Es
wäre für jeden,
der ein IL-2 Produkt, ähnlich
dem PROLEUKINTM, herstellen möchte, nützlich zu wissen,
wie man dieselbe Mikroaggregat-Form des IL-2 erzielt, wie sie in
dem PROLEUKINTM Produkt vorliegt. Es ist
deshalb beabsichtigt, mit dieser Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von IL-2 Mikroaggregaten zu ermöglichen,
wie sie in dem PROLEUKINTM Produkt vorliegen
und auch derartiges mikroaggregiertes IL-2 zur Verfügung zu
stellen. Ein weiteres Anliegen der Erfindung ist es, ein Verfahren
für die
Herstellung von IL-2 zu ermöglichen
und die Offenbarung in Zitat 9 zu ergänzen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das
Verfahren mit dem das PROLEUKINTM Produkt
hergestellt wird, umfasst die folgenden Schritte: (i) Reinigung
von exprimiertem IL-2 aus der Zellkultur; (ii) solubilisieren des
IL-2 unter Verwendung von SDS-Detergens; (iii) Reduzierung des IL-2
zu monomerer Form; (iv) Reinigung, Oxidierung und Präzipitation von
IL-2; (v) Re-solubisierung von IL-2 unter Verwendung einer hohen
Konzentration von SDS-Detergens; (vi) Reinigung zur Entfernung von
oligomerem IL-2; (vii) Diafiltration zur Verringerung der SDS-Konzentration, ohne
es vollständig
zu entfernen, jedoch bis zu einen optimalen Bereich um ein entsprechend
mikroaggregiertes IL-2 Präparat
zu erhalten; (viii) Formulierung mit Mannit und Puffer; und (ix)
Lyophilisierung und Verpackung.
Die
Schritte (i), (iv), (vi), (viii) und (ix) dieses Verfahrens sind
in Zitat 9 offenbart, aber die Schritte (ii), (iii), (v) und (vii)
sind es nicht, obwohl die Verwendung eines nicht näher beschriebenen
Detergens zur Re-solubisierung des IL-2 vor Schritt (vi) offenbart
wird. Weiterhin, schlägt
Zitat 9 vor, dass SDS zu dem IL-2 nach der Reinigung in Schritt
(vi) zugegeben werden soll, während
es tatsächlich
entfernt wird.
Von
den neun Schritten sind die kritischsten Schritte (v) und (vii),
diejenigen in denen die Mikroaggregate gebildet werden. Keiner der
nachfolgenden Schritte (viii) oder (ix) haben eine signifikante
Wirkung auf die Mikroaggregation und die Reinigungsschritte in (i),
(ii), (iii), (iv) und (vi) haben ebenfalls nur wenige Wirkungen. Sobald
das SDS in Schritt (v) zugefügt
ist, löst
sich das IL-2, und es ist die folgende Verringerung der SDS-Menge
in Schritt (vii), die zur Bildung der Mirkoaggregate führt, wie
sie in dem finalen PROLEUKINTM Produkt vorliegen.
Es muss genug SDS zugefügt
werden um das präzipitierte
IL-2 in eine im wesentlichen momomere, lösliche Form zu re-solubisieren,
und danach muss das SDS entfernt werden (aber nicht vollständig), um
die gewünschten
Mikroaggregate zu bilden.
Die
Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Herstellung von IL-2
für die
pharmazeutische Verwerndung vor, das Schritte umfasst, bei denen
man: (a) Natriumdodecylsulfat (SDS) zu einer Zusammensetzung gibt,
die Interleukin-2 umfasst, um eine Endkonzentration von mindestens
500 μg SDS
pro mg IL-2 zu erhalten; (b) etwas, aber nicht alles SDS entfernt,
um eine Zusammensetzung zu erhalten, die zwischen 95 und 250 μg SDS pro
mg IL-2 enthält.
Dieser Vorgang der SDS-Zugabe und der folgenden teilweise Entfernung
erzielt optimale Bedingungen für
eine enge Wechselwirkung von IL-2 und SDS Molekülen, um Mikroaggregate aus
IL-2 und SDS zu bilden, so wie sie in dem PROLEUKINTM Produkt
vorliegen. Ferner erzielt dieser Vorgang bei einem bestimmten IL-2/SDS
Verhältnis,
eine andere Produktform als die, die durch einfaches Mischen von
SDS und IL-2 erzielt wird.
Die
wässrige
Zusammensetzung, die im Laufe des Verfahrens entsteht, kann für die Versendung
lyophilisiert werden und das lyophilisierte Material kann schließlich, zur
Anwendung beim Patienten mit einem wässrigen Träger rekonstituiert werden.
Nach der Rekonstitution hat die Zusammensetzung bevorzugt eine spezifische
Trübung
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g und/oder umfasst SDS/IL-2
Aggregate mit einem mittleren hydrodynamischen Durchmesser zwischen
8 nm und 20 nm. Deshalb kann das Verfahren zusätzliche Schritte zur Lyophilisierung
der Zusammensetzung und dann, gegebenenfalls, Schritte zur Rekonstituierung
der Zusammensetzung mit einem wässrigen
Medium enthalten. Die Zusammensetzung kann diese τ-Werte und/oder hydrodynamischen
Eigenschaften auch vor dem Lyophilisierungsschritt haben.
Die
Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2
und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Aggregate durch
den erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten werden. Diese Zusammensetzungen sind geeignet für die pharmazeutische
Verwendung, wie es mit dem PROLEUKINTM Produkt
gezeigt wurde.
Die
Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2
und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Zusammensetzung
eine spezifische Trübung
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g hat. Diese Zusammensetzungen sind
geeignet für
die pharmazeutische Verwendung, wie es mit dem PROLEUKINTM Produkt gezeigt wurde.
Die
Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2
und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei Aggregate einen mittleren
hydrodynamischen Durchmesser zwischen 8 nm und 20 nm haben. Diese
Zusammensetzungen sind geeignet für die pharmazeutische Verwendung,
wie es mit dem PROLELUKINTM Produkt gezeigt
wurde.
Die
Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2
und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen, wobei die durchschnittliche
Zahl der Interleukin-2 Moleküle
pro Aggregat zwischen 10 und 50 liegt. Diese Zusammensetzungen sind
geeignet für
die pharmazeutische Verwendung, wie es mit dem PROLEUKINTM Produkt gezeigt wurde.
Die
Erfindung stellt eine lyophilisierte Zusammensetzung bereit, die
Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei die Zusammensetzung
rekonstituiert werden kann um eine wässrige Lösung zu ergeben, in der Interleukin-2
und Natriumdodecylsulfat in der Form von Aggregaten vorliegen und
wobei die Zusammensetzung eine spezifische Trübung (τ) von weniger als 1,1 cm2/g hat. Nicht nur, oder sowohl als auch,
sind sie Aggregate durch τ charakterisiert,
sondern sie können
ferner einem mittleren hydrodynamischen Durchmesser zwischen 8 nm
und 20 nm haben. Diese Zusammensetzungen sind geeignet für die pharmazeutische
Verwendung, wie es mit dem PROLEUKINTM Produkt
gezeigt wurde.
Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten
Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
umfasst, wobei: (i) die Zusammensetzung rekonstituiert werden kann um
eine wässrige
Zusammensetzung zu ergeben, in der Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Zusammensetzung
eine spezifische Trübung
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g hat und (ii) das Verfahren
beinhaltet Schritte in denen (a) Natriumdodecylsulfat zu einer Zusammensetzung,
die Interleukin-2 umfasst, gegeben wird, wobei genügend Natriumdodecylsulfat
zugegeben wird, so dass gelöstes
monomeres Interleukin-2 entsteht, (b) die Konzentration an Natriumdodecylsulfat
soweit gesenkt wird, dass das Interleukin-2 Aggregate mit dem Natriumdodecylsulfat
bildet, und (c) die Zusammensetzung lyophilisiert wird.
Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten
Zusammensetzung zur Verfügung,
die Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat umfasst, wobei: (i) die
Zusammensetzung rekonstituiert werden kann um eine wässrige Zusammensetzung
zu ergeben, in der Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat in der
Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Aggregate einen mittleren
hydrodynamischen Durchmesser zwischen 8 nm und 20 nm haben und (ii)
das Verfahren Schritte umfaßt
in denen (a) Natriumdodecylsulfat zu einer Zusammensetzung, die
Interleukin-2 umfasst, gegeben wird, wobei genügend Natriumdodecylsulfat zugegeben
wird, so dass gelöstes
monomeres Interleukin-2 entsteht, (b) die Konzentration an Natriumdodecylsulfat
soweit gesenkt wird, dass das Interleukin-2 Aggregate mit dem Natriumdodecylsulfat
bildet, und (c) die Zusammensetzung lyophilisiert wird.
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten
Zusammensetzung, die Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat umfasst,
wobei: (i) die Zusammensetzung rekonstituiert werden kann um eine
wässrige
Zusammensetzung zu ergeben, in der Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Zusammensetzung
eine spezifische Trübung
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g hat und (ii) das Verfahren
umfasst Schritte in denen (a) Natriumdodecylsulfat und Interleukin-2
so gemischt werden, dass Natriumdodecylsulfat in einer ersten Konzentration
vorliegt, (b) Natriumdodecylsulfat aus der Mischung entfernt wird,
um es auf eine zweite Konzentration zu reduzieren, und (c) Lyophilisierung
der Zusammensetzung, wobei die besagte Zusammensetzung erhalten
wird. Die zweite Konzentration ist geringer als die erste: Die erste
Konzentration ist im allgemeinen zumindest 500 μg SDS pro mg IL-2 in der Mischung und
die zweite Konzentration ist im allgemeinen zwischen 95 und 250 μg SDS pro
mg IL-2.
Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten
Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
umfasst, wobei: (i) die Zusammensetzung rekonstituiert werden kann
um eine wässrige
Zusammensetzung zu ergeben, in der Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Aggregate einen
mittleren hydrodynamischen Durchmesser zwischen 8 nm und 20 nm haben
und (ii) das Verfahren Schritte umfasst, in denen (a) Natriumdodecylsulfat und
Interleukin-2 so gemischt werden das Natriumdodecylsulfat in einer
ersten Konzentration vorliegt, (b) Natriumdodecylsulfat aus der
Mischung entfernt wird so das es in einer zweiten Konzentration
vorliegt und (c) Lyophilisierung der Zusammensetzung, wobei die
besagte Zusammensetzung erhalten wird. Die zweite Konzentration
ist geringer als die Erste: Die erste Konzentration ist im allgemeinen
zumindest 500 μg
SDS pro mg IL-2 in der Mischung und die zweite Konzentration ist
im allgemeinen zwischen 95 und 250 μg SDS pro mg IL-2.
Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten
Zusammensetzung bereit, die Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
umfasst, wobei: (i) die Zusammensetzung rekonstituiert werden kann,
um eine wässrige
Zusammensetzung zu ergeben, in der Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat
in der Form von Aggregaten vorliegen und wobei die Zusammensetzung
eine spezifische Trübung
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g hat und worin die
SDS-Konzentration 'x' μg SDS pro mg IL-2 ist, wobei
x zwischen 95 und 250 ist und (ii) das Verfahren Schritte umfasst,
in denen (a) Natriumdodecylsulfat und Interleukin-2 so gemischt werden
dass eine Mischung entsteht in der die SDS-Konzentration vorliegt
die mindestens 4 mal höher
als 'x' ist, (b) ein Teil
des SDS aber nicht alles von der Mischung entfernt wird, so das
die SDS-Konzentration 'x' ist und (c) Lyophilisierung
der Zusammensetzung. Die Konzentration ist bevorzugt mindestens
5 mal höher
als 'x', und besonders bevorzugt
mindestens 8 mal höher,
10 mal höher,
1 S mal höher
oder sogar 20 mal höher.
Die
Erfindung beinhaltet ebenfalls Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung
bestehend aus Interleukin-2 und Natriumdodecylsulfat (SDS) wobei
(i) Interleukin-2 und SDS in der Zusammensetzung in der Form von
Aggregaten vorliegen, wobei die Aggregate einen mittleren hydrodynamischen
Durchmesser zwischen 8 nm und 20 nm haben und wobei die SDS-Konzentration 'x' μg
SDS pro mg IL-2 ist, wobei x zwischen 95 und 250 ist und (ii) das
Verfahren Schritte beinhaltet in denen (a) Natriumdodecylsulfat
und Interleukin-2 so gemischt werden das eine Mischung entsteht
in der die SDS-Konzentration vorliegt die mindestens 4 mal höher als 'x' ist, (b) ein Teil des SDS aber nicht
alles von der Mischung entfernt wird, so das sie SDS-Konzentration 'x' ist und (c) Lyophilisierung der Zusammensetzung.
Die Konzentration ist bevorzugt mindestens 5 mal höher als 'x', und besonders bevorzugt mindestens
8 mal höher,
10 mal höher,
15 mal höher
oder sogar 20 mal höher.
In
Fällen
wo das Verfahren der Erfindung die Reduzierung der SDS-Konzentration
auf Werte zwischen 95-250 μg
SDS pro mg IL-2 beinhaltet, ist es in einigen Fallen möglich, die
Konzentration auf unter 95 μg/mg (zum
Beispiel auf zwischen 50-95 μg/mg)
zu senken und sie dann wieder auf Konzentrationen zwischen 95 und
250 μg/mg
zu erhöhen.
Dieser Anstieg auf 95-250 μg/mg
kann bequem während
der Rekonstitution des lyophilisierten Materials stattfinden, zum
Beispiel kann dieses Verfahren eine Verringerung des SDS auf < 95 μg/mg gefolgt
von Lyophilisierung, gefolgt von Rekonstitution mit einer wässrigen
SDS-Lösung
beinhalten, so dass die SDS-Konzentration in den Bereich zwischen
95 und 250 mg/mg fällt.
Das Detergens
Die
Verfahren der Erfindung beinhalten die Verwendung von Natriumdodecylsulfat
(SDS) welches auch als Natriumlaurylsulfat bekannt ist. Die chemische
Formel dieses anionischen Detergens ist CH3(CH2)11OSO3 –Na+ seine CAS Nummer ist 151-21-3 und die EC
Nummer 205-788-1.
SDS
ist ein Standardreagenz, das verwendet wird um Proteine zu lösen. Wenn
IL-2 als Präzipitat
vorliegt bevor SDS zugegeben wird, dann wird es zur Erfüllung von
Schritt (a) im Verfahren der Erfindung gebraucht. Ausgehend von
einer Zusammensetzung, die präzipitiertes
IL-2 umfasst, wird genügend
SDS zugegeben um sicherzustellen, dass im wesentlichen alles gefällte IL-2
gelöst
wird (mit Ausnahme aller im Präzipitat vorliegenden
kovalent gebundenen IL-2 Multimere, die auch in Gegenwart von SDS überwiegend
weiterhin als Präzipitat
vorliegen). Mikroaggregation von IL-2 bei einer Konzentration von
1 mg/ml ist im wesentlichen nicht gegeben wenn SDS in Konzentrationen
von mehr als 500 μg/mg
vorliegt, und deshalb wird typischerweise soviel SDS zugegeben,
dass die Endkonzentration an SDS mindestens 500 μg SDS pro mg IL-2 beträgt (zum Beispiel
mindestens 550, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800,
mindestens 900, mindestens 1000, mindestens 1200, mindestens 1400,
mindestens 1600, mindestens 1800 oder mindestens 2000 μg SDS pro
mg IL-2). Die Verwendung von ungefähr 910 μg SDS pro mg IL-2 ist bevorzugt.
Die
Ausgangskonzentration des SDS in einer Probe ist generell bekannt,
da SDS natürlicherweise nicht
in Zellen vorkommt und die Menge an SDS kontrolliert wird, die während der
Verarbeitung von zellulärem Material
zugegeben wurde. Für
den Fall, dass die SDS-Konzentration nicht bekannt ist, kann diese
mit Hilfe von konventionellen Versuchsverfahren bestimmt werden.
Dies kann entweder durch Messung des gesamten Materials oder durch
Messung eines Aliquots geschehen. Zum Beispiel offenbart Zitat 31
eine kapillarelektrophoretische Methode zur Auftrennung und Bestimmung
von Tensiden, einschließlich
SDS; Zitat 32 offenbart eine „Einzel-Tropfen" Methode für die Bestimmung
von Dodecylsulfat-Ionen in einem Bereich von 0,2-100 μM unter Verwendung
eines elektrodenfreien piezoeletrischen Quarz-Kristalls; Zitat 33
vergleicht drei Methoden für
die bequeme Bestimmung von SDS in wässrigen Lösungen, namentlich Titration
unter Verwendung von Cetyltrimethylammonium-Bromid, wobei entweder
eine ionenselektive Elektrode benutzt wird oder eine Endpunktbestimmung
der Trübung
durchgeführt
wird, oder die Trübung
in der Gegenwart von Myristyltrimethylammonium-Brormid gemessen
wird; Zitat 34 offenbart eine Methode zur Bestimmung von SDS, basierend
auf dessen Wechselwirkung mit fluoreszierenden Farbstoffen, wie
Ethidiumbromid, etc. Die bevorzugte Methode zur Bestimmung des SDS-Gehaltes
ist eine spektralphotometrische Messung, basierend auf der Reaktion
von SDS mit Acridin-Orange, wie sie im Detail in den Beispielen
in Zitat 35 beschrieben wird.
Alternativ
zur Bestimmung des SDS-Gehaltes in Relation zur IL-2 Masse, kann
der SDS-Gehalt auch relativ zur IL-2 Aktivität gemessen werden. Basierend
auf einer IL-2 Aktivität
von 18 × 106 IU in 1,1 mg IL-2 (wie er in PROLEUKINTM vorliegt) sind 100 μg SDS pro mg IL-2 äquivalent
zu 6,111 μg
SDS pro MIU IL-2.
Anstelle
der Verwendung von SDS in den Verfahren und Produkten der Erfindung,
ist es auch möglich Natriumlaurethsulfat
(SLS) oder Ammoniumlaurylsulfat (ALS) zu benutzen. Mischungen von
SLS, ALS und/oder SDS können
ebenfalls verwendet werden. In den bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung wird jedoch SDS verwendet.
Entfernung des Detergens
Nach
der Zugabe des SDS zu der IL-2 Zusammensetzung, beinhaltet das Verfahren
der Erfindung die Entfernung von einigem (aber nicht allem) SDS,
wobei Mikroaggregate von IL-2 und SDS gebildet werden.
SDS
kann mit Hilfe verschiedener Techniken entfernt werden. Ionen-Austausch-Chromatographie kann
negativ geladenes SDS entfernen, und Gelfiltration kann auch durchgeführt werden.
Am meisten bevorzugt ist jedoch die Entfernung des SDS mittels Diafiltration.
Während
der Diafiltration werden Lösungsmittel und/oder
Mikrosolute (zum Beispiel Salze) durch andere Lösungsmittel und/oder Mikrosolute
ersetzt. Im allgemeinen erfolgen Entfernung und Ersetzung mit der
gleichen Geschwindigkeit und das Volumen der Lösung bleibt im wesentlichen
konstant. Die allgemeine Wirkung besteht somit in dem Austausch
der ursprünglichen Lösungsmittel/Mikrosolute
gegen neue Lösungsmittel/Mikrosolute.
Diafiltration
gegen einen SDS-freien Puffer ist die bevorzugte Weise zur Entfernung
von SDS, zum Beispiel Diafiltration gegen einen 10 mM Natriumphosphat
Puffer mit pH 7,5.
Die
Entfernung des SDS wird fortgesetzt bis die Zusammensetzung zwischen
95 μg und
259 μg SDS pro
mg Interleukin-2 umfasst, zum Beispiel 118-210 μg/mg, zwischen 135 μg/mg und
180 μg/mg
oder ca. 160 μg/mg,
umfasst. Die pharmakokinetischen Eigenschaften von IL-2 sind im
wesentlichen konstant in diesem Bereich und der Gehalt ans SDS ist
nicht so hoch, als dass er Anlass zu toxikologischen Bedenken gäbe. Fällt die
SDS-Konzentration unter ungefähr
95 μg/mg,
kommt es jedoch zu einer starken Zunahme in der Größe der Mikroaggregate
(1), sie steigt von durchschnittlich etwa 60 IL-2
Molekülen
pro Aggregat bei 95 μg/mg
auf durchschnittlich etwa 180 bei 75 μg/mg.
Zugabe
und anschließende
unvollständige
Entfernung des SDS führt
zum Entstehen der biologisch aktiven IL-2 Mikroaggregate wie sie
in dem PROLEUKINTM Produkt vorliegen. Einfaches
Mischen von SDS und IL-2 in den Konzentrationen in denen sie in
dem PROLEUKINTM Produkt vorliegen, führt nicht
zur Bildung der Mikroaggregate. Zitat 36 beschreibt eine Studie
in der SDS zu IL-2 Präparaten
zugegeben wurde, die wie das PROLEUKINTM Produkt
1.1 mg IL-2 enthalten. Es zeigte sich, dass SDS zur Fällung von
IL-2 führte,
bei Detergens Konzentrationen zwischen 0,02% und 0,05%. Im Gegensatz
hierzu, fällt
IL-2 nicht bei diesen SDS-Konzentrationen aus, wenn das SDS entsprechend
der Erfindung entfernt wird – sogar
wenn SDS von 1200 μg/mg (ungefähr 0.1%
SDS basierend auf 1,1 mg IL-2) auf 70 μg (< 0.01%) abgesenkt wird, findet keine
IL-2 Fällung statt.
Während der
Entfernung kann die SDS-Konzentration wie oben beschrieben bestimmt
werden. Wenn die Methode zur Entfernung standardisiert und reproduzierbar
ist, kann gegebenenfalls auf die Überprüfung der SDS-Mengen verzichtet
werden, da im allgemeinen das gleiche Ergebnis erwartet werden kann,
wann immer das Verfahren durchgeführt wird (obwohl eine finale,
bestätigende
Messung durchgeführt
werden sollte). Wenn jedoch die Methode zur Entfernung variiert,
oder wenn regelmäßiges Überwachen
aus anderen Gründen
notwendig ist, können
regelmäßige oder
fortlaufende Bestimmung der SDS-Mengen durchgeführt werden, bis die erwünschte Endkonzentration
erreicht ist.
Weitere Verfahrensschiritte
Wie
oben erwähnt
sind die wesentlichen Verfahrensschritte zur Herstellung von IL-2/SDS
Mikroaggregaten (a) die Zugabe von SDS und dann (b) die anschließende Entfernung
des SDS. Während
diese zwei Schritte IL-2 in einer Form ergeben, die geeignet ist
um als aktive Substanz in pharmazeutischen Produkten gebraucht zu
werden, sind diese allein nicht geeignet zur Herstellung einer endgültigen pharmazeutischen
Zusammensetzung, und weitere Schritte sind erforderlich. Diese Schritte
können
vor den Schritten (a) und (b), nach den Schritten (a) und (b) und/oder
zwischen Schritt (a) und (b) erfolgen.
Der
erste Schritt im Verfahren um IL-2 für die pharmazeutische Verwendung
herzustellen, ist gewöhnlich
die Expression des Proteins. Dies beinhaltet gewöhnlich die BeVerwendung einer
Wirtszelle, die das IL-2 Gene von Interesse kodiert, zum Beispiel,
bakterielle Wirtszellen, eine Hefe-Wirtszelle, oder eine Säugetier-Wirtszelle.
Als eine Alternative zu der rekombinanten Methode ist es jedoch
auch möglich,
die Expression eines zelleigenen IL-2 Gens in dem Genom einer Wirtszelle
zu aktivieren oder anzukurbeln (zum Beispiel durch Promoter-Aktivierung),
oder das Hormone kann aus einer natürlichen Quelle gereinigt werden
(zum Beispiel aus Blut).
Die
Expression von IL-2 in einem rekombinanten E.coli System ist die
bevorzugte Methode zur Gewinnung von IL-2, wobei IL-2 sogenannte „Inclusion
Bodies" bildet.
Geeignete E.coli Stämme
wurden 1984 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens im ATCC
mit den Accession Numbers 39452 und 39626 hinterlegt.
Verfahren
zum Wachstum, Ernten, Zerreißen
oder der Extraktion von IL-2 aus verschiedenen Zelltypen sind im
Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel Zitate 19-30 und 37-41.
Nach
der Expression, oder wenn das Ausgangsmaterial exprimiertes Material
ist, ist ein erster Schritt zur Reinigung des IL-2 erforderlich.
Wenn das IL-2 innerhalb von Zellen vorliegt umfasst dieser Reinigungsschritt
die Zellzerstörung
(zum Beispiel durch osmotischen Schock, Homogenisierung, Ultraschallbehandlung etc.)
mit dem Ziel das Protein freizusetzen; wenn IL-2 schon in einer
Lösung
vorliegt (zum Beispiel wenn es nach der Expression ausgeschieden
wurde) ist eine Zellzerstörung
nicht erforderlich. Inaktivierung lebender Zellen kann möglicherweise
auch durchgeführt
werden, ebenso Zentrifugation. Am Ende des ersten Reinigungsschrittes
liegt IL-2 typischerweise als Präzipitat
vor, vor allem, wenn es aus „Inclusion
Bodies" isoliert wurde,
aber in jedem Fall ist es getrennt von zellulären Fremdkörpern und liegt als IL-2-reiche
Paste für
das weitere Vorgehen vor.
Nach
der Herstellung von gefälltem,
gereinigtem IL-2, oder ausgehend von gefälltem Material, kann IL-2 gelöst werden,
zur Trennung von Proteinen der Wirtszelle etc. Solubilisierung kann
durch Zugabe von Detergentien wie zum Beispiel SDS erreicht werden,
bevorzugt sollte die Endkonzentration zwischen 4 und 4,5% betragen.
Dies kann einfach erreicht werden indem eine 5%ige SDS Lösung zugegeben
wird.
Nach
der Solubilisierung, oder wenn gelöstes Material als Ausgangsmaterial
benutzt wird, kann IL-2 reduziert werden, um alle Disulfid-Brücken im
Protein und insbesondere um alle intermolekularen Disulfid-Brücken zu
brechen. Alle kovalenten IL-2 Aggregate die durch intermolekulare
Disulfid-Brücken
entstanden sind, werden dadurch in ihre monomere Form überführt. Reduzierende
Substanzen, die gewöhnlich
benutzt werden um Disulfid-Brücken
zu brechen, sind β-Mercaptoethanol
und Dithiothreit (DTT). Die Anwesenheit von Detergens wird gewöhnlich beibehalten
um die Löslichkeit
des IL-2 zu gewährleisten.
Nach
der Reduktion, oder wenn von reduziertem Material ausgegangen wird,
kann das IL-2 reoxidiert werden, um monomeres IL-2 mit intramolekularen
Disulfid-Brücken
zu erhalten.
Nach
der Re-Oxidation, oder wenn von re-oxidiertem Material ausgegangen
wird, wird das IL-2 weiter gereinigt um Reagenzien wie den oxidierenden
Wirkstoff zu entfernen, sowie zur Entfernung von Endotoxin, DNA
und/oder Proteine der Wirtszelle, IL-2 Isoformen oder Konformationsisomere
(zum Beispiel oxidiertes IL-2) etc. Diese Reinigung kann bequem
durch den Einsatz von reversephase HPLC erreicht werden.
Nach
RP-HPLC, oder wenn das Ausgangsmaterial gelöstes RP-HPLC gereinigtes Material
ist, kann IL-2 gefällt
werden, zum Beispiel durch Zugabe von 0.8N Natriumhydroxid. Neben
der Fällung
von IL-2, erlaubt dies die Trennung des Proteins von allen organischen
Lösungsmitteln,
die während
der RP-HPLC benutzt wurden. Das gefällte Material kann bequem durch
Zentrifugation gesammelt werden.
Material
das nach Expression, Reinigung, Lösung, Reduktion, Oxidation,
RP-HPLC und Fällung
(wie oben beschrieben) erhalten wurde, ist ideal für Resolubilisierung
und Diafiltration gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren,
obwohl auch IL-2 benutzt werden kann das auf anderen Reinigungswegen
erhalten wurde. Typischerweise, wird das IL-2 jedoch in einer gefällten Form
vorliegen bevor das SDS in Schritt (a) des Verfahrens der Erfindung
zugefügt
wird.
Wie
oben beschrieben, bleiben kovalent gebundene IL-2-Multimere auch
in Gegenwart von SDS gefallt. Da diese Multimere größer sind
als das SDS-solubilisierte IL-2 Protein (weil sie nicht dissoziierbar
sind) können
sie bequem zwischen Schritt (a) und Schritt (b) (zum Beispiel nach
SDS Zugabe aber vor Diafiltration) durch Gelfiltration entfernt
werden. Die Gegenwart des SDS sollte während der Gelfiltration aufrechterhalten bleiben,
um das Ausfällen
von IL-2 zu verhindern.
Nach
der Diafiltration, um SDS zu entfernen und Mikroaggregate zu bilden,
kann die IL-2 Lösung
einen oder mehrere der folgenden Schritte durchlaufen: Verdünnung um
die gewünschte
Dosis zu erhalten, Sterilisation, typischerweise durch Sterilfiltration,
zum Beispiel durch einen 0,22 μm
Filter; pharmazeutische Formulierung (siehe unten); Lyophilisierung,
Verpackung; etc.
Mikroaggregate
Das
Ergebnis der SDS-Solubilisierung und Diafiltration im Verfahren
der Erfindung ist die Bildung von biologisch aktiven Mikroaggregaten
aus SDS und IL-2, wie sie in dem PROLEUKINTM Produkt
vorliegen.
Die
exakte molekulare Struktur der SDS/IL-2 Mikroaggregate ist nicht
bestimmt worden, aber man nimmt an, dass es sich um micellare oder
Micellen-artige Strukturen handelt. Bei einer SDS-Konzentration von ungefähr 160 μg/mg, beinhaltet
eine typische Micelle ungefähr
30 IL-2-Moleküle
und ungefähr
150 SDS-Moleküle.
Das SDS und IL-2 in den Mikroaggregaten interagieren in nicht-kovalenter Form und
der hydrophobe Schwanz des IL-2 (Aminosäuren 121-133) kann mit dem
Alkyl-Rückgrat
des SDS in Wechselwirkung treten um Micellen zu bilden. Einiges
SDS kann frei in der Lösung
verbleiben.
Die
Mikroaggregate können
mit Hilfe von Lichtstreuung bestimmt werden und diese Technik erlaubt es,
auch die Größe der Mikroaggregate
zu bestimmen (siehe unten). Das Verhältnis zwischen SDS-Konzentration
und durchschnittlicher Mikroaggregat-Größe, wie sie mit klassischer
Lichtstreuung gemessen wird, wurde, wie in 1 dargestellt,
empirisch bestimmt.
Mit
fortschreitender SDS Entfernung, wird eine Konzentration erreicht,
unterhalb derer die Größe der Mikroaggregate
beginnt, exponentiell zuzunehmen (siehe 1). Gemäß der Erfindung
wird das SDS entfernt bis es eine Konzentration zwischen 95 μg und 250 μg pro mg
IL-2 erreicht. In diesem Bereich liegt die spezifische Trübung (τ) zwischen
ungefähr
0,05 und ungefähr
1,00 cm2/g, was im Durchschnitt weniger
als 50 IL-2 Moleküle
pro Aggregat impliziert. Bei 160 μg
SDS pro mg IL-2 liegt die spezifische Trübung (τ) bei ungefähr 0,48 (ungefähr 27 IL-2
Moleküle).
Der
Fachmann wird verstehen, dass eine gegebene Zusammensetzung von
SDS/IL-2 gemäß der Erfindung,
nur selten, wenn überhaupt,
nur eine einzige Mikroaggregat-Spezies umfasst. Vielmehr ergeben
Messungen der Lichtstreuung dass die Mikroaggregate eine Vielzahl
unterschiedlicher Größen haben,
die in eine Verteilung fallen und Messungen können eine mittlere Größe bestimmen.
Wenn eine Zusammensetzung Mikroaggregate mit einer angegeben mittleren
Größe umfasst,
werden demnach im allgemeinen einige Mikroaggregate kleiner und
andere größer sein.
Bevorzugte
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen derartige SDS/IL-2 Mikroaggregate,
so dass die Zusammensetzung eine spezifische Trübung (τ) zwischen 0,3 und 0,6, zum
Beispiel zwischen 0,4 und 0,5 oder ungefähr 0,45 hat. Diese Zusammensetzungen
treffen im speziellen auf Zusammensetzungen zu, die nach Lyophilisierung
rekonstituiert wurden, und der Wert für τ kann vor der Lyophilisierung
und Rekonstitution geringer sein (14).
Bevorzugte
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen SDS/IL-2 Mikroaggregate
mit einem hydrodynamischen Durchmesser zwischen 11 nm und 13 nm.
Bevorzugte
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen zwischen 10 und 50 IL-2
Moleküle,
zum Beispiel zwischen 20 und 35, und bevorzugt ungefähr 27.
In
bevorzugten Zusammensetzungen, liegt im wesentlichen das gesamte
IL-2 in Form von Mikroaggregaten vor. Zusammensetzungen können im
wesentlichen frei von monomeren IL-2 sein.
Spezifische Trübung (τ)
Da
die SDS/IL-2 Mikroaggregate der Erfindung von den gegebenen Umständen beeinflusst
werden, können
Verfahren wie Größen-Ausschluß-Chromatographie
und Analytische Zentrifugation nicht benutzt werden um ihre Größe zu bestimmen.
Statt dessen kann klassische (oder statische) Lichtstreuung (CLS)
benutzt werden, um die Mikroaggregate nachzuweisen und zu analysieren,
indem man ihre Trübung
misst. Dynamische Lichtstreuung (DLS) kann ebenfalls benutzt werden.
Die Messungen können
mit einem speziellen Gerät durchgeführt werden,
oder sie können
mit einem Fluorimeter durchgeführt
werden, wobei Anregungs- und Emissions-Monochromator auf die gleiche
Wellenlänge
eingestellt werden (zum Beispiel 467 nm für eine Xenon-Lampe oder 488
nm für
eine Argon-Lampe, diese beiden Wellenlängen sind weit entfernt von
Wellenlängen
die von dem Analyt absorbiert werden) und/oder es werden geeignete
Filter eingesetzt, (zum Beispiel gelbe Filter) so dass das Fluorimeter
als ein 90° CLS
Photometer arbeitet.
Ein
Standard-Parameter zur Messung der Lichtstreuung ist die 'Rayleigh ratio' (RΘ). Wird
gestreutes Licht bei 90° relativ
zum eingestrahlten Licht gemessen (das heißt wenn Θ = 90°), wird die 'Rayleigh ratio' als R90 bezeichnet
[siehe zum Beispiel Zitat 42], und 90° Streuung wird für Trübungsmessungen
benutzt.
Trübungsmessungen
(Streuungsintensität
bei 90°)
kann relativ zu Toluol mit optischer Qualität normalisiert werden. Das
heißt
die Trübungsmessung
einer Standard Toluol-Probe wird durch den R90-Wert
von Toluol dividiert. Mit Hilfe einer derartigen Normalisierung
kann der absolute Wert der Lichtstreuungsintensität bestimmt
werden.
Die
Trübung
der IL-2 Mikroaggregate der Erfindung kann bei 25°C und 467
nm oder 488 nm gemessen werden. Vor der Trübungsmessung kann die Zusammensetzung
zentrifugiert oder filtriert werden, um größere Partikel (zum Beispiel
gefälltes
Protein), die andernfalls die Ergebnisse verfälschen würden, zu entfernen. Werden
die IL-2 Zusammensetzungen der Erfindung zentrifugiert, verbleiben
bevorzugt mindestens 97% (zum Beispiel ≥ 98%, ≥ 99% oder mehr) des gesamten
IL-2 in dem Überstand.
Trübungsmessungen
der SDS/IL-2 Mischungen können
wie folgt in absolute spezifische Trübung (τ) umgerechnet werden:
Wobei:
- Ti
- die Trübungsintensität der IL-2
Zusammensetzung ist,
- Tt
- die Trübungsintensität der Toluol
Kontrolle ist,
- C
- die Konzentration
des IL-2 in der IL-2 Zusammensetzung ist.
Werden
Ti und Tt in cm–1 und
C in g/ml gemessen (das heißt
g/cm3), dann ist die Einheit für τ cm2/g. Dies ist die bevorzugte Maßeinheit
zur Bestimmung der Trübung
der IL-2 Zusammensetzung der Erfindung.
Zusammensetzungen
der Erfindung können
spezifische Trübungen
(τ) von
weniger als 1,1 cm2/g haben, aber bevorzugt
größer als
0,1 cm2/g. Bevorzugte Zusammensetzungen
haben eine Wert für τ der geringer als
0,7 cm2/g ist. Die Zusammensetzungen der
Erfindung haben bevorzugt einen Wert für τ der zwischen 0,3 und 0,6 cm2/g liegt.
Dynamische Lichtstreuung
Wie
in Zitat 43 beschrieben, und hier insbesondere in Kapitel 10, kann
Dynamische Lichtstreuung (DLS) benutzt werden um den hydrodynamischen
Durchmesser (oder Radius) von Partikeln in Lösung zu bestimmen. SDS/IL-2-Aggregate
der Erfindung können
mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt werden. Wenn DLS
benutzt wird, sollten die Aggregate bevorzugt einen mittleren hydrodynamischen
Durchmesser zwischen 8 nm und 20 nm haben, bevorzugt zwischen 10
nm und 15 nm, und besonders bevorzugt zwischen 11 nm und 13 nm,
am meisten bevorzugt von ungefähr
12 nm. Wie in 17 gezeigt, haben die Aggregate
Durchmesser die um diesen Mittelwert liegen.
In
der Praxis können
einige größere Partikel
mit DLS nachgewiesen werden (zum Beispiel der 54 nm Peak in 17),
aber der oben genannte hydrodynamische Durchmesser ist der Haupt-Peak
der DLS Messung, der typischerweise zahlenmäßig mindestens 90% (zum Beispiel
mindestens 95%, mindestens 97%, mindestens 99%, mindestens 99.5%
oder mehr) des DLS Spektrums repräsentiert. Somit haben zahlenmäßig mindestens
90% der Partikel, die mittels DLS nachgewiesen wurden, den spezifischen
durchschnittlichen Wert.
Interpretation
von DLS Daten kann erschwert werden durch die Anwesenheit von sich „langsam
verändernden" Komponenten, wie
Staubpartikel oder durch das „Mischungs-Phänomen". Um solche Komplikationen
zu vermeiden, sind IL-2 Mischungen der Erfindung, vor der DLS Analyse
bevorzugt frei von Partikeln mit einem Durchmesser von mehr als
ungefähr
1 μm (zum
Beispiel staubfrei), und dies kann durch die BeVerwendung geeigneter
Filter, zum Beispiel 0,22 μm
Filter, erreicht werden. Die Mischung sollte vor der DLS Messung gut
gemischt sein. Wenn die DLS Messung sich „langsam verändernden" Komponenten in der
Mischung aufweist, sollte die Messung verworfen, und mit einer neuen
Probe wiederholt werden.
Das Interleukin-2
IL-2
ist ein wohlbekanntes Protein und Verfahren und Produkte dieser
Erfindung betreffen jede brauchbare Form des IL-2. IL-2 wird gewöhnlich humanen
Ursprungs sein, oder es wird sich um Derivate handeln, die im Menschen
ihre biologische Aktivität
behalten.
IL-2
wird natürlicherweise
im Menschen als ein Vorläufer-Protein
translatiert (zum Beispiel das 153-mer das in der GenBank unter
der Accession Numbers NP_000577.2 beschrieben wird). Der Vorläufer wird
gespalten (zum Beispiel hinter Ser-20 in NP_000577.2) und ergibt
ein matures Produkt mit einem N-terminalen Alanin (SEQ ID NO:4).
Wenn
IL-2 in E.coli exprimiert wird, ist es üblich das natürliche Signalpeptid
durch ein einzelnes N-terminales Methionin zu ersetzen (zum Beispiel
SEQ ID NOS:3 und 4). Während
der Expression wird dieses Methionin ohne weitere Eingriffe abgespalten,
und es entsteht ein natürlicher
humaner N-terminaler Alaninrest (zum Beispiel wird SEQ ID NOS:3
in SEQ ID NOS:1 konvertiert).
Dem
IL-2 in PROLEUKINTM fehlt der natürliche Ala-1-Rest.
Das Fehlen des normalen N-terminalen Alanins
bedeutet, dass das IL-2 in PROLEUKINTM formell
als „Des-alanyl-1-Form
von IL-2" bezeichnet
wird. Die „Des-alanyl-1-Form
von IL-2" wird für die Verwendung
in der Erfindung bevorzugt.
Das
IL-2 in PROLEUKINTM ist weiterhin so gestaltet,
dass es 2 interne Cystein-Reste hat, anstelle der natürlich vorkommenden
drei. Dies reduziert die Anzahl der möglichen Paarungen der Cystein-Reste (und damit
die Bildung intramolekularer Disulfid-Brücken) von drei auf eine [46],
und verbessert die Ergebnisse der Protein-Faltung und Lagerstabilität. Der Austausch
eines Serin-Restes anstelle des natürlichen Cys-125-Restes [44]
bedeutet, dass das IL-2 in PROLEUKINTM formell
als eine „Serin-125-Form
von IL-2" bezeichnet
wird. Serin-125-Formen von IL-2 werden bevorzugt für die Erfindung
benutzt. Die dreidimensionale Kristallstruktur der Ser-125-Form
des humanen IL-2, exprimiert in E.coli, ist in der Struktur Datenbank
unter der Accession '3 INK' verfügbar.
Weitere
Austausche innerhalb der IL-2 Aminosäurensequenz können vorgenommen
werden, speziell solche die konservativ sind. Das heißt solche,
die innerhalb einer Aminosäurenfamilie
stattfinden, die in der Struktur ihrer Seitenketten ähnlich sind.
Aminosäuren
können
in vier Familien unterteilt werden: (1) saure – Aspartat, Glutamat; (2) basische – Lysin,
Arginin, Histidin; (3) nicht-polare – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin,
Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; (4) ungeladene polare – Glycin,
Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin,
Tryptophan, und Tyrosin werden manchmal als die Familie der aromatischen Aminosäuren beschrieben.
Es kann zum Beispiel mit einiger Sicherheit vorhergesagt werden,
dass isoliertes Ersetzen von Leucin mit Isoleucin oder Valin, von
Aspartat mit Glutamat, von Threonin mit Serin, oder ähnliche konservative
Auswechslungen einer Aminosäure
mit einer anderen strukturell verwandten Aminosäure keine großen Einflüsse auf
die biologische Aktivität
haben. Es ist für
den Fachmann ein Leichtes, auf Grund von natürlichen Variationen, Abgleichen
von aktiven Formen des Proteins etc., Bereiche des IL-2 festzustellen
die Veränderungen
tolerieren können,
und veränderte
Proteine können
auf ihre biologische Aktivität
hin getestet werden, zum Beispiel mit Hilfe von Standard 86/504.
Anleitung
zum Auffinden von Regionen des IL-2 Proteins die verändert werden
können,
zum Beispiel durch Aminosäurenaustausche,
Deletionen oder Insertionen können
auch im Stand der Technik gefunden werden (zum Beispiel Struktur-/Funktions-Zusammenhänge und/oder
Bindungsstudien); beispielsweise in Zitaten 45 bis 52, etc.. Zitat
53 offenbart eine Vielfalt von IL-2-Mutationen einschließlich: Asn-26-Gln;
Trp-121-Phe; Entfernung aller Aminosäuren, die auf Arg-120 folgen;
und die Met-1-Formen hiervon. Zitat 44 offenbart IL-2 mit Deletionen
und Austauschen von Cys-125, mit oder ohne N-terminales Ala. Zitat
54 offenbart Austausche oder Deletionen von Aminosäuren einschließlich Aminosäure Nummer
2, 3, 4,5, 6, 104 und 125. Met-104
wird leicht oxidiert, von daher können Mutationen dieser Aminosäure (zum
Beispiel Austausch mit Glu, Val, Ala, etc.) die Stabilität erhöhen [55].
Zitat 56 offenbart IL-2 den Austausch von Asp-20 (mit His oder Ile), von Asn-88 (mit
Arg, Gly, oder Ile), und/oder von Gln-126 (mit Leu oder Glu), welche
nachgewiesenermaßen
weniger toxisch sind und eine erhöhte Affinität für den IL-2 Rezeptor aufweisen.
Zitat 57 offenbart den Austausch von Arg-38-Ala und Phe-42-Lys mit
der Absicht die Toxizität
während
einer Immunotherepie zu verringern. Zitat 58 offenbart die Mutation
der natürlichen
Xaa1-Asp-Xaa2 Tripeptid-Sequenz, wobei Xaa1 entweder Leu, Ile, Gly oder
Val ist, und Xaa2 entweder Val, Leu oder Ser ist, um ein Austreten
der Substanz durch das vaskuläre
System zu verringern. Zitat 59 offenbart Peptide mit einem N-terminalen
Methionin das mit den ersten 30 Aminosäuren des IL-2 verbunden wird,
eventuell gekoppelt mit einem Asp-20-Lys Austausch, von denen behauptet wird,
dass sie Il-2-ähnliche
Aktivität
behalten.
Andere
beschriebene Veränderungen
umfassen: T7A, T7D, T7R, KSL, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K,
T10N, Q11A, Q11R, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L,
K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K351, K35L,
K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H,
L361, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G,
R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A, F42E,
F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M461, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y,
K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, PbSF, P65G, P65H,
P651, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y,
L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N,
H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V,
L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T,
N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W,
L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, M104G,
E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S,
T123C, Q126I, und Q126V.
Biologisch
aktive Variationen des IL-2 haben generell mindestens ungefähr 70%,
(zum Beispiel ≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 98%, ≥ 99%) Aminosäurensequenz-Identität mit der
Aminosäurensequenz
des Referenz IL-2 Polypeptidmoleküls, wie das oben beschriebene
native humane IL-2. Eine Variante kann sich zum Beispiel in nur
1 – 15
Aminosäuren,
1 - 10 Aminosäuren,
6-10 Aminosäuren,
5 Aminosäuren,
nur 4, 3, 2, oder sogar nur 1 Aminosäure unterscheiden.
C-terminale
Verlängerungen
des IL-2 sind ebenfalls beschrieben worden [60]. IL-2 das in der
Erfindung gebraucht wird, hat bevorzugt keine solchen Verlängerungen
am C-terminalen Ende.
Weitere
Formen des IL-2, die benutzt werden können beinhalten nicht-humane
Sequenzen von: Rhesusaffen (Mucucu mulatto; GenBank Accession P51498);
Grüner
Pavian (Papio anubis); GenBank Q865Y1); Halsband-Mangabe (Cercocebus
torquatus atys; P46649); Javaneraffen (Macaca fascicularis; Q29615); Weißhandgibbon
(Hylobates lar; ICGI2); Totenkopfaffen (Saimiri sciureus; Q8MKH2);
Rind (Bos taurus; P05016 oder NP-851340; wobei die aktive Sequenz
die Aminosäuren
24-158 der GenBank Accession No. NP-851340 umfaßt); Wasserbüffel (Bubalus
bubalis; Q95KP3); Pferd (Equus caballus; P37997); Ziege (Capra hircus;
P36835); Schaf (Ovis aries; P19114); Hausschwein (Sus scrofu; P26891);
Rothirsch (Cervus elaphus; P51747); Haushund (Canis familiaris;
Q29416); Hauskatze (Fells catus; 407885); Kaninchen (Oryctolagus
cuniculus; 077620); Schwertwal (Orcinus orca; 097513 ); Nördlicher
See-Elefant (Mirounga angustirostris; 062641); Hausmaus (Mus musculus;
NP-032392); Iberische Hausmaus (Mus spretus; 408867); Wanderratte (Rattus
norvegicus; P17108); Mongolische Wüstenrennmaus (Meriones unguiculatus;
Q08081). Jede variierende Form, die in diesen GenBank Einträgen enthalten
ist, kann ebenfalls genutzt werden. Diese GenBank Einträge beinhalten
normalerweise die vollständigen
Sequenzen, die, wie oben für
die humane Sequenz beschrieben, Verfahreniert werden, um eine biologisch
aktive Form zu ergeben, zum Beispiel durch Abtrennung der ersten
20 Aminosäuren.
Die „Des-alanyl-1,
Serin-125 Formen des humanen IL-2" werden zur Verwendung in der Erfindung
besonders bevorzugt. Die am meisten bevorzugte Form des IL-2 hat
die 132-mer Aminosäurensequenz,
wie sie in 2 dargestellt ist (SEQ ID NO:1),
und wie sie in PROLEUKINTM vorliegt. Mischungen
sind bevorzugt frei IL-2 Formen, die nicht das N-terminale Ala aufweisen.
Das in 2 dargestellte Protein kann exprimiert werden,
wenn die Nukleinsäuresequenz
zugrunde gelegt wird, die in 4 (SEQ ID
NO:2) dargestellt ist, nach Abtrennung des translatierten N-terminalen
Methionins.
Das
IL-2 in dem PROLEUKINTM Produkt ist nicht
glykosyliert, dies ist eine Folge der Expression in dem E.coli System.
Nicht glykosyliertes IL-2 wird für
die Verwendung mit der Erfindung bevorzugt genutzt.
Verfahren
zum Nachweis der Anwesenheit von IL-2 in einer Mischung und zur
Quantifizierung sind im Stand der Technik bekannt. Immunologischer
Nachweis, unter Verwendung von anti-IL-2 Antikörpern (zum Beispiel ELISA)
ist die gebräuchlichste
Nachweismethode, und diese Methoden können auch quantitativ eingesetzt
werden. Andere quantitative Methoden beinhalten Aminosäure-Analyse, Lowry-Proteinbestimmung unter
Verwendung eines anerkannten Proteinstandards, HPLC-Analyse und intrinsische
Ultraviolett Absorptionsmessungen.
Die
Standard Maßeinheit
für IL-2
ist die Internationale Einheit (IU) die nicht auf der Masse an Protein, sondern
auf der Aktivität
in einem biologischen Test basiert. Gemäß Standard 86/504 ist 1 N die
Menge an IL-2 die 50% der maximalen Proliferation einer anerkannt
IL-2 abhängigen
Ziellinie [61] CTLL-2 produziert. Quantifizierung der IL-2 Aktivität in anderen
Präparaten
wird durch den Vergleich von Dosis-Wirkungs-Kurven der Präparate mit
vorhandenen Standards (zum Beispiel die WHO IL-2 Standard Ampulle,
die nach Rekonstitution, 100 IU/ml enthält) erzielt, wobei eine Analyse
paralleler Linien vorgenommen wird, oder Computer-Programme wie
das ALLFIT Programm [62, 63] eingesetzt werden. In der Praxis, ist
es möglich,
wenn die Herstellung standardisiert ist, eine Konversion zwischen
Substanzgewicht und IU durchzuführen.
Für das
PROLEUKINTM Produkt, zum Beispiel, ist die
Konversion wie folgt: 1,1 mg IL-2 entspricht 18 × 106 IU.
Aktivität kann in
spezifische Aktivität
umgerechnet werden (das heißt
Aktivität
pro Masseneinheit IL-2, zum Beispiel IU/mg) indem die Aktivität durch
die Masse des vorhandenen IL-2 geteilt wird. Eine bevorzugte Formulierung
der Erfindung hat eine spezifische Aktivität zwischen 16 und 17 MIU/mg.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Das
Verfahren der Erfindung ergibt IL-2/SDS Mikroaggregate die für die pharmazeutische
Verwendung beim Menschen geeignet sind, und somit stellt die Erfindung
eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die aus den IL-2/SDS
Mikroaggregaten der Erfindung besteht.
Anstatt
die Mikroaggregate direkt nach der Diafiltration zu benutzen werden
sie typischerweise formuliert bevor sie den Patienten verabreicht
werden.
Zum
Beispiel, können
die Mikroaggregate verdünnt
werden um eine Standardkonzentration zu erhalten, und gleichzeitig
die IL-2/SDS Relation aufrechtzuerhalten. Typischerweise wird eine
Verdünnung
vorgenommen die in einer IL-2 Konzentration von ungefähr 1,1 mg/ml
resultiert.
Die
Mikroaggregate können
(zum Beispiel nach der Verdünnung)
mit Stabilisatoren gemischt werden, insbesondere wenn sie lyophilisiert
werden sollen. Die Zugabe von Zuckern (zum Beispiel Saccharose,
Trehalose) ist gebräuchlich,
um Stabilität
während
der Lyophilisierung zu gewährleisten,
und ein bevorzugter Stabilisator ist Mannit. Dieser Zucker-Alkohol
kann bis zu einer Endkonzentration zwischen 40 und 50 (zum Beispiel ungefähr 45,5)
mg Mannit pro mg IL-2 (50 mg für
1,1 mg IL-2) zugegeben werden. Humanes Serumalbumin (bevorzugt rekombinant)
kann auch als Stabilisator zugegeben werden. Mischungen von Zuckern
können
auch benutzt werden, zum Beispiel Saccharose & Mannit, Trehalose & Mannit, etc.
Puffer
können
zu der Mikroaggregat-Zusammensetzung hinzugefügt werden, zum Beispiel ein Tris-Puffer, ein Histidin-Puffer,
ein Glycin-Puffer, oder bevorzugt ein Phosphat-Puffer (der zum Beispiel
Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat enthält). Zugabe
von Puffer, um einen pH-Wert zwischen 7,2 und 7,8 zu erhalten, ist
bevorzugt, und insbesondere ein pH-Wert von ca. 7,5.
Zusammensetzungen,
die Mikroaggregate enthalten, können
sterilisiert werden, typischerweise durch Filtersterilisation, zum
Beispiel durch einen 0,22 μm
Filter. Dies kann nach Filtration durch einen Filter größerer Porenweite
erfolgen.
Wässrige Zusammensetzungen,
die Mikroaggregate enthalten, können
direkt in Spritzen verpackt werden, fertig zur Injektion,. Sie können auch
in Zerstäuber,
fertig zur Inhalation verpackt werden.
Wässrige Zusammensetzungen,
die Mikroaggregate enthalten, können
vor der Distribution lyophilisiert werden. Wässriges oder lyophilisiertes
Material kann in Behälter
(zum Beispiel Phiolen) verpackt werden, diese können dann hermetisch verschlossen
werden. Die Lyophilisierung wird typischerweise in den Phiolen durchgeführt und
diese werden nach der Lyophilisierung verschlossen. Lyophilisiertes
Material, das 22 × 106 IU IL-2 entspricht kann in eine einzelne
Phiole als eine einzelne Dosis für
die Rekonstitution in einem Endvolumen von ungefähr 1,1 ml verpackt werden,
und ergibt dann ungefähr
18 × 106 IU/ml. Bruchteile hiervon (zum Beispiel ½, 1/3, ¼, 1/5,
1/8) können
ebenfalls als einzelne Dosen verpackt werden. Insbesondere Einheiten mit
Dosen von ungefähr
9 × 106 IU, ungefähr 4,5 × 106 IU
und ungefähr
14 × 106 IU können
benutzt werden.
Für die Rekonstitution
nach der Lyophisierung, kann „steriles
Wasser zur Injektion" benutzt
werden. Es ist auch möglich,
den lyophilisierten Kuchen mit einer wässrigen Zusammensetzung, die
humanes Serumalbumin (bevorzugt rekombinantes) enthält, zu rekonstituieren.
Rekonstitution in ein wässriges
Volumen zwischen 1,0 und 1,2 ml wird bevorzugt (das heißt IL-2
kann so verdünnt
werden, dass es dieselbe Konzentration hat wie vor der Lyophilisierung)
Dieses rekonstituierte Material kann dann für intravenöse Infusionen steril in größere Flüssigkeitsvolumina
verdünnt
werden, zum Beispiel in ca. 50 ml einer DSW Lösung (5% „Dextrose zur Injektion". Spezifische Trübung bleibt
während
der DSW Verdünnung
im wesentlichen konstant, bis die IL-2 Konzentration unter etwa
0,1 mg/ml fällt.
Verdünnungen
können
in verschiedenen Behältern
angesetzt werden, zum Beispiel Glasflaschen, Plastikbeuteln (zum
Beispiel Polyvinylchlorid), etc. Verdünnungen auf eine Endkonzentration
von IL-2 außerhalb
eines Bereiches von 30-70 μg/ml
sollten vermieden werden. Bedingungen, die Veränderungen in der Mikroaggregation
hervorrufen, sollten vermieden werden, zum Beispiel Rekonstitution
mit „bakteriostatischem
Wasser zur Injektion" oder
mit „0.9%
Natriumchlorid zur Injektion".
Eine
erste bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist daher eine
wässrige
Zusammensetzung mit einem pH von etwa 7,5, die 1,1 mg/ml IL-2; 0,18
mg SDS; 50 mg/ml Mannit und Phosphatpuffer enthält, wobei IL-2 und SDS Mikroaggregate
bilden, in denen die durchschnittliche Anzahl an IL-2 Molekülen pro Aggregat
zwischen 10 und 50 liegt. Diese Zusammensetzungen können von
lyophilisiertem Material rekonstituiert werden.
Eine
zweite bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist das Produkt,
das entsteht wenn die erste bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung
in eine DSW Lösung
verdünnt
wird.
Bevorzugte
Zusammensetzungen sind frei von Konservierungsstoffen, Antibiotika,
sowie anderen Proteinen als IL-2 (einschließlich HSA), das heißt diese
Materialien sind nicht nachweisbar.
Pharmazeutische Verfahren
und Verwendungen
Die
Erfindung ermöglicht
ein Verfahren zur Behandlung von Patienten, sie beinhaltet die Verabreichung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung an den Patienten.
Der
Patient ist bevorzugt ein Mensch, er kann ein Kind sein (zum Beispiel
ein Kleinkind oder ein Säugling),
ein Teenager oder ein Erwachsener, wird aber im allgemeinen ein
Erwachsener sein.
Die
Erfindung stellt auch SDS/IL-2 Mikroaggregate der Erfindung zur
Verfügung,
um sie als Medikament zu benutzen.
Die
Erfindung ermöglicht
auch die Verwendung der Mikroaggregate der Erfindung in der Herstellung von
Medikamenten zur Behandlung von Patienten.
Diese
Anwendungen, Verfahren und Medikamente sind bevorzugt für die Behandlung
von Krebserkrankungen, insbesondere solche mit soliden Tumoren,
wie Nierenzell-Karzinom, oder Melanom, oder Krebse, die Metastasen
gebildet haben. Diese Anwendungen, Verfahren und Medikamente sind
auch geeignet für
die Behandlung von Patienten, die eine Organtransplantation hinter
sich haben, oder die für
eine vorbereitet sind. Diese Anwendungen, Verfahren und Medikamente
können
auch zur Behandlung von Patienten eingesetzt werden, die mit HIV
infiziert sind, einschließlich
solcher mit oder ohne AIDS.
Patienten,
die mit der Erfindung behandelt werden können, sind deshalb als krebskrank
diagnostiziert worden. Patienten, die jedoch nicht gemäß der Erfindung
behandelt werden sollten, können
Patienten beinhalten, die (1) einer Überempfindlichkeit gegen IL-2
oder jeden anderen Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung
aufweisen; (2) Patienten mit einem Status der ECOG (Eastern Cooproation
Oncology Group) ≥ 2;
(3) Patienten mit einem gleichzeitigen Status der ECOG > 1 und mehr als einem
Organ mit Metastasenbildung und einem Zeitraum < 24 Monaten zwischen der ursprünglichen
Diagnose des Ausgangstumors und dem Zeitpunkt zu dem der Patient
für die
IL-2 Behandlung evaluiert wurde; (4) Patienten mit einer einschlägigen Krankheitsgeschichte
von, oder gegenwärtigen
Anzeichen von schweren Herzkrankheiten; (5) Patienten mit Hinweisen
auf aktive Infektion, die eine Antibiotikabehandlung erfordert;
(6) Patienten mit einem PaO2 < 60 mm Hg in der
Ruhephase; (7) Patienten mit schon existierender schwerer Organdysfunktion,
und (8) Patienten mit Metastasen im Zentralnervensystem oder Epilepsie,
mit der Ausnahme von Patienten mit erfolgreich behandelten Gehirn-Metastasen.
Verfahren
zur Bestimmung der Effizienz von therapeutischen IL-2 Behandlungen
sind im Stand der Technik bekannt.
Die
Halbwertszeit-Kurven von IL-2 im humanen Serum nach intravenöser Bolus-Verabreichung
oder Infusion kann als bi-exponential beschrieben werden. Für einen
Bolus beträgt
die T½α 8 Minuten
und die T½β 88 Minuten;
für eine
Infusion, beträgt
die T½α 15 Minuten
und die T½β 96 Minuten.
Beobachtete Serumwerte sind proportional zur IL-2 Dosis.
Charakteristika
der gebräuchlichen
Medikamente sind oben in dem Kapitel „Pharmazeutische Zusammensetzungen" beschrieben worden.
Diese Zusammensetzungen werden im allgemeinen direkt an einen Patienten
verabreicht. Direkte Zuführung
kann durch parenterale Injektion (zum Beispiel intravenös, subkutan,
intraproitonial, intramuskulär,
oder in die interstitiellen Zwischenräume eines Gewebes) erfolgen,
oder durch rektale, orale, vaginale, topikale, transdermale, intranasale,
okulare, aurale, pulmonare oder durch andere mukosale Verabreichung.
Im allgemeinen wird jedoch IL-2 mittels intravenöser Injektion verabreicht (zum
Beispiel kontinuierliche Infusion, oder Bolus) oder durch subkutane
Injektion (zum Beispiel kontinuierliche Infusion, oder Bolus).
IL-2
Dosierung ist gewöhnlich
abhängig
von der Körpergröße des Patienten,
gemessen entweder in Körpergewicht
(kg) oder in Körperoberfläche („body specific
area", BSA; gemessen
in m2; gemessen oder abgeschätzt aus
einer Kombination der Größe und des
Gewichts des Patienten). Obwohl es keine exakte Umrechnung von Gewicht-
auf BSA-Dosierung gibt, gibt es eine gute Näherung: für eine Proson mit durchschnittlichem
Gewicht und Größe (50%
für jeden
Parameter), sind 25000 IU/kg = 1 MIU/m2.
Die
Behandlung kann als Einzeldosis oder als eine Mehrfachdosis erfolgen.
Dosen können
als Bolus oder als Infusion verabreicht werden. Ein typisches Behandlungsschema
für IL-2
ist die Verabreichung von 18 × 106 IU pro m2 pro 24
Stunden als eine kontinuierliche Infusion für 5 Tage, gefolgt von 2-6 Tagen
ohne die Verabreichung von IL-2, dann eine erneute 5-tägige intravenöse IL-2
Behandlung, wie zuvor verabreicht als kontinuierliche Infusion und
dann 3 Wochen ohne die Verabreichung von IL-2. Dies ist ein einzelner „Induktionszyklus" für IL-2.
Nach der 3-wöchigen
Ruheproiode des ersten Zyklus, kann ein zweiter Induktionszyklus beginnen.
Bis zu vier „Aufrechterhaltungszyklen" können mit
4-wöchigen
Intervallen an Patienten verabreicht werden, die ansprechen oder
eine Krankheitsstabilisierung zeigen. Sollte ein Patient diese Dosierungsverordnung
jedoch nicht tolerieren können,
sollte die Dosis reduziert oder die Verabreichung unterbrochen werden, bis
sich die Toxizität
gemildert hat. Eine andere Behandlungsverordnung für IL-2 ist
die Verabreichung von 6 × 105 IU pro kg mittels intravenösen Bolus
alle 8 Stunden für
14 Dosen über
5 Tage, gefolgt von einer zweiten Behandlung nach einer 9-tägigen Ruheproiode.
Bevorzugte
Verabreichungen beinhalten: intravenöse Infusion zur Behandlung
von metastasenbildendem Nierenzell-Karzinom; intravenöse Infusion
zur Behandlung von metastasenbildendem Melanom; subkutaner Bolus
zur Behandlung von metastasenbildendem Nierenzell-Karzinom; subkutane
Infusion zur Behandlung von metastasenbildendem Nierenzell-Karzinom; pulmonale
Verabreichung mittels Inhalation zur Behandlung von metastasenbildendem
Nierenzell-Karzinom mit Lungenmetastasen.
Kombinationstherapien
IL-2
Mikroaggregate der Erfindung können
als aktive Bestandteile von pharmazeutischen Substanzen benutzt
werden. Solche pharmazeutischen Substanzen können alleine benutzt werden
um Patienten zu behandeln, oder sie können in Verbindung mit anderen
aktiven Bestandteilen benutzt werden. Normalerweise wird IL-2 nicht
vor der Verabreichung mit anderen aktiven Substanzen gemischt, statt
dessen werden das IL-2 und der andere aktive Bestandteil als einzelne
unabhängige
Medikamente in einem kombinierten Protokoll verabreicht. Kombinationstherapie
ist besonders geeignet zur Behandlung von Krebserkrankungen, besonders solchen
die bösartig
oder metastasenbildend sind.
Somit
betrifft die Erfindung (a) IL-2 Mikroaggregate der Erfindung und
(b) einen zweiten pharmazeutischer Wirkstoff zur simultanen, getrennten
Verabreichung oder zur aufeinanderfolgender Verabreichung.
Die
Erfindung betrifft weiterhin, ein pharmazeutisches Präparat oder
System, umfassen (a) einen ersten pharmazeutischen Wirkstoff, der
IL-2 Mikroaggregate der Erfindung umfasst, und (b) einen zweiten
pharmazeutischen Wirkstoff, worin der besagte erste oder zweite
Wirkstoff entweder eine Beimischung oder eine separate Zusammensetzung
darstellen, zum Beispiel zur simultanen, getrennten Verabreichung
oder zur aufeinanderfolgender Verabreichung.
Die
Erfindung betrifft ferner Kits, umfassend: (a) einen ersten pharmazeutischen
Wirkstoff, welcher IL-2 Mikroaggregate der Erfindung umfasst, und
(b) einen zweiten pharmazeutischen Wirkstoff.
Die
Erfindurng betrifft ferner die Verwendung von (a) IL-2 Mikroaggregaten
der Erfindung und (b) einen zweiten pharmazeutischen Wirkstoff,
in der Herstellung eines Kombinationsmedikamentes.
Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung von IL-2 Mikroaggregaten
der Erfindung in der Herstellung eines Medikamentes, worin das Medikament
für die
Verabreichung an Patienten genutzt wird, die mit einem zweiten pharmazeutischen
Wirkstoff vorbehandelt worden sind. In ähnlichem Sinne betrifft die
Erfindung die Verwendung eines zweiten pharmazeutischen Wirkstoffes
in der Herstellung eines Medikamentes, worin das Medikament für die Verabreichung
an Patienten, die mit IL-2 Mikroaggregaten der Erfindung vorbehandelt
worden sind, genutzt wird. Die „Vorbehandlung" kann kürzlich (zum
Beispiel innerhalb von 24 vor der Verabreichung des besagten Medikamentes),
intermediär
(zum Beispiel mehr als 24 Stunden aber nicht länger als 4 Wochen), mehr entfernt
(zum Beispiel mindestens 4 Wochen früher), sehr entfernt (zum Beispiel
mindestens 6 Monate früher)
erfolgt sein, wobei sich diese Zeitangaben auf die letzte Vorbehandlungsdosis
beziehen. Der Patient kann unempfänglich für die Behandlung mit dem pharmazeutischen
Wirkstoff sein, der während
der Vorbehandlung verabreicht wurde.
Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung von IL-2 Mikroaggregaten
der Erfindung; zur Herstellung eines Medikamentes, worin das Medikament
gemeinsam mit einem zweiten pharmazeutischen Wirkstoff verabreicht
wird. In ähnlichem
Sinne betrifft die Erfindung die Verwendung eines zweiten pharmazeutischen
Wirkstoff in der Herstellung eines Medikamentes, worin das Medikament
gemeinsam mit IL-2 Mikroaggregaten der Erfindung verabreicht wird.
Die zwei Wirkstoffe werden bevorzugt innerhalb von 4 Stunden verabreicht.
Bevorzugte
zweite pharmazeutische Wirkstoffe sind aus der folgenden Tabelle
ausgewählt
worden. Diese beinhaltet auch Details der Bedingungen unter denen
die Kombinationstherapie zur Behandlung eingesetzt werden kann (und
wo angezeigt, grundlegende Details wie die Kombinationstherapie
verabreicht werden kann):
Wenn
der zweite Wirkstoff ein Antikörper
ist, ist es bevorzugt ein monoklonaler Antikörper, besonders bevorzugt ein
humanisierter oder ein humaner Antikörper. Antikörper werden gewöhnlich als
Injektion verabreicht, zum Beispiel subkutan oder intravenös. Antikörper können an andere
aktive Wirkstoffe zum Beispiel Tiuxetan, Ozogamicin, oder Radionuclide, 131I, etc., gebunden sein, im speziellen
zur Behandlung von Krebserkrankungen.
Im
allgemeinen, kann der Zweite Wirkstoff ein Antikörper sein, der ADCC (Antikörper-abhängige zelluläre Zelltoxizität) aufweist.
Auf IL-2 basierende Kombinationstherapie ist erfolgreicher in der
Behandlung von Krebserkrankungen zusammen mit Antikörpern die
ADCC vermitteln, als mit Wirkstoffen, die Krebs behandeln durch
Inhibition von Vaskularisierung, oder durch Veränderung der Zellzyklus-Signaltransduktion.
Definitionen
Der
Ausdruck „enthaltend" (bzw. „enthält") erfasst „als Bestandteil
enthalten" ebenso
wie „bestehen aus", z.B. eine Mischung „enthaltend" X kann ausschließlich aus
X bestehen, oder kann etwas Zusätzliches enthalten,
z.B. X + Y.
Der
Ausdruck „etwa" (bzw. „ca.") in Zusammenhang
mit einem numerischen wert x bedeutet z.B. x ± 10%. Wo erforderlich, kann
der Ausdruck „etwa" (bzw. „ca." ) weggelassen werden.
Der
Ausdruck „im
wesentlichen" schließt „vollständig" nicht aus, z.B.
eine Mischung die „im
wesentlichen" frei
von Y ist, kann vollständig
frei von Y sein. Wo erforderlich, kann der Ausdruck „im wesentlichen" weggelassen werden.
Prozent
Sequenzidentität
kann mittels des "Smith-Waterman
homology search" Algorithmus
bestimmt werden, unter Verwendung einer "affine gap search" mit dem Wert 12 für eine "gap open penalty" und dem Wert 2 für eine "gap extension penalty", sowie 62 für "BLOSUM matrix". Der " Smith-Waterman homology search" Algorithmus wird
in Zitat 64 gelehrt.
KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
1 zeigt
den Anstieg der Spezifischen Trübung
(τ) wenn
SDS im Verlauf der Diafiltration entfernt wird.
2 und 3 zeigen
die Aminosäurensequenz
von IL-2 in dem PROLEUKINTM Produkt (SEQ
ID NO:1). Der Sequenz (i) fehlt das N-terminale Methionin der SEQ
ID NO:3, (ii) fehlt der Alaninrest der sich am N-terminalen Ende
des vollentwickelten humanen IL-2, wie in SEQ ID NO:4 dargestellt,
befindet, und (iii) hat einen Serin-Rest im Austausch für den Cys-125-Rest,
wie in SEQ ID NO:4 dargestellt.
4 zeigt
eine Nukleinsäuresequenz,
womit die in 2 dargestellte Sequenz (SEQ
ID NO:2, die das Start- und Stop-Codon beinhaltet, und die in als
SEQ ID NO:3 vor der Abspaltung des N-terminalen Methionin) kodiert wird.
Die Zahlen auf der linken Seite bezeichnen die erste Base in jeder
Reihe, gezählt
vom 5' Ende des
(+) DNA Stranges des IL-2 Gens. Zahlen unter der Aminosäurensequenz
bezeichnen Aminosäure-Nummern,
gezählt
vom N-terminus des nativen humanen IL-2. Pfeile bezeichnen Nukleotidunterschiede,
in Relation zum humanen IL-2 (zum Beispiel die Unterschiede zwischen
den SEQ ID NO:2 und 5).
5 zeigt
die spezifische Trübung
(τ, cm2/g) von sieben Proben mit verschiedene SDS-Konzentrationen (μg SDS pro
mg IL-2) die für
pharmakokinetische Tests gebraucht wurden, und 6 zeigt
den Anteil des totalen IL-2, der durch Zentrifugation aus diesen
sieben Proben pelletiert werden konnte.
7 zeigt
die Plasma-Bioaktivität
von sechs der sieben Proben. 8 vergleicht
die 160 μg/mg
und die 15 μg/mg
Proben. 9 ist eine Kombination der 7 und 8.
X-Achsen zeigen die Zeit (Stunden) nach der Injektion; Y-Achsen
zeigen die Plasma-Bioaktivität
(ng/ml).
10 zeigt τ (cm2/g) gegen die SDS-Konzentration (mg/μg) während der
Diafiltration und in 11 wurde τ in MW (kDa) konvertiert.
12 zeigt
die Abnahme der SDS-Konzentration während der Diafiltration
13 kombiniert
die Trübungsergebnisse
aus 10 mit den SDS-Entfernungsprofilen aus 12.
14 zeigt
den Einfluss der Lyophilisierung auf τ (cm2/g).
Die Quadrate repräsentieren
Werte vor der Lyophilisierung und Kreise repräsentieren Werte nach der Lyophilisierung.
Die X-Achse zeigt die SDS-Konzentration der Probe (μg/mg).
15 zeigt
die Bioaktivität
der IL-2 Mikroaggregate, vor und nach Verdünnung mit Serum, und einen Vergleich
mit monomerem IL-2.
16 und 17 zeigen
Dynamische Lichtstreuungsspektren der IL-2 Mikroaggregate. 16 zeigt die
Verteilung der Masse der Lösungskomponenten,
und 17 die zahlenmäßige Verteilung.