ES2318916B1 - Procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmaceutico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar aldesleukina para
uso farmacéutico.
Un procedimiento para preparar aldesleukina para
uso farmacéutico, que comprende las etapas de (a) añadir SDS a una
composición que comprende aldesleukina, para dar una concentración
final de SDS alta; (b) reducir los niveles de SDS para dar una
composición con una concentración de SDS baja. La adición y a
continuación eliminación parcial de SDS da microagregados de
aldesleukina y SDS que son adecuados para uso farmacéutico.
Description
Procedimiento para preparar aldesleukina para
uso farmacéutico.
Toda los documentos e información en línea
citados en la presente memoria se incorporan en su totalidad como
referencia.
Esta invención es en el campo de la preparación
y formulación de interleucina-2 para uso
farmacéutico.
La interleucina-2
(IL-2) es una citoquina que fomenta el crecimiento y
diferenciación de las células T in vivo y también mejora la
citotoxicidad de las células T CD8+ y las células asesinas
naturales. La administración a pacientes produce múltiples efectos
inmunológicos de una manera dependiente de la dosis, que incluyen
activación de la inmunidad celular con linfocitosis profunda,
eosinofilia, trombopenia, y la producción de citoquinas que incluye
TNF, IL-1 e interferón-\gamma.
Detalles adicionales de la IL-2 se pueden encontrar
en su "GeneCard" bajo el número de acceso GC04M123831.
La IL-2 se ha aprobado para uso
farmacéutico humano en varios países. El nombre común internacional
recomendado es ALDESLEUKINA, y se comercializa una formulación de
Chiron Corporation bajo la denominación comercial PROLEUKIN^{TM}.
La FDA de Estados Unidos ha aprobado la IL-2
PROLEUKIN^{TM} para uso en el tratamiento de adultos con
carcinoma de células renales metastásico (RCC metastásico) o
melanoma metastásico.
Como se estipula en su información de
prescripciones de EE.UU., la PROLEUKIN^{TM} existe como
microagregados no covalentemente unidos biológicamente activos con
un tamaño medio de 27 moléculas de IL-2
recombinantes. Se suministra como una torta liofilizada estéril de
color blanco a blanquecino en viales de un solo uso previstos para
administración intravenosa (IV). Cuando se reconstituye con 1,2 ml
de agua estéril para inyección, cada mililitro contiene 18 millones
de UI (1,1 mg) de IL-2 PROLEUKIN^{TM}, 50 mg de
manitol, y 0,18 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS), tamponado con
aproximadamente 0,17 mg de fosfato sódico monobásico y 0,89 mg de
fosfato sódico dibásico a pH 7,5. Sin embargo, la mezcla simple de
estos ingredientes no da la misma forma microagregada de
IL-2 que la encontrada en el producto
PROLEUKIN^{TM}.
La microagregación de IL-2 en el
producto PROLEUKIN^{TM} es importante para la eficacia in
vivo. Las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la
IL-2 no agregada (monomérica libre) son muy
diferentes de las de la IL-2 microagregada, y las
dos formas tienen índices terapéuticos diferentes: los agregados que
son demasiado pequeños son depurados por el cuerpo demasiado
rápidamente; los agregados que son demasiado grandes pueden ser
insolubles y menos activos. La microagregación es así una
característica clave del producto PROLEUKIN^{TM}
El procedimiento por el cual se forman los
microagregados biológicamente activos de PROLEUKIN^{TM} no se ha
hecho previamente disponible al público, aunque varios
procedimientos para preparar formulaciones farmacéuticas de
IL-2 se han descrito en la técnica anterior [por
ejemplo véanse las referencias 1 a 30]. La referencia 9 en
particular pretende describir el procedimiento de fabricación para
la PROLEUKIN^{TM}, que incluye detalles de expresión,
recuperación, purificación, formulación y terminación, pero esta
descripción es incompleta en varios aspectos.
Saber como conseguir la misma forma activa de
microagregados de IL-2 que la encontrada en el
producto
PROLEUKIN^{TM} sería útil para cualquiera que quiera hacer un producto de IL-2 similar a PROLEUKIN^{TM}. Es por lo tanto un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 en forma de microagregados coma los encontrados en el producto PROLEUKIN^{TM}, y también proporcionar tal IL-2 microagregada. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 para complementar la descripción de la referencia 9.
PROLEUKIN^{TM} sería útil para cualquiera que quiera hacer un producto de IL-2 similar a PROLEUKIN^{TM}. Es por lo tanto un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 en forma de microagregados coma los encontrados en el producto PROLEUKIN^{TM}, y también proporcionar tal IL-2 microagregada. Es un objeto adicional de la invención proporcionar un procedimiento para preparar IL-2 para complementar la descripción de la referencia 9.
El procedimiento por el cual se prepara el
producto PROLEUKIN^{TM} incluye las etapas clave siguientes: (i)
purificación de la IL-2 expresada a partir del
cultivo celular; (ii) solubilización de la IL-2
utilizando detergente SDS; (iii) reducción de la
IL-2 a forma monomérica; (iv) purificación,
oxidación y precipitación de la IL-2; (v)
re-solubilización de la IL-2
utilizando un nivel alto de detergente SDS; (vi) purificación para
quitar la IL-2 oligomérica; (vii) diafiltración
para reducir los niveles de detergente SDS, sin eliminación
completa, hasta un intervalo óptimo para obtener una preparación de
IL-2 apropiadamente microagregada; (viii)
formulación con manitol y tampón; y (ix) liofilización y
envasado.
Las etapas (i), (iv), (vi), (viii) y (ix) de
este procedimiento se describen en la referencia 9, pero las etapas
(ii), (iii), (v) y (vii) no se describen, aunque se describe el uso
de un detergente no especificado para re-solubilizar
la IL-2 antes de la etapa (vi). Además, la
referencia 9 sugiere que se añade SDS a la IL-2
después de la purificación en la etapa (vi), cuando de hecho se
elimina.
\newpage
De las nueve etapas, las más críticas para que
se formen los microagregados son la (v) y la (vii). Ninguna de las
dos etapas posteriores (viii) o (ix) tienen efecto significativo
alguno sobre la microagregación, y los procedimientos de
purificación en las etapas (i), (ii), (iii), (iv) y (vi) también
tienen poco efecto. Sin embargo, una vez que se añade el SDS en la
etapa (v), se disuelve la IL-2, y es la posterior
reducción de los niveles de SDS en la etapa (vii) la que causa la
formación de los microagregados presentes en el producto final
PROLEUKIN^{TM}. Se tiene que añadir suficiente SDS para
resolubilizar la IL-2 precipitada sustancialmente
en una forma soluble monomérica, y a continuación se debe eliminar
(pero no completamente) para dar los microagregados deseados.
La invención por lo tanto proporciona un
procedimiento para prepara interleucina-2 para uso
farmacéutico, que comprende las etapas de: (a) añadir dodecil
sulfato de sodio (SDS) a una composición que comprende
interleucina-2, para dar una concentración final de
SDS de por lo menos 500 \mug de SDS por mg de
IL-2; (b) eliminar algo del SDS pero no todo de la
composición, para dar una composición que contiene entre
95-250 \mug de SDS por mg de
interleucina-2. Este procedimiento de adición de
SDS y después eliminación parcial rinde condiciones óptimas para la
interacción íntima de moléculas de IL-2 y SDS para
formar microagregados de IL-2 y SDS como los
encontrados en el producto PROLEUKIN^{TM} y, para una relación
IL-2/SDS dada, da lugar a un producto diferente del
que se obtiene por simple mezcla de SDS e IL-2.
La composición acuosa que surge del
procedimiento se puede liofilizar para distribución, y el producto
liofilizado se puede eventualmente reconstituir con un vehículo
acuoso para al administración a los pacientes. Después de la
reconstitución, la composición preferentemente tiene una turbidez
específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g y/o contiene agregados
de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de
entre 8 nm y 20 nm. Así el procedimiento puede además comprender
las etapas de liofilizar la composición y a continuación,
opcionalmente, reconstituir la composición con un medio acuoso. La
composición puede también tener estas 2 y/o características
hidrodinámicas antes de la etapa de liofilización.
La invención proporciona una composición que
comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de
sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil
sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que
los agregados son obtenibles por los procedimientos de la
invención. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico,
como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.
La invención también proporciona una composición
que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de
sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil
sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que
la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1
cm^{2}/g. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico,
como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.
La invención también proporciona una composición
que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de
sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil
sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que
los agregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm
y 20 nm. Estas composiciones son adecuadas para uso farmacéutico,
como se muestra mediante el producto PROLEUKIN^{TM}.
La invención también proporciona una composición
que comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de
sodio, en la que la interleucina-2 y el dodecil
sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y en la que
el número medio de moléculas de interleucina-2 por
agregado está entre 10 y 50. Estas composiciones son adecuadas para
uso farmacéutico, como se muestra mediante el producto
PROLEUKIN^{TM}.
La invención proporciona una composición
liofilizada que comprende interleucina-2 y dodecil
sulfato de sodio, en la que la composición se puede reconstituir
para dar una disolución acuosa en la que la
interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están
presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez específica
(\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g. En lugar de, o además de,
considerar \tau, los agregados pueden tener un diámetro
hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm. Estas composiciones son
adecuadas para uso farmacéutico, como se muestra mediante el
producto PROLEUKIN^{TM}.
La invención proporciona un procedimiento para
preparar una composición liofilizada que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la
que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar
una disolución acuosa en la que la interleucina-2 y
el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados, y
que tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g;
y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecil
sulfato de sodio a una composición que comprende
interleucina-2, en la que se añade suficiente
dodecil sulfato de sodio para dar interleucina-2
monomérica solubilizada, (b) reducir la concentración de dodecil
sulfato de sodio a un nivel en el que la
interleucina-2 forma agregados con dodecil sulfato
de sodio, y (c) liofilizar la composición.
La invención proporciona un procedimiento para
preparar una composición liofilizada que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la
que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir para dar
una composición acuosa en la que la interleucina-2
y el dodecil sulfato de sodio están presentes en forma de agregados
con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y (ii)
el procedimiento comprende las etapas de (a) añadir dodecil sulfato
de sodio a una composición que comprende
interleucina-2, en la que se añade suficiente
dodecil sulfato de sodio para dar interleucina-2
monomérica solubilizada, (b) reducir la concentración de dodecil
sulfato de sodio a un nivel en el que la
interleucina-2 forma agregados con dodecil sulfato
de sodio, y (c) liofilizar la composición.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una composición liofilizada que
comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio,
en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir
para dar una composición acuosa en la que la
interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están
presentes en forma de agregados, y que tiene una turbidez
específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g; y (ii) el procedimiento
comprende las etapas de (a) mezclar dodecil sulfato de sodio e
interleucina-2 para dar una mezcla en la que el
dodecil sulfato de sodio está presente en una primera concentración,
(b) eliminar el dodecil sulfato de sodio de la mezcla para reducir
su concentración a una segunda concentración, y (c) liofilizar la
composición, proporcionando de ese modo dicha composición. La
segunda concentración es más baja que la primera concentración. La
primera concentración generalmente será por lo menos 500 \mug de
SDS por miligramo de IL-2 en la mezcla, y la segunda
concentración generalmente estará entre 95-250
\mug de SDS por miligramo de IL-2.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una composición liofilizada que
comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio,
en la que: (i) la composición liofilizada se puede reconstituir
para dar una composición acuosa en la que la
interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio están
presentes en forma de agregados con un diámetro hidrodinámico medio
de entre 8 nm y 20 nm; y (ii) el procedimiento comprende las etapas
de (a) mezclar dodecil sulfato de sodio e
interleucina-2 para dar una mezcla en la que el
dodecil sulfato de sodio está presente en una primera
concentración, (b) eliminar el dodecil sulfato de sodio de la mezcla
para reducir su concentración a una segunda concentración, y (c)
liofilizar la composición, proporcionando de ese modo dicha
composición. La segunda concentración es más baja que la primera
concentración. La primera concentración generalmente será por lo
menos 500 \mug de SDS por miligramo de IL-2 en la
mezcla, y la segunda concentración generalmente estará entre
95-250 \mug de SDS por miligramo de
IL-2.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una composición liofilizada que
comprende interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio
(SDS), en la que: (i) la composición liofilizada se puede
reconstituir para dar una composición acuosa en la que la
interleucina-2 y el SDS están presentes en forma de
agregados, y que tiene una turbidez específica (\tau) menor de
1,1 cm^{2}/g, y en la que la concentración de SDS es
"x" \mug de SDS por miligramo de IL-2,
en la que x está entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende
las etapas de (a) mezclar SDS e interleucina-2 para
dar una mezcla en la que la concentración de SDS es por lo menos 4
veces más alta que "x", (b) eliminar algo de SDS pero
no todo de la mezcla, para dar una composición en la que la
concentración de SDS es "x", y (c) liofilizar la
composición. La concentración es preferentemente al menos 5 veces
más alta que "x", más preferentemente al menos 8 veces
más alta, 10 veces más alta, 15 veces más alta, o incluso 20 veces
más alta.
La invención también proporciona un
procedimiento para preparar una composición que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio (SDS), en
la que: (i) la interleucina-2 y el SDS en la
composición están presentes en forma de agregados, en la que los
agregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20
nm, y en la que la concentración de SDS es "x" \mug
de SDS por miligramo de IL-2, en la que x está
entre 95 y 250; y (ii) el procedimiento comprende las etapas de (a)
mezclar SDS e interleucina-2 para dar una mezcla en
la que la concentración de SDS es por lo menos 4 veces más alta que
"x", (b) eliminar algo de SDS pero no todo de la mezcla,
parar dar una composición en la que la concentración de SDS es
"x", y (c) liofilizar la composición. La concentración
es preferentemente al menos 5 veces más alta que "x",
más preferentemente al menos 8 veces más alta, 10 veces más alta,
15 veces más alta, o incluso 20 veces más alta.
Mientras un procedimiento de la invención
implica reducir la concentración de SDS dentro del intervalo de
95-250 \mug de SDS por miligramo de
IL-2, es posible en algunas realizaciones reducir
la concentración por debajo de 95 \mug/mg (por ejemplo entre 50 y
95 \mug/mg) y a continuación aumentar la concentración otra vez
para estar dentro del intervalo de 95-250
\mug/mg. Este aumento hasta dentro del intervalo de
95-250 \mug/mg puede tener lugar convenientemente
durante la reconstitución del producto liofilizado, por ejemplo el
procedimiento puede implicar eliminación de SDS a < 95
\mug/mg, seguido por liofilización, seguido por reconstitución con
una disolución acuosa de SDS tal que la concentración de SDS cae
dentro del intervalo de 95-250 \mug/mg.
Los procedimientos de la invención implican el
uso de dodecil sulfato de sodio (SDS), que también se conoce como
lauril sulfato de sodio. La fórmula de este detergente aniónico es
CH_{3}(CH_{2})_{11}OSO_{3}^{-}Na^{+}, y
tiene el número CAS 151-21-3 y el
número EC 205-788-1.
El SDS es un reactivo estándar utilizado para
solubilizar proteínas y si la IL-2 está en forma
precipitada antes de que se añada el SDS entonces se utiliza para
este propósito en la etapa (a) del procedimiento de la invención.
Comenzando con una composición que comprende IL-2
precipitada, se añadirá suficiente SDS para asegurar que
sustancialmente toda la IL-2 precipitada se hace
soluble (a excepción de cualquier multímero covalentemente unido de
IL-2 en el precipitado, que quedará
predominantemente precipitado incluso en presencia de SDS). La
microagregación de IL-2 a una concentración de 1
mg/ml está sustancialmente ausente cuando está presente SDS en más
que aproximadamente 500 \mug/mg, así que es típico añadir SDS para
dar una concentración final de SDS de por lo menos 500 \mug de
SDS por miligramo de IL-2 (por ejemplo por lo menos
550, por lo menos 600, por lo menos 700, por lo menos 800, por lo
menos 900, por lo menos 1000, por lo menos 1200, por lo menos 1400,
por lo menos 1600, por lo menos 1800, o por lo menos 2000 \mug de
SDS por miligramo de IL-2). Se prefiere utilizar
aproximadamente 910 \mug de SDS por miligramo de
IL-2.
La concentración de partida de SDS en una
muestra generalmente será conocida, porque el SDS no está presente
de forma natural en las células y la cantidad de SDS que se añadió
durante el procesado del material derivado de las células se habrá
controlado. Sin embargo, en el caso de que la concentración de SDS
no se conozca, se puede medir utilizando técnicas de análisis
convencionales, o realizadas sobre el material en su totalidad o
sobre una muestra del material. Por ejemplo: la referencia 31
describe un método de electroforesis capilar para la separación y
determinación de tensioactivos, que incluye el SDS; la referencia 32
describe un método de gota única para la determinación de ion
dodecilsulfato sobre el intervalo de 0,2-100 \muM
utilizando un cristal piezoeléctrico de cuarzo sin electrodo; la
referencia 33 compara tres métodos para la determinación
conveniente de SDS en disoluciones acuosas, concretamente la
valoración mediante bromuro de cetiltrimetilamonio utilizando o un
electrodo selectivo de iones o la turbidez para medir el punto
final, o la medida de la turbidez en presencia de bromuro de
miristiltrimetilamonio; la referencia 34 describe un método para la
determinación de SDS, basado en su interacción con colorantes
fluorescentes tales como el bromuro de etidio; etc. El método de
análisis preferido para medir los niveles de SDS es un análisis
espectrofotométrico basado en la reacción con naranja de acridina,
como se describe en más detalle en los ejemplos y en la ref. 35.
Como una alternativa a medir el contenido de SDS
relativo a la masa de la IL-2, se puede medir
relativo a la actividad de la IL-2. Basado en una
actividad de IL-2 de 18x10^{6} Ul en 1,1 mg de
IL-2 (según lo encontrado en la PROLEUKIN^{TM}),
100 \mug de SDS por miligramo de IL-2 es
equivalente a 6,111 \mug de SDS por MUI de
IL-2.
En lugar de utilizar SDS en los procedimientos y
productos de la invención, también es posible utilizar lauril éter
sulfato de sodio (SLS) o lauril sulfato de sodio (ALS). También se
pueden utilizar mezclas de SLS, ALS y/o SDS. Sin embargo, en las
realizaciones preferidas de la invención se utiliza SDS.
Después de que se haya añadido SDS a la
composición de IL-2, el procedimiento de la
invención implica la eliminación de algo (pero no todo) del SDS,
proporcionando de ese modo una forma microagregada de
IL-2 y SDS.
El SDS se puede eliminar mediante diversas
técnicas. La cromatografía de intercambio iónico puede eliminar SDS
cargado negativamente, y la cromatografía de filtración en gel
también se puede utilizar. Sin embargo, el SDS se elimina más
preferentemente por diafiltración. En la diafiltración, el
disolvente y/ los microsolutos (por ejemplo sales) se reemplazan
por un disolvente y/o microsolutos diferentes. En general, la
eliminación y sustitución ocurren a la misma velocidad y el volumen
de la disolución puede así permanecer sustancialmente constante, y
de este modo el efecto total es la sustitución de los
disolventes/microsolutos originales con nuevos
disolventes/microsolutos.
La diafiltración contra un tampón sin SDS es el
camino preferido de eliminar SDS por ejemplo contra un tampón de
fosfato sódico 10 mM, pH 7,5.
La eliminación de SDS continúa hasta que la
composición contiene entre 95 \mug y 250 \mug de SDS por cada
miligramo de interleucina-2 por ejemplo entre
118-210 \mug/mg, entre 135-180
\mug/mg, o aproximadamente 160 \mug/mg. Las propiedades
farmacocinéticas de la IL-2 son sustancialmente
consistentes sobre este intervalo, y el nivel de SDS no es tan alto
como para dar lugar a preocupaciones de toxicidad. Sin embargo,
cuando la concentración de SDS cae por debajo de aproximadamente 95
\mug/mg, el tamaño de los microagregados aumenta bruscamente
(Figura 1), aumentando desde una media de \sim 60 moléculas de
IL-2 por agregado a 95 \mug/mg a una media de
\sim 180 a 75 \mug/mg.
La adición y a continuación eliminación
incompleta del SDS da como resultado los microagregados
biológicamente activos de IL-2 que se encuentran en
el producto PROLEUKIN^{TM}. La mezcla simple de SDS e
IL-2 a las concentraciones encontradas en el
producto PROLEUKIN^{TM} no dan microagregados. La referencia 36
describe un estudio en el que se añadió SDS a preparaciones de
IL-2 que contenían, como el producto
PROLEUKIN^{TM}, 1,1 mg de IL-2. Se encontró que el
SDS precipita la IL-2 a concentraciones de
detergente entre 0,02%-0,05%. En contraste, la IL-2
no precipita a estas concentraciones de SDS durante la eliminación
de SDS de acuerdo con la invención - incluso cuando el SDS
disminuye desde 1200 \mug/mg (aproximadamente 0,1% de SDS basado
en 1,1 mg de IL-2) hasta 70 \mug (< 0,01%), no
se observa precipitación de IL-2.
Durante su eliminación, la concentración de SDS
se puede determinar según se describe más arriba. En le caso de que
el método de eliminación sea estandarizado y reproducible entonces
el control de los niveles de SDS durante la eliminación de SDS
puede no ser necesario, ya que generalmente se puede esperar el
mismo resultado cada vez que se realiza el procedimiento (aunque se
pueden realizar medidas confirmatorias finales). Sin embargo, en el
caso de que un método de eliminación sea variable, o si se requiere
control regular por otras razones, se pueden realizar la medida
continua o regular de los niveles de SDS hasta que se alcance la
concentración final deseada.
Como se menciona más arriba, las etapas clave
del procedimiento para la formación de microagregados de
IL-2/SDS son (a) la adición y a continuación (b)
posterior eliminación de SDS. Mientras que estas dos etapas dan
IL-2 en una forma adecuada para el uso como un
ingrediente activo en un producto farmacéutico, ellas solas no son
adecuadas para preparar una composición farmacéutica final, y se
requieren otras etapas. Estas etapas pueden tener lugar antes de las
etapas (a) y (b), después de las etapas (a) y (b), y/o entre las
etapas (a) y (b).
La primera etapa en un procedimiento para
preparar IL-2 para uso farmacéutico generalmente
será la expresión de la proteína. Esto generalmente implicará el uso
de una célula anfitriona que contiene un gen que codifica la
IL-2 de interés, tal como una célula anfitriona
bacteriana, una célula anfitriona de levadura o una célula
anfitriona de mamífero. Sin embargo, como una alternativa a la ruta
recombinante, también es posible activar o favorecer la expresión
de un gen de IL-2 endógeno en un genoma de la
célula anfitriona (por ejemplo por activación del promotor), o
purificar la hormona a partir de una fuente natural (por ejemplo de
la sangre).
La expresión de la IL-2 en una
E. coli recombinante es una ruta preferida para obtener
IL-2, con la IL-2 formando cuerpos
de inclusión. E. coli adecuadas se depositaron bajo la
provisión del Tratado de Budapest en el ATCC en 1984 con el número
de acceso 39452 y 39626.
Se conocen en la técnica procedimientos para
cultivar, cosechar, romper, o extraer la IL-2 a
partir de diversos tipos de células, por ejemplo véanse las
referencias 19 -30 y 37-41.
Después de la expresión, o cuando se empieza con
el material expresado, se utilizará una etapa inicial de
purificación de IL-2. Si la IL-2
está presente dentro de las células entonces la etapa de
purificación implicará la ruptura celular (por ejemplo por choque
osmótico, homogeneización, sonicación, etc.) para liberar la
proteína; si la IL-2 ya está presente en disolución
(por ejemplo se secretó después de la expresión) entonces no se
requiere la ruptura. También se puede llevar a cabo la inactivación
de células vivas, como la centrifugación. Al final de la etapa
inicial de purificación, la IL-2 estará típicamente
en forma precipitada, particularmente si se purifica a partir de
cuerpos de inclusión, pero se habrá separado de los residuos
celulares para dar una pasta rica en IL-2 para
posterior tratamiento.
Después de la preparación de la
IL-2 purificada precipitada, o cuando se empieza
con el material precipitado, la IL-2 se puede
solubilizar para separarla de otras proteínas del anfitrión etc. La
disolución se puede conseguir añadiendo un detergente tal como el
SDS, preferentemente para dar una concentración final de entre el 4
y el 4,5%. Esto se puede conseguir convenientemente añadiendo una
disolución de SDS al 5%.
Después de la solubilización, o cuando se
empieza con el material solubilizado, la IL-2 se
puede reducir, para romper cualquier puente disulfuro en la
proteína, y en particular para romper cualquier puente de disulfuro
intermolecular. Cualquier agregado covalente de
IL-2 formado por puentes disulfuro intermoleculares
se convierten por lo tanto en la forma monomérica. Los agentes
reductores comúnmente utilizados para reducir puentes disulfuro
incluyen \beta-mercaptoetanol y ditiotreitol
(DTT). Generalmente se mantendrá la presencia del detergente para
asegurar la solubilidad de la IL-2.
Después de la reducción, o cuando se empieza con
el material reducido, la IL-2 se puede a
continuación re-oxidar para dar IL-2
monomérica con puentes disulfuro intramoleculares.
Después de la re-oxidación, o
cuando se empieza con el material re-oxidado, la
IL-2 se puede a continuación purificar
adicionalmente para eliminar reactivos tales como el agente
oxidante, para eliminar endotoxina, para eliminar proteínas y/o ADN
de la célula anfitriona, para eliminar isoformas o confórmeros de
IL-2 (por ejemplo formas oxidadas de
IL-2), etc. Esta purificación se puede conseguir
convenientemente utilizando HPLC en fase reversa.
Después de la purificación por
RP-HPLC, o cuando se empieza con el material
purificado por RP-HPLC disuelto, la
IL-2 se puede precipitar por ejemplo añadiendo
hidróxido sódico 0,8 N. Además de la precipitación de la
IL-2, esto permite que la proteína se separé de
cualquier disolvente orgánico utilizado durante la
RP-HPLC. El material precipitado se puede recoger
convenientemente por centrifugación.
El material obtenido después de la expresión,
purificación, disolución, reducción, oxidación,
RP-HPLC y precipitación (como se describe más
arriba) es ideal para la redisolución y diafiltración de acuerdo
con el procedimiento de la invención, aunque también se puede
utilizar la IL-2 preparada por otras rutas de
purificación. Típicamente, sin embargo, la IL-2
estará en forma precipitada antes de que se añada el SDS en la
etapa (a) del procedimiento de la invención.
Como se menciona más arriba, los multímeros
covalentemente unidos de IL-2 permanecen
precipitados incluso en presencia del SDS. Como estos multímeros son
mucho más grandes que las proteínas de IL-2
disueltas con SDS (porque no son disociables) se pueden eliminar
convenientemente entre las etapas (a) y (b) (es decir después de la
adición de SDS pero antes de la diafiltración) mediante
cromatografía de filtración en gel. La presencia de SDS se debe
mantener a través de la cromatografía de filtración en gel para
impedir la precipitación de la IL-2.
Después de la diafiltración para eliminar el SDS
y formar los microagregados, se puede someter una disolución de
IL-2 a una o más de las etapas siguientes: dilución
para dar una dosis final deseada; esterilización, típicamente
mediante filtración esterilizante por ejemplo a través de un filtro
de 0,22 \mum; formulación farmacéutica (véase más abajo);
liofilización; envasado; etc.
El resultado de la solubilización y
diafiltración del SDS mediante el procedimiento de la invención es
la formación de microagregados biológicamente activos de SDS e
IL-2, como los vistos en el producto
PROLEUKIN^{TM}.
La estructura molecular precisa de los
microagregados de SDS/IL-2 no se ha determinado,
pero se cree que son estructuras micelares o similares a micelas. A
una concentración de SDS de \sim 160 \mug/mg, una micela típica
contiene \sim 30 moléculas de IL-2 y \sim150
moléculas de SDS. El SDS y la IL-2 en los
microagregados interactúan de forma no covalente, y la cola
hidrófoba de la IL-2 (restos
121-133) puede interactuar con la cadena principal
alquílica del SDS para formar las micelas. Algunos SDS pueden
permanecer libres en disolución.
Los microagregados se pueden detectar por
dispersión luminosa, y esta técnica también permite que se mida su
tamaño (véase más abajo). La relación entre la concentración de SDS
y el tamaño medio de los microagregados, como se mide mediante
dispersión luminosa clásica, se ha determinado empíricamente, como
se muestra en la Figura 1.
A medida que procede la eliminación de SDS, se
alcanza una concentración por debajo de la cual el tamaño de los
agregados comienza a aumentar exponencialmente (véase la Figura 1).
Según la invención, se elimina SDS hasta que su concentración está
entre 95 \mug y 250 \mug por miligramo de IL-2.
En este intervalo, la turbidez específica (\tau) está entre
\sim0,05 y \sim1,00 cm^{2}/g, lo que implica un promedio de
menos de 50 moléculas de IL-2 por agregado. A 160
\mug de SDS por mg de IL-2 la turbidez específica
(\tau) es aproximadamente 0,48 (aproximadamente 27 moléculas de
IL-2).
La persona experta entenderá que una composición
dada de SDS/IL-2 según la invención rara vez, si es
que alguna vez, contiene una sola especie de microagregado. Es
decir, las medidas de dispersión luminosa revelan que los
microagregados tienen una variedad de tamaños que caen dentro de
una distribución, y las medidas pueden revelar un tamaño medio.
Cuando una composición comprende microagregados con un tamaño medio
establecido, por lo tanto, generalmente habrá algunos microagregar
dos más pequeños y algunos microagregados más grandes.
Las composiciones preferidas de la invención
incluyen microagregados de SDS/IL-2 tales que la
composición tiene una turbidez específica (\tau) de entre 0,3 y
0,6 por ejemplo entre 0,4 y 0,5, o aproximadamente 0,45. Estas
composiciones aplican particular a composiciones que se han
reconstituido después de la liofilización, y el valor de \tau
puede ser más bajo antes de la liofilización y reconstitución
(Figura 14).
Las composiciones preferidas de la invención
incluyen microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro
hidrodinámico entre 11 nm y 13 nm.
Los microagregados preferidos de la invención
contienen entre 10 y 50 moléculas de IL-2 por
ejemplo entre 20 y 35, y preferentemente aproximadamente 27.
En las composiciones preferidas, sustancialmente
toda la IL-2 está presente en forma de
microagregados. Las composiciones pueden estar sustancialmente
libres de IL-2 monomérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Porque los microagregados de
SDS/IL-2 de la invención se afectan por las
condiciones reinantes, no se pueden utilizar técnicas tales como la
cromatografía de exclusión por tamaño y la centrifugación analítica
para determinar su tamaño. En su lugar, se puede utilizar la
dispersión luminosa clásica (o estática) (CLS) para detectar y
analizar tos microagregados midiendo su turbidez. También se puede
utilizar la dispersión luminosa dinámica (DLS). Las medidas se
pueden realizar en la instrumentación específica, o se pueden
realizar en un fluorímetro con los monocrómetros de excitación y
emisión puestos en la misma longitud de onda (por ejemplo 467 nm de
una lámpara de xenón, o 488 nm de una lámpara de argón, que están
alejadas de las longitudes de onda que son absorbidas por el
analito) y/o utilizando filtros adecuados (por ejemplo filtros
amarillos), por que el fluorímetro actúa como un fotómetro CLS a
90º.
Cuando se mide la dispersión luminosa, un
parámetro espectroscópico estándar es la "relación de
Rayleigh" (R_{\Theta}). Cuando se mide la luz dispersada a 90º
relativa a la luz incidente (es decir cuando \Theta = 900), la
relación de Rayleigh se conoce como R_{90} [por ejemplo véase la
ref. 42], y se utiliza la dispersión a 90º para las medidas de
turbidez.
Las medidas de turbidez (intensidad dispersada a
90º) se pueden normalizar relativas a tolueno de calidad óptica, es
decir, las medidas de turbidez para una muestra estándar de tolueno
se divide por el R_{90} del tolueno. Normalizando de esta forma se
puede determinar a continuación los valores absolutos de la
intensidad de luz dispersada.
Para los microagregados de IL-2
de la invención, la turbidez se puede medir a 467 nm o 488 nm,
25ºC. Antes de determinar la turbidez, las composiciones se pues
den centrifugar o filtrar para eliminar partículas grandes (por
ejemplo proteína precipitada) que, de lo contrario, distorsionarían
los datos. Cuando se centrifugan, las composiciones de
IL-2 de la invención retienen por lo menos el 97%
(por ejemplo \geq 98%, \geq 99% o más) del total de
IL-2 en el sobrenadante.
\newpage
Las medidas de turbidez para mezclas de
SDS/IL-2 se pueden convertir en valores de turbidez
específica absoluta (\tau) como sigue:
en la
que:
T_{i} es la intensidad de turbidez de la
composición de IL-2,
T_{t} es la intensidad de turbidez de un
control de tolueno,
C es la concentración de IL-2 en
la composición de IL-2.
Cuando T_{i} y T_{t} se miden en cm^{-1} y
C se mide en g/ml (es decir g/cm^{3}) entonces las unidades de
\tau son cm^{2}/g. Esta es la medida preferida para determinar
la turbidez de las composiciones de IL-2 de la
invención.
Las composiciones de la invención pueden tener
una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g, pero
preferentemente mayor de 0,1 cm^{2}/g. Las composiciones
preferidas tienen ti menor de 0,7 cm^{2}/g. Las composiciones de
la invención preferentemente tienen T en el intervalo de
0,3-0,6 cm^{2}/g.
Como se describe en la referencia 43, en
particular el capítulo 10, la dispersión luminosa dinámica (DLS) se
puede utilizar para determinar el diámetro hidrodinámico (o el
radio) de las partículas dentro de la disolución. Los agregados de
SDS/IL-2 de la invención se pueden detectar por
dispersión luminosa dinámica (DLS). Utilizando DLS, los agregados
preferidos tienen un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20
nm, preferentemente entre 10 nm y 15 nm, más preferentemente entre
11 nm y 13 nm, y más preferentemente aproximadamente 12 nm. Como se
muestra en la Figura 17, los agregados tendrán diámetros
distribuidos alrededor de esta media.
En la práctica, algunas partículas más grandes
se pueden detectar por DLS (por ejemplo el pico de 54 nm en la
Figura 17), pero el diámetro hidrodinámico aludido más arriba es el
del pico principal de DLS, que típicamente representará por lo menos
el 90% en número (por ejemplo por lo menos el 95%, por lo menos el
97%, por lo menos el 99% o más) en el espectro de DLS. Así por lo
menos el 90% en número de las partículas detectadas por DLS tendrán
la media numérica especificada.
La interpretación de los datos de DLS se puede
complicar por la presencia de, componentes que varían lentamente,
tales como partículas de polvo o fenómenos de mezcla. Para evitar
estas complicaciones, las composiciones de IL-2 de
la invención para la medida de DLS están preferentemente libres de
partículas con un diámetro mayor de aproximadamente 1 \mum (por
ejemplo libre de polvo), y esto se puede conseguir mediante el uso
de filtros adecuados por ejemplo filtros de 0,22 \mum. Las
composiciones deben también estar bien mezcladas antes de la medida
de DLS. Si la medida de DLS revela un componente que varía
lentamente en la composición, los resultados se deben rechazar y la
medida se debe repetir en una muestra nueva.
La IL-2 es una proteína bien
conocida, y los procedimientos y productos de la invención pueden
utilizar cualquier forma adecuada de IL-2. La
IL-2 será usualmente IL-2 humana, o
será un derivado de IL-2 que conserva actividad
biológica en seres humanos.
La IL2 se traduce de manera natural en seres
humanos como una proteína precursora (por ejemplo el
153-mero en el GenBank bajo el número de acceso
NP_000577.2). El precursor se separa (por ejemplo después de la
Ser-20 en el NP_000577.2) para dar un producto
maduro con una alanina en el extremo N (SEQ ID NO: 4).
Cuando se expresa en E. coli, es habitual
reemplazar el péptido señal natural con un residuo de metionina en
el extremo N (por ejemplo SEQ ID NOS: 3 y 4). Cuando se expresa,
esta metionina se rompe sin intervención, dejando el residuo humano
natural en el extremo N de alanina (por ejemplo SEQ ID NO: 3 se
convierte en la SEQ ID NO: 1).
La IL-2 en la PROLEUKIN^{TM}
carece del residuo Ala-1 natural. La ausencia de la
alanina usual en el extremo N significa que la IL-2
en la PROLEUKIN^{TM} es formalmente referida como una forma
"des-alanil-1" de
IL-2. Se prefieren las formas
des-alanil-1 de
IL-2 para el uso con la invención.
La IL-2 en la PROLEUKIN^{TM}
también se diseño para tener dos residuos internos de cisteina, en
lugar de los tres naturales. Esto reduce el número de posibles
apareamientos de los residuos de cisteina (y así los puentes
disulfuro intra-moleculares) de tres a uno [46], y
mejora el resultado del re-plegado de la proteína y
la estabilidad de almacenamiento. La sustitución de un residuo de
serina por el residuo natural de Cys-125 [44]
significa que la IL-2 en la PROLEUKIN^{TM} es
formalmente referida como una forma
"serina-125" de IL-2. Se
prefieren las formas serina-125 de
IL-2 para el uso con la invención. La estructura
cristalina tri-dimensional de una forma
Ser-125 a partir de IL-2 humana
expresada en E. coli está disponible en las bases de datos de
estructuras bajo el registro "3INK".
Se pueden hacer otras sustituciones dentro de
una secuencia de aminoácidos de IL-2,
particularmente esas en las que la sustitución es conservativa, es
decir, las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos
que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos se
pueden dividir en cuatro familias: (1)
ácido-aspartato, glutamato; (2)
básico-lisina, arginina, histidina; (3) no
polar-alanina, valina, leucina, isoleucina,
prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) polar no cargado
- glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina,
tirosina. La fenilalanina, triptófano, y tirosina algunas veces se
clasifican como la familia de aminoácidos aromáticos. Por ejemplo,
es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina
con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina
con una serina, o una sustitución conservativa similar de un
aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no
tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. La
persona experta puede fácilmente determinar regiones de la
IL-2 que pueden tolerar cambios, basados en la
variación natural, alineamiento de formas activas de proteínas,
etc., y se pueden probar para su actividad biológica proteínas
sustituidas por ejemplo mediante el estándar 86/504.
Orientación en cuanto a las regiones de la
proteína IL-2 que se pueden alterar o vía
sustituciones, deleciones, o inserciones de residuos se pueden
también encontrar en la técnica (por ejemplo relaciones
estructura/función y/o estudios de unión), tales como las
referencias 45 a 52, etc. La referencia 53 describe una variedad de
mutantes de IL-2, que incluyen:
Asn-26-Gln;
Trp-121-Phe; deleción de todos los
residuos que siguen a Arg-120; y las formas
Met-1 de la misma. La referencia 44 describe la
IL-2 con deleción o sustitución de la
Cys-125, con o sin Ala en el extremo N. La
referencia 54 describe la sustitución o deleción de residuos que
incluyen los números 2, 3, 4, 5, 6, 104 y 125. La
Met-104 es susceptible de oxidación, así la mutación
de este residuo (por ejemplo sustitución con Glu, Val, Ala, etc.)
puede mejorar la estabilidad [55]. La referencia 56 describe
sustituciones de IL-2 en la Asp-20
(con His, o Ile), en Asn-88 (con Arg, Gly, o Ile),
y/o en Gln-126 (con Leu o Glu), que según los
informes han reducido la toxicidad y selectividad por los
receptores de IL-2 de alta afinidad. La referencia
57 describe sustituciones de
Arg-38-Ala y
Phe-42-Lys para reducir la toxicidad
para el uso durante la inmunoterapia. La referencia 58 describe la
mutación de una secuencia tripéptida natural
Xaa^{1}-Asp-Xaa^{2} en la que
Xaa^{1} es Leu, Ile, Gly o Val, y Xaa^{2} es Val, Leu o Ser,
para reducir la filtración vascular. La referencia 59 describe
péptidos con una metionina en el extremo N fusionada a los 30
primeros residuos de la IL-2, opcionalmente con una
sustitución Asp-20-Lys, que se dice
que retiene la actividad similar a la IL-2.
Otras sustituciones conocidas incluyen: T7A,
T7D, T7R, K5L, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, Q11A, Q11R,
Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E,
P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K351, K35L, K35M, K35N, K35P,
K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L361, L36K, L36M,
L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S,
L40D, L40G, L40N, L40S, T41 E, T41 G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V,
K43H, F44K, M461, E61 K, E61 M, E61 R, E62T, E62Y, K64D, K64E,
K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P651, P65K,
P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F,
E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q,
H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W,
L80Y, R81 E, R81 K, R81 L, R81 M, R81 N, R81 P, R81 T, D84R, S87T,
N88D, N88H, N88T, V91 A, V91 D, V91 E, V91 F, V91 G, V91 N, V91 Q,
V91 W, L94A, L941, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S,
T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T,
E116G, N119Q, T123S, T123C, Q1261, y Q126V.
Las variantes biológicamente activas de
IL-2 tendrán generalmente por lo menos
aproximadamente el 70%, (por ejemplo \geq 80%, \geq 90%, \geq
95%, \geq 98%, \geq 99%) identidad de la secuencia de
aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la molécula
polipeptídica de IL-2 de referencia, tal como la
IL-2 humana natural tratada más arriba. Una
variante puede, por ejemplo, diferir en solamente 1 a 15 residuos de
aminoácidos, solamente 1 a 10 residuos, tal como
6-10, solamente 5, solamente 4, 3, 2, o incluso
sólo 1 residuo de aminoácido.
Se ha divulgado la extensión del extremo C de la
IL-2 [60]. La IL-2 utilizada con la
invención no tiene preferentemente ninguna de tales extensiones en
el extremo C.
Otras formas de IL-2 que se
pueden utilizar incluyen secuencias no humanas. Por ejemplo, la
IL-2 puede ser de: mono rhesus (Macaca
mulatto; Registro de GenBank P51498); papión olivo (Papio
anubis; GenBank Q865Y1); mangabeye ceniciento (Cercocebus
torquatus atys; P46649); macaco cangrejero (Macaca
fascicularis; Q29615); gibón común (Hylobates lar,
ICGI2); mono ardilla común (Saimiri sciureus; Q8MKH2); vaca
(Bos taurus; P05016 o NP-851340; la secuencia
madura representada por los residuos 24-158 del
Registro del GenBank Nº NP-851340); búfalo de agua
(Bubalus bubalis; Q95KP3); caballo (Equus caballus;
P37997); cabra (Capra hircus; P36835); oveja (Ovis
aries; P19114); cerdo (Sus scrofu; P26891); ciervo rojo
(Cervus elaphus; P51747); perro (Canis familiaris;
Q29416); gato (Fells catus; 407885); conejo (Oryctolagus
cuniculus; 077620); orca (Orcinus orca; 097513); elefante
marino del norte (Mirounga angustirostris; 062641); ratón
casero (Mus musculus; NP-032392); ratón
moruno (Mus spretus; 408867); rata Noruega (Rattus
norvegicus; P17108); gerbo de Mongolia (Meriones
unguiculatus; Q08081). También se pueden utilizar cualquiera de
las formas variantes descritas en estas entradas del GenBank. Estas
entradas del GenBank generalmente describen las secuencias
precursoras que, como se describe más arriba para la secuencia
humana, se transforman para dar una forma final biológicamente
activa por ejemplo por separación de los 20 primeros
aminoácidos.
Se prefieren particularmente las formas
des-alanil-1,
serina-125 de la IL-2 humana para
el uso con la invención. La forma más preferida de
IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos
132-mero mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 1),
como la encontrada en la PROLEUKIN^{TM}. Las composiciones están
preferentemente libres de IL-2 que no tenga Ala en
el extremo N. La proteína de la Figura 2 se puede expresar
utilizando la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 4
(SEQ ID NO: 2), después de la ruptura (separación) de la metionina
traducida en el extremo N.
La IL-2 en el producto
PROLEUKIN^{TM} es no glicosilada, como consecuencia del anfitrión
de expresión E. coli. Se prefiere IL-2 no
glicosilada para el uso con la invención.
Los métodos para detectar la presencia de
IL-2 en una composición y para cuantificarla son
conocidos en la técnica. La detección inmunológica utilizando
anticuerpos anti-IL-2 (por ejemplo
ELISA) es el método de detección más común, y estos métodos también
se pueden utilizar cuantitativamente. Otros métodos cuantitativos
incluyen el análisis de aminoácidos, el ensayo de proteínas de Lowry
con un estándar de proteína reglamentariamente aprobado, análisis
de HPLC, y medidas intrínsecas de absorbancia ultravioleta.
La medida cuantitativa estándar para la
IL-2 es la Unidad Internacional (UI) que se basa no
en la masa de proteína sino en la actividad en un ensayo biológico.
Según el estándar 86/504, 1 UI es la cantidad de
IL-2 que produce el 50% de proliferación máxima de
una línea celular dependiente de IL-2 establecida
[61] CTLL-2. La cuantificación de la actividad de
la IL-2 en otras preparaciones se consigue
comparando las curvas dosis respuesta de la preparación con los
estándares disponibles (por ejemplo la ampolla estándar de
IL-2 WHO, que contiene 100 UI/ml después de la
reconstitución) utilizando un análisis de líneas paralelas, o
mediante programas computerizados tal como el programa ALLFIT
[62,63]. En la práctica, cuando la fabricación está estandarizada
entonces es posible una conversión entre el peso del fármaco y la
Uls. Para el producto PROLEUKIN^{TM}, por ejemplo, la conversión
es 1,1 mg de IL-2 es igual a 18x10^{6} Ul.
La actividad se puede convertir en actividad
específica (es decir actividad por unidad de masa de
IL-2 por ejemplo UI/mg) dividiéndola por la masa de
IL-2 presente. Una composición preferida de la
invención tiene una actividad específica de entre 16 y 17
MUl/mg.
Los procedimientos de la invención dan
microagregados de IL-2/SDS que son adecuados para
uso farmacéutico en seres humanos, y así la invención proporciona
una composición farmacéutica que comprende los microagregados de
IL-2/SDS de la invención. Sin embargo, en lugar de
utilizar simplemente microagregados directamente de la
diafiltración, típicamente se formularán antes de la administración
a pacientes.
Por ejemplo, los microagregados se pueden diluir
para dar una concentración estándar, mientras que se mantiene la
relación IL-2/SDS. La dilución para dar una
concentración de IL-2 de aproximadamente 1,1 mg/ml
es típica.
Los microagregados (por ejemplo después de la
dilución) se pueden mezclar con estabilizadores, particularmente si
van a ser liofilizados. Es típica la adición de azúcares (por
ejemplo, sacarosa, trehalosa) para dar estabilidad durante la
liofilización, y un estabilizador preferido es el manitol. Este
alcohol de azúcar se puede añadir para dar una concentración final
de entre 40 y 50 (por ejemplo 45,5) mg de manitol por miligramo de
IL-2 (50 mg por 1,1mg de IL-2).
También se puede añadir seroalbúmina humana (preferentemente
recombinante) como un estabilizador. También se pueden usar mezclas
de azúcares por ejemplo sacarosa y manitol, trehalosa y manitol,
etc.
Se puede añadir tampón a la composición de
microagregado por ejemplo un tampón Tris, un tampón de histidina,
un tampón de glicina o, preferentemente, un tampón fosfato (por
ejemplo que contenga dihidrogeno fosfato de sodio e hidrogeno
fosfato de disodio). Se prefiere la adición de un tampón para dar
un pH entre 7,2 y 7,8, y en particular un pH de aproximadamente
7,5.
Las composiciones que comprenden los
microagregados se pueden esterilizar, típicamente mediante
esterilización por filtración por ejemplo a través de un filtro de
0,22 \mum. Esta puede estar precedida por la filtración a través
de un filtro con poros más grandes.
Las composiciones acuosas que comprenden los
microagregados se pueden envasar directamente en jeringas, listas
para inyección. También se pueden envasar en nebulizadores, listos
para inhalación.
Las composiciones acuosas que comprenden los
microagregados se pueden liofilizar antes de la distribución. El
producto acuoso o liofilizado se puede envasar en contenedores (por
ejemplo viales), que a continuación se pueden sellar herméticamente.
La liofilización tendrá lugar típicamente en viales, con el sellado
después de la liofilización. El producto liofilizado equivalente a
22x10^{6} Ul de IL-2 se puede envasar en un único
vial como una dosis unitaria, para la reconstitución en un volumen
acuosos final de aproximadamente 1,1 ml, para dar aproximadamente
18x10^{6} Ul/ml. Por lo tanto, también se pueden envasar
cantidades fraccionarias (por ejemplo ^{1}/_{2}, ^{1}/_{3},
^{1}/_{4}, ^{1}/_{5}, ^{1}/_{8}) como dosis unitarias.
En particular, se pueden utilizar dosis unitarias de aproximada-
mente 9x10^{6} Ul, aproximadamente 4,5x10^{6} Ul y
aproximadamente 14x10^{6} Ul.
\newpage
Para la reconstitución después de la
liofilización, se puede utilizar agua estéril para inyección.
También es posible reconstituir una torta liofilizada con una
composición acuosa que comprende seroalbúmina humana
(preferentemente recombinante). Se prefiere la reconstitución en un
volumen acuosos de entre 1,0 ml y 1,2 ml (es decir la
IL-2 se puede diluir para dar la misma concentración
que antes de la liofilización). Este producto reconstituido a
continuación se puede diluir asépticamente en un volumen más grande
de líquido para infusión intravenosa por ejemplo en aproximadamente
50 ml de una solución D5W (Inyección de Dextrosa al 5%). La turbidez
específica permanece sustancialmente constante durante la dilución
con D5W, hasta que la concentración de IL-2 cae por
debajo de aproximadamente 0,1 mg/ml. La dilución puede tener lugar
en diversos contenedores por ejemplo botellas de vidrio, bolsas de
plástico (por ejemplo cloruro de polivinilo), etc. Se debe evitar
la dilución para dar una concentración final de IL-2
fuera del intervalo 30-70 \mug/ml. Se deben evitar
las condiciones que causan cambios en la microagregación por
ejemplo la reconstitución con Agua Bacteriostática para Inyección o
con Inyección de Cloruro Sódico al 0,9%.
Una primera composición farmacéutica preferida
es así una composición acuosa con un pH de aproximadamente 7,5, que
comprende 1,1 mg/ml de IL-2, 0,18 mg de SDS, 50
mg/ml de manitol y tampón fosfato, en la que la IL-2
y el SDS forman microagregados en los cuales el número medio de
moléculas de IL-2 por agregado está entre 10 y 50.
Estas composiciones se pueden reconstituir a partir del material
liofilizado.
Una segunda composición farmacéutica preferida
es el producto de diluir la primera composición farmacéutica
preferida en una solución D5W.
Las composiciones preferidas están libres de
conservantes, libres de antibióticos, y libres de proteínas
distintas de IL-2 (incluyendo libres de HSA) es
decir estos productos son indetectables.
La invención proporciona un método para tratar a
un paciente, que comprende administrar una composición farmacéutica
de la invención al paciente. El paciente es preferentemente un ser
humano, y puede ser un niño (por ejemplo un niño pequeño o bebé),
un adolescente o un adulto, pero generalmente será un adulto.
La invención también proporciona los
microagregados de SDS/IL-2 de la invención para uso
como un medicamento.
La invención también proporciona el uso de los
microagregados de la invención en la fabricación de un medicamento
para tratar a un paciente.
Estos usos, métodos y medicamentos son
preferentemente para el tratamiento de un cáncer, particularmente
esos con tumores sólidos, tales como carcinoma de células renales o
melanoma, en los que el cáncer puede ser metastásico. Los usos,
métodos y medicamentos también ser pueden utilizar para el
tratamiento de pacientes que han recibido un transplante de tejido
u órgano, o que están listos para recibir uno. Los usos, métodos y
medicamentos también se pueden utilizar para el tratamiento de
pacientes que están infectados con VIH, incluyendo esos con y sin
SIDA.
Los pacientes para tratamiento con la invención,
por lo tanto, habrán sido diagnosticados con un cáncer. Los
pacientes que no deben ser tratados de acuerdo con la invención,
sin embargo, pueden incluir: (1) pacientes con hipersensibilidad a
la IL-2 o a cualquier otro componente de la
composición farmacéutica; (2) pacientes con un estado general del
ECOG (Grupo de Oncología Cooperativa del Este) \geq 2; (3)
pacientes con una presencia simultánea de un estado general del
ECOG >1 y más de un órgano con sitios de enfermedad metastásica
y un periodo de <24 meses entre el diagnóstico inicial del tumor
primario y la fecha en que el paciente es evaluado para el
tratamiento con IL-2; (4) pacientes con una
historia significativa o evidencia concurrente de enfermedad
cardiaca grave; (5) pacientes con evidencia de infección activa que
requiere terapia antibiótica; (6) pacientes con un PaO_{2} <
60 mm Hg durante el descanso; (7) pacientes con disfunción
pre-existente grave de órgano principal; y (8)
pacientes con metástasis en el sistema nervioso central o trastornos
epilépticos, con la excepción de pacientes con metástasis cerebral
tratada con éxito.
Los métodos para comprobar la eficacia del
tratamiento terapéutico de IL-2 son conocidos en la
técnica.
Las curvas de suero semivida de la
IL-2 en seres humanos que siguen a la administración
intravenosa en una embolada o a la infusión intravenosa se pueden
describir como bi-exponenciales. Para una embolada,
el T_{1/2}\alpha es 8 minutos y el T_{1/2}\beta es 88
minutos; para una infusión, el T_{1/2}\alpha es 15 minutos y el
T_{1/2}\beta es 96 minutos. Los niveles en suero observados son
proporcionales a la dosis de IL-2.
Las características de los medicamentos
adecuados se dan más arriba en la sección titulada "Composiciones
farmacéuticas". Estas composiciones generalmente se
administrarán directamente a un paciente. La administración directa
se puede conseguir mediante inyección parenteral (por ejemplo de
manera intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, o
en el espacio intersticial de un tejido), o por administración
rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular,
aural, pulmonar o en otra mucosa. En general, sin embargo, la
IL-2 se administra por inyección intravenosa (por
ejemplo infusión continua o en una embolada) o por inyección
subcutánea (por ejemplo infusión continua o en una embolada).
La dosificación de IL-2
generalmente se dimensiona al tamaño del cuerpo del paciente,
medido o por el peso corporal (kg) o por la superficie corporal
(BSA; medida en m^{2}, medida, o estimada por una combinación de
peso y altura del paciente). Aunque no hay una conversión exacta
entre la dosificación por peso y por BSA, hay una buena
aproximación: para una persona de peso y altura medios (50º
percentil para cada uno), 25000 Ul/kg = 1 MUl/m^{2}.
El tratamiento puede ser un programa de dosis
única o un programa de dosis múltiple. Las dosis se pueden dar por
embolada o por infusión. Un régimen típico de tratamiento por
IL-2 es administrar 18x10^{6} Ul por m^{2} por
24 horas como una infusión continua durante 5 días, seguido por
2-6 días sin recibir IL-2, a
continuación 5 días adicionales de IL-2 intravenosa
como una infusión continua como antes, y después 3 semanas sin
recibir IL-2. Este es un "ciclo de inducción"
único para IL-2. Después del periodo de descanso de
3 semanas del primer ciclo, puede comenzar un segundo ciclo de
inducción. Se pueden dar hasta 4 ciclos de mantenimiento con
intervalos de 4 semanas a pacientes que responden o tienen
estabilización de la enfermedad. Sin embargo, si un paciente no
puede tolerar este régimen de dosificación, la dosis se debe
reducir o interrumpir la administración hasta que la toxicidad se
haya moderado. Otro régimen de tratamiento por IL-2
es administrar 6x10^{5} Ul por kg mediante una embolada
intravenosa cada 8 horas, durante 14 dosis en un periodo de 5 días,
con un segundo tratamiento que se da después de un periodo de
descanso de 9 días.
Las administraciones preferidas incluyen:
infusión intravenosa para el tratamiento de carcinoma metastásico
de células renales; infusión intravenosa para el tratamiento de
melanoma metastásico; embolada subcutánea para el tratamiento de
carcinoma metastásico de células renales; infusión subcutánea para
el tratamiento de:. carcinoma metastásico de células renales;
administración pulmonar por inhalación para el tratamiento de
carcinoma metastásico de células renales con metástasis
pulmonar.
Los microagregados de IL-2 de la
invención se pueden utilizar como el ingrediente activo de
productos farmacéuticos. Tales productos farmacéuticos se pueden
utilizar por si mismos para tratar pacientes, o se pueden utilizar
conjuntamente con otros ingredientes activos. Típicamente, la
IL-2 no se mezclará con el otro ingrediente activo
antes de la administración; en su lugar, la IL-2 y
el otro ingrediente activo se administrarán como medicinas
separadas independientes en un protocolo combinado. La politerapia
es particularmente idónea para tratar cánceres, incluyendo cánceres
malignos y metastásicos.
Así la invención proporciona (a) microagregados
de IL-2 de la invención, y (b) un segundo agente
farmacéutico, para administración separada simultánea o
secuencial.
La invención también proporciona una preparación
o sistema farmacéuticos, que comprende (a) un primer agente
farmacéutico, que comprende microagregados de IL-2
de la invención; y (b) un segundo agente farmacéutico, en el que
dichos primer y segundo agentes están o en mezcla o son
composiciones separadas por ejemplo para administración separada
simultánea o secuencial.
La invención también proporciona un kit que
comprende (a) un primer agente farmacéutico, que comprende los
microagregados de IL-2 de la invención; y (b) un
segundo agente farmacéutico.
La invención también proporciona el uso de (a)
los microagregados de IL-2 de la invención y (b) un
segundo agente farmacéutico, en la fabricación de un medicamento
combinado.
La invención también proporciona el uso de los
microagregados de IL-2 de la invención en la
fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para la
administración a un paciente que ha sido pre-tratado
con un segundo agente farmacéutico. Igualmente, la invención
proporciona el uso de un segundo agente farmacéutico en la
fabricación de un medicamento, en el que el medicamento es para la
administración a un paciente que ha sido
pre-tratado con los microagregados de
IL-2 de la invención. El
pre-tratamiento puede ser reciente (por ejemplo
dentro de las 24 horas que preceden a la administración de dicho
medicamento), intermedio (por ejemplo más de 24 horas previas, pero
no más de 4 semanas), más distante (por ejemplo por lo menos 4
semanas previas), o muy distante (por ejemplo por lo menos 6 meses
previos), con estos periodos de tiempo referidos a la dosis de
pre-tratamiento más reciente. El paciente puede ser
refractario al tratamiento por el agente farmacéutico que se
administró en el pre-tratamiento.
La invención también proporciona el uso de los
microagregados de IL-2 de la invención en la
fabricación de un medicamento, en el que el medicamento se
co-administra con un segundo agente farmacéutico.
Igualmente, la invención proporciona el uso de un segundo agente
farmacéutico en la fabricación de un medicamento, en el que el
medicamento se co-administra con los microagregados
de IL-2 de la invención. Los dos agentes se
administran preferentemente dentro del plazo de 4 horas entre
ellos.
Los segundos agentes farmacéuticos preferidos se
seleccionan de la tabla siguiente, que también incluye detalles de
las enfermedades que la politerapia se puede utilizar para tratar
(y, cuando es apropiado, detalles básicos de cómo se puede
administrar la politerapia):
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el segundo agente es un anticuerpo,
preferentemente es un anticuerpo monoclonal, más preferentemente un
anticuerpo humano o humanizado. Los anticuerpos generalmente se
administrarán por inyección por ejemplo subcutánea o intravenosa.
Los anticuerpos se pueden conjugar a otros agentes activos por
ejemplo tiuxetano, ozogamicina, radionúclidos, ^{131}I, etc.,
particularmente para el tratamiento del cáncer.
En general, el segundo agente puede ser
cualquier anticuerpo que proporcione ADCC (citotoxicidad celular
dependiente del anticuerpo). La politerapia basada en
IL-2 es más útil con anticuerpos que median en la
ADCC para tratar el cáncer que con agentes que tratan el cáncer por
inhibición de la vascularización o por alteración de la
transducción de señales del ciclo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La terminología "que comprende" abarca
"que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una
composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en
X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.
El término "aproximadamente" en relación
con un valor numérico x significa, por ejemplo, x \pm 10%. Cuando
sea necesario, el término "aproximadamente" se puede
omitir.
La palabra "sustancialmente" no excluye
"completamente" por ejemplo una composición que está
"sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de
Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" se puede
omitir de la definición de la invención.
El porcentaje de identidad de secuencia se puede
determinar utilizando el algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman utilizando una búsqueda de hueco
afín con una penalización de apertura del hueco de 12 y una
penalización de extensión del hueco de 2, matriz de BLOSUM de 62.
El algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman se enseña en la referencia 64.
La Figura 1 muestra el aumento en la turbidez
específica (\tau) según se elimina el SDS durante la
diafiltración.
Las Figuras 2 y 3 muestran la secuencia de
aminoácidos de la IL-2 en el producto
PROLEUKIN^{TM} (SEQ ID NO: 1). Esta secuencia (i) carece de la
metionina en el extremo N de la SEQ ID NO: 3, (ii) carece del
residuo de alanina encontrado en el extremo N de la
IL-2 humana madura natural como se ve en la SEQ ID
NO: 4, y (iii) tiene una sustitución serina en el residuo
Cys-125 vista en la SEQ ID NO: 4.
La Figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos
que codifica la secuencia de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2, que incluye
los codones de iniciación y parada, y se expresa como la SEQ ID NO:
3 antes de separar la metionina en el extremo N). Los números en la
izquierda indican el número de la primera base en cada fila, según
se cuente desde el extremo 5' de la cadena (+) ADN del gen de
IL-2. Los números bajo la secuencia de aminoácidos
indican números de residuos, según se cuenta desde el extremo N de
la IL-2 humana natural. Las flechas indican
diferencias de nucleótidos respecto a la IL-2
humana (es decir las diferencias entre las SEQ ID NOS: 2 y 5).
La Figura 5 muestra la turbidez específica
(\tau, cm^{2}/g) de las siete muestras utilizadas para la
prueba farmacocinética, con diferentes concentraciones de SDS
(\mug de SDS por mg de IL-2), y la Figura 6
muestra la proporción de la IL-2 total que se puede
granular por centrifugación en las siete muestras.
La Figura 7 muestra la bioactividad en plasma
para seis de las siete muestras. La Figura 8 compara las muestras
de 160 \mug/mg y 25 \mug/mg, y la Figura 9 es una composición
de las Figuras 7 y 8. Los ejes X muestran tiempo (horas) después de
la inyección; los ejes Y muestran bioactividad en plasma
(ng/ml).
La Figura 10 muestra T (cm^{2}/g) contra la
concentración de SDS (mg/\mug) durante la diafiltración, y la
Figura 11 convierte \tau en MW (kDa).
La Figura 12 muestra la bajada en la
concentración de SDS durante la diafiltración.
La Figura 13 superpone los resultados de
turbidez de la Figura 10 sobre el perfil de eliminación de SDS de
la Figura 12.
La Figura 14 muestra el efecto de la
liofilización sobre \tau (cm^{2}/g). Los cuadrados muestran los
valores de pre-liofilización, y los círculos
muestran los valores de post-liofilización. El eje X
muestra la concentración de SDS en las muestras (\mug/mg).
La Figura 15 muestra la bioactividad de los
microagregados de IL-2, antes de y después de la
dilución con suero, y una comparación con IL-2
monomérica.
Las Figuras 16 y 17 muestran los espectros de
dispersión luminosa dinámica para los microagregados de
IL-2. La Figura 16 está distribuida por masa de los
componentes de la disolución, y la Figura 17 está distribuida por
número.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó bajo condiciones estándar E.
coli transformada con un plásmido que escondía la secuencia de
nucleótidos de la Figura 4, tal que se expresó la proteína IL 2 que
tenía la secuencia de la Figura 2. Después del cultivo, la
IL-2 estaba predominantemente en forma de cuerpos
de inclusión.
La recuperación principal de
IL-2 incluyó concentración, destrucción celular,
diafiltración, inactivación, re-destrucción y
suspensión de sacarosa. La concentración de las células cosechadas
se realizó utilizando filtros de flujo transversal para disminuir
el volumen de trabajo aproximadamente cinco veces. Las células se
destruyeron por homogeneización para facilitar el aislamiento de los
cuerpos de inclusión de IL-2. Las sales de los
medios de fermentación se eliminaron por diafiltración y la bacteria
anfitriona en la disolución de diafiltración se mató mediante la
adición de un alcohol. Después del tratamiento con alcohol, las
células se destruyeron por homogeneización. Se añadió sacarosa par
obtener una mezcla de densidad más alta, para permitir la separación
de los cuerpos de inclusión de IL-2 de los residuos
celulares durante la centrifugación. La pasta de partículas de
IL-2 se recogió por centrifugación, se tomaron
alícuotas y se almacenaron a -70ºC o más frío, hasta el
procesamiento adicional.
La pasta de partículas de IL-2
se solubilizó con SDS y se redujo con ditiotreitol (DTT) para
obtener una forma monomérica de IL-2 soluble sin
ningún enlace disulfuro. Esta etapa del procedimiento se realizó
para aumentar el rendimiento cuando la IL-2 se
cromatografíe en la siguiente etapa.
La forma soluble monomérica de
IL-2 se purificó mediante un procedimiento que
incluía las etapas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC),
oxidación, concentración, RP-HPLC, precipitación y
centrifugación. La primera etapa cromatográfica de SEC se realizó
para separar la IL-2 de las proteínas anfitrionas y
los ácidos nucleicos. Las fracciones que contenían
IL-2 se recogieron y se juntaron. La
IL-2 se oxidó para obtener el enlace disulfuro
intramolecular. La concentración de la disolución de
IL-2 se llevó a cabo utilizando ultrafiltración para
disminuir el volumen de trabajo. La segunda etapa cromatográfica,
RP-HPLC preparativa, se realizó para separar la
IL-2 de las endotoxinas bacterianas, ácidos
nucleicos, y proteínas anfitrionas, y para eliminar las isoformas
de IL-2, incluyendo las formas oxidadas. Las
fracciones que contenían IL-2 se recogieron y se
juntaron. La IL-2 se precipitó por adición de
hidróxido sódico (NaOH) y se recogió por centrifugación. Esta etapa
del procedimiento se llevó a cabo para eliminar los disolventes
utilizados en la purificación pro RP-HPLC. El
producto en este estadio es denominado como la "pasta de
HPLC".
A continuación la pasta de HPLC se resolubilizó
añadiendo una disolución de Na_{2}HPO_{4} 0,05 M + 1% SDS.
Cuando se añade el SDS a una concentración suficiente entonces la
composición contiene principalmente IL-2
solubilizada monomérica, pero se puede haber formado una pequeña
cantidad de IL-2 oligomerizada (es decir moléculas
de IL-2 covalentemente unidas en forma de
oligómeros) durante la polimerización. Estos oligómeros se
eliminaron mediante cromatografía de filtración en gel, que también
elimina cualquier disolvente orgánico residual de las etapas
previas.
Como el SDS puede ser tóxico para las células,
se elimina de la IL-2 solubiliza da. La disolución
se diafiltró contra tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,5, hasta
que el nivel de SDS alcanza aproximadamente 160 \mug/mg de
IL-2. Los microagregados de IL-2 y
SDS comienzan a formarse a aproximadamente 500-600
\mug/mg, y su tamaño aumenta gradualmente según el nivel de SDS
disminuye adicionalmente hasta el nivel objetivo de 160 \mug/mg
(Figura 1). Esta eliminación de SDS, que es clave para la formación
de los microagregados, es la última etapa en el procedimiento de
purificación de la IL-2, antes de la
formulación.
La mezcla de SDS/IL-2
diafiltrada, que contiene los microagregados, se probó para
concentración de proteínas (mg/ml) dividiendo la absorbancia a 280
nm por el coeficiente de extinción de la IL-2
(0,79). También se midió el volumen de la disolución de
IL-2 diafiltrada (ml). La cantidad total de proteína
IL-2 (mg) se calculó multiplicando el volumen de la
disolución de IL-2 diafiltrada por la concentración
de proteína. El volumen final de trabajo (ml) para la formulación
se calculo multiplicando los mg totales de proteína por el factor
0,909. Este factor tiene en cuenta la pérdida de
IL-2 durante la filtración.
Para estabilizar la IL-2 durante
la liofilización, se añadió un ¼ de volumen de una disolución de
manitol al 20%, para dar una concentración final de manitol del 5%
(es decir 50 mg/ml). También se añadió tampón de fosfato sódico 10
mM pH 7,5 hasta el volumen final de trabajo. Después de que se
añadieron el manitol y el tampón, se determinó la concentración de
IL-2 en la disolución formulada midiendo la
absorbancia a 280 nm.
El resultado final después de la formulación fue
una disolución a granel a pH 7,5, que contenía:
IL-2 en una concentración final de 1,1 \pm 0,05
mg/ml; 0,18 mg/ml de SDS; 50 mg/ml de manitol; 0,17 mg/ml de
fosfato sódico monobásico; y 0,89 mg/ml de fosfato sódico
dibásico.
La disolución a granel formulada de
IL-2 se esterilizó por filtración a un depósito
estéril. El producto se transfiere desde este depósito a viales
estériles. En cada vial se introdujo 1,2 ml de la disolución a
granel. A continuación los viales se colocaron en un liofilizador y
se liofilizaron. Después los tapones se aplicaron, y los tapones se
sobre sellaron. A continuación los viales se etiquetaron y
empaquetaron.
Antes de llegar al intervalo preferido de
concentración de SDS, se preparó la IL-2 por el
método descrito más arriba, excepto que se sacaron muestras grandes,
(\sim300 mg de IL-2) en diversos puntos durante
la diafiltración para la investigación de; turbidez, para establecer
el efecto del SDS sobre la agregación de IL-2.
La Figura 12 muestra la concentración de SDS
durante la diafiltración del material de partida. La concentración
disminuye según una línea recta en el eje logarítmico. Las muestras
se sacaron en las siguientes concentraciones de SDS (\mug por mg
de IL-2): 1195, 536, 351, 217, 173, 137, 123, 104 y
72.
La pureza de IL-2 fue la misma
en cada muestra (100% por SDS-PAGE, \geq98,5% por
HPLC). La turbidez se midió a 488 nm y se convirtió a una turbidez
específica absoluta (\tau) como se describe más arriba, basada en
la concentración de IL-2 en las muestras. Los
resultados se muestran en la Figura 10, y la Figura 13 superpone
los resultados de turbidez sobre el perfil de eliminación de SDS de
la Figura 12. Por debajo de aproximadamente 300 \mug/mg la
turbidez aumenta gradualmente, y el aumento llega a ser muy
pronunciado por debajo de aproximadamente 95 \mug/mg.
Los valores de \tau se pueden convertir en
pesos moleculares inferidos mediante la fórmula siguiente:
Los resultados de esta conversión para las
muestras de pre-liofilización se muestran en la
Figura 11. Estos y otros datos muestran que un MW que corresponde a
una IL-2 monomérica se ve por encima de
aproximadamente 600 g/mg, y el MW comienza a aumentar
significativamente cuando el SDS está por debajo de aproximadamente
300 \mug/mg, con el aumento que llega a ser muy pronunciado cuando
el SDS cae por debajo de aproximadamente 100 \mug/mg.
Basado en el MW de la IL-2
monomérica (15,3 kDa para la IL-2 natural), el peso
molecular de un agregado se puede convertir en un número inferido de
monómeros de IL-2 por agregado.
Durante la diafiltración para eliminar el SDS,
se sacaron muestras de 15 ml a las siguientes concentraciones de
SDS: 1155; 840; 585; 400; 190; y 155 \mug/mg de
IL-2. Se determinó la turbidez de estas muestras
antes y después de la formulación (es decir después de la adición de
manitol, tampón fosfato, Liofilización y reconstitución) En ambos
casos, las medidas de turbidez se precedieron por filtración a
través de un filtro de 0,2 pm para eliminar cualquier agregado
grande.
La Figura 14 muestra el efecto de la
liofilización sobre T (escala logarítmica) para estas muestras. El
gráfico muestra que la Liofilización no destruye los microagregados,
sino que a menudo puede aumentar ligeramente la turbidez específica
(es decir los agregados aumentan en tamaño), sin afectar la
dependencia sobre la concentración de SDS. El efecto es
generalmente de menor importancia en el intervalo preferido de
SDS.
Los microagregados de IL-2 se
prepararon como se describe más arriba, con una concentración de
SDS de 160 \mug/mg, y se analizaron por DLS. Los resultados se
muestran en las Figuras 16 y 17. La Figura 16 muestra los resultados
de DLS distribuidos por masa de los componentes de la disolución, y
la Figura 17 los muestra por número.
El la Figura 16, el pico principal tiene un
diámetro hidrodinámico medio de 12,7 nm, que representa el 99,02%
de la masa total. También hay un pico posterior con un diámetro
medio de 55,6 nm, que representa el 0,98% de masa restante. El la
Figura 17, el pico principal tiene un diámetro hidrodinámico medio
de 11,7 nm, que representa el 99,99% del total en número. También
hay un pico posterior con un diámetro medio de 53,7 nm, que
representa el 0,01% de partículas restantes.
La IL-2 microagregada se comparó
a la IL-2 monomérica en diversas pruebas. Los
microagregados de IL-2 se prepararon según se
describe más arriba. Para propósitos comparativos, la
IL-2 se preparó en una forma monomérica, en la que
se utilizó Tween 80 como detergente en lugar de SDS. Este
detergente no forma microagregados con IL-2, pero
el detergente solubiliza la IL-2 y da un producto
monomérico bioactivo.
Se confirmó que ambas formas de
IL-2 eran bioactivas. La IL-2
microagregada tuvo una actividad de aproximadamente 20 MUl/mg.
Cuando se diluyó con suero ex vivo, la actividad cayó
ligeramente. En ambos casos, la actividad fue ligeramente más alta
que la de la IL-2 monomérica (Figura 15). Así los
microagregados de IL-2 de la invención son capaces
de disociarse para dar un producto bioactivo, y la bioactividades
equivalente a la de la IL-2 que no se ha
agregado.
La distribución in vivo de
IL-2 radiomarcada se comparó después de la
administración intravenosa de la proteína o en forma microagregada
con SDS o en forma monomérica. La forma microagregada distribuyó
preferentemente al pulmón, hígado y riñones, mientras que el
producto monomérico distribuyó casi el 100% a los riñones. La
microagregación por lo tanto tiene un impacto en la distribución
in vivo.
También se comparó la IL-2
microagregada y monomérica en un modelo de tumor de metástasis.
Células tumorales B16F10 se inyectaron de forma intravenosa en las
colas de ratones y 14 días más tarde, se inspeccionaron los pulmones
para tumores. Los animales tratados recibieron IL-2
diariamente desde los días 3-10. Los números
mediana de las metástasis de pulmón en el día 14 fueron como
sigue:
La forma microagregada de IL-2
es así mas efectiva en el modelo de tumor que la forma monomérica,
en el que la metástasis se puede prevenir utilizando dosis mucho
más bajas de IL-2. Sin embargo, los datos no son
directamente comparables porque la IL-2 puede ella
misma ser tóxica, por ejemplo 10 mg/kg de microagregados de
IL-2 pueden matar aproximadamente % de una población
experimental. La comparación más significativa es así a la dosis no
letal más alta, concretamente a la dosis de 7,5 mg/kg. A esta dosis
equitóxica, el número mediana de metástasis visto con microagregados
fue 4,5 (intervalo 1-18), comparado a 16 (intervalo
4-57) con IL-2 monomérica, siendo
la diferencia estadísticamente significativa. Esta diferencia
representa un índice terapéutico de 3 a 5 veces mejor para la forma
microagregada de IL-2.
Estudios adicionales con el modelo artificial de
metástasis B16 revelaron que los niveles de SDS en el producto
final no parecen tener impacto en la eficacia. Por ejemplo, una
composición con 160 \mug/mg de SDS rindió de la misma manera que
una con 181 \mug/mg. Por lo tanto, con el SDS en el intervalo de
95-250 \mug/mg la actividad
anti-tumoral permanece óptima mientras que se evita
la toxicidad relacionada con el SDS.
Como se muestra más arriba, la turbidez de las
mezclas de IL-2/SDS aumenta según disminuyen los
niveles de SDS durante la diafiltración. En una prueba fármaco
cinética, la diafiltración se continuó mucho más allá del objetivo
típico de 160 \mug/mg, justo se bajó a 25 \mug/mg. Las muestras
se tomaron durante el procedimiento de diafiltración en diversos
estadios: 1090 \mug/mg; 200 \mug/mg; 160 \mug/mg; 125
\mug/mg; 95 \mug/mg; 65 \mug/mg; y 25 \mug/mg.
Todas las muestras excepto la más diluida (25
\mug/mg) fueron visiblemente claras, y la Figura 5 muestra la
turbidez específica (\tau) de las siete muestras. La caída en
\tau en la concentración más baja refleja un enorme aumento en la
precipitación de proteína a 25 \mug/mg, que fue visible a simple
vista. La Figura 6 muestra la proporción de total que se puede
granular por centrifugación en las siete muestras, y se ve un gran
aumento en la concentración más baja de SDS mientras que las
concentraciones más altas son esencialmente constantes. Este
material precipitado sedimenta y así no causa turbidez, lo que
explica el bajo valor de \tau en la Figura 5.
En contraste con la turbidez y precipitación
variables, la bioactividad (Ul) fue esencialmente constante para
las siete muestras (aproximadamente 19 Ul/mg).
Para estudiar la farmacocinética, todas las
muestras excepto la más diluida se inyectaron en una sola embolada
en la vena comentada de ratas (triplicada pro dosis de SDS, 18
ratas en total) a 0,2 mg de IL-2 por kg de peso
corporal, basado en una extrapolación alómétrica de una dosis
humana. Las muestras de sangre se tomaron a 1, 3, 5, 7,5, 10, 15,
20, 25, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección y se valoraron
para la bioactividad de IL-2. La Figura 7 muestra la
bioactividad en plasma (ng/ml) de estas muestras. Entre 0,5 horas y
1 hora, la línea de la parte superior es la dosis de 160 \mug/mg
(\blacksquare), y la línea más baja es 65 \mug/mg (\Delta),
aunque todas las líneas son muy similares.
En un segundo estudio, la muestra con la línea
más alta en el primer experimento (160 \mug/mg) se comparó a la
muestra más diluida (25 \mug/mg). Los parámetros farmacocinéticos
de la muestra de 160 \mug/mg en el segundo estudio encajaron con
los del primer estudio. Sin embargo, mientras que las líneas en la
Figura 7 son todas de formas similares unas a otras, la muestra más
diluida dio resultados muy diferentes (Figura 8). La velocidad de
clarificación calculada de las curvas fue diferente \sim30 veces:
12,7 ml/min/kg para la dosis de 160 \mug/mg, y 362 ml/min/kg para
la dosis de 25 \mug/mg.
Cuando los resultados de los dos experimentos se
comparan, la muestra más diluida es claramente distinta de las
otras seis muestras (Figura 9).
Así el estado de agregación de la
IL-2 tiene un claro efecto sobre su farmacocinética
in vivo.
Los experimentos anteriormente mencionados miden
la concentración total de SDS en las mezclas de
SDS/IL-2. Se realizaron experimentos para ver cuanto
del SDS total se asociaba con la IL-2 y cuanto
permanecía libre en disolución.
Se reconstituyeron viales del producto
PROLEUKIN^{TM} según se indica y se ultrafiltraron a través de
membranas Centricon 10 (corte 10 kDa) mediante dos centrifugaciones
a 3000 rpm durante 30 minutos cada una. Se analizaron los niveles de
SDS e IL-2 de la muestra de partida y el filtrado.
Se midió el SDS mediante el ensayo de naranja de acridina [35].
Brevemente, este ensayo implica: tomar 0,5 ml de muestra; añadir
0,1 ml de disolución de NaHSO_{4} 1,75 M; añadir 0,1 ml de
disolución de naranja de acridina al 1% (p/v); añadir 1,5 ml de
tolueno; sellar; agitar en un vortex durante 3 minutos; separar las
fases orgánica y acuosa por ejemplo por centrifugación durante 5
minutos a 3000 rpm y temperatura ambiente; medir la absorbancia de
la capa orgánica superior a 499 nm. Las muestras se pueden diluir
(por ejemplo con agua pura) antes del ensayo para hacerlas entrar
dentro del intervalo de una curva estándar por ejemplo si la curva
estándar se basa en concentraciones conocidas de SDS de hasta 25
\mug/ml entonces la muestra se debe diluir para hacer entrar su
concentración de SDS dentro de este intervalo. El blanco para la
etapa espectrofotométrica debe ser un estándar que contenga cero SDS
que se ha tratado de la misma manera que la muestra
experimental.
Los resultados mostraron que la
IL-2 era totalmente retenida por las membranas de
ultrafiltración (nada detectable en el filtrado), mientras que
aproximadamente el 35% del SDS fue capaz de pasar a través de la
membrana.
Se entenderá que la invención se ha descrito vía
ejemplo solamente y se puede hacer modificación del detalle sin
apartarse del espíritu y alcance de la invención.
\global\parskip0.930000\baselineskip
(Los contenidos totales de las
cuales se incorporan en la presente memoria como
referencia)
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> CHIRON CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PREPARACIÓN DE ALDESLEUKINA PARA USO
FARMACÉUTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ATTORNEY REF
P-100204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99, version 1.02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante
des-alanyl-1
serine-125 madura de la interleukina
humana-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante
des-alanyl-1
serine-125 madura de la interleukina
humana-2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante
des-alanyl-1
serine-125 madura de la interleukina
humana-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 405
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia IL-2
humana con Met en lugar de la señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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Claims (52)
1. Un procedimiento para preparar
interleucina-2 para uso farmacéutico, que comprende
las etapas de: (a) añadir dodecil sulfato de sodio (SDS) a una
composición que comprende interleucina-2 con
puentes disulfuro intramoleculares, para dar una concentración
final de SDS de por lo menos 500 \mug de SDS por mg de
IL-2; (b) eliminar cualquier multímero covalente de
IL-2 precipitado mediante cromatografía de
filtración en gel; (c) reducir la concentración de SDS para eliminar
algo del SDS, pero no todo, de la composición para dar una
composición que contiene entre 95-250 \mug de SDS
por mg de interleucina-2.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende las etapas de: purificar la IL-2 mediante
RP-HPLC; precipitar la IL-2; añadir
dodecil sulfato de sodio (SDS) a la IL-2
precipitada, para dar una concentración final de SDS de al menos 500
\mug de SDS por mg de IL-2; eliminar cualquier
multímero covalente de IL-2 precipitado mediante
cromatografía de filtración en gel; y reducir la concentración de
SDS para eliminar algo del SDS, pero no todo, de la composición
para dar una composición que contiene entre 95-250
\mug de SDS por mg de IL-2.
3. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que la concentración final de SDS en la etapa (a)
es por lo menos 900 \mug/mg.
4. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que el producto de la etapa (c) tiene una
concentración de SDS entre 135-180 \mug/mg.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de SDS se
reduce por diafiltración.
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que además comprende una etapa de:
adición de manitol.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que además comprende una etapa de:
liofilización.
8. Una composición que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la
que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio
están presentes en forma de agregados, y en la que los agregados
son obtenibles mediante el proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes.
9. Una composición que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en la
que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio
están presentes en forma de agregados, y en la que la composición
tiene una o más de las características siguientes:
- (i)
- la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g; 39
- (ii)
- la composición contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y/o
- (iii)
- la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Una composición liofilizada que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio,
composición que se puede reconstituir con un medio acuoso para dar
la composición de la reivindicación 9.
11. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 8-10 precedentes, que tiene una
turbidez específica menor de 0,7 cm^{2}/g.
12. La composición de la reivindicación 11, que
tiene una turbidez específica entre 0,3 cm^{2}/g y 0,6
cm^{2}/g.
13. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 8-12 precedentes, que comprende
microagregados de SDS/IL-2 con un diámetro
hidrodinámico medio entre 11 nm y 13 nm.
14. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que se
añade manitol a una concentración final de entre 40 y 50 mg de
manitol por mg de IL-2.
15. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 es una IL-2 humana.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 es una
des-alanil-1
IL-2.
17. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 es una serina-125
IL-2.
IL-2.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 es
des-alanil-1,
serina-125 IL-2.
19. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
1.
20. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 precedentes, en el que la
IL-2 es no glicosilada.
21. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, que incluye
manitol a una concentración entre 40 y 50 mg de manitol por mg de
IL-2.
22. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 es una IL-2 humana.
23. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 es una
des-alanil-1
IL-2.
24. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 es una serina-125
IL-2.
25. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 es
des-alanil-1,
serina-125 IL-2.
26. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
1.
27. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 precedentes, en la que la
IL-2 es no glicosilada.
28. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 ó 14-20
precedentes, en el que la IL-2 se purifica después
de la expresión en un anfitrión procariótico recombinante.
29. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13 6 21-27, que
tiene una concentración de IL-2 de 1,1 mg/ml.
30. Una composición farmacéutica liofilizada
que, cuando se reconstituye con 1,2 ml de agua estéril para
inyección, contiene en cada mililitro: 1,1 mg de
desalanil-1, serina-125
IL-2 humana no glicosilada; 50 mg de manitol; 0,18
mg de dodecil sulfato de sodio (SDS); 0,17 mg de fosfato sódico
monobásico; y 0,89 mg de fosfato sódico dibásico a pH 7,5, en la
que la IL-2 y el SDS están en forma de agregados
tales que la composición reconstituida tiene una turbidez
específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g.
31. Una composición farmacéutica acuosa,
obtenible reconstituyendo la composición liofilizada de la
reivindicación 30 con 1,2 ml de agua estéril para inyección.
32. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13, 21-27,
29-31, y un segundo agente farmacéutico, como una
preparación combinada para la puesta en práctica de un método
terapéutico mediante administración secuencial o separada
simultánea.
33. Un kit que comprende (a) la composición de
una cualquiera de las reivindicaciones 8-13,
21-27, 29-32; y (b) un segundo
agente farmacéutico.
34. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13, 21-27,
29-32, para uso en medicina.
35. El uso de microagregados de (a)
interleucina-2 y (b) dodecil sulfato de sodio, en el
que los microagregados tienen un diámetro hidrodinámico medio de
entre 8 nm y 29 nm, en la fabricación de un medicamento para la
administración a un paciente.
36. El uso de una composición que comprende
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, en el
que la interleucina-2 y el dodecil sulfato de sodio
están presentes en forma de agregados, y en el que la composición
tiene una o más de las características siguientes:
- (i)
- la composición tiene una turbidez específica (\tau) menor de 1,1 cm^{2}/g;
- (ii)
- la composición contiene agregados de SDS/IL-2 con un diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm; y/o
- (iii)
- la composición contiene entre 95-250 \mug de SDS por mg de interleucina-2,
en la fabricación de un medicamento para la
administración a un paciente.
37. El uso de la reivindicación 35 ó 36, en el
que el medicamento es para tratar el cáncer.
38. El uso de la reivindicación 37, en el que el
cáncer es carcinoma de células renales.
39. El uso de la reivindicación 37, en el que el
cáncer es melanoma.
40. El uso de (a) microagregados de
interleucina-2 y dodecil sulfato de sodio, y (b) un
segundo agente farmacéutico, en el que los microagregados tienen un
diámetro hidrodinámico medio de entre 8 nm y 20 nm, en la
fabricación de un medicamento combinado.
41. La composición de la reivindicación 32, en
la que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo
monoclonal.
42. La composición de la reivindicación 32, en
la que el segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que
proporciona ADCC.
43. La composición de la reivindicación 32, en
la que el segundo agente: farmacéutico se selecciona del grupo que
consiste en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo
anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2;
un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo
anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52;
un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor
H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida;
Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de
ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de
ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una
citoquina interferón \alpha; interferón \gamma;
5-fluorouracilo; un compuesto
anti-retrovírico; un inhibidor de tirosina quinasa;
y Decitabina.
44. La composición de la reivindicación 43, en
la que el agonista del receptor de H2 es histamina o una sal
farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el
dihidrocloruro de histamina.
45. El kit de la reivindicación 33, en el que el
segundo agente farmacéutico es un anticuerpo monoclonal.
46. El kit de la reivindicación 33, en el que el
segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que proporciona
ADCC.
47. El kit de la reivindicación 33, en el que el
segundo agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste
en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo
anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2;
un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo
anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52;
un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor
H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida;
Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación d e
ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de
ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una
citoquina; interferón \alpha; interferón \gamma;
5-fluorouracilo; un compuesto
anti-retrovirico; un inhibidor de tirosina quinasa;
y Decitabina.
48. El kit de la reivindicación 47, en el que el
agonista del receptor de H2 es histamina o una sal
farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el dihidrocloruro
de histamina.
49. El uso de la reivindicación 40, en el que el
segundo agente farmacéutico es un anticuerpo monoclonal.
50. El uso de la reivindicación 40, en el que el
segundo agente farmacéutico es un anticuerpo que proporciona
ADCC.
51. El uso de la reivindicación 40, en el que el
segundo agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste
en: un anticuerpo anti-CD20; un anticuerpo
anti-CD40; un anticuerpo anti-Her2;
un anticuerpo anti-EGFR; un anticuerpo
anti-VEGF; un anticuerpo anti-CD52;
un anticuerpo anti-CD33; un agonista del receptor
H2; Bacilo de Calmette-Guerin; talidomida;
Lenalidomida; un inhibidor de proteasoma; una combinación de
ciclofosfamida, vincristina y prednisona; una combinación de
ciclofosfamida, hidroxidoxorubicina, vincristina y prednisona; una
citoquina; interferón \alpha; interferón \gamma;
5-fluorouracilo; un compuesto
anti-retrovírico; un inhibidor de tirosina quinasa;
y Decitabina.
52. El uso de la reivindicación 51, en el que el
agonista del receptor de H2 es histamina o una sal
farmacéuticamente aceptable de histamina, tal como el dihidrocloruro
de histamina.
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ES200500241A ES2318916B1 (es) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | Procedimiento para preparar aldesleukina para uso farmaceutico. |
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ES2318916A1 ES2318916A1 (es) | 2009-05-01 |
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Title |
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ARAKAWA, T., PHILO, J., KENNEY, W. C. Structure and solubility of interleukin-2 in sodium dodecyl sulfate. International Journal of Peptide & Protein Research. Junio 1994, Vol. 43, N$^{o}$ 6, páginas 583-587. ISSN 0367-8377. * |
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