DE69417397T2

DE69417397T2 - Lösung, die igf-1 enthält

Info

Publication number: DE69417397T2
Application number: DE69417397T
Authority: DE
Inventors: Ebba Florin-Robertsson; Jonas Fransson; Diane Moore
Original assignee: Pharmacia and Upjohn AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-10
Publication date: 1999-09-09
Anticipated expiration: 2014-01-11
Also published as: AU5893994A; GR3030383T3; JPH08505617A; ATE177942T1; SE9300105D0; EP0679079B1; JP3580816B2; US5783559A; ES2131673T3; NZ259951A; EP0679079A1; DK0679079T3; WO1994015584A1; AU676882B2; DE69417397D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Lösung, enthaltend einen insulinartigen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) in einem Phosphat-Puffer, in einer Menge von 50 mmol oder darunter, was zu einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 führt, der isotonisch und zur Injektion geeignet ist.

Einleitung

Insulinartiger Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) ist ein in Plasma und anderen Körperflüssigkeiten sowie vielen Zellen/Geweben vorhandenes Peptid. Es umfaßt 70 Aminosäuren, einschließlich 3 Disulfidbindungen, und kann die Proliferation eines weiten Bereichs von Zellarten stimulieren, und es vermittelt einige der Wirkungen von Wachstumshormon. Human IGF-1 ist aus Plasma gereinigt worden, und seine vollständige Aminosäure-Sequenz ist sichergestellt. (Rinderknecht E. et al. "The amino acid sequence of human insulin-like growth factor 1 and its structural homology with proinsulin", J. Biol. Chem. 253; 2769-76, 1978). Sequenzen mit extensiven Homologien zu Human IGF-1 sind in IGF-1 vorhanden, das von Plasma von anderen Arten gereinigt worden ist.
Es besitzt sowohl systemische als auch lokale Wirkungen und scheint überwiegend mit unterschiedlichen spezifischen Bindungsproteinen assoziiert zu sein, von denen von vier die Sequenz ermittelt ist und die als IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3 und IGFBP4 bezeichnet werden. Diese scheinen die biologischen Funktionen und die Verfügbarkeit von IGF-1 sowohl in positiver als auch in negativer Weise zu modulieren. Analoge mit veränderten Affinitäten zu Bindungsproteinen sind erzeugt worden, und Veränderungen von biologischen Aktivitäten, die mit einer Sequenzvariation zusammenhängen, haben sich gezeigt. IGF-1 scheint hauptsächlich durch Wechselwirkung mit dem IGF-Typ 1-Rezeptor, der an der Außenoberfläche von Plasma-Membranen in vielen unterschiedlichen Zellarten freiliegt, zu wirken. Eine Bindung vom IGF-Typ 2 und von Insulin-Rezeptoren scheint jedoch auch von Bedeutung zu sein.
Aufgrund der Seltenheit von gereinigtem Plasma IGF-1, bestand stark die Notwendigkeit, eine Methode zur kommerziellen Herstellung von IGF-1 zu entwickeln. Heutzutage kann eine solche Produktion in großem Maßstab leicht unter Anwendung von Rekombinations- DNA-Techniken erreicht werden.
Als Ergebnis von Untersuchungen an Präparaten von Rekombinations-DNA-IGF-1 hat es sich gezeigt, daß es das Skelettwachstum und die Skelettmuskel-Proteinsynthese fördert. Es wurde gezeigt, daß IGF-1 sowohl als endokriner Faktor als auch als parakriner/autokriner Faktor wirkt (Skottner et al., Endocrinology, Bd. 124, Nr. 5, 1989 und Cook et al., J. Clin. Invest. 81, 206-212, 1988).
Darüberhinaus ist IGF-1 auch wirksam zur Behandlung oder Verhütung von katabolischen Zuständen bei Patienten (schwedische Patentanmeldung SE 9 002 731-9) und verbessert die Regenerierung von durchtrennten peripheren Nerven (EP-0 308 386).
Es ist früher in vitro gezeigt worden, daß IGF-1 auch die Aktinsynthese in Myozyten in Kulturen fördern kann (Florini, J. R., Muscle and Nerve 10 (1987), 577-598) und in vitro die Kontraktilität von neonatalen Ratten-Kardiozyten (Vetter, U. et al., Basic Res., Cardiol. 83 (1988) 647-654).
Die Stabilität von Proteinen ist allgemein ein Problem in der pharmazeutischen Industrie.
Eine Zubereitung mit einem geringen Gehalt an Protein verliert im allgemeinen ihre Wirksamkeit während der Reinigung, sterilen Herstellung, Lagerung und während der Verabreichung.
Es ist häufig gelöst worden durch Trocknen des Proteins in unterschiedlichen Trocknungsverfahren, wie Gefriertrocknen. Das Protein ist anschließend in getrockneter Form verteilt und gelagert worden. Der Patient muß notwendigerweise das getrocknete Protein in einem Lösungsmittel vor der Anwendung rekonstituieren, was natürlich ein Nachteil ist und eine Unbequemlichkeit für den Patienten darstellt.
Für einen Patienten, der täglich Injektionen von IGF-1 braucht, und besonders wenn der Patient ein Kind ist, ist es von Bedeutung, daß das Produkt leicht zu handhaben, zu dosieren und zu injizieren ist. Die Rekonstitution eines gefriergetrockneten Produktes erfordert Vorsicht und Sorgfalt und sollte daher vorzugsweise vermieden werden.
Das Gefrier-Trocknungsverfahren ist auch eine kostspielige und zeitaufwendiger Verfahrensstufe, und es wäre von großem Vorteil, wenn diese Stufe vermieden werden könnte bei der Herstellung eines kommerziellen Produktes eines Proteins.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, Humanalbumin, das allgemein den Aktivitätsverlust des aktiven Proteins wesentlich verringert, zuzusetzen. Wenn das Protein gefriergetrocknet ist, wirkt Humanalbumin als ein allgemeiner Stabilisatoren während der Reinigung, sterilen Herstellung und dem Gefriertrocknen. Es ist jedoch nicht erwünscht, irgendeine Sub stanz, die von Blut abgeleitet ist, zuzusetzen aufgrund der Gefahr von Viruskontaminationen von Plasma, soweit es nicht absolut notwendig ist.
Es würde die Verwendung eines pharmazeutischen Proteins erleichtern, wenn es als stabile Lösung mit verlängerter Lagerstabilität für den Patienten hergestellt und in den Handel gebracht werden könnte, der das Medikament direkt, ohne es zu rekonstituieren, injizieren könnte.
Es sind verschiedene Lösungen zur Stabilisierung von unterschiedlichen Proteinen vorgeschlagen worden:
Die EP-35 204 (Cutter) beschreibt ein Verfahren, um einem Proteinmittel in Gegenwart eines Polyols thermische Stabilität zu verleihen.
Die EP-381 345 (Corint) beschreibt eine wäßrige Flüssigkeit eines Peptids, Desmopressin, in Gegenwart von Carboxymethylcellulose.
In der WO 89/09614 (Gentech) ist eine stabilisierte Zubereitung von Human-Wachstumshormon, enthaltend Glycin, Mannit, gegebenenfalls ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und einen Puffer für pH 4-8, angegeben. Das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel wird zugesetzt, um die Aggregation und Denaturierung zu verringern. Die Zubereitung besitzt eine erhöhte Stabilität in lyophilisierter Form und als Lösung, die nach dem Rekonstituieren erhalten wird.
Die EP-303 746 (International Minerals and Chemical Corporation) beschreibt Wachstumshormon (GH), das in wäßriger Umgebung stabilisiert ist durch Vermischen des Wachstumshormons mit Polyol, Aminosäure, Polymer von Aminosäure oder Cholin-Derivat.
Die US-4 165 370 (Coval) beschreibt eine γ-Globulin-Lösung und ein Verfahren zu deren Herstellung. Die Lösung enthält Polyethylenglykol (PEG).
In der EP-77 870 (Green Cross) ist der Zusatz von Aminosäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden oder Zuckeralkoholen oder Kohlenwasserstoff-Carbonsäuren zur Verbesserung der Stabilität einer Faktor VIII-enthaltenden Lösung angegeben.
Die EP-440 989 (Fujisawa) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Mittels von IGF-1, umfassend das Trocknen einer Lösung, enthaltend IGF-1 zusammen mit einer starken Säure.
IGF-1 in einem Citrat-Puffer bei pH 6 ist aus der WO 91/18621, Gentech, bekannt. Bezüglich der Stabilität von IGF-1 ist nichts erwähnt.
Proteine sind verschieden in Bezug auf die physiologischen Eigenschaften. Bei der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, das physiologisch annehmbar und während einer lan gen Zeit stabil sein sollte, kann nicht nur auf die physiologischen Eigenschaften des Proteins geachtet werden, sondern es müssen auch andere Aspekte berücksichtigt werden, wie die industrielle Herstellung, die Leichtigkeit der Handhabung für den Patienten und die Sicherheit für den Patienten. Die Ergebnisse dieser Aspekte sind nicht voraussehbar, wenn unterschiedliche Zubereitungen untersucht werden, und jedes Protein hat häufig eine einzigartige Lösung bezüglich der Stabilität.
Es würde die Verwendung von IGF-1 erleichtern, wenn das Protein als Lösung für den Patienten hergestellt und vertrieben werden könnte, der das Medikament direkt, ohne es zu rekonstruieren, injizieren könnte. Die Lösung muß über mindestens zwei Jahre stabil sein, und es wäre vorteilhaft, wenn die endgültige pharmazeutische Lösung nur ein Minimum an Additiven, wie Zuckern, Tensiden usw., enthalten würde.
Bei Lösungen, die zur subkutanen Injektion vorgesehen sind, kann Schmerz ein Problem darstellen, besonders wenn der pH-Wert der Lösung von dem physiologischen pH-Wert abweicht. Aus Stabilitätsgründen für die aktive Substanz kann es noch erforderlich sein, einen pH-Wert zu wählen, der von dem physiologischen pH-Wert abweicht. Für eine solche Lösung wäre ein Mittel zur Vermeidung des Schmerzes bei der Injektion sehr wichtig, besonders wenn das Arzneimittel regelmäßig über mehrere Jahre injiziert werden muß, z. B. IGF-1.
Der pH-Wert ist von Bedeutung, und normalerweise wird ein pH-Wert von 7 für Lösungen ausgewählt, die injiziert werden müssen, und das ist der physiologische pH-Wert. Subkutane Injektionen von Zubereitungen mit pH 6 führen häufig zu Schmerzen. Es ist bekannt (J. C. Fleishaker et al., J. Clin. Pharmacol. 1993: 33, 182-190), daß eine Salzlösung zu weniger Schmerz führt als Citrat-Puffer oder ein ein Arzneimittel enthaltender Citrat-Puffer (hier Tiralazad Mesylate). L. A. M. Frenken et al., in BMJ Bd. 303, 3. Aug. 1991 berichten über eine Studie, die zeigte, daß EPO in einem Puffer von Albumin und Citrat zu stärkerem Schmerz führte als EPO in Phosphat-Puffer bei dem gleichen pH-Wert.
Das Problem, eine stabile Lösung für IGF-1 zu finden, die, wenn sie injiziert wird, nicht zu Schmerz führt, ist noch nicht gelöst.
Es hat sich jetzt gezeigt, daß der Schmerz deutlich verringert wird, wenn eine erfindungsgemäße Lösung verwendet wird.
Es ist tatsächlich so, daß das Schmerzgefühl das gleiche ist, wie wenn eine isotonische wäßrige Natriumchlorid-Lösung subkutan injiziert wird.
Es wurde so eine neue Zubereitung gefunden, die die oben erwähnte Probleme löst.
Es hat sich gezeigt, daß die Stabilität von IGF-1 in Lösung bei pH 7 nicht so gut ist, aber pH 6 zu einer besseren Stabilität führt. Für die Lagerung bei Raumtemperatur ist die Auswahl des pH-Wertes wichtiger als bei 5ºC, und der pH-Wert muß weniger als 7 betragen.
Es hat sich auch gezeigt, daß die Stabilität unter Verwendung von Citrat oder Phosphat als Puffer die gleiche ist. Vergleiche Beispiele 5 und 6. In der vorliegenden Schmerzstudie (Beispiel 10) wird gezeigt, daß pH 7 zu geringerem Schmerz führt (wie erwartet), aber die Stabilitätsstudien zeigen, daß die Stabilität bei pH 7 nicht gut genug ist. Durch Anwendung von pH 6 und einer Weinen Menge von Puffer (unter 50 mmol) ist der Schmerz ebenso gering, wie unter Anwendung von pH 7. Das ist eine überraschende Feststellung.
Da es bekannt ist, daß Citrat-Puffer zu Schmerz führen kann, wenn er injiziert wird, wurde Phosphat als bevorzugter Puffer ausgewählt und dadurch ein neues Mittel entwickelt, das bei 5ºC über 24 Monate stabil ist, und das nicht zu Schmerz bei den Patienten führt und das eine bessere Stabilität bei 30ºC besitzt als erwartet.
Eine stabile Lösung von IGF-1, die nur einen Puffer und ein Salz, um Isotonie zu erzeugen, enthält, ist nicht bekannt, und es muß bei Studium des Standes der Technik als überraschend angesehen werden, daß eine Lösung über zwei Jahre stabil ist, ohne irgendwelche anderen zusätzlichen Komponenten, und auch von dem Patienten gut vertragen wird.

Die folgenden Figuren sind beigefügt.

Fig. 1a und 1b. Prozent der verbliebenen Konzentration an IGF-1 bei unterschiedlichen pH-Werten nach Lagerung bei 5ºC bzw. 30ºC während 10 Wochen. Beispiel 3
Fig. 2a und 2b. Prozent der verbliebenen Konzentration an IGF-1 bei unterschiedlichen pH-Werten nach Lagerung bei 5ºC bzw. 30ºC während 5 Monaten. Beispiel 4

Die Erfindung

Die Erfindung betrifft eine stabile Lösung, enthaltend IGF-1 oder irgendein funktionelles Analoges davon und einen Phosphat-Puffer in einer Menge von 50 mmol/l oder weniger, was einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5, vorzugsweise 5,7 bis 6,2, in einer isotonischen Lösung zur Injektion ergibt.
Die beanspruchte Lösung, bei der die Menge an Phosphat-Puffer 5 bis 20 mmol/l, vorzugsweise etwa 10 mmol/l, beträgt, führt zu verringertem Schmerz bei subkutaner Injektion, im Vergleich mit einem Mittel, das eine höhere Phosphatmenge enthält.
Die beanspruchte Lösung hat eine verbleibende Aktivität von mindestens 90% des restlichen ursprünglichen Wertes nach +5±3ºC-Lagerung während 24 Monaten.
Die Lösung könnte IGF-1, einen Puffer und ein isotonisches Mittel, und gegebenenfalls ein Konservierungsmittel, enthalten. Es besteht somit kein Bedarf an anderen Stabilisierungsmitteln.
Die Menge an Phosphat-Puffer ist normalerweise eine Menge von 5 bis 50 mmol/l, vorzugsweise 5 bis 20 mmol/l und insbesondere etwa 10 mmol/l.
Die Lösung enthält vorzugsweise 10 mmol/l Natriumphosphat-Puffer, und der pH-Wert beträgt 5,7 bis 6,2.
Die Lösung sollte isotonisch sein, was leicht durch irgendeines von verschiedenen dem Fachmann bekannten Exzipientien erreicht werden kann. Zum Beispiel können NaCl, Glycin, Mannit, Glycerin und/oder andere Kohlenhydrate zugesetzt werden. Benzylalkohol kann als Konservierungsmittel gewählt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Zubereitung durch Vermischen von IGF-1 oder irgendeinem funktionellen Analogen davon mit einer Phosphat- Puffersubstanz, die einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 ergibt, und einem isotonischen Mittel und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel.
Unter insulinartigem Wachstumsfaktor (IGF-1) sind sowohl natürlich vorkommende Mensch- und Tier-IGF-1 als auch Rekombinations-IGF-1 (rIGF-1), wie rhIGF-1 (Mensch), rbIGF-1 (Rinder) und rpIGF-I (Schwein), zu verstehen. Unter funktionellen Analogen sind Verbindungen zu verstehen, die die gleiche therapeutische Wirkung wie IGF-1 bei Tieren und Menschen zeigen.
Die Konzentration von IGF-1 hängt nur ab von seiner Löslichkeit in dem angewandten Puffer und der erwünschten therapeutischen Menge für die gewünschte Dosis. Vorzugsweise beträgt die Konzentration an IGF-1 1 bis 100 mg/ml, insbesondere 1 bis 20 mg/ml.

Beispiele

Das in den Versuchen verwendete Rekombinations-Human-IGF-1 (rhIGF-1) wurde in Hefe gebildet. rhIGF-1 wurde zunächst als ein Hybrid-Protein synthetisiert, das mit dem α- Paarungsfaktor pre-pro-leader-Peptid verschmolzen war. Nach der Expression wurde das primäre Translationsprodukt aus der Zelle ausgeschieden. Während dieses Prozesses wurde der pre-pro-leader abgespalten. Korrekt verarbeitetes und ausgeschiedenes rhIGF-1 konnte dann in nativer Form von dem Fermentationsmedium isoliert werden.
Das Medium mit rhIGF-1 wurde dann mikrofiltriert, und Verunreinigungen wurden durch verschiedene auf diesem Gebiet bekannte chromatographische Techniken entfernt.
Alle in den Beispielen verwendeten Puffer-Komponenten erfüllen die in Ph. Eur. 2. Auflage beschriebenen Erfordernisse.
In den Beispielen 1, 2, 5 und 8 wurden lyophilisierte IGF-1-Pools aus der Endstufe des Reinigungsverfahrens in dem Zubereitungs-Puffer gelöst und über eine Sephadex G-50-Säule chromatographiert.
In den Beispielen 3 und 4 wurden lyophilisierte IGF-1-Pools aus der Endstufe des Reinigungsverfahrens in dem Zubereitungs-Puffer gelöst.
In den Beispielen 6, 7 und 9 wurden Lösungen von IGF-1-Pools aus der Endstufe des Reinigungsverfahrens ultrafiltriert, um eine korrekte Konzentration und die korrekte Puffer- Zubereitung zu erhalten.
Die Proben wurden bei +5±3ºC oder +30±3ºC gelagert.
Die folgenden analytischen Techniken wurden in allen Beispielen angewandt:
Phasenumkehr-HPLC (RP-HPLC). Das Elutionssystem besteht aus Acetonitril, Wasser, Phosphat-Puffer und Propansulfonsäurenatriumsalz. Die Elution wird durchgeführt durch Verringerung der Polarität der mobilen Phase. UV-Nachweis bei 220 nm. Angewandt zur Messung der Konzentration und Reinheit von IGF-1.
SDS-PAGE. Protein-Zubereitungen von IGF-1 wurden durch Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert, um negativ geladene Komplexe von Protein-SDS zu erhalten. Die Proben wurden mit 2-Mercaptoethanol reduziert. Eine Trennung wurde entsprechend der Molekulargröße erreicht durch Elektrophorese in Polyacrylamid-Gelen (PAGE) in Gegenwart von SDS. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Gel fixiert und mit Silber angefärbt. Die Bewertung des Gels wurde halb-quantitativ und qualitativ durchgeführt durch Vergleich der Proben mit Standard- und Bezugsgrößen. Angewandt zum Nachweis von IGF-1-Dimeren, -Polymeren oder -Fragmenten.
RRA. Radiorezeptor-Assay wurde durchgeführt im wesentlichen entsprechend K. Hall et al., J. Clin. Endocrin. Metab. 39, 973-76 (1974). Rohe Membran-Fraktionen wurden aus menschlicher Plazenta hergestellt. Die Inkubation wird bei +4ºC durchgeführt. Nach der Inkubation wird RRA-Puffer zu den Röhrchen zugegeben, die zentrifugiert werden.
Alle Röhrchen werden in einem γ-Zähler gezählt. Gebundene/Gesamt-Radioaktivität wird berechnet sowie gebundene/gesamte gebundene Radioaktivität. Die Standardkurve wird aufgestellt und die Konzentration an IGF-1 in den unbekannten Proben wird berechnet.
Die pH-Messung wurde, wie in Ph. Eur. 2. Auflage angegeben, durchgeführt.
Die Zubereitungen der Bezugsproben für die Beispiele 3 und 4 wurden bei -70ºC aufbewahrt und wenn die Analyse durchgeführt wurde, aufgetaut.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Ergebnisse einer Stabilitätsuntersuchung einer Lösung, die bei +5ºC und bei +30ºC aufbewahrt worden war.
Zusammensetzung pro ml:
IGF-1 1 mg
Natriumdihydrogenphosphat 5,25 mg
Dinatriumphosphat 0,89 mg
Natriumchlorid 6,43 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
PH 5,9
Diese Zusammensetzung ergibt eine Konzentration von 1 mg/ml IGF-1 in 50 mmol/l Natriumphosphat-Puffer und einen pH-Wert von 6, mit 10 mmol/l Natriumchlorid als Mittel zur Einstellung der Tonizität.
4 ml dieser Lösung wurden in eine sterile 5 ml Glasampulle gefüllt.
Alle Proben wurden vor Licht geschützt gelagert und nach 12 und 24 Monaten bei +5±3ºC und nach 3 und 12 Monaten bei +30±3ºC untersucht.
Ergebnisse. Die Ergebnisse nach der Lagerung bei +5ºC und +30ºC sind in den Tabellen 1a bzw. 1b angegeben. Tabelle 1a 1mg/ml IGF-1, gelagert bei +5ºC Tabelle 1b 1mg/ml IGF-1, gelagert bei +30ºC

RP-HPLC

Nach 24 Monate langer Lagerung bei +5ºC verblieben 94% der ursprünglichen Konzentration.
Bei +30ºC verblieben nach 3 Monaten 86% IGF-1.

Schlußfolgerung

Diese Untersuchung zeigt, daß die 24 Monate lange Lagerung bei +5ºC die Qualität des Produktes nicht stark beeinflußt.

Beispiel 2

Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Stabilität von IGF-1, das in wäßriger Lösung mit 10 oder 50 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 6, zubereitet war, zu vergleichen.

Zusammensetzung 2A:

1 ml enthält:
IGF-1 2 mg
Natriumdihydrogenphosphat 5,25 mg
Dinatriumphosphat 0,89 mg
Natriumchlorid 6,43 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 5,9
Die Konzentration des Puffers beträgt 50 mmol/l.

Zusammensetzung 2B:

1 ml enthält:
IGF-1 1,7 mg
Natriumdihydrogenphosphat 1,02 mg
Dinatriumphosphat 0,21 mg
Natriumchlorid 8,48 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 6,0
Die Konzentration des Puffers beträgt 10 mmol/l.

Ergebnisse

Die Analyseergebnisse von IGF-1 in der Zubereitung mit 50 mmol/l Phosphat-Puffer sind in den Tabellen 2a bzw. 2b angegeben, und die Ergebnisse für IGF-1 in 10 mmol/l Phosphat-Puffer sind in den Tabellen 2c bzw. 2d angegeben. Tabelle 2a Zusammensetzung 2A, gelagert bei +5ºC Tabelle 2b Zusammensetzung 2A, gelagert bei +30ºC Tabelle 2c Zusammensetzung 2B, gelagert bei +5ºC Tabelle 2d Zusammensetzung 2B, gelagert bei +30ºC
Aus den Daten in den Tabellen ist zu entnehmen, daß keine deutlichen Unterschiede in der Stabilität von IGF-1 bei den beiden untersuchten Zubereitungen bestanden.
Die Analyse durch SDS-PAGE konnte keinerlei Unterschiede in der Stabilität zwischen den beiden Zubereitungen nachweisen.
Die Puffer-Kapazität eines 10 mmol/l Phosphat-Puffers hat sich als ausreichend erwiesen, um einen stabilen pH-Wert der Zubereitung aufrecht zu erhalten.
Neue klinische Daten haben gezeigt, daß eine Phosphat-Pufferkonzentration von 10 mmol/l von Patienten, die subkutane Injektionen erhalten, besser vertragen wird.

Schlußfolgerung

Die Stabilität von IGF-1, 2 mg/ml, zubereitet in 10 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 6, ist die gleiche wie in 50 mmol/l Phosphat-Puffer.
IGF-1, 2 mg/ml, zubereitet in 10 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 6, erwies sich während 24 Monaten als stabil, wenn es bei +5±3ºC gelagert wurde.

Beispiel 3

Der Zweck dieses Versuchs bestand darin, den Einfluß des pH-Werts auf die Stabilität von IGF-1 in einfachen Puffer-Lösungen zu untersuchen. Die pharmazeutische Verwendung von IGF-1 macht isotonische Lösungen erforderlich, und Natriumchlorid wurde als Tonizitätsmittel ausgewählt. Ein weiter pH-Bereich wurde zum Teil für diesen Versuch ausgewählt, um Veränderungen an den extremen Enden (pH 3 und 9) hervorzurufen, und zum Teil, um den pharmakologischen pH-Bereich, in diesem Falle pH S und 7, abzudecken.
Zum Vergleich wurde IGF-1 in den gleichen Puffer-Lösungen, aber ohne Natriumchlorid, in diese Untersuchung einbezogen. E bis H sind somit nicht isotonisch. Der Grund hierfür bestand darin zu untersuchen, ob das Natriumchlorid die Stabilität von IGF-1 beeinflußt.

Experimentelle Methode

Lösungen, enthaltend 750 ug/ml IGF-1, wurden in den folgenden Puffern hergestellt.
A: 50 mmol/l Natriumcitrat
95 mmol/l Natriumchlorid pH = 3
B: 50 mmol/l Natriumacetat
95 mmol/l Natriumchlorid pH = 5
C: 50 mmol/l Natriumphosphat
95 mmol/l Natriumchlorid pH = 7
D: 50 mmol/l Glycin
95 mmol/l Natriumchlorid pH = 9
E: 50 mmol/l Natriumcitrat pH = 3
F: 50 mol/l Natriumacetat pH = 5
G: 50 mmol/l Natriumphosphat pH = 7
H: 50 mol/l Glycin E pH = 9
Lagerung: 0 (Anfangsproben), 3, 6 und 10 Wochen (Proben A bis D) oder 0 und 10 Wochen (Proben E bis H).
Temperatur: +5ºC und +30ºC.

Ergebnisse

RP-HPLC ergab die in den Fig. 1a und 1b angegebenen Ergebnisse, wobei die Ergebnisse für A, B, C und D bei +5ºC und +30ºC angegeben und als Prozentsatz berechnet sind. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Lösungen E bis H erhalten.
Die Konzentration und RRA-Aktivität von IGF-1 in den Puffern mit Natriumchlorid bei pH 3, 5 und 7 waren bis zu 10 Wochen bei +5ºC stabil. Bei +30ºC war die Konzentration an IGF-1 im Glycin-Puffer (pH = 9) nicht stabil, wenn sie nach drei Wochen untersucht wurde. Bei pH 3, 5 und 7 in den Puffern mit Natriumchlorid war die Konzentration und RRA-Aktivität von IGF-1 leicht verringert bei 10 Wochen langer Lagerung bei +30ºC. Bei pH 9 und einer Lagerung von 10 Wochen bei +30ºC waren die IGF-1-Konzentration, Rezeptoraktivität und immunologische Aktivität stark verringert. Die Lösungen ohne Natriumchlorid waren etwas weniger stabil als ihre isotonischen Entsprechungen nach HPLC und vergleichbar stabil nach RRA.

SDS-PAGE

Veränderungen in der Molekulargrößenverteilung traten auf, wenn IGF-1 in Puffern A und D (pH 3 bzw. 9) 3 Wochen bei +30ºC gelagert wurde, aber in den Puffern B und C (pH 5 bzw. 7) traten keine Veränderungen auf.

Schlußfolgerung

Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigen, daß IGF-1 in Natriumacetat-Puffer, pH 5, und in Natriumphosphat-Puffer, pH 7, stabiler ist als in Natriumcitrat-Puffer, pH 3, oder Glycin- Puffer, pH 9. Die Ergebnisse zeigen auch, daß das Vorhandensein von Natriumchlorid eine leicht positive Wirkung auf die Stabilität von IGF-1 in diesen Puffer-Lösungen ausübt.

Beispiel 4

Entsprechend den Ergebnissen der Untersuchung in Beispiel 3 war IGF-1 bei pH 5 und 7 stabiler als bei pH 3 und 9. Da Zubereitungen mit einem so niedrigen pH-Wert, wie 5, zu Unannehmlichkeiten führen können, wenn sie subkutan oder intramuskulär verabreicht werden, sollte ein pH-Wert über 5 bevorzugt werden, und der pH-Bereich, der für diesen Versuch ausgewählt wurde, betrug pH 6 bis pH 7,5.
Lösungen von Natriumdihydrogenphosphat besitzen eine Pufferkapazität in diesem Bereich und sind geeignet zur parenteralen Injektion, wenn sie isotonisch gemacht sind. Aus diesem Grund wurde Natriumphosphat unter Zusatz von entweder NaCl oder Glycerin zur Erhöhung der Tonizität bei dieser Untersuchung als Puffer verwendet.
Der Grund für diese Vorformulierungsstudie bestand darin zu bestimmen, ob ein optimaler pH-Wert für die Zubereitung von IGF-1 besteht, um eine Bewertung der Stabilität von IGF-1 in diesen Lösungen durchzuführen.

Experimentelle Methode

Gefriergetrocknetes IGF-1 wurde in jeder von fünf Puffer-Lösungen auf eine Konzentration von etwa 1 mg IGF-1/ml gelöst. Die Puffer-Lösungen wurden hergestellt aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumphosphat proportional, um 50 mmol/l, pH 6, 6,5, 7 und 7,5, zu erreichen. Natriumchlorid, 100 mmol/l, wurde zu vier der Lösungen (pH 6 bis 7,5) als Tonizitätsmittel zugesetzt, um die Osmolarität auf etwa 290 mmol/l zu bringen. Zum Vergleich wurde Glycerin, 200 mmol/l, anstelle von Natriumchlorid zu einer Lösung mit pH 7 zugegeben. Die einzelnen Puffer-Zusammensetzungen sind in Tabelle 3 angegeben. Das Volumen jeder Lösung betrug 125 ml. Die fünf IGF-1-Lösungen wurden jeweils durch ein steriles Durapore®-Filter (Millipore, 47 mm Durchmesser, 0,22 um Porengröße) filtriert und unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe (Schuco Peristaltic Filler, Paxall Schubert Machinery Co. A/S) in sterile Glasfläschchen mit einem Volumen von 1 ml/Fläschchen eingefüllt. Die Fläschchen wurden mit sterilen Gummistopfen verschlossen und mit Metallkappen versiegelt. Die gefüllten Fläschchen wurden anschließend gelagert und analysiert. Tabelle 3 Zusammensetzung pro Fläschchen und ph-Wert jedes IGF-1

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den Fig. 2a und 2b gezeigt, die den Prozentsatz des Bezugswertes für IGF-1 entsprechend RP-HPLC angeben.
Nach diesen Ergebnissen bei +30ºC ist IGF-1 in Natriumphosphat-Puffer mit NaCl bei pH 6 stabil und etwas weniger stabil bei pH 6,5 und 7, und deutlich weniger stabil bei pH 7,5. Auch der Zusatz von Glycerin anstelle von NaCl verringert die Stabilität von IGF-1.

Schlußfolgerung

Aus diesem Versuch können zwei Schlußfolgerungen gezogen werden. Erstens ist im Bereich von pH 6 bis 7,5 IGF-1 in isotonischem Natriumphosphat-Puffer (mit NaCl als Tonizitätsmittel) umso stabiler, je niedriger der pH-Wert ist, d. h. die Stabilität nimmt mit höherem pH-Wert ab. Zweitens ist IGF-1 in diesem isotonischen Natriumphosphat-Puffer mit NaCl 6 Monate stabil, wenn es bei +5ºC gelagert wird.

Beispiel 5

Der Zweck dieser Untersuchung lag darin, die Stabilität von IGF-1, 2 mg/ml, in einem Citrat-Puffer mit pH 6 zu untersuchen.
1 ml enthält:
IGF-1 2 mg
Trinatriumcitrat-dihydrat 10,5 mg
Dinatriumcitrat-1,5-hydrat 3,76 mg
Natriumchlorid 4,97 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 6,0
Die Konzentration des Puffers beträgt 50 mmol/l. Ergebnisse Tabelle 4 Stabilitätsdaten für IGF-1

Schlußfolgerung

Es hat sich gezeigt, daß IGF-1, das in einem Citrat-Puffer mit pH 6 formuliert ist, 26 Monate stabil ist, wenn es bei +5ºC gelagert wird.

Beispiel 6

Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Stabilität von IGF-1, 7 mg/ml, in einem 50 mmol/l Phosphat-Puffer bei pH 6 zu untersuchen.
1 ml enthält:
IGF-1 7 mg
Mononatriumphosphat, wasserfrei 5,25 mg
Dinatriumphosphat, wasserfrei 0,89 mg
Natriumchlorid 6,43 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 5,9 Ergebnisse Tabelle 5 Stabilitätsdaten für IGF-1

Schlußfolgerung

Es hat sich gezeigt, daß IGF-1, 7 mg/ml, 18 Monate bei +5ºC stabil war, wenn es in einem Phosphat-Puffer, 50 mmol/l, mit pH 5,9 gelagert wurde.

Beispiel 7

Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Stabilität von IGF-1, 10 mg/ml, in einem 50 mmol/l Phosphat-Puffer bei pH 6 zu untersuchen.
1 ml enthält:
IGF-1 10 mg
Mononatriumphosphat, wasserfrei 1,02 mg
Dinatriumphosphat, wasserfrei 0,21 mg
Natriumchlorid 8,48 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 6,0 Ergebnisse Tabelle 6 Stabilitätsdaten für IGF-1

Schlußfolgerung

Es hat sich gezeigt, daß IGF-1, 10 mg/ml, mindestens 12 Monate bei +5ºC stabil war, wenn es in einem Phosphat-Puffer, 10 mmol/l, mit pH 6 gelagert wurde.

Beispiel 8

Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Stabilität von IGF-1, 1,4 mg/ml, in 50 mM Phosphat-Puffer mit pH 6 und Benzylalkohol als Konservierungsmittel zu untersuchen.

Zubereitung 8a

Zusammensetzung pro ml:
IGF-1 1,4 mg
Mononatriumphosphat 5,25 mg
Dinatriumphosphat 0,89 mg
Natriumchlorid 6,43 mg
Benzylalkohol 11 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 5,9
Es wurde auch eine Bezugsprobe ohne Konservierungsmittel hergestellt, Zubereitung 8b.
Die Kartuschen wurden nach 23 Monate langer Lagerung bei +5±3ºC untersucht.
Die Ergebnisse der Analyse nach der Lagerung sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 2 mg/ml IGF-1, gelagert bei +5ºC während 23 Monaten

Schlußfolgerung

Nach 23-monatiger Lagerung bei +5ºC konnten keine deutlichen Unterschiede in der Konzentration oder Reinheit festgestellt werden. Benzylalkohol beeinträchtigt die Stabilität von IGF-1 nicht. Beide Zubereitungen waren während der untersuchten Zeit stabil.

Beispiel 9

Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, die Stabilität von IGF-1,9 mg/ml, in einem 10 mmol/l Phosphat-Puffer mit pH 6 und Benzylalkohol zu untersuchen.
Zusammensetzung pro ml:
IGF-1 9 mg
Mononatriumphosphat 1,02 mg
Dinatriumphosphat 0,21 mg
Natriumchlorid 8,48 mg
Benzylalkohol 14 mg
Wasser zur Injektion auf 1,0 ml
pH 6,0
Die Fläschchen wurden gelagert und nach 6 Monaten bei +25±3ºC und +5±3ºC untersucht.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8a und 8b angegeben. Tabelle 8a 9 mg/ml IGF-1 mit Benzylalkohol, gelagert bei +5ºC Tabelle 8b 9 mg/ml IGF-1 mit Benzylalkohol, gelagert bei +25ºC

Schlußfolgerung

Es konnte nur eine geringe Abnahme der Reinheit nach 6-monatiger Lagerung bei +5ºC festgestellt werden. Die Zubereitung blieb während der Untersuchung stabil.

Beispiel 10

Die lokale Toleranz bei subkutaner Injektion von 9 Zubereitungen I-X wurde an 10 männlichen Personen untersucht.
Jede Person erhielt zehn Injektionen an den Unterarmen. Die Injektionen wurden in einem Intervall von 17 min/Injektion/Person verabreicht. Die Gesamtdosis an rIGHF-1 betrug 3 mg, unterteilt in drei Injektionen mit 1 mg IGF-1/Injektion.
Alle Injektionen wurden innerhalb von 3,5 h an eine Person verabreicht mit einem Volumen von 0,2 ml/Injektion.
Eine Natriumchlorid-Zusammensetzung mit physiologischem pH, Zusammensetzung I, wurde als Kontrolle verwendet.
Der Injektionsschmerz, bewertet durch die Freiwilligen auf einer horizontalen visuellen analogen Skala (V. A. S.) 0 bis 100 mm, 30 s nach jeder Injektion (0 mm bedeutet keinen Schmerz, 100 mm bedeutet schweren Schmerz), wurde bewertet.
In dieser Untersuchung verwendete Zusammensetzungen in mg.
Wasser zur Injektion auf 1 ml:
Wenn LS-Mittel auf V. A. S., mmol/l, für jede Zusammensetzung berechnet wurde, wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle 9

Zusammensetzung LS-Mittel

VIII 6,5
I 7,2
IX 8,3
III 9,7
IV 12,2
II 15,1
VII 16,3
V 30,9
VI 38,4

Schlußfolgerung

Zusammensetzungen III und IV führen zu beträchtlich weniger Schmerz als die Zusammensetzungen V und VI.
Bei pH 6 führt eine Abnahme der Puffer-Konzentration zu geringeren Unannehmlichkeiten bei der Injektion und verringert den Injektionsschmerz auf ein Niveau von physiologischer Natriumchlorid-Lösung.
Diese Untersuchung zeigt, daß eine verringerte Puffer-Konzentration bei pH 6 vorteilhaft ist, um die beste lokale Toleranz gegenüber der Injektion von IGF-1 zu erzielen.

Claims

1. Stabile Lösung, enthaltend IGF-1 oder irgendein funktionelles Analoges davon und einen Phosphatpuffer in einer Menge von 50 mmol/l oder weniger, was einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5, vorzugsweise 5,7 bis 6,2, in einer isotonischen Lösung zur Injektion ergibt.

2. Stabile Lösung nach Anspruch 1, bei der die Menge an Phosphat-Puffer 5 bis 20 mmol/l, vorzugsweise etwa 10 mmol/l beträgt, und die zu verringertem Schmerz bei subkutaner Injektion im Vergleich mit einem Mittel führt, das eine höhere Phosphatmenge enthält.

3. Stabile Lösung nach Anspruch 1 oder 2, die bei einer Lagerung während mindestens 24 Monaten bei +5±3ºC eine verbleibende Aktivität von mindestens 90% ihres ursprünglichen Wertes aufweist.

4. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend IGF-1, den Puffer und ein isotonisches Mittel und gegebenenfalls ein Konservierungsmittel.

5. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der Puffer ein Natriumphosphat-Puffer ist.

6. Stabile Lösung nach Anspruch 5, bei der die Menge an Natriumphosphat-Puffer 5 bis 50 mmol/l beträgt.

7. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Menge an Phosphat-Puffer 5 bis 20 mmol/l, vorzugsweise etwa 10 mmol/l, beträgt.

8. Stabile Lösung nach Anspruch 7, bei der der Puffer 10 mmol/l Natriumphosphat-Puffer ist und der pH-Wert 5,7 bis 6,2 beträgt.

9. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die auch NaCl enthält.

10. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die Benzylalkohol als Konservierungsmittel enthält.

11. Stabile Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, die auch Glycin, Glycerin, Mannit und/oder Kohlenhydrate als isotonische Mittel enthält.

12. Verfahren zur Herstellung der stabilen Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 durch Vermischen von IGF-1 oder irgendeinem funktionellen Analogen davon mit der Puffersubstanz unter Erzeugung eines pH-Werts von 5,5 bis 6,5 und einem isotonischen Mittel und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel.