DE3520228A1 - Wasserloesliche bioaktive trockenfeststoffzusammensetzung, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische praeparate - Google Patents

Wasserloesliche bioaktive trockenfeststoffzusammensetzung, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische praeparate

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DE3520228A1 DE19853520228 DE3520228A DE3520228A1 DE 3520228 A1 DE3520228 A1 DE 3520228A1 DE 19853520228 DE19853520228 DE 19853520228 DE 3520228 A DE3520228 A DE 3520228A DE 3520228 A1 DE3520228 A1 DE 3520228A1
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Description

Wasserlösliche bioaktive Trockenfeststoffzusammensetzung, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate
Die Erfindung betrifft eine stabilisierte, wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung, die eine proteinartige bioaktive Substanz und ein im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose-Einheiten bestehenden Polysaccharid enthält, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Zusammensetzung enthaltende pharmazeutische Präparate.
Im folgenden werden folgende Abkürzungen verwendet: IFN: Interferon; HuIFN: Humaninterferon; TNF: Tumornekrosefaktor; LT: Lymphotoxin; GH: Wachstumshormon; EPO: Erythropoietin; EGF: Epidermiswachstumsfaktor; und TSH: Schilddrüse stimulierendes Hormon, "h" bedeutet bei diesen Abkürzungen, daß die Substanz humanspezifisch ist, beispielsweise hGH, hEGF, hEPO und hTSH.
-2-
-Ji-
3520223
Proteinartige bioaktive Substanzen, die als Testreagenzien und/oder pharmazeutische Präparate verwendbar sind, wie .beispielsweise Lymphokine und Peptidhormone, sind eingehend untersucht worden und haben zu bemerkenswerten Fortschritten 'in der Biochemie und der Medizin geführt. Einige dieser Substanzen sind im Handel erhältlich oder für die Vermarktung bereit.
Da proteinartige bioaktive Substanzen im allgemeinen relativ instabil sind, muß ihnen zur Vermarktung ein Stabilisator zugesetzt werden. Der am meisten verwendete Stabilisator ist Humanserumalbumin (HSA), der jedoch folgende Nachteile aufweist:
(1) Die stabilisierende Wirkung auf proteinartige bioaktive Substanzen ist nicht zufriedenstellend;
(2) die Zugabe'von HSA verschleiert die spezifische Aktivität der Substanz. Die spezifische Aktivität wird angegeben als Aktivität/mg Protein und wird zur Bestimmung des Reinheitsgrades verwendet;
(3) die Verwendung von HSA verursacht möglicherweise Infektionskrankkeiten beim Menschen, da HSA ein von Humanserum abgeleitetes Protein ist;
(4) HSA neigt beim Trocknen zur Bildung eines wasserunlöslichen Feststoffs.
Um diese Nachteile von HSA zu vermeiden, wurden verschiedene Stabilisatoren vorgeschlagen: Als Stabilisator für IFN werden in der JA-PS 92691/83 Cyclodextrin und in der JA-PS 25333/84 Saccharide (mit Ausnahme von Polysacchariden)
-3-
wie Mono- und Oligosaccharide, und Polyole, wie Glyzerin und Ethylenglycol, vorgeschlagen. Für die Stabilisierung von TNF werden in der JA-PS 39829/84 nichtionische oberflächenaktive Mittel und in der JA-PS 59625/84 D-Glukose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, Dextran, Hydroxyethylstärke und vorzugsweise Trehalose vorgeschlagen. Die mit diesen Stabilisatoren erzielte stabilisierende Wirkung ist jedoch ungenügend. Außerdem ist Trehalose relativ teuer. Deshalb werden diese Stabilisatoren praktisch nicht verwendet.
Aufgabe der Erfindung war es, einen wasserlöslichen Trockenfeststoff mit einem Gehalt an einer proteinartigen bioaktiven Substanz mit hoher Stabilität zu gewinnen.
Zu diesem Zweck wurden verschiedene Stabilisatoren, insbesondere Polysaccharide, untersucht. Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Aufgabe mit einem Polysaccharid, das im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose-Einheiten besteht, gelöst werden kann.
Die Erfindung betrifft daher eine wasserlösliche Trockenfeststoff zusammensetzung , die durch eine proteinartige bioaktive Substanz und ein im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose-Einheiten bestehendes Polysaccharid gekennzeichnet ist.
Es wurde festgestellt, daß eine erfindungsgemäße Trockenfeststoff zusammensetzung , die durch Eindampfen bis zur Trockene einer wässerigen Lösung, die die Substanz und das Polysaccharid enthält, erhältlich ist, die gewünschte Wasserlöslichkeit aufweist und die Aktivität der Substanz wesentlich stabiler beibehält.
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■#~ 3520223
Der Ausdruck "proteinartige bioaktive Substanz" bedeutet hier proteinartige Substanzen, die in vivo Bioaktivität aufweisen, wie beispielsweise einfache Proteine und Protein-Konjugate, insbesondere Lymphokine, wie IFN, LT, TNF, Makrophagen-Migrationshemmfaktor, Transferfaktor, T-Zeileηwachstumsfaktor und Kolonie-Stimuiationsfaktor, sowie Peptidhormone, wie beispielsweise Insulin, GH, Prolaktin, Choriongonadotropin, EPO, follikelstimulierendes Hormon, Gelbkörperhormon, EGF, adrenocorticotropes Hormon, Plazentalaktogen, TSH und Parathyroidhormon, die ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Dalton haben.
Die für die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung verwendbaren proteinartigen bioaktiven Substanzen können aus Körperflüssigkeiten, Zellen, Gewebe oder Organen isoliert werden, in denen die Substanzen natürlich vorkommen, oder aus deren in vitro- oder in vivo-Kulturen gewonnen werden. Die proteinartigen bioaktiven Substanzen können aber auch aus Kulturen von Humanzellen, Tierzellen oder Mikroorganismen gewonnen werden, die in herkömmlicher Weise biotechnisch so verändert worden sind, daß sie diese Substanzen produzieren, z.B. durch Zellfusion oder Genrekombinationsverfahren; die erfindungsgemäß verwendbaren bioaktiven proteinartigen Substanzen beschränken sich jedoch nicht auf solche Substanzen, die in besonderen Verfahren hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Polysaccharide bestehen im wesentlichen aus alpha-polymerisierten Maltotriose-Einheiten. Spezielle Beispiele sind Pullulan, Elsinan und ihre Teilhydrolysate mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10.000 bis 10.000.000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 20.000 bis 2.000.000 Dalton. Das Gewichtsverhältnis
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3520223
von Polysaccharid zu proteinartiger Substanz beträgt mindestens 0,5 und vorzugsweise 1,0 bis 10.000, bezogen auf die Trockenfeststoffe.
Die wässerige Lösung, die die proteinartige bioaktive Substanz und das Polysacchariti enthält, wird unter solchen Bedingungen getrocknet, daß ohne wesentliche Abnahme der Substanzaktivität ein wasserlöslicher Trockenfeststoff erhalten wird. Obwohl herkömmliche Trockenverfahren, die bei vermindertem Druck und einer Temperatur unter 30 C durchgeführt werden, erfindungsgemäß anwendbar sind, wird Gefriertrocknung bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung kann außer dem Polysaccharid noch andere Substanzen enthalten, wie Mineralstoffe, Puffer, Aminosäuren und/oder Saccharide, die der wässerigen Lösung vor dem Trocknen zugegeben werden können. Der auf diese Weise erhältliche Trockenfeststoff löst sich leicht in Wasser und behält mit großer Stabilität die Aktivität der proteinartigen bioaktiven Substanz bei. Deshalb kann die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung günstigerweise für beispielsweise Testreagenzien, Injektionen und Arzneipräparate für die äußerliche oder innere Verabreichung zur Verhinderung und/oder Behandlung von Humanerkrankungen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft daher ferner pharmazeutische Präpa·- rate, die durch die wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung als Wirkstoff in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln gekennzeichnet sind.
Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung.
Versuch 1: Stabilisierungstest an Interferon (IFN) 1 A: Herstellung von IFN
Neugeborenen Hamstern wurde ein in herkömmlicher Weise hergestelltes Kaninchen-Antiserum zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert, dann subkutan BALL-1-Zellen implantiert. Die Tiere wurden in üblicher Weise drei Wochen gefüttert. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten, wurden extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit serumfreiem RPMI 1640-Medium, pH 7,2, gewaschen, in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium zu einer Zelldichte von etwa 2x10 Zellen/ml suspendiert und bei 35 C stehengelassen. Die Zellsuspension wurde mit teilgereinigtem HuIFN in einer Menge von 200 U/ml versetzt, etwa 2 h inkubiert, mit Sendai-Virus (etwa 300 Hämagglutinationstiter/ml) versetzt und weitere 20 h zur Induktion der HuIFN-Bildung inkubiert. Die entstandene Kultur wurde bei etwa 1000 g und etwa 4 0C zur Entfernung des Feststoffs zentrifugiert, der Überstand wurde durch eine Membran filtriert. Das FiI-trat wurde an einer Säule mit herkömmlichem, immobilisiertem Anti-HuIFN-Antikörper chromatographiert, die nicht adsorbierten Fraktionen wurden entfernt. Das adsorbierte HuIFN wurde von der Säule eluiert und mit einer Membran konzentriert, wobei ein etwa 0,01-proz. (Gewicht/Volumen-Basis) Konzentrat
mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1,5x10 U/mg Protein in einer Ausbeute von etwa 4 ml/Hamster erhalten wurde.
Die HuIFN-Aktivität wurde mit der herkömmlichen Plaque-Reduktionsmetfiode unter Verwendung von FL-Zellen bestimmt. Der Hämagglutinationstiter wurde gemäß J.E. SaIk, The Journal of Immunology, Bd. 49, Seiten 87 bis 98 (1944) bestimmt.
ORIGINAL INSPECTEQ, *
AO
1 B: Vergleich der stabilisierenden Wirkung auf IFN mit verschiedenen Stabilisatoren
0,5 ml gemäß Versuch 1 A erhaltenes HuIFN-Konzentrat und 1 ml einer wässerigen Lösung eines Stabilisators wurden in eine Glasampulle eingebracht, vermischt, gefriergetrocknet und entweder bei 4 oder 37 0C 2 Monate gelagert. Der Feststoff wurde mit 30 °C warmer Salzlösung versetzt, um HuIFN aufzulösen oder zu eluieren. HuIFN wurde bestimmt; das Retentionsverhältnis (%) im Vergleich zur Aktivität vor dem Gefriertrocknen wurde gemäß folgender Gleichung berechnet:
Retentions- _ Aktivität bei der Lagerung verhältnis {%) Aktivität vor dem Gefriertrocknen
Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Trockenfeststoffe, die als Stabilisator ein Polysaecharid, wie Pullulan oder Elsinan, enthalten, eine ausgezeichnete HuIFN-Stabilität und Wasserlöslichkeit aufweisen und deshalb leicht zu handhaben sind.
■- R —
ORJQSNAL INSPECTED
Tabelle I
Stabilisator *
Löslichkeit in Salzlösung
Retentionsverhältnis (%)
4°C
37°C
Bemerkung
- ** leicht löslich 60.9 0 Kontrolle
Phosphatpuffer *** leicht löslich 68.3 15.2 Kontrolle
Maltose leicht löslich 72.4 41.2 Kontrolle
ß-Cyclodextrin leicht löslich 78.1 45.6 Kontrolle
HSA löslich 86.2 67.3 Kontrolle
Amylopektin löslich 80.1 59.2 Kontrolle
Hydroxyethylstärke leicht löslich 78.3 56.6 Kontrolle
Dextran leicht löslich 81.5 65.3 Kontrolle
OJ
cn
r .... co
Tabelle I (Fortsetzung)
Stabilisator *
Löslichkeit in Salzlösung
Retentionsverhältnis (%)
4°C
370C
Bemerkung
Pullulan leicht löslich 100.0 100.0 erfindungsgemäß
Elsinan leicht löslich 100.0 99.1 erfindungsgemäß
Gummi arabicum leicht löslich 76.2 54.6 Kontrolle
Tragantgummi leicht löslich 77.3 52.1 Kontrolle
Carrageenan leicht löslich 75.4 48.7 Kontrolle
Agar kaum löslich 33.1 21.6 Kontrolle
Pektin leicht löslich 50.3 25.3 Kontrolle
* wenn nichts anderes angegeben, 0,5-proz. (Gewicht/Volumen-Basis) wässerige Lösung des jeweiligen. Stabilisators
** nur entionisiertes Wasser *** 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,2
OJ
cn
[NJ
CID hO NJ OO
Versuch 2: Stabilisierungstest an Tumornekrosefaktor (TNF) 2 A: Herstellung von TNF
Neugeborenen Hamstern wurde ein in herkömmlicher Weise hergestelltes Kaninchen-Antiserum zur Schwächung ihrer Immunreaktion injiziert und subkutan eine mit SV—40-Virus transformierte Humanmonocytenzellinie implantiert. Die Tiere wurden 1 Woche in herkömmlicher Weise gefüttert, dann wurden ihnen intraperitoneal BCG-Rohzellen in einer Dosis von 10 Zellen/Hamster injiziert; die Tiere wurden weitere 2 Wochen gefüttert. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten und je 15 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden in Eagle's Minimalnährmedium, pH 7,2, gewaschen, mit 5 Vol.-%
Humanserum versetzt, in 37 C warmem, frisch hergestellteflgleichen Kulturmedium zu einer Zelldichte von etwa 5x10 Zellen/ml suspendiert, mit Endotoxin aus Escherichia coli (etwa 1O.ug/ml) versetzt und bei
um die TNF-Bildung zu induzieren.
(etwa 1O.ug/ml) versetzt und bei 37 0C 16 h inkubiert,
Die entstandene Kultur wurde bei etwa 1.000 g und etwa 4 0C zur Entfernung des Feststoffs zentrifugiert, der Übei— stand wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,2, enthaltende Salzlösung 21 h dialysiert und dann durch eine Membran filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und zu einem Pulver mit TNF-Aktivität gefriergetrocknet. Das Pulver wurde gereinigt durch Adsorption/Desorption mit Ionenaustausch, Molekulargewichtsfraktionierung durch Gelfiltration, Einengung und Membranfiltration gemäß G. Bodo, Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon (11. Internationales Immunologisches Symposium, 8. und 9. Juni 1977, Zagreb, Jugoslawien). Das entstandene HuIFN-freie Präparat
-11-
OBlGlNAL INSPECTED
wunde mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, durch Affinitätschromatographie mit ConA-Sepharose gereinigt und eingeengt, wobei etwa ein 0,01-proz. (Gewicht/Volumen-Basis) Konzentrat mit hochreinem TNF in einer Ausbeute von etwa 30 ml/Hamster erhalten wurde. Das TNF wurde dadurch charakterisiert, daß es hämorrhagische Nekrose auf MethA-Sarkom verursachte, normale Zellen jedoch nicht beeinträchtigte. Das so erhaltene TNF war ein Glycoprotein mit einer spezifischen Aktivität von etwa 3,5x10 U/mg Protein, das frei vom verwendeten Induktor war.
Die TNF-Aktivität wurde in herkömmlicher Weise bestimmt und zwar gemäß E. Pick, Lymphokines, Bd. 2, Seiten 235 272, Tumor Necrosis Factors, Academic Press, Inc. (1981): Nachdem man eine vorgegebene Zeit eine L-929-Zellkultur (TNF-empfindliche Normalzellinie) TNF-Verdünnungen ausgesetzt hatte, wurden die restlichen behandelten Zellen gezählt .
2 B: Vergleich der Stabilisierungswirkung verschiedener Stabilisatoren auf TNF
Gemäß Versuch 1 B wurden 0,5 ml gemäß Versuch 2 A hergestelltes TNF-Konzentrat und 1 ml wässerige Stabilisatorlösung in eine Glasampulle eingebracht, gefriergetrocknet und gelagert. Das Retentionsverhältnis (%) wurde bestimmt, die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Die Ergebnisse bestätigen, daß die Trockenfeststoffe, die als Stabilisator Polysaccharide, wie Pullulan oder Elsinan, enthalten, eine ausgezeichnete TNF-Stabilität und Löslichkeit in Wasser aufweisen und deshalb leicht zu handhaben sind .
-12-
Tabelle II
Stabilisator *
Löslichkeit in Salzlösung
Retentionsverhaltnis {%)
37°C
Bemerkung
_ ** leicht löslich 43.8 0 Kontrolle
Phosphatpuffer *** leicht löslich 46.2 6.7 ,Kontrolle
Maltose' leicht löslich 62.5 22.3 Kontrolle
ß-Cyclodextrin leicht löslich 60.3 25.7 Kontrolle
HSA löslich 76.1 40.9 Kontrolle
Amylopektin löslich 64.3 41.7 Kontrolle
Hydroxyethylstarke leicht löslich 70.9 36.9 Kontrolle
Dextran leicht löslich 78.2 43.6 Kontrolle
Tabelle II (Fortsetzung)
Stabilisator *
Löslichkeit in SaI/1ösunn
Retentionsverhältnis (%)
4°C
37°C
Bemerkung
Pullulan leicht löslich 100.0 99.4 erfindungsgemäß
Elsinan leicht löslich 100.0 98.2 erfindungsgemäß
Gummi arabicum leicht löslich 63.8 28.6 Kontrolle
Tragantgumm i leicht löslich 70.4 30.1 KontrolIe
Carrageenan leicht löslich 62.6 25.2 KontrolIe
Agar kaum löslich 25.1 10.5 Kontrolle
Pektin leicht löslich 28.8 16.3 kontrolle
* wenn nichts anderes angegeben, 0,5-proz. Stabilisators
** nur entionisiertes Wasser *** 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,2
(Gewicht/Volumen-Basis) wässerige Lösung des jeweiligen
CO cn KJ CD K) K) CO
47-
Versuch 3: Polysaccharidverhältnis
Die stabilisierende Wirkung auf die proteinartigen bioaktiven Substanzen wurde mit verschiedenen Polysaccharid-Gewichtsverhältnissen untersucht: 0,5 ml gemäß Versuch 1 A erhaltenes HuIFN-Konzentrat oder 0,5 ml gemäß Versuch 2 A erhaltenes TNF-Konzentrat wurden in eine Glasampulle eingebracht zusammen mit Pullulan oder Elsinan in einer solchen Konzentration, daß ein Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger Substanz von 0, 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10,0 oder 100,0, bezogen auf die Trockenfeststoffe, entstand. Es wurde vermischt, entsprechend Versuch 1 B gefriergetrocknet und bei 37 C 1 Monat gelagert, dann wurden die Retentionsverhältnisse (%) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben, alle Trockenfeststoffe lösten sich leicht in Salzlösung.
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, beträgt das Gewichtsverhältnis, das eine proteinartige bioaktive Substanz wirkungsvoll stabilisiert, 0,5 oder darüber und vorzugsweise 1,0 oder darüber, bezogen auf die Trockenfeststoffe.
-15-ORJQINAL INSPECTED
Ml
Polysaccharid
Gew.-Verh.
zu Protein
(fach) HuIFN-Retention
TNF-Retention
Pullulan
0.01 12.3 0
0.1 34.5 28.4
0.5 87.2 83.5
1.0 94.6 89.9
5.0 98.3 96.2
10.0 100.0 97.8
100.0 100.0
99.4
Elsinan
0.01 10.5 0
0.1 27.7 21.2
0.5 83.5 81.6
1.0 91.6 87.3
5.0 96.1 93.7
10.0 97.7 96.5
100.0 98.9
98.2
Wie oben beschrieben, ist die erfindungsgemäße Trockenfeststoff zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie in Wasser leicht löslich ist und die Aktivität einer proteinartigen' bioaktiven Substanz über lange Zeit unter strengen Bedingungen, z.B. Raumtemperatur, beständig behält. Im Gegensatz zu herkömmlichen Stabilisatoren, wie HSA, verursacht das erfindungsgemäß verwendete Polysaccharid keine Infektionskrankheiten beim Menschen und verschleiert nicht die spezifische Aktivität der Substanz, die für die Bestimmung des Reinheitsgrades verwendet wird, bzw. wenn ihr Reinheitsgrad bestimmt wird.
Daher kann die erfindungsgemäße Trockenfeststoffzusammensetzung günstigerweise für Testreagenzien, Injektionen und Arzneipräparate zur inneren und äußeren Verabreichung verwendet werden, um Humanerkrankungen zu verhindern und/ oder zu behandeln.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Humaninterferon (HuIFN)
Ein Konzentrat, das gereinigtes HuIFN enthielt und gemäß Versuch 1 A erhalten wurde, wurde mit einer wässerigen Lösung versetzt, die 100 Teile (bezogen auf das Gewicht des festen Hu-IFN) eines gereinigten Pullulans enthielt, unter sterilen Bedingungen filtriert, in 2 ml-Glasampullen zu einem HuIFN-Gehi
gefriergetrocknet.
zu einem HuIFN-Gehalt von 3x10 U/Ampulle verteilt und
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb geeig net für Testreagenzien sowie für intramuskuläre oder intravenöse Injektionen.
-17-
ΙΟ 3520223
Beispiel 2 Tumornekrosefaktor (TNF)
Ein Konzentrat, das gereinigtes TNF enthielt und gemäß Versuch 2 A erhalten wurde, wurde mit einer wässerigen Lösung versetzt, die 200 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen TNF, eines gereinigten Pullulans enthielt, unter sterilen Bedingungen filtriert, in 2 ml-Glasampullen zu einem TNF-Gehalt von 2.000 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet .
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb geeignet für Testreagenzien sowie für intramuskuläre oder intravenöse Injektionen.
Beispiel 3 Lymphotoxin (LT)
Nichtadsorbierte Fraktionen von einer Säule mit immobilisiertem Anti-HuIFN-Antikörper, die gemäß Versuch 1 A erhalten wurden, wurden durch Affinitätschromatographie mit Phytohämagglutinin-Sepharose gereinigt und mit einer Membran konzentriert. Das Konzentrat, das hochreines LT enthielt, wurde mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 50 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen LT, Elsinan enthielt, in 5 ml-Glasampullen zu einem LT-Gehalt von 1.000 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.
Das Produkt'ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist daher geeignet
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352022G
für z.B. Testreagenzien, Injektionen, als Granulat, Tabletten oder Salbe.
Die LT-Aktivität wurde in herkömmlicher Weise bestimmt (vgl. B.R. Blood & P.R. Glade, In Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity, Academic Press, Inc. (1971)); eine Kultur von Mäuse-L-Zellen wurde mit LT-Verdünnungen in Berührung gebracht, die übrig bleibenden behandelten L-Zellen wurden gezählt.
Beispiel 4
Wachstumshormon (GH)
Acidophile Adenomzellen wurden einem Patienten mit acidophilem Adenom entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und subkutan in erwachsene Nacktmäuse implantiert, die dann 3 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren bildeten und etwa je 10 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit glukosefreiem Earle's 199-Medium, pH 7,2, gewaschen, mit 10 Vol.~% Kälberfötusserum versetzt, in frisch hergestelltem gleichen Kultui— medium, das zusätzlich 30 mM L-Arginin als GH-Induktor ent-
15 hielt, zu einer Zelldichte von etwa 10 /ml suspendiert und zur Induktion der hGH-Bildung bei 37 0C 6h inkubiert. Die Zellen der entstandenen Kultur wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hGH im Überstand wurde bestimmt. Die hGH-Bildung betrug etwa 500 ng/ml Zellsuspension. Der Überstand wurde in herkömmlicher Weise gereinigt und eingeengt, wobei ein hGH-Konzentrat erhalten wurde, das mit einer wässerigen Lösung vermi.scht wurde, die 10.000 Teile, bezogen auf das Gewicht des festen hGH, Pullulan enthielt, in 2 ml-Glasampullen zu einem hGH-Gehalt von 10 ng/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.
ORIGINAL INSPECTED
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb für Testreagenzien oder Injektionen geeignet.
Die hGH-Aktivität wurde durch herkömmliche Radioimmunoversuche gemäß S.M. Gilick et al., Nature, Bd. 199, Seite 784 (1963) bestimmt.
Beispiel 5
Hautwachstumsfaktor (EGF)
Submaxillare Drüsentumorzellen wurden einem Patienten mit submaxillarem Drüsentumor entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und in ein Earle's 199-Medium, pH 7,2, inokuliert und mit 10 Vol.-% Kälberfötusserum zu einer Zelldichte
5
von etwa 1x10 Zellen/ml versetzt. Die Tumorzellen wurden bei 37 0C in einem geschlossenen System 1 Woche kultiviert, wobei das Kulturmedium periodisch aufgefrischt wurde. Sobald die wachsenden Zellen eine Monoschicht gebildet hatten, wurde die Kultur in Salzlösung, die ein Phosphat und Trypsin enthielt, gewaschen. Die proliferierten Zellen wurden in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium zu einer Zelldich-
5 ο
te von etwa 1x10 Zellen/ml suspendiert und bei 37 C und einem pH-Wert von 7,2 eine weitere Woche in Suspension kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Ultraschall aufgebrochen, das hEGF im Überstand wurde bestimmt. Die hEGF-Bildung betrug etwa 1,3,ug/rnl Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstands in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hEGF-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 200 Teile, bezogen auf das Gewicht des -festen hEGF, Elsinan enthielt, in 5 ml-Glasampullen zu einem hEGF-Gehalt von 0,5 .ug/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.
-20-
IM3PECTED
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb für beispielsweise Testreagenzien, Injektionen, Granulat, Tabletten oder Suppositorien geeignet.
Die hEGF-Aktivität wurde durch herkömmliche Radiorezeptorversuche gemäß R.L. Ladda et al., Analytical Chemistry, Bd. 93, Seiten 286 - 294 (1979) bestimmt.
Beispiel 6 Hautwachstumsfaktor (EPO)
Humannierentumorzellen wurden einem Patienten mit Nierentumor entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und in einer Flasche, die Namalwa (Human-Lymphoblastoid-Zellinie) und eine Salzlösung mit 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mto NaH PO.
3 und 2 mM CaCIp enthielt, zu einer Zelldichte von etwa Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde unter . Eiskühlung zu einem frischen Präparat der gleichen Salzlösung gegeben, die jedoch noch durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Sendai-Virus enthielt; nach 5 min wurde die Zellsuspension zur Zellfusion etwa 30 min in einen 37 C warmen Inkubator eingebracht. Auf diese Weise wurde das Bildungsvermögen von hEPO in die Namalwa-Zellen eingeführt. Die Namalwa-Zellen wurden intraperitoneal erwachsenen Nacktmäusen implantiert, die in herkömmlicher Weise 5 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich subkutan bei den Tieren gebildet hatten und etwa je 15 g wogen, wurden extrahiert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit Earle's 199-Medium, pH 7,2, gewaschen, mit 10 Vo1.-% Kälberfötusserum zu einer Zelldichte von etwa 10 Zellen/ml versetzt und bei 37 0C h unter einem verminderten Druck von 931 Pa (700 mmHg)
-21-OBlGlNAL
inkubiert, um die hEPO-Bildung zu induzieren. Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hEPO im Überstand wurde bestimmt. Die hEPO-Bildung betrug etwa 170 U/ml Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstands in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hEPO-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 500 Teile Pullulan, bezogen auf das Gewicht des festen hEPO, enthielt, in 5 ml-Glasampullen zu einem hEPO-Gehalt von 10 U/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil und löst sich leicht in Wasser. Es ist deshalb für Testreagenzien oder Injektionen geeignet.
Die hEPO-Aktivität wurde durch herkömmliche Bioversuche
59
durch Fe-Aufnahme bestimmt (vgl. P.M. Cotes und D.R. Bangham, Nature, Nr. 4793, Seiten 1065 - 1067 (1961)). Eine Einheit (U) der hEPO-Aktivität entspricht 1/10 der hEPO-Aktivität einer von der WHO verteilten Ampulle.
Beispiel 7
Schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH)
Basophile Humanadenornzellen wurden einem Patienten mit basophilem Adenom entnommen, zerkleinert, aufgebrochen und mit Namalwa-Zellen in einer Salzlösung, die 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM NaH3PO und 2mM CaCIp enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10 Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde unter Eiskühlung mit einem frischen Präparat der gleichen Salzlösung versetzt, die jedoch noch durch UV-Bestrahlung vorher inaktiviertes Sendai-Virus enthielt. Nach 5 min wurde die Zellsuspension zur Zellfusion etwa 30 min in einen 37 °C warmen Inkubator eingebracht.
CO
Auf diese Weise wurde das Bildungsvermogen von hTSH in die Namalwa- Zellen eingeführt. Die Namalwa-Zellen wurden intraperitorieal erwachsenen Nacktmäusen implantiert, die in herkömmlicher Weise 5 Wochen gefüttert wurden. Die Tumormassen, die sich bei den Tieren gebildet hatten und die je etwa 15 g wogen, wurden extrahiert, zerkleinert und in Trypsin enthaltender Salzlösung aufgebrochen. Die so erhaltenen Zellen wurden mit Earle's 199-Medium, pH 7,2, gewaschen, mit 10 Vol.-% Kälberfötusserum versetzt, in frisch hergestelltem gleichen Kulturmedium, das außerdem 30 mM L-Arginin
5 als TSH-Induktor enthielt, zu einer Zelldichte von etwa 10 Zellen/ml suspendiert und bei 37 G 35 h inkubiert, um die hTSH-Bildung zu induzieren. Die Zellen wurden mit Ultraschall aufgebrochen, das hTSH im Überstand wurde bestimmt. Die hTSH-Bildung betrug etwa 180 mlU/ml Zellsuspension. Nach der Reinigung und Einengung des Überstands in herkömmlicher Weise wurde das entstandene hTSH-Konzentrat mit einer wässerigen Lösung vermischt, die 100 Teile Elsinan, bezogen auf das Gewicht des festen hTSH, enthielt, in 5 ml-Glasampullen zu einem hTSH-Gehalt von 10 mlU/Ampulle verteilt und gefriergetrocknet.
Das Produkt ist sogar bei Raumtemperatur über längere Zeit stabil. Es ist daher für Testreagenzien oder Injektionen geeignet.
Die hTSH-Aktivität wurde mit herkömmlichen Radiorezeptorversuchen gemäß S.W. Manley et al., Journal of Endocrinology, Bd. 61, Seiten 419 - 436 (1974) bestimmt und in Internationalen Einheiten (IU) gemäß der vom National Institute for Medical Research, England, verteilten hTSH-Standardprobe angegeben.
Die Beschreibung erläutert bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung; dem Fachmann ist klar, daß Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.

Claims (13)

Patentansprüche:
1. Wasserlösliche Trockenfeststoffzusammensetzung, gekennzeichnet durch eine proteinartige bioaktive Substanz und ein im wesentlichen aus sich wiederholenden Maltotriose-Einheiten bestehendes Polysaccharid.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz mindestens 0,5, bezogen auf die Trockenfeststoffe, beträgt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet , daß die proteinartige bioaktive Substanz ein Lymphokin oder Peptidhormon ist.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Pullulan, El'sinan, eines ihrer Teilhydrolysate oder eine Mischung davon ist.
ORIGINAL INSPECTED
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des Polysaccharids von 10.000 bis 10.000.000 Dalton beträgt.
6. Verfahren zur Herstellung der wasserlöslichen Trockenfeststoff zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, g e k e η η ζ e i c h η e t durch die Gewinnung einer wässerigen Lösung, die die proteinartige bioaktive Substanz und das Polysaccharid enthält, und Trocknen dieser wässerigen Lösung.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu proteinartiger bioaktiver Substanz von mindestens 0,5, bezogen auf die Trockenfeststoffe, vorsieht.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß als proteinartige bioaktive Subtanz ein Lymphokin oder Peptidhormon eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß als Polysaccharid Pullulan, Elsinan, eines ihrer Teilhydrolysate oder eine Mischung davon verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß ein Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 10.000.000 Dalton verwendet wird.
-3-
- 3 - 3520220
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daf3 die wässerige Lösung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 30 C getrocknet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die wässerige Lösung gefriergetrocknet wird.
13. Pharmazeutisches Präparat, gekennzeichnet durch eine Trockenfeststoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Wirkstoff in Kombination mit üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.
IMSFECTED
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