DE3520228C2

DE3520228C2 - Wasserlösliche bioaktive Trockenfeststoffzusammensetzung, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate

Info

Publication number: DE3520228C2
Application number: DE3520228A
Authority: DE
Inventors: Shunsaku Koyama; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1984-06-06
Filing date: 1985-06-05
Publication date: 1994-02-24
Anticipated expiration: 2005-06-06
Also published as: DE3520228A1; US4824938A; GB2160528A; GB8513502D0; FR2565490A1; FR2565490B1; JPS60258125A; GB2160528B; JPH0533208B2

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene stabilisierte, wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung nach den Ansprüchen 5 bis 10 und diese Zusammensetzung enthaltende pharmazeutische Präparate nach Anspruch 11.

Im folgenden werden folgende Abkürzungen verwendet: IFN: Interferon; HuIFN: Humaninterferon; TNF: Tumornekrosefaktor; LT: Lymphotoxin, GH: Wachstumshormon, EPO: Erythropoietin; EGF: Epidermiswachstumsfaktor; und TSH: Schilddrüse stimulierendes Hormon. "h" bedeutet bei diesen Abkürzungen, daß die Substanz humanspezifisch ist, beispielsweise hGH, hEGF, hEPO und hTSH.

Proteinartige bioaktive Substanzen, die als Testreagenzien und/oder pharmazeutische Präparate verwendbar sind, wie beispielsweise Lymphokine und Peptidhormone, sind eingehend untersucht worden und haben zu bemerkenswerten Fortschritten in der Biochemie und der Medizin geführt. Einige dieser Substanzen sind im Handel erhältlich oder für die Vermarktung bereit.

Da proteinartige bioaktive Substanzen im allgemeinen relativ instabil sind, muß ihnen zur Vermarktung ein Stabilisator zugesetzt werden. Der am meisten verwendete Stabilisator ist Humanserumalbumin (HSA), der jedoch folgende Nachteile aufweist:

(1) Die stabilisierende Wirkung auf proteinartige bioaktive Substanzen ist nicht zufriedenstellend;
(2) die Zugabe von HSA verschleiert die spezifische Aktivität der Substanz. Die spezifische Aktivität wird angegeben als Aktivität/mg Protein und wird zur Bestimmung des Reinheitsgrades verwendet;
(3) die Verwendung von HSA verursacht möglicherweise Infektionskrankheiten beim Menschen, da HSA ein von Humanserum abgeleitetes Protein ist;
(4) HSA neigt beim Trocknen zur Bildung eines wasserunlöslichen Feststofffs.

Um diese Nachteile von HSA zu vermeiden, wurden verschiedene Stabilisatoren vorgeschlagen: Als Stabilisator für IFN werden in der JA-PS 92 691/83 Cyclodextrin und in der JA-PS 25 333/84 Saccharide (mit Ausnahme von Polysacchariden) wie Mono- und Oligosaccharide, und Polyole, wie Glyzerin und Ethylenglycol vorgeschlagen. Für die Stabilisierung von TNF werden in der JA-PS 39 829/84 nichtionische oberflächenaktive Mittel und in der JA-PS 59 625/84 D-Glukose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, Dextran, Hydroxyethylstärke und vorzugsweise Trehalose vorgeschlagen. Die mit diesen Stabilisatoren erzielte stabilisierende Wirkung ist jedoch ungenügend. Außerdem ist Trehalose relativ teuer. Deshalb werden diese Stabilisatoren praktisch nicht verwendet.

Aufgabe der Erfindung war es, einen wasserlöslichen Trockenfeststoff mit einem Gehalt an einer proteinartigen bioaktiven Substanz mit hoher Stabilität zu gewinnen.

Zu diesem Zweck wurden verschiedene Stabilisatoren, insbesondere Polysaccharide, untersucht. Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Aufgabe mit einem Polysaccharid, das im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose- Einheiten besteht, gelöst werden kann.

Die Erfindung betrifft daher eine wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung, die durch eine proteinartige bioaktive Substanz und ein im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose- Einheiten bestehendes Polysaccharid gekennzeichnet ist, wobei das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz mindestens 0,5, bezogen auf die Trockenfeststoffe beträgt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der wasserlöslichen Trockenfeststoffzusammensetzung, das durch die Gewinnung einer wässerigen Lösung, die die proteinartige bioaktive Substanz und das Polysaccharid enthält, und Trocknen dieser wässerigen Lösung gekennzeichnet ist, wobei man ein Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz von mindestens 0,5, bezogen auf die Trockenfeststoffe, vorsieht.

Es wurde festgestellt, daß eine erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung, die nach dem angegebenen Verfahren erhältlich ist, die gewünschte Wasserlöslichkeit aufweist und die Aktivität der Substanz wesentlich stabiler beibehält.

Der Ausdruck "proteinartige bioaktive Substanz" bedeutet hier proteinartige Substanzen, die in vivo Bioaktivität aufweisen, wie beispielsweise einfache Proteine und Protein-Konjugate, insbesondere Lymphokine, wie IFN, LT, TNF, Makrophagen- Migrationshemmfaktor, Transferfaktor, T-Zellenwachstumsfaktor und Kolonie-Stimulationsfaktor, sowie Peptidhormone, wie beispielsweise Insulin, GH, Prolaktin, Choriongonadotropin, EPO, follikelstimulierendes Hormon, Gelbkörperhormon, EGF, adrenocorticotropes Hormon, Plazentalaktogen, TSH und Parathyroidhormon, die ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10 000 bis etwa 200 000 Dalton haben.

Die für die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung verwendbaren proteinartigen bioaktiven Substanzen können aus Körperflüssigkeiten, Zellen, Gewebe oder Organen isoliert werden, in denen die Substanzen natürlich vorkommen, oder aus deren in vitro- oder in vivo-Kulturen gewonnen werden. Die proteinartigen bioaktiven Substanzen können aber auch aus Kulturen von Humanzellen, Tierzellen oder Mikroorganismen gewonnen werden, die in herkömmlicher Weise biotechnisch so verändert worden sind, daß sie diese Substanzen produzieren, z. B. durch Zellfusion oder Genrekombinationsverfahren; die erfindungsgemäß verwendbaren bioaktiven proteinartigen Substanzen beschränken sich jedoch nicht auf solche Substanzen, die in besonderen Verfahren hergestellt werden können.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Polysaccharide bestehen im wesentlichen aus alpha-polymerisierten Maltotriose-Einheiten. Spezielle Beispiele sind Pullulan, Elsinan und ihre Teilhydrolysate mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 10 000 000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 20 000 bis 2 000 000 Dalton. Das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger Substanz beträgt mindestens 0,5 und vorzugsweise 1,0 bis 10 000, bezogen auf die Trockenfeststoffe.

Die wässerige Lösung, die die proteinartige bioaktive Substanz und das Polysaccharid enthält, wird unter solchen Bedingungen getrocknet, daß ohne wesentliche Abnahme der Substanzaktivität ein wasserlöslicher Trockenfeststoff erhalten wird. Obwohl herkömmliche Trockenverfahren, die bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 30°C durchgeführt werden, erfindungsgemäß anwendbar sind, wird Gefriertrocknung bevorzugt.

Die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung kann außer dem Polysaccharid noch andere Substanzen enthalten, wie Mineralstoffe, Puffer, Aminosäuren und/oder Saccharide, die der wässerigen Lösung vor dem Trocknen zugegeben werden können. Der auf diese Weise erhältliche Trockenfeststoff löst sich leicht in Wasser und behält mit großer Stabilität die Aktivität der proteinartigen bioaktiven Substanz bei. Deshalb kann die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung günstigerweise für beispielsweise Testreagenzien, Injektionen und Arzneipräparate für die äußerliche oder innere Verabreichung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Humanerkrankungen verwendet werden.

Die Erfindung betrifft daher ferner pharmazeutische Präparate, die durch die wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung als Wirkstoff in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gekennzeichnet sind.

Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung.

Versuch 1 Stabilisierungstest an Interferon (IFN) 1A: Herstellung von IFN

Neugeborenen Hamstern wurde ein in herkömmlicher Weise hergestelltes Kaninchen-Antiserum zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert, dann subkutan BALL-1-Zellen implantiert. Die Tiere wurden in üblicher Weise drei Wochen gefüttert. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten, wurden extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit serumfreiem RPMI 1640-Medium, pH 7,2 gewaschen, in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium zu einer Zelldichte von etwa 2×10⁶ Zellen/ml suspendiert und bei 35°C stehengelassen. Die Zellsuspension wurde mit teilgereinigtem HuIFN in einer Menge von 200 U/ml versetzt, etwa 2 h inkubiert, mit Sendai-Virus (etwa 300 Hämagglutinationstiter/ml) versetzt und weitere 20 h zur Induktion der HuIFN-Bildung inkubiert. Die entstandene Kultur wurde bei etwa 1000 g und etwa 4°C zur Entfernung des Feststoffs zentrifugiert, der Überstand wurde durch eine Membran filtriert. Das Filtrat wurde an einer Säule mit herkömmlichem, immobilisiertem Anti-HuIFN-Antikörper chromatographiert, die nicht adsorbierten Fraktionen wurden entfernt. Das adsorbierte HuIFN wurde von der Säule eluiert und mit einer Membran konzentriert, wobei ein etwa 0,01-proz. (Gewicht/Volumen-Basis) Konzentrat mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1,5·10⁸ U/mg Protein in einer Ausbeute von etwa 4 ml/Hamster erhalten wurde.

Die HuIFN-Aktivität wurde mit der herkömmlichen Plaque-Reduktionsmethode unter Verwendung von FL-Zellen bestimmt. Der Hämagglutinationstiter wurde gemäß J.E. Salk, The Journal of Immunology, Bd. 49, Seiten 87 bis 98 (1944) bestimmt.

1B: Vergleich der stabilisierenden Wirkung auf IFN mit verschiedenen Stabilisatoren

0,5 ml gemäß Versuch 1A erhaltenes HuIFN-Konzentrat und 1 ml einer wässerigen Lösung eines Stabilisators wurden in eine Glasampulle eingebracht, vermischt, gefriergetrocknet und entweder bei 4 oder 37°C 2 Monate gelagert. Der Feststoff wurde mit 30°C warmer Salzlösung versetzt, um HuIFN aufzulösen oder zu eluieren. HuIFN wurde bestimmt; das Retentionsverhältnis (%) im Vergleich zur Aktivität vor dem Gefriertrocknen wurde gemäß folgender Gleichung berechnet:

Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Trockenfeststoffe, die als Stabilisator ein Polysaccharid, wie Pullulan oder Elsinan enthalten, eine ausgezeichnete HuIFN-Stabilität und Wasserlöslichkeit aufweisen und deshalb leicht zu handhaben sind.

Versuch 2 Stabilisierungstest an Tumornekrosefaktor (TNF) 2A: Herstellung von TNF

Neugeborenen Hamstern wurde ein in herkömmlicher Weise hergestelltes Kaninchen-Antiserum zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert und subkutan eine mit SV-40-Virus transformierte Humanmonocytenzellinie implantiert. Die Tiere wurden 1 Woche in herkömmlicher Weise gefüttert, dann wurden ihnen intraperitoneal BCG-Rohzellen in einer Dosis von 10⁷ Zellen/Hamster injiziert; die Tiere wurden weitere 2 Wochen gefüttert. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten und je 15 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden in Eagle′s Minimalnährmedium, pH 7,2 gewaschen, m it 5 Vol.-% Humanserum versetzt, in 37°C warmem, frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium zu einer Zelldichte von etwa 5×10⁶ Zellen/ml suspendiert, mit Endotoxin aus Escherichia coli (etwa 10 µg/ml) versetzt und bei 37°C 16 h inkubiert, um die TNF-Bildung zu induzieren.

Die entstandene Kultur wurde bei etwa 1000 g und etwa 4°C zur Entfernung des Feststoffs zentrifugiert, der Überstand wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,2 enthaltende Salzlösung 21 h dialysiert und dann durch eine Membran filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und zu einem Pulver mit TNF-Aktivität gefriergetrocknet. Das Pulver wurde gereinigt durch Adsorption/Desorption mit Ionenaustausch, Molekulargewichtsfraktionierung durch Gelfiltration, Einengung und Membranfiltration gemäß G. Bodo, Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon (11. Internationales Immunologisches Symposium, 8. und 9. Juni 1977, Zagrab, Jugoslawien). Das entstandene HuIFN-freie Präparat wurde mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, durch Affinitätschromatographie mit ConA-Sepharose gereinigt und eingeengt, wobei etwa ein 0,01-proz. (Gewicht/Volumen-Basis) Konzentrat mit hochreinem TNF in einer Ausbeute von etwa 30 ml/Hamster erhalten wurde. Das TNF wurde dadurch charakterisiert, daß es hämorrhagische Nekrose auf MethA-Sarkom verursachte, normale Zellen jedoch nicht beeinträchtigte. Das so erhaltene TNF war ein Glycoprotein mit einer spezifischen Aktivität von etwa 3,5×10⁵ U/mg Protein, das frei vom verwendeten Induktor war.

Die TNF-Aktivität wurde in herkömmlicher Weise bestimmt und zwar gemäß E. Pick, Lymphokines, Bd. 2, Seiten 235- 272, Tumor Necrosis Factors, Academic Press, Inc. (1981): Nachdem man eine vorgegebene Zeit eine L-929-Zellkultur (TNF-empfindliche Normalzellinie) TNF-Verdünnungen ausgesetzt hatte, wurden die restlichen behandelten Zellen gezählt.

2B: Vergleich der Stabilisierungswirkung verschiedener Stabilisatoren auf TNF

Gemäß Versuch 1B wurden 0,5 ml gemäß Versuch 2A hergestelltes TNF-Konzentrat und 1 ml wässerige Stabilisatorlösung in eine Glasampulle eingebracht, gefriergetrocknet und gelagert. Das Retentionsverhältnis (%) wurde bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Die Ergebnisse bestätigen, daß die Trockenfeststoffe, die als Stabilisator Polysaccharide, wie Pullulan oder Elsinan, enthalten, eine ausgezeichnete TNF-Stabilität und Löslichkeit in Wasser aufweisen und deshalb leicht zu handhaben sind.

Versuch 3 Polysaccharidverhältnis

Die stabilisierende Wirkung auf die proteinartigen bioaktiven Substanzen wurde mit verschiedenen Polysaccharid-Gewichtsverhältnissen untersucht: 0,5 ml gemäß Versuch 1A erhaltenes HuIFN-Konzentrat oder 0,5 ml gemäß Versuch 2A erhaltenes TNF-Konzentrat wurden in eine Glasampulle eingebracht zusammen mit Pullulan oder Elsinan in einer solchen Konzentration, daß ein Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger Substanz von 0, 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10,0 oder 100,0, bezogen auf die Trockenfeststoffe, entstand. Es wurde vermischt, entsprechend Versuch 1B gefriergetrocknet und bei 37°C 1 Monat gelagert, dann wurden die Retentionsverhältnisse (%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben, alle Trockenfeststoffe lösten sich leicht in Salzlösung.

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, beträgt das Gewichtsverhältnis, das eine proteinartige bioaktive Substanz wirkungsvoll stabilisiert, 0,5 oder darüber und vorzugsweise 1,0 oder darüber, bezogen auf die Trockenfeststoffe.

Tabelle III

Wie oben beschrieben, ist die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie in Wasser leicht löslich ist und die Aktivität einer proteinartigen bioaktiven Substanz über lange Zeit unter strengen Bedingungen, z. B. Raumtemperatur, beständig behält. Im Gegensatz zu herkömmlichen Stabilisatoren, wie HSA, verursacht das erfindungsgemäß verwendete Polysaccharid keine Infektionskrankheiten beim Menschen und verschleiert nicht die spezifische Aktivität der Substanz, die für die Bestimmung des Reinheitsgrades verwendet wird, bzw. wenn ihr Reinheitsgrad bestimmt wird.

Daher kann die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung günstigerweise für Testreagenzien, Injektionen und Arzneipräparate zur inneren und äußeren Verabreichung verwendet werden, um Humanerkrankungen zu verhindern und/ oder zu behandeln.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Humaninterferon (HuIFN)

Ein Konzentrat, das gereinigtes HuIFN enthielt und gemäß Versuch 1A erhalten wurde, wurde mit einer wässerigen Lösung versetzt, die 100 Teile (bezogen auf das Gewicht des festen HuIFN) eines gereinigten Pullulans enthielt, unter sterilen Bedingungen filtriert, in 2-ml-Glasampullen zu einem HuIFN-Gehalt von 3×10⁶ U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb geeignet für Testreagenzien sowie für intramuskuläre oder intravenöse Injektionen.

Beispiel 2 Tumornekrosefaktor (TNF)

Ein Konzentrat, das gereinigtes TNF enthielt und gemäß Versuch 2A erhalten wurde, wurde mit einer wässerigen Lösung versetzt, die 200 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen TNF, eines gereinigten Pullulans enthielt, unter sterilen Bedingungen filtriert, in 2-ml-Glasampullen zu einem TNF-Gehalt von 2000 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb geeignet für Testreagenzien sowie für intramuskuläre oder intravenöse Injektionen.

Beispiel 3 Lymphotoxin (LT)

Nichtadsorbierte Fraktionen von einer Säule mit immobilisiertem Anti-HuIFN-Antikörper, die gemäß Versuch 1A erhalten wurden, wurden durch Affinitätschromatographie mit Phytohämagglutinin- Sepharose gereinigt und mit einer Membran konzentriert. Das Konzentrat, das hochreines LT enthielt, wurde mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 50 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen LT, Elsinan enthielt, in 5-ml- Glasampullen zu einem LT-Gehalt von 1000 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist daher geeignet für z. B. Testreagenzien, Injektionen, als Granulat, Tabletten oder Salbe.

Die LT-Aktivität wurde in herkömmlicher Weise bestimmt (vgl. B.R. Blood & P.R. Glade, In Vitro Methods in Cell- Mediated Immunity, Academic Press, Inc. (1971)); eine Kultur von Mäuse-L-Zellen wurde mit LT-Verdünnungen in Berührung gebracht, die übrig bleibenden behandelten L-Zellen wurden gezählt.

Beispiel 4 Wachstumshormon (GH)

Acidophile Adenomzellen wurden einem Patienten mit acidophilem Adenom entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und subkutan in erwachsene Nacktmäuse implantiert, die dann 3 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten und etwa je 10 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit glukosefreiem Earle′s 199-Medium, pH 7,2 gewaschen, mit 10-Vol.-% Kälberfötusserum versetzt, in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium, das zusätzlich 30 mM L-Arginin als GH-Induktor enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10¹⁵/ml suspendiert und zur Induktion der hGH-Bildung bei 37°C 6 h inkubiert. Die Zellen der entstandenen Kultur wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hGH im Überstand wurde bestimmt. Die hGH-Bildung betrug etwa 500 ng/ml Zellsuspension. Der Überstand wurde in herkömmlicher Weise gereinigt und eingeengt, wobei ein hGH-Konzentrat erhalten wurde, das mit einer wässerigen Lösung vermischt wurde, die 10 000 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen hGH, Pullulan enthielt, in 2-ml-Glasampullen zu einiem hGH-Gehalt von 10 ng/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb für Testreagenzien oder Injektionen geeignet.

Die hGH-Aktivität wurde durch herkömmliche Radioimmunoversuche gemäß S.M. Gilick et al., Nature, Bd. 199, Seite 784 (1963) bestimmt.

Beispiel 5 Hautwachstumsfaktor (EGF)

Submaxillare Drüsentumorzellen wurden einem Patienten mit submaxillarem Drüsentumor entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und in ein Earle′s 199-Medium, pH 7,2 inokuliert und mit 10-Vol.-% Kälberfötusserum zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁵ Zellen/ml versetzt. Die Tumorzellen wurden bei 37°C in einem geschlossenen System 1 Woche kultiviert, wobei das Kulturmedium periodisch aufgefrischt wurde. Sobald die wachsenden Zellen eine Monoschicht gebildet hatten, wurde die Kultur in Salzlösung, die ein Phosphat und Trypsin enthielt, gewaschen. Die proliferierten Zellen wurden in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium zu einer Zelldichte von etwa 1×10⁵ Zellen/ml suspendiert und bei 37°C und einem pH-Wert von 7,2 eine weitere Woche in Suspension kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Ultraschall aufgebrochen, das hEGF im Überstand wurde bestimmt. Die hEGF- Bildung betrug etwa 1,3 µg/ml Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstandes in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hEGF-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 200 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen hEGF, Elsinan enthielt, in 5-ml-Glasampullen zu einem hEGF-Gehalt von 0,5 µg/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb für beispielsweise Testreagenzien, Injektionen, Granulat, Tabletten oder Suppositorien geeignet.

Die hEGF-Aktivität wurde durch herkömmliche Radiorezeptorversuche gemäß R.L. Ladda et al., Analytical Chemistry, Bd. 93, Seiten 286-294 (1979) bestimmt.

Beispiel 6 Hautwachstumsfaktor (EPO)

Humannierentumorzellen wurden einem Patienten mit Nierentumor entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und in einer Flasche, die Namalwa (Human-Lymphoblastoid-Zellinie) und eine Salzlösung mit 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄ und 2 mM CaCl₂ enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10³ Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde unter Eiskühlung zu einem frischen Präparat der gleichen Salzlösung gegeben, die jedoch noch durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Sendai-Virus enthielt; nach 5 min wurde die Zellsuspension zur Zellfusion etwa 30 min in einen 37°C warmen Inkubator eingebracht. Auf diese Weise wurde das Bildungsvermögen von hEPO in die Namalwa-Zellen eingeführt. Die Namalwa-Zellen wurden intraperitoneal erwachsenen Nacktmäusen implantiert, die in herkömmlicher Weise 5 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren gebildet hatten und etwa je 15 g wogen, wurden extrahiert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit Earle′s 199-Medium, pH 7,2 gewaschen, mit 10-Vol.-% Kälberfötusserum zu einer Zelldichte von etwa 10⁶ Zellen/ml versetzt und bei 37°C 20 h unter einem verminderten Druck von 931 Pa (700 mmHg) inkubiert, um die hEPO-Bildung zu induzieren. Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hEPO im Überstand wurde bestimmt. Die hEPO-Bildung betrug etwa 170 U/ml Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstands in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hEPO-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 500 Teile Pullulan, bezogen auf das Gewicht des festen hEPO enthielt, in 5-ml-Glasampullen zu einem hEPO-Gehalt von 10 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Die hEPO-Aktivität wurde durch herkömmliche Bioversuche durch ⁵⁹Fe-Aufnahme bestimmt (vgl. P.M. Cotes und D.R. Bangham, Nature, Nr. 4793, Seiten 1065-1067 (1961)). Eine Einheit (U) der hEPO-Aktivität entspricht 1/10 der hEPO-Aktivität einer von der WHO verteilten Ampulle.

Beispiel 7 Schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH)

Basophile Humanadenomzellen wurden einem Patienten mit basophilem Adenom entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und mit Namalwa-Zellen in einer Salzlösung, die 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄ und 2 mM CaCl₂ enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10⁴ Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde unter Eiskühlung mit einem frischen Präparat der gleichen Salzlösung versetzt, die jedoch noch durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Sendai-Virus enthielt. Nach 5 min wurde die Zellsuspension zur Zellfusion etwa 30 min in einen 37°C warmen Inkubator eingebracht.

Auf diese Weise wurde das Bildungsvermögen von hTSH in die Namalwa-Zellen eingeführt. Die Namalwa-Zellen wurden intraperitoneal erwachsenen Nacktmäusen implantiert, die in herkömmlicher Weise 5 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich bei den Tieren gebildet hatten und die je etwa 15 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit Earle′s 199-Medium, pH 7,2 gewaschen, mit 10-Vol.-% Kälberfötusserum versetzt, in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium, das außerdem 30 mM L-Arginin als TSH-Induktor enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10⁵ Zellen/ml suspendiert und bei 37°C 35 h inkubiert, um die hTSH-Bildung zu induzieren. Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hTSH im Überstand wurde bestimmt. Die hTSH-Bildung betrug etwa 180 mIU/ml Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstandes in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hTSH-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 100 Teile Elsinan, bezogen auf das Gewicht des festen hTSH enthielt, in 5-ml-Glasampullen zu einem hTSH-Gehalt von 10 mIU/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.

Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil. Es ist daher für Testreagenzien oder Injektionen geeignet.

Die hTSH-Aktivität wurde mit herkömmlichen Radiorezeptorversuchen gemäß S.W. Manley et al., Journal of Endocrinology, Bd. 61, Seiten 419-436 (1974) bestimmt und in Internationalen Einheiten (IU) gemäß der vom National Institute for Medical Research, England, verteilten hTSH-Standardprobe angegeben.

Die Beschreibung erläutert bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung; dem Fachmann ist klar, daß Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.

Claims

1. Wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung, gekennzeichnet durch eine proteinartige bioaktive Substanz und ein im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose- Einheiten bestehendes Polysaccharid, wobei das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz mindestens 0,5 bezogen auf die Trockenfeststoffe beträgt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinartige bioaktive Substanz ein Lymphokin oder Peptidhormon ist.

3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Pullulan, Elsinan, eines ihrer Teilhydrolysate oder eine Mischung davon ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des Polysaccharids von 10 000 bis 10 000 000 Dalton beträgt.

5. Verfahren zur Herstellung der wasserlöslichen Trockenfeststoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Gewinnung einer wässerigen Lösung, die die proteinartige bioaktive Substanz und das Polysaccharid enthält, und Trocknen dieser wässerigen Lösung, wobei man ein Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz von mindestens 0,5 bezogen auf die Trockenfeststoffe vorsieht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als proteinartige bioaktive Substanz ein Lymphokin oder Peptidhormon eingesetzt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharid Pullulan, Elsinan, eines ihrer Teilhydrolysate oder eine Mischung davon verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000 bis 10 000 000 Dalton verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wässerige Lösung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 30°C getrocknet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wässerige Lösung gefriergetrocknet wird.

11. Pharmazeutisches Präparat, gekennzeichnet durch eine Trockenfeststoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, als Wirkstoff in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.