DE69819322T2

DE69819322T2 - Pharmazeutische zubereitung enthaltend peptide mit geringer löslichkeit in physiologischem medium

Info

Publication number: DE69819322T2
Application number: DE69819322T
Authority: DE
Inventors: Peter Richardson
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2018-05-27
Also published as: EA199901089A1; WO1998053844A1; ES2210772T3; CN1159062C; PL336982A1; SI0984788T1; ATE252909T1; DK0984788T3; EP0984788B1; NO995763D0; NO995763L; DE69819322D1; BR9809708A; SK284640B6; EE9900545A; CN1263469A; KR100552546B1; EA002227B1; SK159799A3; US6331520B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend:

a) ein Peptid, das in wässriger physiologischer Kochsalzlösung schlecht löslich ist, als aktives Ingrediens;
b) ein nicht-ionisches, aromatisches, hydrotropes, pharmazeutisch annehmbares Agens; und
c) eine physiologische wässrige Lösung.

Das Peptid (a) ist ein LHRH-Analogon oder ein GRF-Peptid, und das Agens (b) ist Nicotinamid.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist oft notwendig, die Löslichkeit eines Arzneimittels in physiologischen Medien zu verbessern um eine wirksame klinische Leistungsfähigkeit von injizierbaren Formulierungen des Arzneimittels zu erreichen. Peptid-Arzneimittel sind infolge des Vorliegens von hydrophoben Substituenten oft in physiologischen Medien schlecht löslich.
Löslichkeitsprobleme können auch zu einer schlechten Absorption bei anderen Verabreichungswegen führen, und in einigen Fällen können geeignete Solubilisierungsmittel die Absorption des Arzneimittels auf anderen Wegen, z. B. auf oralem oder nasalem Weg, unterstützen.
Beispiele für Peptid-Arzneimittel, die in physiologischen Medien so schlecht löslich sind, sind LHRH-Analoga und Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor (GRF)-Peptide.
Luteinisierendes Hormon-Freisetzungshormon (LHRH oder GnRH) ist ein Decapeptid, das vom Hypotalamus sezerniert wird und fähig ist, die Freisetzung sowohl von LH, als auch von FSH zu induzieren. Es hat die folgende Formel: pyroGlu–His–Trp–Ser–Tyr–Gly–Leu–Arg –Pro–Gly–NH₂.
LHRH kann entweder die Hypophysen-Gonadotropin-Sekretion stimulieren oder kann ein wirksamer Inhibitor sein. Bei Verabreichung in einem genauen pulsierenden Muster kann LHRH die normale cyclische Gonadotropin-Sekretion wiederherstellen. Eine pulsierende Verabreichung von LHRH unter Verwendung einer Computer-gesteuerten Pumpe wurde mit guten Resultaten bei der Induzierung einer Ovulation bei anovulatorischen Frauen mit Hypotalamus-Dysfunktion eingesetzt. Bei chronischer Verabreichung erwiesen sich LHRH oder seine Agonisten als wirksame Inhibitoren der Gonadotropin-Sekretion, wobei eine temporäre (vollständig reversible) Gonadotropin-spezifische, medizinische Hypophysektomie erhalten wird.
Bis heute wurden tausende von LHRH-Analoga synthetisiert, die entweder als Agonisten oder Antagonisten wirken können. Um LHRH-Antagonisten herzustellen, die durch Rezeptorbesetzung wirken, ist es notwendig, mehrere Aminosäuren am LHRH-Molekül zu ersetzen. Antagonisten erfordern auch genaue topologische Merkmale um eine hohe Bindungsaffinität für den Rezeptor zu erreichen. Kürzlich wurde eine Menge an LHRH-Analoga synthetisiert, in denen die Amionsäuren aromatische oder andere funktionelle Gruppen enthalten, die zur sogenannten hydrotropen Wechselwirkung fähig sind. Die Verwendung von LHRH-Antagonisten mit ihrer unmittelbaren Hemmung der Gonadotrophin-Freisetzung, können auf therapeutischen Gebieten einsetzbar sein, z. B. bei der Kontrazeption und bei der Behandlung Hormon-abhängiger Krankheiten. Im Fall von Hormon-abhängigen Tumoren kann die Vermeidung einer anfänglichen stimulatorischen Phase, erzeugt durch LHRH-Agonisten, ein besonderer Vorteil sein. Bezüglich einer Übersicht über LHRH-Analoga siehe Karten und Rivier, 1986.
Insbesondere Antid ist ein wirksamer LHRH-Antagonist mit der Formel, biologischen Aktivität und der Herstellung, wie sie im EP-Patent 377 665 beschrieben wird.
Aus den von der Anmelderin durchgeführten Untersuchungen resultierte z. B., dass Antid eine sehr schlechte Löslichkeit in 0,9% NaCl-Lösung (Löslichkeit 25 μg/ml) oder anderen isotonischen Medien, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung (Löslichkeit war 16 μg/ml), hat. Frühere wässrige Formulierungen von Antid haben eine schlechte Bioverfügbarkeit und schlechte pharmakokinetische Reproduzierbarkeit gezeigt. Dies resultiert daher, dass Antid an der Injektionsstelle beispielsweise in Konzentrationen von über 25 μg/ml vorliegt, welche zur Bildung eines Präzipitats bei Kontakt mit dem physiologischen Medium führt. Dieses Präzipitat kann eine Gelatin-artige Natur haben und hat eine schädliche Wirkung auf die Arzneimittelabsorption, was durch klinische Untersuchungen, die von der Anmelderin durchgeführt wurden, gezeigt wurde.
Andere Gonadotrophin-freisetzende Hormon-Antagonisten in wässrigen Lösungen können Gelstrukturen bilden, und darüber hinaus ist bekannt, dass die Löslichkeit zunimmt, wenn der pH der Lösung verringert wird, und zwar infolge einer verstärkten Ionisierung des Moleküls (Cannon J. B., et al., 1995).
GRF (auch Somatorelin genannt) ist ein Peptid, das durch den Hypotalamus sezerniert wird und das die Freisetzung von Wachstumshormon aus der vorderen Hypophyse begünstigt. Es tritt natürlicherweise als 44-, 40- und 37-Aminosäure-Peptid auf; die 44-Aminosäuren-Form kann möglicherweise in kleinere Formen umgewandelt werden, allerdings wird von allen beschrieben, dass sie aktiv sind, wobei die Aktivität auf den ersten 29 Aminosäureresten beruht. Ein Peptid, das der 1-29-Aminosäure-Sequenz von humanem GRF [hGRF(1-129)], auch als Sermorelin bezeichnet, entspricht, wurde durch DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt, wie es im europäischen Patent EP 105 759 beschrieben wird.
Sermorelin wurde in Acetat-Form zur Diagnose und Behandlung einer Wachstumshormondefizienz verwendet.
GRF besitzt therapeutischen Wert zur Behandlung bestimmter Krankheiten, die mit Wachstumshormon in Verbindung stehen. Die Verwendung von GRF zur Stimulierung der Freisetzung von GH ist ein physiologisches Verfahren zur Induzierung des langen Knochenwachstums oder des Proteinanabolismus.
Es ist gut bekannt, dass die natürliche Form von GRF in wässriger Lösung an einem chemischen Abbau leiden kann, in erster Linie von Asn in Position 8, was zu einer verringerten biologischen Wirksamkeit führt (Friedman et al., 1991; Bongers et al., 1992).
Die hauptsächlichen hydrolytischen Reaktionen, die in GRF auftreten, sind gegenüber pH empfindlich, und beschrieben sind: Umlagerung von Asp³ bei pH 4–6,5, Spaltung der Asp³-Ala⁴-Bindung bei pH 2,5–4,5, Desamidierung und Umlagerung von Asn⁸ bei pH über 7 (Felix A. M., 1991). Infolge der kombinierten Abbauwege sind nicht-stabilisierte wässrige GRF-Lösungen im pH-Bereich von 4–5 am stabilsten. Bonders et al. (Bongers et al., 1992) haben gezeigt, dass die Desamidierungsreaktion bei Asn⁸ schnell ansteigt, wenn der pH über pH 3 steigt.
Verschiedene Forscher haben Analoga von GRF durch Substitution von Aminosäuren in der natürlichen GRF-Sequenz hergestellt um die chemische Stabilität zu verbessern (Serono Symposia USA, 1996, Friedman, 1991). Obgleich eine Modifikation ein wirksames Mittel zur Verbesserung der Stabilität und Aufrechterhaltung der Bioaktivität sein kann, kann sie wegen der veränderten Immunogenität, die ein Problem für chronische Therapien, z. B. bei Wachstumshormondefizienz, sein könnte, unerwünscht sein.
Aus der Literatur ist bekannt, dass in bestimmten Fällen der Zusatz von aromatischen Agenzien zu Lösungen von Proteinen einen negativen Effekt auf die Löslichkeit haben kann, was zu einer Präzipitation führt. Wenn z. B. aromatische Agenzien mit rekombinantem humanen Wachstumshormon (rhGH) in Kontakt gebracht werden, treten Konformationsänderungen oder eine Denaturierung ein, was zur Bildung von rhGH-Aggregaten führt. (Maa Y. F. und Hsu C. C., 1996). Um zu zeigen, dass dies kein allgemeines Phänomen darstellt, wurde gezeigt, dass aromatische Aminosäure-Derivate die Löslichkeit verbesserten und die Absorption von Wachstumshormon steigerten (Leone Bay A., et al., 1996).
Es wurde berichtet, dass Nicotinamid herkömmliche pharmazeutische Verbindungen (d. h. Nicht-Peptide mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton) durch einen Prozess der Ladungstransferkomplexierung solubilisiert, was auch als hydrotrope Solubilisierung bezeichnet wird. Dieser Prozess kann aus der Wechselwirkung aromatischer Gruppen in Solubilisierungsmittel und aromatischer oder anderer geeigneter funktioneller Gruppen am Arzneimittelmolekül resultieren. Siehe z. B. Rasool et al., 1991.
Allerdings hat die Anmelderin festgestellt und die entsprechenden Daten auch hier im experimentellen Abschnitt vorgelegt, dass andere Moleküle, die aromatische Gruppen enthalten, z. B. Benzoat oder Salicylat, die durch hydrotropen Mechanismus Wechselwirken könnten (Jain N. K. und Patel V. V., 1986), nur eine sehr geringe Verbesserung bei der Solubilisierung eines LHRH-Analogon (Antid) in Kochsalzlösung zeigen.
Die europäische Patentanmeldung 0 649 655 beschreibt die Solubilisierung eines in Wasser unlöslichen Arzneimittels gegen Ulcus, wobei Nicotinamid verwendet wird um eine einsetzbare injizierbare Form herzustellen. Viele potentielle Derivate der aktiven Gruppierung werden beansprucht, allerdings werden keine in vivo-Daten präsentiert um eine verbesserte Wirksamkeit zu beweisen.
Die PCT-Anmeldung WO 96/10417 beschreibt die Co-Verabreichung von Asp^B28-Humaninsulin und Nicotinamid um ein schnelles Einsetzen der Wirkung des hypoglykämischen Effekts zu erreichen. Der beanspruchte Nicotinamid-Konzentrationsbereich war 0,01 bis 1 M (0,1–12 Gew.-%), vorzugsweise 0,05 bis 0,5 M. Das Dokument liefert den Beweis für eine schnellere Absorption während einer in vivo-Studie bei Ferkeln, allerdings wird kein Mechanismus angegeben, durch den die verbesserte Absorption auftritt, und daher können aus diesem Dokument keine verallgemeinerbaren Lehren gezogen werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde festgestellt, dass, wenn ein nicht-ionisches, aromatisches, hydrotropes Agens wässrigen Lösungen eines Peptid-Arzneimittels, das normalerweise in wässriger physiologischer Kochsalzlösung schlecht löslich ist, zugesetzt wird, seine Löslichkeit erhöht wird und die resultierenden pharmazeutischen Zubereitungen auch ausgezeichnete Stabilität zeigen.
Es wurde insbesondere festgestellt, dass, wenn Nicotinamid einer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) von Antid zugesetzt wird, das Molekül die Löslichkeit dieses Arzneimittels begünstigen kann. Die Endkonzentration des solubilsierten Antids hängt von der Konzentration des zugesetzten Nicotinamids ab und nimmt exponentiell mit der erhöhten Nicotinamid-Konzentration zu, was unten gezeigt wird. Es ist bekannt, dass die Löslichkeit des Gonadotrophin-freisetzenden Hormon-Antagonisten zunimmt, wenn der pH der Lösung verringert wird; allerdings zeigen die Daten, die hier im experimentellen Abschnitt für Antid angegeben werden, dass die erhöhte Löslichkeit keine Folge des pHs ist. Außerdem wurde festgestellt, das Nicotinamid auch die Löslichkeit von Antid in rein wässrigen Umgebungen erhöhen kann.
Daher besteht die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend:

(a) ein Peptid, das in wässriger physiologischer Kochsalzlösung schlecht löslich ist, als aktives Ingrediens;
b) ein nicht-ionisches, aromatisches, hydrotropes, pharmazeutisch annehmbares Agens; und
c) eine physiologische wässrige Lösung.

Das Peptid als aktives Ingrediens kann ein LHRH-Analogon oder ein Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor (GRF)-Peptid sein. Vorzugsweise ist das LHRH-Analogon ein Antagonist. Bevorzugter ist es Antid, hGRF oder PEG-Konjugate davon.
Erfindungsgemäß soll das Wort "hGRF" jedes beliebige humane GRF-Peptid abdecken, wobei insbesondere die 1–44-, 1–40-, 1–29-Peptide und die entsprechenden Amide davon (enthaltend -NH₂ an ihrem Ende) genannt werden. Diese sind alles im Handel erhältliche Verbindungen. Der bevorzugte hGRF ist hGRF(1-129)-NH₂. Das GRF-Peptid, das in den Beispielen verwendet wird, wird ein handelsübliches Produkt sein, das in Abschnit "Materialien" spezifiziert wird.
Es wurde auch festgestellt, dass der Zusatz von Nicotinamid zu wässrigen Lösungen von hGRF die Desamidierungsrate von Asn⁸ sowie die Menge an zusätzlichen Abbauprodukten, von denen bisher noch nicht alle identifizert wurden, verringern kann. Es ist bekannt, dass Asn⁸ sich in wässriger Lösung zersetzen kann, wobei die folgenden Abbauprodukte gebildet werden: α-Asp⁸, beta-Asp⁸ und Succinimidyl-Asn⁸.
Außerdem wurde die Feststellung gemacht, dass GRF in nicht-wässrigen Lösungsmitteln gelöst werden kann und dass durch die daraus folgende Verringerung der Wasseraktivität in der Lösung eine Desamidierung in der Position Asn⁸ verhindert wird. Wenn der GRF in Propylenglykol (PG) gelöst wird, zeigte sich, dass alternative (nicht vollständig charakterisierte) Abbauwege auftreten. Es wurde außerdem gefunden, dass die Bildungsrate von einigen dieser zusätzlichen Abbauprodukte durch Einarbeitung von Nicotinamid in eine nicht-wässrige Lösung, z. B. PG, verringert wird.
Nicotinamid ist eine üblicherweise verwendete Quelle für Vitamin B in pharamazeutischen Produkten und wird hauptsächlich auf oralem Weg, aber auch durch Injektion, verabreicht. Dosen von bis zu 500 mg täglich (in aufgeteilten Dosen) wurden empfohlen, siehe z. B. Martindale.
Die physiologische wässrige Lösung kann eine isotonische Salzlösung oder eine Phosphat-gepufferte Salzlösung sein oder eine beliebige geeignete Lösung sein, die anorganische Salze mit derselben Tonizität wie das physiologische Medium enthält.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können für einen beliebigen Verabreichungsweg geeignet sein, z. B. für eine orale, parenterale, nasale oder pulmonale Verabreichung. Sie können in flüssiger Form, wie auch in fester Form als inniges Gemisch (z. B. nach Sprühtrocknung, Lyophilisierung, usw.) vorliegen. Sie können z. B. in fester Dosierungsform, beispielsweise als Gelatinekapsel zur oralen Verabreichung, vorliegen oder können zur nasalen oder pulmonalen Inhalation formuliert sein, wobei keine Beschränkung auf diese Formen besteht. Andere pharmazeutisch annehmbare Dosierungsformen könnten verwendet werden, z. B. eine Suspension, Emulsion, Mikroemulsion, mikronisiertes Pulver, Lösung, Suppositorien, Pessar, Mikrokügelchen, Nanokügelchen, Implantat, usw., wobei die Absorption oder Stabilität des Peptid-Arzneimittels durch die Kombination mit dem nicht-ionischen hydrotropen Agens verbessert ist. Orale Mikroemulsionen sind besonders bevorzugte Verabreichungsformen.
Daher können die erfindungsgemäßen Zubereitungen auch lyophilisiert werden und sind rekonstituierbar und umfassen außerdem ein Stabilisierungsmittel oder mehrere Stabilisierungsmittel, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipientien.
Beispielhafte Zubereitungsbereiche für eine injizierbare Zubereitung sind die folgenden:

Antid oder hGRF 0,1–20,0 mg

Nicotinamid 10–300 mg

Propylenglykol 0–800 mg

Wässrige Phase, q. s. 1,0 ml
Der Ausdruck "Peptid", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezeichnet eine Verbindung, die aus zwei oder mehr Aminosäuren aufgebaut ist. Darin ist die Amino (NH₂)-Gruppe einer Aminosäure an die Carboxyl (COOH)-Gruppe einer anderen gebunden, wodurch eine Peptidbindung gebildet wird. Solche Aminosäuren können natürlich auftretende, chemisch synthetisierte oder modifzierte sein. Die erfindungsgemäßen Peptide haben im Allgemeinen bis zu 100 Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 50, bevorzugter bis zu 20 Aminosäuren.
Der Ausdruck "in wässriger physiologischer Kochsalzlösung schlecht löslich", wie er in der vorliegenden Patentanmeldung verwendet wird, bedeutet, dass das Peptid in einer solchen Lösung bei Raumtemperatur ohne Zusatz von Säuren oder Basen eine Löslichkeit < 1 mg/ml zeigt, und/oder dass die Löslichkeit in wässriger physiologischer Kochsalzlösung eine Größenordnung niedriger ist als die Löslichkeit in Wasser allein unter denselben Bedingungen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die allerdings die Erfindung in keiner Weise beschränken sollen. Die Beispiele werden sich auf die nachfolgend spezifizierte Figur beziehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1: Die Antid-Löslichkeit in 0,9% NaCl-Lösung ist gegen die Nicotinamid-Konzentration aufgetragen. Das halb-logarithmische Diagramm zeigt, dass bei der Löslichkeit von Antid eine halb-logarithmische Beziehung zu der vorliegenden Nicotinamid-Konzentration besteht. Die lineare Natur dieses Profils ist wichtig, da es eine genaue Betrachtung der Löslichkeitseffekte erlaubt und auch zeigt, dass für das Arzneimittel in diesen Lösungen eine Gleichgewichtslöslichkeit erreicht wurde.
BEISPIELE
Materialien

Antid-Masse (Bachem), Chargen 8901 und 9001,
hGRF-(1–29)-NH₂ (Bachem), Chargen 1299201 und 1299202,
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (Sigma, D-8537),
Histidinhydrochlorid (Merck, 1.04351 – Biochemie-Qualität),
Nicotinamid (Fluka, 72345), Qualität entsprechend dem amerikanischen Arzneibuch,
Phenylalanin (Merck, 7256) – Biochemie-Qualität,
Natriumbenzoat (Merck, 6290), Ph. Eur/NF-Qualität,
Natriumsalicyclat (Sigma, 5-3007) – Universalreagens, 35H1207,
Thiaminhydrochlorid (Merck 8181) – Biochemie-Qualität,
Kautschukstöpsel, Butylkautschuk (Pharmagummi, Art. 1779 W 1816, grau),
3 ml-Phiolen DIN2R-Glas, Typ I (Nuova Ompi).

Alle anderen verwendeten Reagentien hatten "Analysen-Qualität", wenn nichts anderes spezifiziert ist.
Gerätschaften
Es wurden die folgenden Gerätschaften verwendet:

– Merck Hitachi HPLC-System (L-6200-Pumpe, L-4250-Detektor, AS-2000A-Autosampler, Compaq-PC, HPLC-Manager 2000-Software);
– Waters-HPLC-System (626-Pumpe, 6005-Regler, 994-Detektor, 717-Autosampler, NEC-PC, Maxima Baseline-Software).
– Gefriertrockner (Edwards, Lyoflex Mod. 06 und Mod. 04).

Analyseverfahren für Antid
RP-HPLC-Gradientenelution, C-18 (z. B. Vydac 218-TP54, 250×4,6 mm)-Säule; UV-Detektion bei 215 nm, Injektionsvolumen 15 μl, mobile Phase A: pH 4,5-Phosphatpuffer (0,1M), mobile Phase B: Acetonitril, Durchflussgeschwindigkeit = 1,0 ml/min., Laufzeit = 23 min. Während der Analyse wurden externe Standardlösungskonzentrationen mit 100 μg/ml injiziert. Der Gradient war: 77% A, 23% B bis 52% A, 48% B über 30 Minuten.
Analyseverfahren für hGRF

Für die Analyse von GRF(1-29)-NH₂ wurde ein RP-HPLC-Verfahren entwickelt, das fähig ist, die folgenden Abbauprodukte zu unterscheiden:

Oxidiert:	an Met²⁷
Freie Säure:	GRF(1-29)-OH
Desamido:	α-Asp⁸, beta-Asp⁸ und Succinimidyl-Asn⁸
Acetyliert:	Acetyl-Tyr¹
Isomerisiert:	β-Asp³ und Succinimidyl-Asp³
Verkürzt:	hGRF(4-29)-NH₂, GRF(9–29)-NH₂.

Dieses Verfahren wurde angewendet um die chemische Reinheit einer Reihe von hGRF-Lösungen während einer Lagerung bei 4°C und 40°C zu bestimmen, wie es in den folgenden Tabellen bewiesen wird.
Die Bedingungen waren ähnlich denen für Antid, wobei eine mobile Phase verwendet wurde, die aus ACN/H₂O bestand und TFA anstelle von Phosphatpuffer enthielt. Der Gradient wirkte über einen Zeitraum von 60 Minuten, wobei die Gesamtlaufzeit 80 Minuten war.
Antid-Stabilität in wässrigen Lösungen
Einleitende Stabilitätsuntersuchungen mit Antid-Lösungen mit 0,1 mg/ml bei –20°C, 4°C, 25°C und 40°C wurden durchgeführt um ihre Stabilität bei pH 2,3 und 4 zu beurteilen. Die Lösungen mit 0,1 mg/ml wurden hergestellt, indem Antid in Wasser gelöst wurde und der pH unter Verwendung von 0,01 M Salzsäure eingestellt wurde.
hGRF-Stabilität in wässrigen Lösungen
Stabilitätsuntersuchungen für wässrige hGRF-Lösungen mit 2,0 mg/ml, 5,0 mg/ml und 10,0 mg/ml bei 4°C und 40°C wurden durchgeführt um ihre Stabilität bei pH 7,5 zu beurteilen. Der Effekt des Zusatzes von Propylenglykol wurde beurteilt.
Solubilisierungsuntersuchungen für Antid
Es wurden Solubilisierungsuntersuchungen durchgeführt um die Wirkung von:

– pH (Lösungen wurden entweder mit Essigsäure oder Salzsäure angesäuert)
– hydrotropen Agenzien (Nicotinamid, Natriumsaccharin, Natriumsalicylat, Natriumbenzoat, Histidinhydrochlorid, Thiaminhydrochlorid, Phenylalanin) zu untersuchen.

Die in diesen Untersuchungen verwendete Kochsalzlösung entspricht einer 0,9%igen Natriumchloridlösung.
Basierend auf den Resultaten früherer Studien wurde überschüssiges Antid der Testlösung zugesetzt, und nach Äquilibrierung über Nacht bei 25°C wurden visuelle Beobachtungen durchgeführt um die Löslichkeit zu beurteilen. Nach der visuellen Analyse wurde eine Reihe von Lösungen für eine weitere quantitative Bestimmung der Löslichkeit durch Filtration (0,45 μm-Filter) und geeignete Verdünnung unter Verwendung des oben beschriebenen RP-HPLC-Verfahrens selektiert.
Solubilisierungsuntersuchungen für hGRF
Es wurden Solubilisierungsuntersuchungen durchgeführt um die Wirkung von Kochsalzlösung und Phosphatpuffer mit pH 7 auf die Löslichkeit von hGRF zu untersuchen.
Die Quantifizierung der gelösten Menge an hGRF wurde durch Filtration der äquilibrierten Lösung durch ein 0,45 μm-Filter vor Verdünnung und Analyse durch HPLC durchgeführt.
Herstellung einer gefriergetrockneten Antid-Formulierung
Wie folgt werden 50 Violen mit gefriergetrocknetem Antid/Nicotinamid-Produkt hergestellt:

1) 0,7 g Antidacetat (ausgedrückt als trockenes Pulver) werden abgewogen, 3,5 g Mannit werden abgewogen, und es werden etwa 50 ml Wasser für injizierbare Produkte (WFI) zugesetzt,
2) beide Materialien werden durch leichtes Rühren in Lösung gebracht,
3) mit WFI wird ein Endgewicht von 70 g hergestellt,
4) die Phiolen werden mit 1 ml Lösung gefüllt,
5) Gefriertrocknungszyklus:

Das Produkt wird auf –40°C gebracht und dort für 1,5 Stunden gehalten, dann wird Vakuum angelegt.
Es wird eine erste Trocknung für 2 Stunden durchgeführt.
Die Lagertemperatur wird auf +20°C erhöht und für 60 Stunden dort gehalten.
Die Lagertemperatur wird auf +40°C erhöht und zur Vervollständigung 5 Stunden gehalten.
Resultate und Diskussion
Antid-Stabilität in wässrigen Lösungen
Die Resultate des dreimonatigen Stabilitätstests mit 0,1 mg/ml Antid-Lösungen bei pH 2,3 und 4, der unter Verwendung von verdünnter Salzsäure eingestellt worden war, wobei die Lösungen bei –20°C, +4°C, +25°C und +40°C gelagert wurden, sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Der prozentuale Abbau nahm zu, wenn der pH abnahm, was durch die beobachteten Reinheitswerte definiert wird. Es war auch zu erkennen, dass eine Lagerung bei –20°C die Stabilität des Produktes nachteilig beeinträchtigt, wenn der pH niedriger als 4 war.
Solubilisierungsuntersuchungen für Antid
Effekt des pH
Die Tabellen 3 bis 7 fassen die gesammelten Beobachtungen zusammen, wodurch Informationen über das Löslichkeitsverhalten von Antid in Wasser für injizierbare Präparate (WFI), in WFI, das mit HCl oder Essigsäure azidifiziert war, Kochsalzlösung und in Kochsalzlösung, die mit Essigsäure azidifiziert war, zu erhalten. In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen nahm die Löslichkeit von Antid zu, wenn der pH abnahm.
In Tabelle 3 liegt der natürliche pH von Antidacetat in Lösung in Abhängigkeit von der gelösten Menge zwischen 4,4 bis 5,0. Antid könnte mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml einfach in Wasser gelöst werden, ohne weitere Azidifizierung wurde die Löslichkeitsgrenze mit 8,1 mg/ml festgestellt. Der pH wurde nicht gemessen, wenn die Lösung geliert war.
Als Antid mit 50 mg/ml in Wasser, das mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt worden war, gegeben wurde, bildete sich ein Gel, was eine partielle Löslichkeit anzeigt. Auf der Basis dieser Resultate wäre es notwendig, weitere Säure zuzusetzen um eine Lösung mit dieser Konzentration vollständig zu solubilisieren.
Die Tabellen 4 und 5 zeigen, dass signifikante Mengen an Essigsäure Antid in Wasser nicht wirksam solubilisieren. Der Zusatz von 2% Essigsäure zu Wasser, was einer 0,33 M-Lösung entspricht (zu injizierbaren Zwecken als zu konzentriert erachtet), erwies sich als wirksam um zwischen 10 und 20 mg/ml Antid zu solubilisieren.
Der Zusatz von 5 mg/ml Antid zu 1%iger Essigsäure lieferte eine Lösung mit pH 3,12 in Gegenwart von Kochsalzlösung. Die Lösung blieb opaleszierend, was anzeigt, dass die Arznemittellöslichkeit kleiner als 5 mg/ml war; die genaue Menge wurde nicht quantifiziert (Tabelle 6).
Tabelle 7 zeigt, dass Antid in einer Konzentration von 10 mg/ml in Kochsalzlösung bei einem pH von 3,0 oder 4,6 nicht löslich ist, wobei 4% Essigsäure verwendet wurden um eine pH-Reduzierung zu erreichen. Der pH wurde gemessen, als die Lösung hergestellt war, wonach das Gel sich allmählich bildete, was die partielle Löslichkeit des Arznemittels anzeigt. Bei pH 3,0 erwies sich die Löslichkeit des Arzneimittels in Kochsalzlösung als 2,2 mg/ml; im Vergleich dazu war der Wert 0,025 mg/ml beim natürlichen pH von 5,04 für diese Lösung.
Effekt von hydrotropen Solubilisierungsmitteln auf die Antid-Löslichkeit
Die Wirkung verschiedener hydrotroper Agenzien (1,5 Gew.-% und 15 Gew.-%) in Kochsalzlösung wurde beurteilt und ist in den Tabellen 8 und 9 angegeben. Nicotinamid und Thiaminhydrochlorid erwiesen sich als die wirksamsten Solubilisierungsmittel.
Tabelle 8 zeigt die Wirkung niedriger Konzentrationen (1,5 Gew.-%) der selektierten hydrotropen Agenzien auf den pH der Lösung, gemessen vor Arzneimittelzusatz; allerdings waren sie bei der Solubilisierung von Antid mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Kochsalzlösung nicht wirksam.
Das in Tabelle 8 beschriebene Experiment wurde wiederholt, wobei eine niedrigere Konzentration an Arznemitel und eine höhere Konzentration an hydrotropem Agens verwendet wurde, wie es in Tabelle 9 angegeben ist. Bei Quantifizierung der gelösten Antidmenge wurde festgestellt, dass Nicotinamid ein sehr gutes Solubilisierungsmittel für Antid war, wobei 3,3 mg/ml in 15 gew.%iger Nicotinamid/Kochsalz-Lösung mit pH 5,8 gelöst wurden. Thiaminhydrochlorid solubilisierte auch signifikante Mengen an Antid in Kochsalzlösung, wobei 3,0 mg/ml in 15 gew.-%iger Kochsalzlösung aufgelöst wurden. In diesem Fall bewirkte allerdings die Azidifizierung, die durch das Säuresalz von Thiamin bewirkt wurde, eine wesentliche Reduzierung des pHs auf 3,3; die Solubilisierungskraft war in großem Umfang durch die Azidität dieser Lösung bedingt. Ionische, hydrotrope Agenzien führten zu keiner guten Solubilisierung von Antid in Kochsalzlösung.
Nicotinamid
Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt um den Solubilisierungseffekt von Nicotinamid auf Antid in Kochsalzlösung zu bestätigen und die wirksamste Konzentration zur Verwendung zu entwickeln. Der Effekt der Nicotinamid-Konzentration auf die Antid-Löslichkeit ist in Tabelle 10 gezeigt, wo festgestellt wurde, dass 20% Nicotinamid in Kochsalzlösung die Solubilisierung von 8,5 mg/ml Antid erlauben.
Diese Resultate sind graphisch in 1 dargestellt. Das halb-logarithmische Diagramm zeigt, dass die Löslichkeit von Antid eine logarithmische Beziehung zu der Konzentration an vorliegendem Nicotinamid aufweist. Die lineare Natur dieses Profils ist wichtig, da es eine genaue Betrachtung von Verdünnungseffekten ermöglicht und auch zeigt, dass für das Arzneimittel in diesen Lösungen eine Gleichgewichtslöslichkeit erreicht wurde.
Da sich Nicotinamid als sehr gutes Solubilisierungsmittel für Antid erwies, wurde eine weitere Untersuchung unternommen um die chemische Kompatibilität zwischen Nicotinamid und Antid zu verifizieren. Es wurden vier Formulierungen aus Antid und Nicotinamid mit verschiedenen Konzentrationsverhältnissen hergestellt und auf pH 5 eingestellt und über 3 Monate bei +40°C, +25°C und –4°C untersucht. Die Stabilitätsdaten sind in Tabelle 1 angegeben.
Eine erhöhte Viskosität mit Präzipitatbildung wurde in der Formulierung, die 10 mg/ml Antid und 5% Nicotinamid enthielt, nach einer Woche bei +40°C und +25°C beobachtet; es wurde keine Veränderung bei den Proben beobachtet, die bei +4°C gelagert wurden. Dies zeigt an, dass die Löslichkeit von Antid in Nicotinamid/Kochsalz-Lösungen sich verringert, wenn die Temperatur ansteigt. Nach 3 Monaten wurde bei den Formulierungen kein Abbau beobachtet, was anzeigt, dass zwischen den zwei Substanzen bei den untersuchten Verhältnissen keine chemische Unverträglichkeit besteht. Die chromatographischen Spesen von Antid waren identisch mit denen des Standards, wobei der früh eluierende Nicotinamid-Peak bei einer Retentionszeit von 3,2 Minuten auftrat.
Die Nicotinamid-Mengen, die notwendig sind um Antid nach Injektion zu solubilisieren, können größer sein als die isotonische Konzentration von Nicotinamid, die 4,5% ist. Nach Injektion an einer extravaskulären Stelle würden die Körperflüssigkeiten sich unter Einstellung des osmotischen Gleichgewichts re-äquilibrieren, was zu einer Verdünnung des Solubilisierungsmittels führt. Bei einem Versuch, die potentielle Verdünnung einer injizierten Formulierung, die auftreten könnte, zu simulieren, wurde der Effekt von Verdünnungsformulierungen, die Antid und Nicotinamid in Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) enthalten, durch die folgenden in vitro-Experimente untersucht. Die Verdünnungen wurden so gemacht, dass die Nicotinamid-Konzentration 5% wurde, worauf Zusatz von PBS folgte. Lösungen von Antid mit Konzentrationen von 1 bis 5 mg/ml wurden in 15% Nicotinamid/WFI, gefolgt von einer Verdünnung in PBS mit dem Faktor 3, hergestellt. Über einen Zeitraum von 3 Stunden wurden Beobachtungen durchgeführt, wobei die Wirkung der Verdünnung in PBS in Tabelle 12 angegeben ist.
Die Resultate stehen in guter Übereinstimmung mit der gemessenen Löslichkeit von Antid in diesen Systemen und sind in Tabelle 1 angegeben, wonach eine Lösung von 5% Nicotinamid in Kochsalzlösung etwa 0,5 mg/ml Antid solubilisieren kann. Die Daten zeigen, dass es möglich ist, eine leicht supergesättigte Antid-Lösung in Körperflüssigkeiten herzustellen, indem man eine Lösung von 2 mg/ml Antid in 15% Nicotinamid herstellt. Bei Verdünnung auf 5% würde diese 0,67 mg-ml Antid enthalten, was während der oben beschriebenen Untersuchungen in Lösung blieb.
Daher können geeignete Formulierungen, die z. B. 15% Nicotinamid und 2 mg/ml Antid oder 5% Nicotinamid und 0,5 mg/ml Antid enthalten, eine Präzipiation an der Injektionsstelle nach Verabreichung reduzieren. Andere geeignete Formulierungen, wie z. B. die oben beschriebenen, können aus den Löslichkeitsprofilen in 1 bestimmt werden und sind gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Als Resultat der obigen Beispiele kann Antid durch eine Reihe von Agenzien, die nichtionische, aromatische, hydrotrope Verbindungen sind, wirksam solubilisiert werden, während der Zusatz von ionisierten Spezies die Wasserlöslichkeit reduziert. Es zeigt sich, dass die Antid-Löslichkeit mit abnehmendem pH zunimmt, wobei die chemische Antid-Stabilität abnimmt, wenn der pH unter den Wert von pH 4 gesenkt wird.
Es wurde auch festgestellt, dass Antid in Gegenwart von Nicotinamid chemisch stabil bleibt.
Solubilisierungsuntersuchungen für hGRF
Die Löslichkeit von hGRF wurde bei 25°C in Wasser gegenüber Salzlösung (zur Erreichung des Gleichgewichts für eine Woche gelagert), und PBS, das 5 Tage gelagert worden war, gemessen. Die Löslichkeiten waren

WFI > 1 mg/ml

0,9% NaCl 0,042 mg/ml

PBS 0,032 mg/ml
Nach Lagerung bei 40°C für eine Woche wurden die folgenden Löslichkeiten beobachtet:

0,9% NaCl 0,097 mg/ml

0,9% NaCl + 5% Nicotinamid 0,875 mg/ml
hGRF-Lösungen (5 und 20 mg/ml) wurden in Wasser hergestellt, auf pH 3,0 eingestellt, und es wurden 5% oder 20% Nicotinamid zugesetzt. Durch Erhöhung des pH wurde der Punkt der hGRF-Präzipiation bestimmt. Die Resultate beweisen die Fähigkeit von Nicotinamid, hGRF selbst bei hohem pH zu solubilisieren. Die Resultate sind in Tabelle 13 angegeben.
Stabilität von hGRF in wässrigen Lösungen
Durch Einarbeitung von Nicotinamid in wässrige Lösungen von hGRF wurde festgestellt, dass dieses Agens auch die Fähigkeit hat, den chemischen Abbau dieses Peptids drastisch zu reduzieren. GRF zersetzt sich bekannterweise rasch durch Desamidierung in wässriger Lösung, wobei die Geschwindigkeit des Abbaus erhöht ist, wenn der pH auf einen Bereich von über 4–5 erhöht ist. Es wurden wässrige hGRF-Lösungen in Wasser, das auf pH 7,5 eingestellt war und entweder 0,5 oder 20% Nicotinamid enthielt, gelöst und dann für bis zu 12 Wochen bei 4°C und 40°C gelagert.
Die in den Tabellen 14 und 15 angegebenen Daten zeigen, dass die Desamidierungsrate durch das Vorliegen von Nicotinamid wesentlich reduziert ist, und zwar insbesondere die Desamidierungsrate am Asparagin in Position 8 in hGRF, wobei Lösungen bei niedrigerer Temperatur stabiler sind.
Da eine Desamidierung in Lösung erfolgt, ist die Wasseraktivität ein wichtiger Faktor, der die Abbaurate steuert. Da hGRF in Propylenglykol löslich ist, wurde die Stabilität von hGRF in Lösung in diesem Lösungsmittel untersucht um die Wirkung auf Desamidierungsreaktionen zu verstehen.
Die in den Tabellen 16 und 17 angegebenen Daten beweisen, dass ein Abbau über Desamidierung am Asparagin in Position 8 in dieser Lösung auf ein sehr niedriges Niveau reduziert war. Die Daten zeigen auch, dass hGRF, das in Propylenglykol gelöst ist, einen wesentlichen Abbau über Routen, die noch nicht vollständig geklärt sind und die zahlreiche neue Abbauprodukte bilden, welche als Peaks nach dem Hauptpeak für hGRF unter den verwendeten chromatographischen Bedingungen eluiert werden, zeigt.
Aus den Daten ist klar ersichtlich, dass der Zusatz von Nicotinamid zu der Lösung von hGRF in Propylenglykol eine wesentliche Reduzierung in der Konzentration dieser Abbauprodukte bewirkt. Die Abbauraten werden wiederum durch die Temperatur beeinflusst, wobei die Lösungen bei 4°C stabiler sind als bei 40°C.
Um den Effekt einer Kombination von Nicotinamid und Propylenglykol in einer wässrigen Lösung von hGRF zu beurteilen, wurden 10 mg hGRF in einer Lösung, die 60% Propylenglykol und 20% Nicotinamid enthielt, gelöst, wobei das Volumen mit Wasser, das auf pH 7,5 eingestellt wurde, aufgefüllt wurde.
Die in den Tabellen 18, 19 und 20 angegebenen Daten beweisen, dass ein Abbau über Desamidierung am Asparagin in Position 8 in dieser Lösung auf ein sehr niedriges Niveau reduziert war, und dass die Abbaurate bei 4°C ausreichend niedrig war um für pharmazeutische Anwendungen in Betracht gezogen zu werden.
Die Daten zeigen die Stabilisierung von wässrigen hGRF-Lösungen durch die Verwendung von Nicotinamid und die Einarbeitung von Propylenglykol. Es wird davon ausgegangen, dass die Zusammensetzung für verschiedene pharmazeutische Anwendungen optimert werden könnte oder dass andere nicht-wässrige Lösungsmittel verwendet werden könnten um die Wasseraktivität zu reduzieren.
Allerdings sind die stabilisierenden Wirkungen von Nicotinamid für eine effektive pharmazeutische Leistungsfähigkeit notwendig.
TABELLE 1 Stabilität von 0,1 mg/ml Antidlösungen bei pH 2, 3 und 4; Temp. = +4°C und –20°C
TABELLE 2 Stabilität von 0,1 mg/ml Antidlösungen bei pH 2, 3 und 4; Temp. = +25°C und +40°C
TABELLE 3 Antidlöslichkeit in WFI
TABELLE 4 Antidlöslichkeit in WFI + 4% Essigsäure
TABELLE 5 Antidlöslichkeit in WFI + 2% Essigsäure
TABELLE 6 Antidlöslichkeit in Kochsalzlösung + 1% Essigsäure
TABELLE 7 Effekt des pH auf die Antidlöslichkeit in Kochsalzlösung
TABELLE 8 Effekt von 1,5% hydrotropen Agenzien auf die Antidlöslichkeit in Kochsalzlösung
TABELLE 9 Effekt von 15% hydrotropen Agenzien auf die Antidlöslichkeit in Kochsalzlösung
TABELLE 10 Effekt der Nicotinamid-Konzentration auf die Antidlöslichkeit in Kochsalzlösung
TABELLE 11 Stabilität von Nicotinamid/Antid-Formulierungen bei 4°, 25° und 40°C
TABELLE 12 Effekt einer 1 : 3-Verdünnung von Antid/15% Gew./Gew. Nicotinamid-Lösungen in PBS
TABELLE 13 hGRF-Löslichkeit in wässrigen Nicotinamid-Lösungen
Legende (für die Abkürzungen in den Tabellen 1–13):

NB: = nicht bestimmt;
W: = Wochen;
Temp: = Temperatur;
WFI: = Wasser für injizierbare Präparate,
Ant.: = Antid,
Nic.: = Nicotinamid

TABELLE 14 Stabilität bei +40°C für GRF (2 mg/ml) + Nicotinamid-Lösungen, eingestellt auF pH 7,5
TABELLE 15 Stabilität bei +4°C für GRF (2 mg/ml) + Nicotinamid-LösungeN, eingestellt auF pH 7,5
Legende (für die Abkürzungen in den Tabellen 14–15):

nr: = nicht aufgetrennt. Succ-D3 + Asp⁸ können als überlappender Peak eluiert werden
?: = es ist eine weitere Charakterisierung notwendig um die Peak-Identität zu bestätigen
rtr: = Retentionszeitverhältnis

TABELLE 16 Stabilität von hGRF (5 mg/ml) in Propylenglykol+ Nicotinamid-Lösungen, eingestellt auf pH 7,5, bei +4°C
TABELLE 17 Stabilität von hGRF (5 mg/ml) in Propylenglykol + Nicotinamid-Lösungen, eingestellt auf pH 7,5, bei +40°C
TABELLE 18 Stabilität für hGRF (10 mg/ml) in 60% Propylenglykol + 20% Nicotinamid, 20% H₂O, eingestellt auf pH 7,5, bei +4°C
TABELLE 19 Stabilität von hGRF (10 mg/ml) in 60% Propylenglykol + 20% Nicotinamid, 20% H₂O, eingestellt auf pH 7,5, bei +25°C
TABELLE 20 Stabilität von hGRF (10 mg/ml) in 60% Propylenglykol + 20% Nicotinamid, 20% H₂O, eingestellt auf pH 7,5, bei +40°C
Literaturstellen
Bongers, J., et al., Int. J. Peptide. Protein Res. 39, 364–374, 1992; Cannon, I. B., J. Pharm. Sci., 84, 953–958, 1995; Felix, A.M., et al., Peptides, Herausg.: Giralt E. und Andreu D., S. 732–733, Escom Publishers 1991; Friedman, A. R., et al., Int. J. peptide. Protein Res., 37, 14–20, 1991; Golightly, L., et al., Med. Toxicol., 3, 128–165, 1988; Graham, C. W., et al., Anaesthesia & Analgesia, 56, 409–13, 1977; Jain, N. K., et al., The Eastern Pharmacist, November, 51–54, 1986, Physicians Desk Reference, Librium monograph, 47. Ausgabe, 1993; Leone Bay A., et al., J. Med. Chem., 39(13), 2571–2578, 1996; Maa, Y. F., et al., Int. J. Pharm, 140(2): 155–168, 1996; Rasool et al., J. Pharm. Sci., 80(4), 387–393, 1991; Sasaki H., Biol. Pharm. Bull. (Japan), 18/1, 169–171, 1995; Serono Symposia USA, Growth hormone secretagogues, Kap. 3, Herausgeber B. B. Bercu & R. F. Walker, Springer Verlag, New-York, 1996; Spiegel, A. J., et al., J. Pharm. Sci., 52, 917–927, 1963; Wang, Y-C. J., et al., J. Parenter. DrugAssoc., 34, 452–462, 1980; Yalkowsky, S. H., et a1., Drug Int. Clin. Pharm, 11, 417–419, 1977; Yalkowsky, S. H., et a1., J. Pharm. Sci., 74, 416–412, 1986.

Claims

Pharmazeutische Zubereitung, umfassend: a) einen LHRH-Peptid-Agonisten, einen LHRH-Antagonisten oder ein Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor-Peptid als aktives Ingredienz; b) Nicotinamid; und c) eine physiologische wässrige Lösung.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, worin das aktive Ingredienz ein LHRH-Peptid-Antagonist ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, in der das aktive Ingredienz Antid oder humaner GRF ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die lyophilisiert und rekonstituierbar ist und außerdem ein Stabilisierungsmittel oder mehrere Stabilisierungsmittel umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die außerdem Propylenglycol umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die für den parenteralen, oralen, nasalen oder pulmonalen Verabreichungsweg geeignet ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die außerdem ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipientien umfasst.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die für Injektionen geeignet ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 3, die die folgenden Zusammensetzungsbereiche hat: Antid oder hGRF 0,1–20,0 mg Nicotinamid 10–300 mg Propylenglycol 0–800 mg Wässrige Phase, q. s. 1,0 ml