 de la invención en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento se co-administra con un segundo agente farmacéutico. Igualmente, la invención proporciona el uso de un segundo agente farmacéutico en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento se co-administra con los microagregados de IL-2 de la invención. Los dos agentes se administran preferentemente dentro del plazo de 4 horas entre ellos.

Los segundos agentes farmacéuticos preferidos se seleccionan de la tabla siguiente, que también incluye detalles de las enfermedades que la politerapia se puede utilizar para tratar (y, cuando es apropiado, detalles básicos de cómo se puede administrar la politerapia):

2

3

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Cuando el segundo agente es un anticuerpo, preferentemente es un anticuerpo monoclonal, más preferentemente un anticuerpo humano o humanizado. Los anticuerpos generalmente se administrarán por inyección por ejemplo subcutánea o intravenosa. Los anticuerpos se pueden conjugar a otros agentes activos por ejemplo tiuxetano, ozogamicina, radionúclidos, ^{131}I, etc., particularmente para el tratamiento del cáncer.

En general, el segundo agente puede ser cualquier anticuerpo que proporcione ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo). La politerapia basada en IL-2 es más útil con anticuerpos que median en la ADCC para tratar el cáncer que con agentes que tratan el cáncer por inhibición de la vascularización o por alteración de la transducción de señales del ciclo celular.

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Definiciones

La terminología "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x \pm 10%. Cuando sea necesario, el término "aproximadamente" se puede omitir.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" se puede omitir de la definición de la invención.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar utilizando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de hueco afín con una penalización de apertura del hueco de 12 y una penalización de extensión del hueco de 2, matriz de BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en la referencia 64.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el aumento en la turbidez específica (\tau) según se elimina el SDS durante la diafiltración.

Las Figuras 2 y 3 muestran la secuencia de aminoácidos de la IL-2 en el producto PROLEUKIN^{TM} (SEQ ID NO: 1). Esta secuencia (i) carece de la metionina en el extremo N de la SEQ ID NO: 3, (ii) carece del residuo de alanina encontrado en el extremo N de la IL-2 humana madura natural como se ve en la SEQ ID NO: 4, y (iii) tiene una sustitución serina en el residuo Cys-125 vista en la SEQ ID NO: 4.

La Figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2, que incluye los codones de iniciación y parada, y se expresa como la SEQ ID NO: 3 antes de separar la metionina en el extremo N). Los números en la izquierda indican el número de la primera base en cada fila, según se cuente desde el extremo 5' de la cadena (+) ADN del gen de IL-2. Los números bajo la secuencia de aminoácidos indican números de residuos, según se cuenta desde el extremo N de la IL-2 humana natural. Las flechas indican diferencias de nucleótidos respecto a la IL-2 humana (es decir las diferencias entre las SEQ ID NOS: 2 y 5).

La Figura 5 muestra la turbidez específica (\tau, cm^{2}/g) de las siete muestras utilizadas para la prueba farmacocinética, con diferentes concentraciones de SDS (\mug de SDS por mg de IL-2), y la Figura 6 muestra la proporción de la IL-2 total que se puede granular por centrifugación en las siete muestras.

La Figura 7 muestra la bioactividad en plasma para seis de las siete muestras. La Figura 8 compara las muestras de 160 \mug/mg y 25 \mug/mg, y la Figura 9 es una composición de las Figuras 7 y 8. Los ejes X muestran tiempo (horas) después de la inyección; los ejes Y muestran bioactividad en plasma (ng/ml).

La Figura 10 muestra T (cm^{2}/g) contra la concentración de SDS (mg/\mug) durante la diafiltración, y la Figura 11 convierte \tau en MW (kDa).

La Figura 12 muestra la bajada en la concentración de SDS durante la diafiltración.

La Figura 13 superpone los resultados de turbidez de la Figura 10 sobre el perfil de eliminación de SDS de la Figura 12.

La Figura 14 muestra el efecto de la liofilización sobre \tau (cm^{2}/g). Los cuadrados muestran los valores de pre-liofilización, y los círculos muestran los valores de post-liofilización. El eje X muestra la concentración de SDS en las muestras (\mug/mg).

La Figura 15 muestra la bioactividad de los microagregados de IL-2, antes de y después de la dilución con suero, y una comparación con IL-2 monomérica.

Las Figuras 16 y 17 muestran los espectros de dispersión luminosa dinámica para los microagregados de IL-2. La Figura 16 está distribuida por masa de los componentes de la disolución, y la Figura 17 está distribuida por número.

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Modos para llevar a cabo la invención 1/ Preparación de microagregados de 1L-2

Se cultivó bajo condiciones estándar E. coli transformada con un plásmido que escondía la secuencia de nucleótidos de la Figura 4, tal que se expresó la proteína IL 2 que tenía la secuencia de la Figura 2. Después del cultivo, la IL-2 estaba predominantemente en forma de cuerpos de inclusión.

La recuperación principal de IL-2 incluyó concentración, destrucción celular, diafiltración, inactivación, re-destrucción y suspensión de sacarosa. La concentración de las células cosechadas se realizó utilizando filtros de flujo transversal para disminuir el volumen de trabajo aproximadamente cinco veces. Las células se destruyeron por homogeneización para facilitar el aislamiento de los cuerpos de inclusión de IL-2. Las sales de los medios de fermentación se eliminaron por diafiltración y la bacteria anfitriona en la disolución de diafiltración se mató mediante la adición de un alcohol. Después del tratamiento con alcohol, las células se destruyeron por homogeneización. Se añadió sacarosa par obtener una mezcla de densidad más alta, para permitir la separación de los cuerpos de inclusión de IL-2 de los residuos celulares durante la centrifugación. La pasta de partículas de IL-2 se recogió por centrifugación, se tomaron alícuotas y se almacenaron a -70ºC o más frío, hasta el procesamiento adicional.

La pasta de partículas de IL-2 se solubilizó con SDS y se redujo con ditiotreitol (DTT) para obtener una forma monomérica de IL-2 soluble sin ningún enlace disulfuro. Esta etapa del procedimiento se realizó para aumentar el rendimiento cuando la IL-2 se cromatografíe en la siguiente etapa.

La forma soluble monomérica de IL-2 se purificó mediante un procedimiento que incluía las etapas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), oxidación, concentración, RP-HPLC, precipitación y centrifugación. La primera etapa cromatográfica de SEC se realizó para separar la IL-2 de las proteínas anfitrionas y los ácidos nucleicos. Las fracciones que contenían IL-2 se recogieron y se juntaron. La IL-2 se oxidó para obtener el enlace disulfuro intramolecular. La concentración de la disolución de IL-2 se llevó a cabo utilizando ultrafiltración para disminuir el volumen de trabajo. La segunda etapa cromatográfica, RP-HPLC preparativa, se realizó para separar la IL-2 de las endotoxinas bacterianas, ácidos nucleicos, y proteínas anfitrionas, y para eliminar las isoformas de IL-2, incluyendo las formas oxidadas. Las fracciones que contenían IL-2 se recogieron y se juntaron. La IL-2 se precipitó por adición de hidróxido sódico (NaOH) y se recogió por centrifugación. Esta etapa del procedimiento se llevó a cabo para eliminar los disolventes utilizados en la purificación pro RP-HPLC. El producto en este estadio es denominado como la "pasta de HPLC".

A continuación la pasta de HPLC se resolubilizó añadiendo una disolución de Na_{2}HPO_{4} 0,05 M + 1% SDS. Cuando se añade el SDS a una concentración suficiente entonces la composición contiene principalmente IL-2 solubilizada monomérica, pero se puede haber formado una pequeña cantidad de IL-2 oligomerizada (es decir moléculas de IL-2 covalentemente unidas en forma de oligómeros) durante la polimerización. Estos oligómeros se eliminaron mediante cromatografía de filtración en gel, que también elimina cualquier disolvente orgánico residual de las etapas previas.

Como el SDS puede ser tóxico para las células, se elimina de la IL-2 solubiliza da. La disolución se diafiltró contra tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,5, hasta que el nivel de SDS alcanza aproximadamente 160 \mug/mg de IL-2. Los microagregados de IL-2 y SDS comienzan a formarse a aproximadamente 500-600 \mug/mg, y su tamaño aumenta gradualmente según el nivel de SDS disminuye adicionalmente hasta el nivel objetivo de 160 \mug/mg (Figura 1). Esta eliminación de SDS, que es clave para la formación de los microagregados, es la última etapa en el procedimiento de purificación de la IL-2, antes de la formulación.

2/ Formulación de los microagregados de 1L-2 para uso farmacéutico

La mezcla de SDS/IL-2 diafiltrada, que contiene los microagregados, se probó para concentración de proteínas (mg/ml) dividiendo la absorbancia a 280 nm por el coeficiente de extinción de la IL-2 (0,79). También se midió el volumen de la disolución de IL-2 diafiltrada (ml). La cantidad total de proteína IL-2 (mg) se calculó multiplicando el volumen de la disolución de IL-2 diafiltrada por la concentración de proteína. El volumen final de trabajo (ml) para la formulación se calculo multiplicando los mg totales de proteína por el factor 0,909. Este factor tiene en cuenta la pérdida de IL-2 durante la filtración.

Para estabilizar la IL-2 durante la liofilización, se añadió un ¼ de volumen de una disolución de manitol al 20%, para dar una concentración final de manitol del 5% (es decir 50 mg/ml). También se añadió tampón de fosfato sódico 10 mM pH 7,5 hasta el volumen final de trabajo. Después de que se añadieron el manitol y el tampón, se determinó la concentración de IL-2 en la disolución formulada midiendo la absorbancia a 280 nm.

El resultado final después de la formulación fue una disolución a granel a pH 7,5, que contenía: IL-2 en una concentración final de 1,1 \pm 0,05 mg/ml; 0,18 mg/ml de SDS; 50 mg/ml de manitol; 0,17 mg/ml de fosfato sódico monobásico; y 0,89 mg/ml de fosfato sódico dibásico.

La disolución a granel formulada de IL-2 se esterilizó por filtración a un depósito estéril. El producto se transfiere desde este depósito a viales estériles. En cada vial se introdujo 1,2 ml de la disolución a granel. A continuación los viales se colocaron en un liofilizador y se liofilizaron. Después los tapones se aplicaron, y los tapones se sobre sellaron. A continuación los viales se etiquetaron y empaquetaron.

3/ Efecto de la concentración de SDS sobre la turbidez

Antes de llegar al intervalo preferido de concentración de SDS, se preparó la IL-2 por el método descrito más arriba, excepto que se sacaron muestras grandes, (\sim300 mg de IL-2) en diversos puntos durante la diafiltración para la investigación de; turbidez, para establecer el efecto del SDS sobre la agregación de IL-2.

La Figura 12 muestra la concentración de SDS durante la diafiltración del material de partida. La concentración disminuye según una línea recta en el eje logarítmico. Las muestras se sacaron en las siguientes concentraciones de SDS (\mug por mg de IL-2): 1195, 536, 351, 217, 173, 137, 123, 104 y 72.

La pureza de IL-2 fue la misma en cada muestra (100% por SDS-PAGE, \geq98,5% por HPLC). La turbidez se midió a 488 nm y se convirtió a una turbidez específica absoluta (\tau) como se describe más arriba, basada en la concentración de IL-2 en las muestras. Los resultados se muestran en la Figura 10, y la Figura 13 superpone los resultados de turbidez sobre el perfil de eliminación de SDS de la Figura 12. Por debajo de aproximadamente 300 \mug/mg la turbidez aumenta gradualmente, y el aumento llega a ser muy pronunciado por debajo de aproximadamente 95 \mug/mg.

Los valores de \tau se pueden convertir en pesos moleculares inferidos mediante la fórmula siguiente:

4

Los resultados de esta conversión para las muestras de pre-liofilización se muestran en la Figura 11. Estos y otros datos muestran que un MW que corresponde a una IL-2 monomérica se ve por encima de aproximadamente 600 g/mg, y el MW comienza a aumentar significativamente cuando el SDS está por debajo de aproximadamente 300 \mug/mg, con el aumento que llega a ser muy pronunciado cuando el SDS cae por debajo de aproximadamente 100 \mug/mg.

Basado en el MW de la IL-2 monomérica (15,3 kDa para la IL-2 natural), el peso molecular de un agregado se puede convertir en un número inferido de monómeros de IL-2 por agregado.

4/ Liofilización y turbidez específica

Durante la diafiltración para eliminar el SDS, se sacaron muestras de 15 ml a las siguientes concentraciones de SDS: 1155; 840; 585; 400; 190; y 155 \mug/mg de IL-2. Se determinó la turbidez de estas muestras antes y después de la formulación (es decir después de la adición de manitol, tampón fosfato, Liofilización y reconstitución) En ambos casos, las medidas de turbidez se precedieron por filtración a través de un filtro de 0,2 pm para eliminar cualquier agregado grande.

La Figura 14 muestra el efecto de la liofilización sobre T (escala logarítmica) para estas muestras. El gráfico muestra que la Liofilización no destruye los microagregados, sino que a menudo puede aumentar ligeramente la turbidez específica (es decir los agregados aumentan en tamaño), sin afectar la dependencia sobre la concentración de SDS. El efecto es generalmente de menor importancia en el intervalo preferido de SDS.

5/ Dispersión luminosa dinámica

Los microagregados de IL-2 se prepararon como se describe más arriba, con una concentración de SDS de 160 \mug/mg, y se analizaron por DLS. Los resultados se muestran en las Figuras 16 y 17. La Figura 16 muestra los resultados de DLS distribuidos por masa de los componentes de la disolución, y la Figura 17 los muestra por número.

El la Figura 16, el pico principal tiene un diámetro hidrodinámico medio de 12,7 nm, que representa el 99,02% de la masa total. También hay un pico posterior con un diámetro medio de 55,6 nm, que representa el 0,98% de masa restante. El la Figura 17, el pico principal tiene un diámetro hidrodinámico medio de 11,7 nm, que representa el 99,99% del total en número. También hay un pico posterior con un diámetro medio de 53,7 nm, que representa el 0,01% de partículas restantes.

6/ Comparación de los microagregados frente a la IL-2 monomérica

La IL-2 microagregada se comparó a la IL-2 monomérica en diversas pruebas. Los microagregados de IL-2 se prepararon según se describe más arriba. Para propósitos comparativos, la IL-2 se preparó en una forma monomérica, en la que se utilizó Tween 80 como detergente en lugar de SDS. Este detergente no forma microagregados con IL-2, pero el detergente solubiliza la IL-2 y da un producto monomérico bioactivo.

Se confirmó que ambas formas de IL-2 eran bioactivas. La IL-2 microagregada tuvo una actividad de aproximadamente 20 MUl/mg. Cuando se diluyó con suero ex vivo, la actividad cayó ligeramente. En ambos casos, la actividad fue ligeramente más alta que la de la IL-2 monomérica (Figura 15). Así los microagregados de IL-2 de la invención son capaces de disociarse para dar un producto bioactivo, y la bioactividades equivalente a la de la IL-2 que no se ha agregado.

La distribución in vivo de IL-2 radiomarcada se comparó después de la administración intravenosa de la proteína o en forma microagregada con SDS o en forma monomérica. La forma microagregada distribuyó preferentemente al pulmón, hígado y riñones, mientras que el producto monomérico distribuyó casi el 100% a los riñones. La microagregación por lo tanto tiene un impacto en la distribución in vivo.

También se comparó la IL-2 microagregada y monomérica en un modelo de tumor de metástasis. Células tumorales B16F10 se inyectaron de forma intravenosa en las colas de ratones y 14 días más tarde, se inspeccionaron los pulmones para tumores. Los animales tratados recibieron IL-2 diariamente desde los días 3-10. Los números mediana de las metástasis de pulmón en el día 14 fueron como sigue:

5

La forma microagregada de IL-2 es así mas efectiva en el modelo de tumor que la forma monomérica, en el que la metástasis se puede prevenir utilizando dosis mucho más bajas de IL-2. Sin embargo, los datos no son directamente comparables porque la IL-2 puede ella misma ser tóxica, por ejemplo 10 mg/kg de microagregados de IL-2 pueden matar aproximadamente % de una población experimental. La comparación más significativa es así a la dosis no letal más alta, concretamente a la dosis de 7,5 mg/kg. A esta dosis equitóxica, el número mediana de metástasis visto con microagregados fue 4,5 (intervalo 1-18), comparado a 16 (intervalo 4-57) con IL-2 monomérica, siendo la diferencia estadísticamente significativa. Esta diferencia representa un índice terapéutico de 3 a 5 veces mejor para la forma microagregada de IL-2.

Estudios adicionales con el modelo artificial de metástasis B16 revelaron que los niveles de SDS en el producto final no parecen tener impacto en la eficacia. Por ejemplo, una composición con 160 \mug/mg de SDS rindió de la misma manera que una con 181 \mug/mg. Por lo tanto, con el SDS en el intervalo de 95-250 \mug/mg la actividad anti-tumoral permanece óptima mientras que se evita la toxicidad relacionada con el SDS.

7/ Efectos farmacocinéticos de la concentración final de SDS

Como se muestra más arriba, la turbidez de las mezclas de IL-2/SDS aumenta según disminuyen los niveles de SDS durante la diafiltración. En una prueba fármaco cinética, la diafiltración se continuó mucho más allá del objetivo típico de 160 \mug/mg, justo se bajó a 25 \mug/mg. Las muestras se tomaron durante el procedimiento de diafiltración en diversos estadios: 1090 \mug/mg; 200 \mug/mg; 160 \mug/mg; 125 \mug/mg; 95 \mug/mg; 65 \mug/mg; y 25 \mug/mg.

Todas las muestras excepto la más diluida (25 \mug/mg) fueron visiblemente claras, y la Figura 5 muestra la turbidez específica (\tau) de las siete muestras. La caída en \tau en la concentración más baja refleja un enorme aumento en la precipitación de proteína a 25 \mug/mg, que fue visible a simple vista. La Figura 6 muestra la proporción de total que se puede granular por centrifugación en las siete muestras, y se ve un gran aumento en la concentración más baja de SDS mientras que las concentraciones más altas son esencialmente constantes. Este material precipitado sedimenta y así no causa turbidez, lo que explica el bajo valor de \tau en la Figura 5.

En contraste con la turbidez y precipitación variables, la bioactividad (Ul) fue esencialmente constante para las siete muestras (aproximadamente 19 Ul/mg).

Para estudiar la farmacocinética, todas las muestras excepto la más diluida se inyectaron en una sola embolada en la vena comentada de ratas (triplicada pro dosis de SDS, 18 ratas en total) a 0,2 mg de IL-2 por kg de peso corporal, basado en una extrapolación alómétrica de una dosis humana. Las muestras de sangre se tomaron a 1, 3, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección y se valoraron para la bioactividad de IL-2. La Figura 7 muestra la bioactividad en plasma (ng/ml) de estas muestras. Entre 0,5 horas y 1 hora, la línea de la parte superior es la dosis de 160 \mug/mg (\blacksquare), y la línea más baja es 65 \mug/mg (\Delta), aunque todas las líneas son muy similares.

En un segundo estudio, la muestra con la línea más alta en el primer experimento (160 \mug/mg) se comparó a la muestra más diluida (25 \mug/mg). Los parámetros farmacocinéticos de la muestra de 160 \mug/mg en el segundo estudio encajaron con los del primer estudio. Sin embargo, mientras que las líneas en la Figura 7 son todas de formas similares unas a otras, la muestra más diluida dio resultados muy diferentes (Figura 8). La velocidad de clarificación calculada de las curvas fue diferente \sim30 veces: 12,7 ml/min/kg para la dosis de 160 \mug/mg, y 362 ml/min/kg para la dosis de 25 \mug/mg.

Cuando los resultados de los dos experimentos se comparan, la muestra más diluida es claramente distinta de las otras seis muestras (Figura 9).

Así el estado de agregación de la IL-2 tiene un claro efecto sobre su farmacocinética in vivo.

8/ SDS libre

Los experimentos anteriormente mencionados miden la concentración total de SDS en las mezclas de SDS/IL-2. Se realizaron experimentos para ver cuanto del SDS total se asociaba con la IL-2 y cuanto permanecía libre en disolución.

Se reconstituyeron viales del producto PROLEUKIN^{TM} según se indica y se ultrafiltraron a través de membranas Centricon 10 (corte 10 kDa) mediante dos centrifugaciones a 3000 rpm durante 30 minutos cada una. Se analizaron los niveles de SDS e IL-2 de la muestra de partida y el filtrado. Se midió el SDS mediante el ensayo de naranja de acridina [35]. Brevemente, este ensayo implica: tomar 0,5 ml de muestra; añadir 0,1 ml de disolución de NaHSO_{4} 1,75 M; añadir 0,1 ml de disolución de naranja de acridina al 1% (p/v); añadir 1,5 ml de tolueno; sellar; agitar en un vortex durante 3 minutos; separar las fases orgánica y acuosa por ejemplo por centrifugación durante 5 minutos a 3000 rpm y temperatura ambiente; medir la absorbancia de la capa orgánica superior a 499 nm. Las muestras se pueden diluir (por ejemplo con agua pura) antes del ensayo para hacerlas entrar dentro del intervalo de una curva estándar por ejemplo si la curva estándar se basa en concentraciones conocidas de SDS de hasta 25 \mug/ml entonces la muestra se debe diluir para hacer entrar su concentración de SDS dentro de este intervalo. El blanco para la etapa espectrofotométrica debe ser un estándar que contenga cero SDS que se ha tratado de la misma manera que la muestra experimental.

Los resultados mostraron que la IL-2 era totalmente retenida por las membranas de ultrafiltración (nada detectable en el filtrado), mientras que aproximadamente el 35% del SDS fue capaz de pasar a través de la membrana.

Se entenderá que la invención se ha descrito vía ejemplo solamente y se puede hacer modificación del detalle sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

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Referencias

(Los contenidos totales de las cuales se incorporan en la presente memoria como referencia)

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[64] Smith & Waterman (1981) Adv. App/Math. 2:482-9.

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<110> CHIRON CORPORATION

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<120> PREPARACIÓN DE ALDESLEUKINA PARA USO FARMACÉUTICO

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<130> ATTORNEY REF P-100204

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<160> 5

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<170> SeqWin99, version 1.02

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<210> 1

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<211> 132

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanyl-1 serine-125 madura de la interleukina humana-2

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<400> 1

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17

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<210> 2

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<211> 402

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanyl-1 serine-125 madura de la interleukina humana-2

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<400> 2

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18

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<210> 3

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Variante des-alanyl-1 serine-125 madura de la interleukina humana-2

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<400> 3

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19

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<210> 4

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<211> 133

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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20

21

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<210> 5

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<211> 405

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia IL-2 humana con Met en lugar de la señal

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<400> 5

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22

Claims

1. Un procedimiento para preparar interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecil sulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende interleucina-2 con puentes disulfuro intramoleculares, para dar una concentración final de SDS de por lo menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; (b) eliminar cualquier multímero covalente de IL-2 precipitado mediante cromatografía de filtración en gel; (c) reducir la concentración de SDS para eliminar algo del SDS, pero no todo, de la composición para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende las etapas de: purificar la IL-2 mediante RP-HPLC; precipitar la IL-2; añadir dodecil sulfato de sodio (SDS) a la IL-2 precipitada, para dar una concentración final de SDS de al menos 500 \mug de SDS por mg de IL-2; eliminar cualquier multímero covalente de IL-2 precipitado mediante cromatografía de filtración en gel; y reducir la concentración de SDS para eliminar algo del SDS, pero no todo, de la composición para dar una composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de IL-2.

3. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la concentración final de SDS en la etapa (a) es por lo menos 900 \mug/mg.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el producto de la etapa (c) tiene una concentración de SDS entre 135-180 \mug/mg.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de SDS se reduce por diafiltración.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una etapa de: adición de manitol.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende una etapa de: liofilización.

8. Una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados son obtenibles mediante el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

9. Una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que la composición tiene una o más de las características siguientes:

(i): la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g; 39

(ii): la composición contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y/o

(iii): la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2.

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10. Una composición liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, composición que se puede reconstituir con un medio acuoso para dar la composición de la reivindicación 9.

11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-10 precedentes, que tiene una turbidez específica menor de 0,7 cm^{2}/g.

12. La composición de la reivindicación 11, que tiene una turbidez específica entre 0,3 cm^{2}/g y 0,6 cm^{2}/g.

13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-12 precedentes, que comprende microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio entre 11 nm y 13 nm.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que se añade manitol a una concentración final de entre 40 y 50 mg de manitol por mg de IL-2.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 es una IL-2 humana.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 es una des-alanil-1 IL-2.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 es una serina-125
IL-2.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 es des-alanil-1, serina-125 IL-2.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la IL-2 es no glicosilada.

21. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, que incluye manitol a una concentración entre 40 y 50 mg de manitol por mg de IL-2.

22. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 es una IL-2 humana.

23. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 es una des-alanil-1 IL-2.

24. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 es una serina-125 IL-2.

25. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 es des-alanil-1, serina-125 IL-2.

26. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

27. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la IL-2 es no glicosilada.

28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 14-20 precedentes, en el que la IL-2 se purifica después de la expresión en un anfitrión procariótico recombinante.

29. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13 6 21-27, que tiene una concentración de IL-2 de 1,1 mg/ml.

30. Una composición farmacéutica liofilizada que, cuando se reconstituye con 1,2 ml de agua estéril para inyección, contiene en cada mililitro: 1,1 mg de desalanil-1, serina-125 IL-2 humana no glicosilada; 50 mg de manitol; 0,18 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS); 0,17 mg de fosfato sódico monobásico; y 0,89 mg de fosfato sódico dibásico a pH 7,5, en la que la IL-2 y el SDS están en forma de agregados tales que la composición reconstituida tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g.

31. Una composición farmacéutica acuosa, obtenible reconstituyendo la composición liofilizada de la reivindicación 30 con 1,2 ml de agua estéril para inyección.

32. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, 21-27, 29-31, y un segundo agente farmacéutico, como una preparación combinada para la puesta en práctica de un método terapéutico mediante administración secuencial o separada simultánea.

33. Un kit que comprende (a) la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, 21-27, 29-32; y (b) un segundo agente farmacéutico.

34. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, 21-27, 29-32, para uso en medicina.

35. El uso de microagregados de (a) interleucina-2 y (b) dodecil sulfato de sodio, en el que los microagregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 29 nm, en la fabricación de un medicamento para la administración a un paciente.

36. El uso de una composición que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en el que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en el que la composición tiene una o más de las características siguientes:

(i): la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g;

(iii): la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2,

en la fabricación de un medicamento para la administración a un paciente.

37. El uso de la reivindicación 35 ó 36, en el que el medicamento es para tratar el cáncer.

38. El uso de la reivindicación 37, en el que el cáncer es carcinoma de células renales.

39. El uso de la reivindicación 37, en el que el cáncer es melanoma.

40. El uso de (a) microagregados de interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, y (b) un segundo agente farmacéutico, en el que los microagregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm, en la fabricación de un medicamento combinado.

41. La composición de la reivindicación 32, en la que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo monoclonal.

42. La composición de la reivindicación 32, en la que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que proporciona ADCC.

43. La composición de la reivindicación 32, en la que el segundo agente: farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2; un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52; un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida; Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una citoquina interferón \alpha; interferón \gamma; 5-fluorouracilo; un compuesto anti-retrovírico; un inhibidor de tirosina quinasa; y Decitabina.

44. La composición de la reivindicación 43, en la que el agonista del receptor de H2 es histamina o una sal farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el dihidrocloruro de histamina.

45. El kit de la reivindicación 33, en el que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo monoclonal.

46. El kit de la reivindicación 33, en el que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que proporciona ADCC.

47. El kit de la reivindicación 33, en el que el segundo agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2; un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52; un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida; Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación d e ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una citoquina; interferón \alpha; interferón \gamma; 5-fluorouracilo; un compuesto anti-retrovirico; un inhibidor de tirosina quinasa; y Decitabina.

48. El kit de la reivindicación 47, en el que el agonista del receptor de H2 es histamina o una sal farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el dihidrocloruro de histamina.

49. El uso de la reivindicación 40, en el que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo monoclonal.

50. El uso de la reivindicación 40, en el que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que proporciona ADCC.

51. El uso de la reivindicación 40, en el que el segundo agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2; un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52; un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida; Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una citoquina; interferón \alpha; interferón \gamma; 5-fluorouracilo; un compuesto anti-retrovírico; un inhibidor de tirosina quinasa; y Decitabina.

52. El uso de la reivindicación 51, en el que el agonista del receptor de H2 es histamina o una sal farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el dihidrocloruro de histamina.