ES2906791T3 - Composiciones farmacéuticas de veldoreotida soluble en agua con escasa solubilidad en condiciones fisiológicas y métodos de producción - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: veldoreotida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; un excipiente seleccionado de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPBCD) o dextrosa; y una microesfera polimérica, que comprende poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), en donde la veldoreotida o la sal farmacéuticamente aceptable de la misma y el excipiente están encapsulados en la microesfera polimérica; y en donde el área superficial de la microesfera polimérica es de desde 7 m2/g hasta 12 m2/g.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones farmacéuticas de veldoreotida soluble en agua con escasa solubilidad en condiciones fisiológicas y métodos de producción
Campo de la invención
La presente divulgación se dirige a composiciones farmacéuticas y métodos para usar tales composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones fisiológicas.
Antecedentes de la invención
El principal problema que dificulta el uso de péptidos lineales como fármacos se refiere al hecho de que tales péptidos existen en un rápido equilibrio entre múltiples conformaciones mientras que muy pocas de estas conformaciones son bioactivas. Esta flexibilidad conduce a una escasa selectividad, rápida digestión proteolítica y baja biodisponibilidad. Una de las mejores maneras de superar este problema es mediante la ciclación, que introduce restricciones conformacionales en los péptidos.
En los péptidos cíclicos naturales, la ciclación une cadenas laterales y/o grupos terminales específicos del péptido. Estos modos de ciclación, denominados modos clásicos de ciclación, están muy limitados debido al pequeño número de cadenas laterales de aminoácidos y extremos peptídicos que se prestan a la ciclación. Por lo tanto, la diversidad de posibles análogos cíclicos "clásicos" restringidos de una secuencia dada es pequeña.
La ciclación de la estructura principal supera estas limitaciones (Afargan etal., Novel Long-Acting Somatostain Analog with Endocrine Selectivity: Potent Suppression of Growth Hormone But Not of Insulin, Endocrinology, 142:1 (2001) 477-486). Aplicando esta tecnología, la ciclación tiene lugar mediante una interconexión covalente de uno o más nitrógeno(s) en a en la estructura principal peptídica entre sí o con los extremos amino o carboxilo o con una cadena lateral.
La somatostatina es un tetradecapéptido cíclico que se encuentra tanto en el sistema nervioso central como en los tejidos periféricos. Se aisló originalmente a partir de hipotálamo de mamíferos y se identificó como un importante inhibidor de la secreción de la hormona del crecimiento de la hipófisis anterior. Sus múltiples actividades biológicas incluyen la inhibición de la secreción de glucagón e insulina del páncreas, la regulación de la mayoría de las hormonas intestinales y la regulación de la liberación de otros neurotransmisores involucrados en la actividad motora y los procesos cognitivos en todo el sistema nervioso central. (Véase Lamberts, Endocrine Rev., 9:427, 1988). Además, la somatostatina y sus análogos son agentes antiproliferativos potencialmente útiles para el tratamiento de diversos tipos de tumores.
En su forma natural, la somatostatina tiene un uso limitado como agente terapéutico ya que presenta dos propiedades indeseables: escasa biodisponibilidad y corta duración de acción. Por esta razón, se han realizado grandes esfuerzos durante las últimas dos décadas para encontrar análogos de somatostatina que tengan superioridad en potencia, bioestabilidad, duración de acción o selectividad con respecto a la inhibición de la liberación de hormona de crecimiento, insulina o glucagón.
Un grupo de análogos de somatostatina (patentes estadounidenses N.os 4.310.518 y 4.235.886) incluye octreotida, el primer análogo de somatostatina clínicamente disponible aprobado.
Otro análogo de la somatostina es la veldoreotida (anteriormente conocida como PTR 3173 o DG3173), un péptido sintético de estructura principal cíclica, restringido conformacionalmente, que se representa en la Figura 1 y es el siguiente:
-Y-Abu-Phe-T rp-D-T rp-Lys-Thr-Phe-N-carbamoilmetilo
donde Abu es aminobutirilo.
El acetato de veldoreotida se describe más comúnmente como ciclo(-Y-aminobutiril-L-fenilalanil-L-triptofanil-D-triptofanil-L-lisil-L-treonil-L-fenilalanil-N-carbamoilmetil-Y-aminobutirilo), sal de acetato o ciclo(-Y-Abu-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-N-carbamoilmetil-Y-Abu), sal de acetato.
Octreotida y veldoreotida tienen una solubilidad similar en agua destilada para inyección, pero una solubilidad muy diferente en condiciones fisiológicas. Una vez que el acetato de veldoreotida avanzó a estudios en humanos, se encontró que, aunque el acetato de veldoreotida tiene la misma afinidad por el receptor para la inhibición de la GH que la octreotida, se requería una dosis mayor para el mismo efecto farmacológico, cuando ambos se inyectaban en tampón de ácido láctico. Al investigar la causa de este problema, se descubrió que el acetato de veldoreotida es escasamente soluble en condiciones fisiológicas, lo que lleva a una farmacocinética "flip-flop". Se ha encontrado en estudios previos con acetato de veldoreotida que la inyección de una solución de acetato de veldoreotida da como resultado reacciones adversas en el lugar de la inyección y biodisponibilidad limitada debido a su solubilidad relativamente baja en soluciones ¡sotónicas. Por lo tanto, se necesitan métodos para mejorar la solubilidad del acetato de veldoreotida en soluciones fisiológicas (isotónicas).
Compendio
La invención es tal como se establece en las reivindicaciones.
La presente divulgación tiene como objetivo proporcionar formulaciones que mejoren la solubilidad y dispersión de péptidos inyectables o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, mejoren la biodisponibilidad y distribución, y reduzcan las reacciones adversas en el lugar de la inyección.
Independientemente de las teorías y mecanismos discutidos en el presente documento en esta divulgación, la invención abarca las propiedades fisicoquímicas y farmacocinéticas mejoradas de las composiciones descritas en el presente documento independientemente del mecanismo real.
En determinadas realizaciones, se utilizan las propiedades únicas de actividad superficial de la veldoreotida. Por ejemplo, la veldoreotida reduce la tensión superficial del agua en más del 30% y sus propiedades anfifílicas únicas son coherentes con su uso como tensioactivo. Esta reducción de la tensión superficial se alivia parcialmente mediante la adición de dextrosa o polisacárido cíclico.
La invención también proporciona un procedimiento para fabricar microesferas poliméricas que comprende las etapas de:
(i) mezclar un azúcar seleccionado de hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPBCD) o dextrosa o una combinación de los mismos, y veldoreotida o una de sus sales farmacéuticamente aceptable en agua para formar una primera mezcla acuosa, en donde el péptido o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo es totalmente soluble en agua desionizada con una solubilidad en agua desionizada de desde 100 hasta 350 mg/ml pero es ligeramente soluble en condiciones fisiológicas, o de lo contrario en soluciones con iones cloruro, con una solubilidad de 2-3 mg/ml y el péptido o la sal farmacéuticamente aceptable precipita por salificación a una concentración superior a 3 mg/ml;
(ii) mezclar un polímero de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PGLA) en un disolvente orgánico tal como diclorometano para formar una solución polimérica;
(iii) mezclar la primera mezcla acuosa en la solución orgánica polimérica para formar una primera mezcla de dispersión que comprende una emulsión primaria de agua en aceite;
(iv) mezclar poli(alcohol vinílico) (PVA) en una cantidad del 0,1 al 3% en peso en solución salina tamponada con fosfato o en solución salina para formar una segunda mezcla acuosa;
(v) mezclar la emulsión primaria en la segunda mezcla acuosa de PVA para formar una emulsión doble de agua en aceite en agua para proporcionar una mezcla de dispersión secundaria;
(vi) permitir que el disolvente orgánico en la mezcla de dispersión secundaria se evapore para formar microesferas poliméricas sólidas, en donde el péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo se encapsula en las microesferas poliméricas;
(vii) lavar y aislar las microesferas poliméricas; y
(viii) secar las microesferas en condiciones de control con o sin la adición de una mezcla de tensioactivo y manitol durante el procedimiento de secado.
La invención también proporciona una composición farmacéutica de liberación prolongada producida mediante el procedimiento anterior. En esta realización, se proporciona una pluralidad de microesferas poliméricas que comprenden veldoreotida, en donde las microesferas poliméricas tienen un área superficial de desde aproximadamente 7 m2/g hasta aproximadamente 12 m2/g medido mediante, por ejemplo, el método Brunauer-Emmett-Teller (BET). En determinadas realizaciones, la pluralidad de microesferas poliméricas tienen un diámetro medio de desde aproximadamente 10 gm hasta aproximadamente 100 gm y más preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente 10 gm hasta aproximadamente 30 gm. En determinadas realizaciones, las microesferas poliméricas pueden comprender cantidades muy pequeñas de dextrosa, tal como desde aproximadamente el 0,1% en peso hasta aproximadamente el 1% en peso del peso total de las microesferas poliméricas. En otras realizaciones, las microesferas poliméricas pueden comprender un polisacárido cíclico de desde aproximadamente el 1% en peso hasta aproximadamente el 10% en peso del peso total de las microesferas poliméricas, y más preferiblemente desde aproximadamente el 2,5% en peso hasta aproximadamente el 5% en peso. En determinadas realizaciones, la veldoreotida comprende de desde aproximadamente el 10% en peso hasta aproximadamente el 30% en peso del peso total de las microesferas poliméricas, y más preferiblemente desde aproximadamente el 15% en peso hasta aproximadamente el 20% en peso.
Descripción de los dibujos y figuras
Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención se apreciarán más fácilmente a medida que se entiendan mejor con referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma junto con los dibujos adjuntos.
La Figura 1 representa la estructura química de veldoreotida.
La Figura 2 representa la estructura tridimensional tanto del acetato de veldoreotida como del acetato de octreotida. La Figura 3 muestra una fotografía de las formulaciones de emulsión de agua en aceite (w/o) de acetato de veldoreotida, acetato de octreotida y goserelina en 80:20 de aceite de semilla de algodón:agua para inyección (WFI). La Figura 4 muestra un gráfico de la concentración plasmática de acetato de veldoreotida en ratas inyectadas con diversas formulaciones de acetato de veldoreotida con o sin excipientes.
La Figura 5 muestra un gráfico que ilustra el efecto de la formulación IR de dextrosa/solución salina sobre el perfil PK de COR005 en ratas a 0,3 mg/kg de DEX:PEP relación 5:1.
La Figura 6 es un gráfico que ilustra el efecto sobre el perfil PK de COR005 en ratas de HPB/solución salina (HPB:PEP 15:1).
La Figura 7 es un gráfico que compara las formulaciones de HPB y DEX SC en cerdos enanos a 0,4 mg/kg.
La Figura 8 es un gráfico que compara la formulación de HPB con respecto a ácido láctico en cerdos enanos a 0,4 mg/kg.
La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto de DEX en el perfil PK de la formulación IR de acetato de COR005, SC, 0,4 mg/kg en cerdos enanos.
La Figura 10 es un gráfico que muestra el efecto de DEX en el perfil PK de la formulación IR de acetato de COR005, SC, 0,1 mg/kg en cerdos enanos.
La Figura 11 muestra un gráfico de la concentración plasmática de COR005 de los grupos de tratamiento SC B9-13. La Figura 12 muestra un gráfico de la farmacocinética "en ráfaga" de los grupos de tratamiento SC B9-13 para una única dosis SC.
La Figura 13 muestra el efecto de HPB en la liberación en ráfaga de COR005 PLGA MS.
La Figura 14 muestra el efecto de DEX en la liberación en ráfaga de COR005 PLGA MS.
La Figura 15 muestra el efecto de DEX:PEP 1:8 en cerdos enanos con perfiles PK de microesferas de PSI13 (B12: DXE:PEP 1:8).
La Figura 16 muestra el efecto de HPB:PEP 1:2 en cerdos enanos con perfiles PK de la formulación de microesferas de liberación en ráfaga B13.
La Figura 17 muestra el efecto de HPB:PEP 1:4 en cerdos enanos con perfiles PK de liberación en ráfaga de microesferas de composición B14.
La Figura 18 muestra perfiles IVR comparativos de COR005 de las formulaciones de microesferas B9-13.
La Figura 19 muestra una micrografía SEM de la morfología externa de la formulación de microesferas básica B10. La Figura 20 muestra una fotomicrografía de la morfología interna de la formulación de microesferas básica B10. La Figura 21 muestra una imagen SEM de la morfología externa de la formulación B12.
La Figura 22 muestra una imagen SEM de la morfología interna de la formulación B12.
La Figura 23 muestra una imagen SEM de la morfología externa de la formulación B13.
La Figura 24 muestra una imagen SEM de la morfología interna de la formulación B13.
La Figura 25 muestra las morfologías externa e interna de un MS de placebo con HPB pero sin péptido.
La Figura 26 muestra las morfologías externa e interna de un MS de placebo con DEX pero sin péptido.
La Figura 27 muestra imágenes SEM de la morfología de matrices internas de formulaciones de MS con diversas relaciones de HPB:PEP.
La Figura 28 muestra una micrografía SEM de liposomas formulados con acetato de veldoreotida.
La Figura 29 muestra la concentración plasmática (ng/ml, eje vertical) de veldoreotida a lo largo del tiempo (horas, eje horizontal) en ratas inyectadas con liposomas de acetato de veldoreotida frente a ratas inyectadas con acetato de veldoreotida en un vehículo de ácido láctico.
Descripción detallada de la invención
"Polímero", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de polímero que incluye, por ejemplo, un homopolímero, un copolímero, un copolímero de bloques, un copolímero aleatorio, y similares. A menos que se indique lo contrario, las especies descritas en el presente documento comprenden todos los isómeros individuales posibles, por ejemplo, cada enantiómero y diastereoisómero, y una mezcla de isómeros, tal como mezclas racémicas o escalémicas. Las especies enantioméricas pueden existir en diferentes formas isoméricas o enantioméricas. A menos que se especifique de otro modo, las especies enantioméricas discutidas en el presente documento sin referencia a su forma isomérica incluirán todas las diversas formas isoméricas, así como mezclas racémicas de formas isoméricas. Por ejemplo, la referencia al ácido láctico incluirá en el presente documento ácido L-láctico, ácido D-láctico y mezclas racémicas de los isómeros L y D de ácido láctico; la referencia a lactida incluirá en el presente documento L-lactida, D-lactida y DL-lactida (donde DL-lactida se refiere a mezclas racémicas de los isómeros L y D de lactida); de manera similar, la referencia a poli(lactida) incluirá en el presente documento poli(L-lactida), poli(D-lactida) y poli(DL-lactida); de manera similar, la referencia a poli(lactida-co-glicolida) incluirá en el presente documento poli(L-lactida-co-glicolida), poli(D-lactida-co-glicolida) y poli(DL-lactida-co-glicolida).
Tal como se usa en el presente documento, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a una condición normalmente presente en cuerpos de mamíferos (p. ej., ratón, rata o ser humano), tal como una solución que contiene solutos (p. ej., sales que comprenden iones cloruro) en concentraciones equivalentes a las que se encuentran en fluidos corporales de mamíferos. El término "isotónico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a fluidos, una solución que tiene la misma presión osmótica que alguna otra solución, especialmente una en una célula o un fluido corporal. En algunos casos, una solución isotónica tiene la misma concentración de solutos que la sangre, tal como una solución salina isotónica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "veldoreotida" es un polímero cíclico también conocido como ciclo(-Y-aminobutiril-L-fenilalanil-L-triptofanil-D-triptofanil-L-lisil-L-treonil-L-fenilalanil-N-carbamoilmetil-Y-aminobutirilo). También se conoce como "COR-005", "COR005", que se usa indistintamente en el presente documento. Anteriormente se conocía como PTR 3173 o DG3173. Los términos "acetato de veldoreotida", "acetato de COR-005", "acetato de COR005", usados indistintamente en el presente documento, se refieren a la sal monoacetato de veldoreotida.
La presente invención combina análogos de péptidos sintéticos de estructura principal cíclica conformacionalmente restringidos con excipientes para aumentar la solubilidad en soluciones isotónicas así como para aumentar la absorción y la biodisponibilidad cuando tales péptidos se suministran mediante inyección. La presente invención también divulga formulaciones de análogos de péptidos sintéticos de estructura cíclica conformacionalmente restringidos con o sin excipientes que demuestran una farmacocinética mejorada y reacciones reducidas en el sitio de inyección.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, un polímero y, opcionalmente, un excipiente, en donde el excipiente es un secuestrante hidrófobo, un azúcar o un aminoácido.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, un polímero que forma microesferas y, opcionalmente, un excipiente, donde el excipiente es un secuestrante hidrófobo, un azúcar o un aminoácido.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, un polímero que forma microesferas, en donde el polímero es PLGA, y opcionalmente, un excipiente, en donde el excipiente es un secuestrante hidrófobo, un azúcar o un aminoácido.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, un polímero y un excipiente, en donde la composición farmacéutica forma un gel.
La composición farmacéutica puede formar una emulsión que comprende un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, una fase oleosa, una fase acuosa y, opcionalmente, un excipiente, en donde el excipiente es un secuestrante hidrófobo, un azúcar o un aminoácido, en donde la composición farmacéutica es una emulsión.
La composición farmacéutica puede comprender un péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el péptido es soluble en agua, pero tiene baja solubilidad en condiciones isotónicas, un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, un agente liposomal que forma liposomas y, opcionalmente, un excipiente en donde el excipiente es un secuestrante hidrófobo, un azúcar o un aminoácido.
Los péptidos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en cualquiera de las realizaciones pueden ser veldoreotida y sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, acetato de veldoreotida. El péptido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede actuar como emulsionante de agua en aceite y tener un balance hidrófilo-lipófilo de entre 3 y 8.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, acetato, trifluoroacetato, citrato, oxalato, malonato, salicilato, p-aminosalicilato, malato, fumarato, succinato, ascorbato, maleato, sulfonato, fosfonato, perclorato, nitrato, formiato, propioniato, gluconato, lactato, tartrato, pamoato, hidroximaleato, piruvato, fenilacetato, benzoato, p-aminobenzoato, p-hidroxibenzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, nitrito, hidroxietanosulfonato, etilensulfonato, p-toluensulfonato, naftilsulfonato, sulfanilato, canfersulfonato, mandelato, ometilmandelato , hidrogeno-bencenosulfonato, picrato, adipato, D-o-toliltartrato, tartronato, a-toluato, (o, m, p)-toluato, sulfonato de naftilamina, octanoato, palmitato, estearato, sal de ácido graso, otra sal de ácido mineral y ácidos carboxílicos.
El azúcar puede ser hidroxipropil-p-ciclodextrina o dextrosa. La dextrosa puede estar presente en aproximadamente el 2,5% en peso de la composición. El aminoácido puede ser cualquier aminoácido, incluyendo lisina o arginina, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, tal como una sal clorhidrato, por ejemplo, clorhidrato de L-lisina o clorhidrato de L-arginina. Los secuestrantes hidrófobos pueden tener al menos un grupo amino libre.
Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables pueden incluir tampón acetato isotónico, ácido láctico, solución salina y solución salina tamponada con fosfato. El portador farmacéuticamente aceptable puede estar en una concentración de aproximadamente el 0,45% en peso de la composición, por ejemplo, solución salina al 0,45%.
Los polímeros pueden incluir polímeros que forman una matriz, que forman partículas, que forman microesferas, que forman un gel y que son biocompatibles.
Los polímeros que forman microesferas pueden incluir PLGA. El PLGA puede comprender una relación 50:50 de ácido láctico con respecto a ácido glicólico. Los polímeros que forman un gel pueden incluir gomas de celulosa y sus derivados, tal como carboximetilcelulosa. Los polímeros usados para formar un gel pueden caracterizarse como agentes modificadores de la viscosidad, espesantes y agentes gelificantes (gelificantes). Los agentes de este tipo aumentan la viscosidad de los fluidos a los que se añaden y pueden formar geles. Los polímeros de este tipo pueden tener una viscosidad promedio de 1500-3000 cps en una solución acuosa al 1%. Los polímeros de este tipo también pueden interactuar con el péptido o su sal farmacéuticamente aceptable y una ciclodextrina para formar un gel.
Los agentes liposomales que forman liposomas pueden incluir cualquier agente liposomal farmacéuticamente aceptable, incluyendo la fosfatidilcolina y sus derivados, tal como 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), HSPC, colesterol, DSPG, DOPC, DPPG, LIPOVA-E120, LECIVA-S70, LECIVA-S90, PG de huevo, MPEG-DSPE, aceite de soja, polisorbato-80, esfingomielina de huevo y fosfatidilcolina.
Las composiciones farmacéuticas tal como se describen en el presente documento en donde el polímero forma microesferas pueden tener mayor porosidad, mayor área superficial, mayor liberación de péptidos, mayor liberación del péptido durante un primer período de 24 horas tras la inyección de la composición farmacéutica en un paciente en comparación con las microesferas sin el excipiente Las composiciones farmacéuticas en donde el polímero forma microesferas también pueden mostrar un perfil de liberación sostenida durante al menos una, dos o cuatro semanas tras la inyección de la composición farmacéutica en un paciente. Además, los polímeros pueden encapsular el excipiente, el péptido o su sal farmacéuticamente aceptable o tanto el excipiente como el péptido o su sal farmacéuticamente aceptable y el péptido o su sal farmacéuticamente aceptable y el excipiente pueden localizarse conjuntamente dentro del polímero. Los polímeros de las realizaciones anteriores también pueden tener un peso molecular promedio de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 17 kilodaltons o 38 y 54 kilodaltons.
Las composiciones farmacéuticas pueden inyectarse mediante una aguja de calibre pequeño, tan pequeña como 27G.
La fase oleosa puede incluir semilla de algodón o aceite o cualquier aceite farmacéuticamente aceptable. La fase acuosa de las realizaciones anteriores puede incluir agua o cualquier vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden formar una emulsión que es una emulsión de agua en aceite. La relación de la fase oleosa con respecto a la fase acuosa puede estar entre 50,1:49,9 y 99,9:0,01. La relación de la fase oleosa con respecto a la fase acuosa puede ser de 80:20. En las composiciones farmacéuticas que forman una emulsión, el péptido o su sal farmacéuticamente aceptable puede actuar como emulsionante en una concentración de aproximadamente el 1% peso/volumen.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente liposomal pueden mostrar un perfil de liberación lenta del péptido o su sal farmacéuticamente aceptable durante al menos 48 horas. El perfil de liberación lenta puede comprender una concentración plasmática terapéuticamente eficaz del péptido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo durante al menos 48 horas.
Un péptido notable es la veldoreotida y una de sus sales farmacéuticamente aceptables es acetato de veldoreotida.
El acetato de veldoreotida ha mejorado la selectividad de unión y un perfil de unión único al subtipo de receptor SST SST-R2, SST-R4 y SST-R5 y ofrece un candidato a fármaco con un claro potencial terapéutico para el tratamiento de tumores carcinoides, acromegalia y complicaciones asociadas a diabetes, un análogo único selectivo para los subtipos 2, 4 y 5 del receptor de somatostatina, reduce eficazmente la secreción de GH en adenomas hipofisarios secretores de GH humanos, incluso en tumores que no responden a octreotida. El acetato de veldoreotida tiene ventajas significativas sobre cualquier otro análogo de somatostatina actualmente disponible, incluyendo octreotida, ya que es equipotencial con respecto a los análogos de somatostatina disponibles en la inhibición de la hormona del crecimiento sin efectos no selectivos sobre la insulina o el glucagón. Por lo tanto, el acetato de veldoreotida puede mejorar la disponibilidad de farmacoterapias para anomalías endocrinas asociadas con la secreción excesiva de hormona de crecimiento e IGF-1 con mejor selectividad y mejor control glucémico de estos pacientes.
Según la presente invención, pueden combinarse análogos de péptidos sintéticos de estructura principal cíclica conformacionalmente restringidos con excipientes para formar una composición farmacéutica para la administración a un paciente. Por ejemplo, aunque el acetato de veldoreotida es una molécula soluble en agua, determinados excipientes mejoran inesperadamente la solubilidad del acetato de veldoreotida en condiciones isotónicas.
La composición farmacéutica que comprende péptidos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y excipientes puede combinarse con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables para formular la composición para su administración a pacientes.
El péptido cíclico veldoreotida está compuesto por una combinación específica de residuos de aminoácidos que contribuyen a sus propiedades fisicoquímicas únicas además de su mecanismo de acción biológica. La combinación de los aminoácidos hidrófobos en posiciones; Phe6, Trp7, D-Trp8, Phe11 opuestos a los dos grupos de cabeza hidrófilos de la amina cargada de Lys9 y los grupos polares de cabeza hidroxilo de Thr10, crea dos dominios hidrófilos frente a hidrófobos distintivos. Como resultado de sus dominios hidrófobos e hidrófilos distintivos, el giro beta tridimensional y la forma de sal específica de un solo contraión de acetato, el acetato de veldoreotida tiene un carácter anfifílico y, por lo tanto, se considera un péptido anfífilo y también tiene una propiedad de tensioactivo. La figura 2 muestra una comparación de las estructuras tridimensionales del acetato de veldoreotida y el acetato de octreotida, que muestra que el acetato de veldoreotida tiene una sola amina libre en el residuo de lisina con un solo contraión de acetato, mientras que la octreotida tiene dos contraiones de acetato, uno en el residuo de lisina. y uno en la amina terminal.
Dada la utilidad farmacéutica de los análogos de somatostatina, en particular el acetato de veldoreotida, un análogo de somatostatina de estructura principal cíclica con propiedades anfifílicas aumentadas como agente emulsionante y gelificante, y tensioactivo de agua en aceite, tales composiciones pueden usarse para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, diabetes tipo 2, acromegalia, trastornos metabólicos, trastornos endocrinos y exocrinos, y tumores relacionados con hormonas con farmacoterapia mejorada caracterizada por menos efectos adversos y acción prolongada del fármaco.
Otra ventaja de la composición farmacéutica es que la composición de acetato de veldoreotida con los excipientes de la presente divulgación mejora la biodisponibilidad y sorprendentemente reduce las reacciones adversas en el sitio de inyección.
Se ha descubierto que el acetato de veldoreotida y otros análogos de somatostatina de estructura principal cíclica poseen una bioestabilidad metabólica considerable frente a la degradación por enzimas.
El acetato de veldoreotida ejerce una inhibición significativa con una duración de acción prolongada sobre el eje de la hormona de crecimiento-IGF-1 de una magnitud similar a la del fármaco octreotida, pero carece de las desventajas de la octreotida, tales como la inhibición de la secreción de insulina. El acetato de veldoreotida también tiene un efecto considerablemente menor sobre la liberación de glucagón que la octreotida, por lo que tiene la ventaja de no provocar hiperglucemia, lo que lo convierte en un compuesto muy atractivo para mejorar el control glucémico de pacientes acromegálicos y para el tratamiento de la diabetes tipo 2.
El acetato de veldoreotida muestra una inhibición significativa del crecimiento de la expresión de células CHO de SST-R5 humana clonada, lo que indica un papel potencial en el tratamiento de tumores que expresan SST-R5 (p. ej., carcinoides, tumores hipofisarios). El acetato de veldoreotida inhibe la liberación de cromogranina A de la línea celular carcinoide humana, lo que indica un efecto antitumoral.
El perfil farmacocinético único del acetato de veldoreotida evaluado en animales es consistente con su estabilidad metabólica evaluada in vitro frente a diversas enzimas y homogeneizados tisulares. Tras la administración subcutánea a ratas, el acetato de veldoreotida tuvo una vida media circulatoria de aproximadamente 3 horas, sobrepasando significativamente al fármaco de acción prolongada octreotida, que tiene una vida media circulatoria de solo 40 minutos. Esta vida media prolongada se debe a su cinética de "flip-flop" única, como resultado de su liberación lenta desde el sitio de inyección.
El acetato de veldoreotida es selectivo para los receptores de somatostatina y se une significativamente menos a otros receptores acoplados a proteína G clonados humanos que octreotida. Esta característica es ventajosa porque la unión a receptores que no son de somatostatina podría provocar efectos adversos potenciales en humanos.
También se ha encontrado que el acetato de veldoreotida no es mitogénico para los linfocitos humanos en ensayos de proliferación de linfocitos en sangre periférica humana.
Se ha encontrado que el acetato de veldoreotida tiene una solubilidad relativamente alta en agua, dextrosa al 5%, acetona y diversos alcoholes, incluyendo etanol, glicerol y propilenglicol. También se ha encontrado que el acetato de veldoreotida tiene una solubilidad relativamente alta en soluciones acuosas ácidas tales como ácido láctico, ácido acético y ácido trifluoroacético. Inesperadamente, se descubrió que la solubilidad del acetato de veldoreotida en ácido clorhídrico depende de la concentración (el aumento de la concentración de cloruro dio como resultado una disminución de la solubilidad debido a la precipitación/salificación del péptido). Esta incompatibilidad con el cloruro condujo al descubrimiento de su solubilidad relativamente baja en condiciones fisiológicas (es decir, cloruro de sodio al 0,9% pH 4,5 y solución salina tamponada con fosfato pH 7,2) que no depende del pH.
La solubilidad limitada del acetato de veldoreotida en condiciones fisiológicas es una propiedad muy específica del péptido y se desconocía anteriormente. Dada su solubilidad en agua relativamente alta, el acetato de veldoreotida se considera un fármaco soluble en agua. Fue sorprendente e inesperado encontrar que el acetato de veldoreotida, un fármaco soluble en agua, tenía baja solubilidad en condiciones fisiológicas.
La estructura tridimensional del acetato de veldoreotida contiene un giro p de tipo II específico, una conformación que es típica en la mayoría de los análogos de somatostatina. Como resultado de esta conformación, la flexibilidad tridimensional del péptido se ve restringida y da como resultado la superposición de los residuos hidrófobos (aromáticos) expuestos en el exterior del anillo peptídico frente al entorno acuoso.
Otros análogos cíclicos de somatostatina, es decir, octreotida, lanreotida, valpreotida y pasireotida, contienen dos grupos amino libres (grupos de cabeza cargados positivamente); uno es la amina del residuo de lisina y la otra amina en el extremo amino de estos péptidos. El acetato de veldoreotida tiene solo una amina libre como grupo de cabeza polar. Su extremo amino es una amida.
Además, a diferencia de la mayoría de análogos de somatostatina que tienen 1-2 aminoácidos de fenilalanina y 1 de triptófano, el acetato de veldoreotida tiene 2 aminoácidos de fenilalanina y 2 de triptófano en su secuencia.
La veldoreotida es una molécula cíclica. El papel principal de la ciclación es reducir o restringir el espacio conformacional o la forma tridimensional (3D) de la molécula. Por lo tanto, como tal, es una molécula restringida conformacionalmente. Sin embargo, aunque el péptido está restringido por su estructura cíclica, su estructura o conformación 3D en diversos medios acuosos puede depender de las interacciones inter e intramoleculares de los enlaces H-H. El enlace H-H es el factor dominante de la estructura 3D de péptidos y polipéptidos.
El acetato de veldoreotida tiene una serie de donadores y aceptores de H: 12 donadores de hidrógeno y 10 aceptores de hidrógeno. Otros análogos cíclicos de somatostatina tienen relaciones similares de donadores de hidrógeno con respecto a aceptores de hidrógeno. Por ejemplo, el acetato de octreotida tiene 13 donadores de hidrógeno y 10 aceptores de hidrógeno.
Debido a que tiene el doble de aminoácidos hidrófobos - 2 Trp y 2 Phe y solo un único catión/amina, la veldoreotida tiene una relación 5:2 de grupos hidrófobos con respecto a hidrófilos. En particular, hay más grupos hidrófobos que grupos hidrófilos en el acetato de veldoreotida. El acetato de octreotida tiene solo 1 Trp y 2 Phe pero, lo que es más importante, tiene dos cationes/aminas y un OH terminal adicional y una relación 3:5 de grupos hidrófobos con respecto a hidrófilos. Esto hace que el acetato de octreotida sea más soluble en agua y con menos actividad superficial que el acetato de veldoreotida.
El péptido veldoreotida tiene una composición única de aminoácidos hidrófobos que dominan la porción hidrófila del péptido. Esta composición da como resultado un grado relativamente alto de anfifilicidad. Esta propiedad anfifílica afecta la partición de péptidos en medios acuosos. Tiende a concentrarse en la superficie del medio con el fin de exponer los residuos hidrófobos al aire para proporcionar estabilidad termodinámica. Cuando se concentra en la superficie acuosa, reduce la tensión superficial de la solución.
La tensión superficial es la propiedad de las moléculas de un fluido de adherirse entre sí en la interfase fluido/aire con más fuerza que a las moléculas de aire, y hace que el fluido se comporte como si su superficie estuviera cubierta con una membrana elástica estirada. A menudo, los solutos reducirán la tensión superficial en comparación con la del disolvente puro. El agua y diversas soluciones isotónicas tienen una tensión superficial en el intervalo de aproximadamente 65-72 dinas/cm a 25°C. Un péptido con actividad superficial disminuirá la tensión superficial: cuanto mayor sea la actividad superficial de un soluto, menor será la tensión superficial, y más libremente las moléculas u objetos pueden pasar a través de la interfase. El acetato de veldoreotida reduce la tensión superficial del agua bidestilada (pH = 5,0) hasta aproximadamente 45 dinas/cm (véase la tabla 3).
Cuando un péptido se disuelve en una solución acuosa, los aminoácidos hidrófobos generalmente forman áreas hidrófobas protegidas, mientras que los aminoácidos hidrófilos interactúan con las moléculas de solvatación y permiten que los péptidos formen enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua circundantes. Si una parte suficiente de la superficie del péptido es hidrófila, el péptido puede disolverse en agua. Cuando aumenta la concentración salina, por ejemplo en medios fisiológicos tales como PBS o NaCl al 0,9%, algunas de las moléculas de agua son atraídas por los iones salinos, lo que disminuye el número de moléculas de agua disponibles para interactuar con la parte cargada del péptido mediante enlaces de hidrógeno. Como resultado de la mayor demanda de moléculas de disolvente, las interacciones péptido-péptido son más fuertes que las interacciones disolvente-soluto; dando como resultado la desolvatación del péptido. Las moléculas peptídicas se coagulan formando interacciones hidrófobas entre sí. Este proceso se conoce como precipitación por salificación.
Basándose en sus propiedades anfifílicas, se evaluó el acetato de veldoreotida mediante formulación en emulsión. Sin embargo, se encontró que el acetato de veldoreotida no actúa como un emulsionante o/w de aceite en agua. Sorprendentemente, se encontró que el acetato de veldoreotida es un emulsionante de agua en aceite (w/o). La emulsión obtenida con acetato de veldoreotida con agua en aceite dio como resultado una emulsión de w/o estable. Por lo tanto, el acetato de veldoreotida puede considerarse un tensioactivo iónico de w/o o hidrótropo con un balance hidrófilo lipofílico (HLB) de 6.
Debido a su alta relación de grupo hidrófobo con respecto a grupo de cabeza polar (4:1), el acetato de veldoreotida es más anfifílico y tiene un comportamiento de tensioactivo mejorado, como lo demuestran los datos de la tabla 3.
Formulaciones de veldoreotida con diversos excipientes
Los excipientes pueden mejorar la solubilidad, la dispersión y la biodisponibilidad de péptidos inyectables tales como el acetato de veldoreotida V. Tales excipientes pueden incluir secuestrantes hidrófobos, azúcares y aminoácidos tales como hidroxipropil-p-ciclodextrina, L-lisina HCl y dextrosa.
Hidroxipropil-p-ciclodextrina
La hidroxipropil-p-ciclodextrina (HP-p-CD o HPBCD) es un oligosacárido cíclico compuesto por 7 unidades de dextrosa unidas a través de enlaces 1-4 que poseen interiores relativamente lipófilos y exteriores relativamente hidrófilos y tienden a formar complejos de inclusión (Chang, patente estadounidense N.° 7.259.153).
Sin estar ligado a ninguna hipótesis en particular, la HPBCD puede formar complejos de inclusión con las porciones hidrófobas de veldoreotida, lo que reduce su hidrofobicidad eficaz. Las relaciones de HPBCD:PEP de 1:2 o superiores (p. ej., 10:1) mejoran la solubilidad del péptido en condiciones fisiológicas. Sin embargo, la relación utilizada para lograr el perfil farmacocinético y la biodisponibilidad deseados (1 HPBCD:4 PEP) no mejora la solubilidad de altas concentraciones de veldoreotida en medios fisiológicos (solución salina o solución salina tamponada con fosfato), pero se muestra que modula las propiedades físicas de la péptido tal como se evidencia por la tensión superficial. El complejo de HPBCD con acetato de veldoreotida proporcionó una tensión superficial de más de 50 dinas/cm en comparación con 45 dinas/cm del acetato de veldoreotida no complejado (véase la tabla 3). Esto indica que el complejo HPBCD:acetato de veldoreotida actúa menos en la superficie y más en la solución a granel. La formación de complejos con ciclodextrinas para mejorar la solubilidad se produce en una relación de ciclodextrina con respecto a péptido de 1:1 a 10:1, exactamente lo contrario de lo observado. La solvatación mejorada del acetato de veldoreotida con HPBCD proporciona menos cambios en la tensión superficial en comparación con la ausencia de HPBCD.
La presente invención combina análogos cíclicos de somatostatina con HP-p-CD para aumentar la solubilidad en soluciones isotónicas así como para aumentar la absorción y la biodisponibilidad cuando tales péptidos se suministran mediante inyección. Además, sorprendentemente se encuentran efectos secundarios adversos reducidos en el sitio de inyección.
L-lisina HCl
Se ha observado que la solubilidad del acetato de veldoreotida se reduce en soluciones que contienen iones cloruro. Por ejemplo, aunque es soluble en HCl 0,1 N, el acetato de veldoreotida es insoluble en HCl 0,9 N. De manera similar, el acetato de veldoreotida tiene una solubilidad limitada en soluciones isotónicas que contienen cloruro, incluyendo solución salina al 0,9% y solución salina tamponada con fosfato.
Se ha descubierto inesperadamente que el acetato de veldoreotida es muy soluble en Tris-HCl 20 mM a pesar del contenido de cloruro de esta solución tampón. Sin embargo, a medida que aumenta la concentración de cloruro, la solubilidad del acetato de veldoreotida se reduce drásticamente. Por ejemplo, la solubilidad del acetato de veldoreotida se reduce significativamente si la concentración de Tris-HCl aumenta hasta 137 mM o se añade NaCl 117 mM.
Como es evidente a partir de la estructura de Tris, el resto de TRIZMA/tampón Tris está compuesto por una amina libre. Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la amina TRIZMA compite con la amina libre del residuo de lisina en el acetato de veldoreotida por el cloruro en solución. Incluso con una mayor concentración de cloruro, este efecto da como resultado una mayor solubilidad del péptido, ya que puede disolverse con menos cloruro alrededor del grupo amino libre. Esto se confirma por la disminución de la solubilidad del acetato de veldoreotida en T ris-HCl a medida que aumenta la concentración de cloruro.
En vista de la solubilidad del acetato de veldoreotida en Tris-HCl, se sometió a prueba la solubilidad del acetato de veldoreotida en soluciones que contenían L-lisina y L-lisina HCl.
Se descubrió inesperadamente que la L-lisina, a pesar de tener una amina libre para competir con la amina de acetato de veldoreotida por el cloruro, no mejoraba sustancialmente la solubilidad del acetato de veldoreotida. Sin embargo, más sorprendentemente, se descubrió que la adición de L-lisina HCl mejoraba sustancialmente la solubilidad del acetato de veldoreotida en medios isotónicos y limitaba la precipitación del péptido.
Dextrosa
También se ha descubierto inesperadamente que la biodisponibilidad del acetato de veldoreotida en soluciones isotónicas y fisiológicas mejora mediante la adición de dextrosa como excipiente. Se encontró que el acetato de veldoreotida es totalmente soluble en dextrosa al 5% (USP), con una solubilidad de aproximadamente 400 mg/ml. Sorprendentemente, la dextrosa al 5% no mejora la solubilidad de altas concentraciones de veldoreotida en medios fisiológicos (solución salina o solución salina tamponada con fosfato). Esto es contrario a la solubilidad muy alta de veldoreotida en dextrosa al 5% en agua. El perfil farmacocinético y la biodisponibilidad mejorados de LAR se logran a pesar de la baja relación dextrosa:péptido utilizada (1:8). No se espera que una relación tan baja mejore la solubilidad del péptido en medios fisiológicos, pero aquí se muestra que modula las propiedades físicas del péptido, como lo demuestra el comportamiento de la tensión superficial.
Sin estar ligado a ninguna hipótesis en particular, la dextrosa mejora la solvatación del agua alrededor de los grupos polares del péptido. La solvatación mejorada del acetato de veldoreotida con dextrosa proporciona menos cambios en la tensión superficial en comparación con la ausencia de dextrosa. El complejo de dextrosa con acetato de veldoreotida proporcionó una tensión superficial de más de 50 dinas/cm en comparación con 45 dinas/cm del acetato de veldoreotida no complejado (véase la tabla 3). Esto indica que el complejo dextrosa:acetato de veldoreotida actúa menos en la superficie y más en la solución a granel. Esta interacción aumenta la hidrofilia de la veldoreotida y, por lo tanto, se concentrará más péptido en la solución a granel que en la superficie. Esto mejora la biodisponibilidad de veldoreotida.
La presente invención combina análogos cíclicos de somatostatina con dextrosa para aumentar la solubilidad en soluciones isotónicas así como para aumentar la absorción y la biodisponibilidad cuando tales péptidos se administran mediante inyección. Además, sorprendentemente se encuentran efectos secundarios adversos reducidos en el lugar de la inyección.
La nicotinamida es otro excipiente útil en las composiciones (véase la patente estadounidense N.° 6.331.520.
Formulaciones de liberación sostenida (SR)
Formulaciones de microesferas
Dada la farmacocinética de los análogos cíclicos de somatostatina, a menudo es deseable proporcionar formulaciones de liberación sostenida in vivo. Pueden usarse varios métodos para lograr la liberación sostenida, incluyendo el uso de diversas formulaciones a base de polímeros, tal como el uso de microesferas e hidrogeles de PLGA. También pueden ser útiles las emulsiones y las formulaciones de liposomas. Si bien las formulaciones de liberación sostenida, incluyendo emulsiones, geles, microesferas y liposomas, pueden disminuir las reacciones en el sitio de inyección, mejorar la biodisponibilidad y proporcionan un perfil de liberación sostenida, basándose en los hallazgos con excipientes para formulaciones de liberación inmediata, el uso de tales excipientes en formulaciones de liberación sostenida fue investigó y, sorprendentemente, se descubrió que el uso de tales excipientes mejoraba la farmacocinética de los análogos de somatostina cíclica en vivo y para reducir las reacciones en el lugar de la inyección.
Los análogos cíclicos de somatostatina pueden prepararse en microesferas de PLGA utilizando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como la divulgada en el Ejemplo 7. Los análogos cíclicos de somatostatina también pueden formularse en emulsiones y geles basándose en sus propiedades específicas.
Sin estar ligado a ninguna hipótesis en particular, la diferencia entre las microesferas puede deberse a cómo los excipientes interactúan con la estructura 3D de veldoreotida, lo que puede estar relacionado con su actividad superficial. Tal como se muestra en la tabla 3, la tensión superficial de la solución de dextrosa-acetato de veldoreotida es similar a la de la solución de HPBCD-acetato de veldoreotida, con 54 y 51 Dina/cm, respectivamente. Sin embargo, la estructura microscópica de las microesferas preparadas con HPBCD y dextrosa es diferente.
La HPBCD tiene un peso molecular (PM) mucho más alto que la dextrosa, prácticamente en el mismo intervalo del PM del péptido. La HPBCD tiene un núcleo hidrófobo que puede interactuar con restos hidrófobos tales como los residuos hidrófobos del péptido, creando uno o más complejos de inclusión con las porciones hidrófobas del péptido. Las porciones del péptido atrapadas en el/los complejo(s) de inclusión pueden impartir menos movilidad y menos disponibilidad para acceder al polímero cuando se introduce el polímero hidrófobo. El complejo con HDPCD da como resultado una disminución eficaz de la hidrofobicidad del péptido. Como resultado, la interacción superficial entre el péptido y la solución de polímero está menos favorecida, y el complejo de HPBCD con el péptido atrae el agua. Esto dará como resultado una menor dilución/dispersión de HPBCD en la solución de polímero, lo que establece una estructura interna de gotas grandes y, como resultado, se forman menos poros pero con un diámetro más grande y menos área superficial en comparación con las microesferas que contienen dextrosa.
En las microesferas que contenían dextrosa se observaron un mayor número de poros de pequeño diámetro. Como molécula pequeña, la dextrosa se dispersa/diluye mucho más en la solución peptídica en comparación con la HPBCD. Esta dextrosa diluida permite una mejor movilidad del péptido. Una mejor movilidad conducirá a una mejor distribución del péptido dentro de la solución de polímero. Esta mejor distribución/dispersión del péptido se debe a su propiedad hidrófoba. Cuando se añade el polímero hidrófobo, las porciones hidrófobas del péptido tenderán a ser atraídas por el polímero hidrófobo. En resumen, la dextrosa está afectando a la estructura 3D del péptido a través del enlace H-H, mejorando su solvatación y, debido a su pequeño PM, mejora la distribución y dispersión del péptido dentro de la solución polimérica hidrófoba. El resultado es una mayor densidad de poros en las microesferas. Los cambios en la estructura interna de las microesferas se reflejan en la superficie de las microesferas poliméricas medidas por métodos adecuados, tales como BET. Cuando se añade dextrosa o HPBCD en determinadas relaciones, tales como 1:8 (dextrosa con respecto a veldoreotida) y 1:2 o 1:4 (HPBCD con respecto a veldoreotida), a la emulsión primaria utilizada para formar las microesferas, las microesferas resultantes tienen un área superficial de aproximadamente 7 m2/g a aproximadamente 12 m2/g. Debe entenderse que pueden quedar sólo trazas de dextrosa en el producto final de microesferas, de modo que el efecto de la dextrosa en la formación de las microesferas puede ser en gran medida una función de la capacidad de la dextrosa de modificar la actividad superficial de la veldoreotida. Este efecto se analiza con más detalle en los ejemplos expuestos a continuación. Sin embargo, parece que cuando se usa HPBCD en las emulsiones primarias para formar las microesferas, gran parte de la HPBCD se retiene en el producto final de microesferas.
Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la relación en masa de dextrosa con respecto a veldoreotida en la emulsión primaria para formar las microesferas es de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:16 y más preferiblemente desde aproximadamente 1:4 hasta aproximadamente 1:8. Por tanto, en algunas realizaciones, la relación en masa puede ser de aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10. , 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15 o 1:16.
En determinadas otras realizaciones, la relación en masa de HPBCD con respecto a veldoreotida en la emulsión primaria para formar las microesferas es de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 1:8 y más preferiblemente desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:4. Por lo tanto, en algunas realizaciones la relación en masa puede ser de aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 o 1:8.
En realizaciones adicionales, la emulsión primaria para formar las microesferas puede incluir tanto dextrosa como HPBCD en diversas relaciones en masa con respecto a la veldoreotida tal como se estableció anteriormente.
Formulaciones de liposomas
También se ha descubierto que el acetato de veldoreotida puede formularse en liposomas que muestran un perfil de liberación sostenida durante al menos 48 horas en donde la concentración plasmática de acetato de veldoreotida se encuentra en un nivel terapéuticamente eficaz.
Los liposomas son vesículas concéntricas bicapa en las que un volumen acuoso está completamente encerrado por una bicapa lipídica membranosa compuesta principalmente de fosfolípidos naturales o sintéticos. Los liposomas se forman cuando las películas lipídicas delgadas o las tortas lipídicas se hidratan y las pilas de bicapas cristalinas líquidas se vuelven fluidas y se hinchan. Durante la agitación, las láminas de lípidos hidratados se desprenden y se autoasocian para formar vesículas, lo que evita la interacción del agua con el núcleo de hidrocarburo de la bicapa en los bordes. Dichos liposomas incluyen vesículas multilaminares (MLV) que están compuestas de un solo fosfolípido, que es fosfatidilcolina, más preferiblemente 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC).
Emulsiones y formulaciones de hidrogel
Se ha encontrado, tal como se indicó anteriormente, que el acetato de veldoreotida actúa como tensioactivo y puede emulsionar agua en aceite. Además, dadas sus propiedades anfifílicas, el acetato de veldoreotida también puede formularse en forma de hidrogel. Ambos vehículos pueden proporcionar formulaciones de liberación sostenida.
Sorprendentemente, se ha descubierto que la inyección de acetato de veldoreotida en una formulación de emulsión de agua en aceite reduce y retrasa la aparición de reacciones de conjunto de inyección y puede inyectarse usando una aguja tan pequeña como 27G.
Además, se ha descubierto que el acetato de veldoreotida puede formar un hidrogel estable que retrasa la inducción de reacciones en el sitio de inyección y también puede inyectarse con una aguja tan pequeña como 27G.
Por lo tanto, se ha descubierto que las formulaciones de emulsión e hidrogel de acetato de veldoreotida son más fáciles de inyectar y producen menos reacciones en el sitio de inyección al tiempo que proporcionan una formulación de liberación sostenida de acetato de veldoreotida.
Ejemplos
La presente invención se demuestra en los siguientes ejemplos, entendiéndose que estos son solo para fines ilustrativos, y no se pretende que la invención se limite a ellos.
Materiales
Acetato de COR005 (Lonza, DADR-APJ-001-5AN1R)
Hidroxipropil p ciclodextrina - HPB (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania (grado farmacéutico) Ciclodextrina HPB Farm. Eur., NF 1.4220.0050)
Dextrosa al 5% -USP — DEX (Teva Medical Dextrosa al 5% AWB0064 pH 4,0252 mOsmol/l pH 4,0 252 mOsmol/l)
Agua estéril para inyección - WFI (Norbrook laboratories Irlanda del Norte. B.W. 4364-90)
Manitol -M200 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania (grado farmacéutico) Parteck M200 Emprove exp Farm. Eur, BP, JP, USP, E 421)
Solución de ácido láctico (90%) -(Sigma Aldrich espec. USP L6661 Lote n.° MKBR6268V)
Solución salina normal al 0,9% de NaCl, pH 5,0 (Teva Medical AWB1324 lote XP5E035 pH 5,0, 308 mOsmol/l)
PBS 10 mM pH 7,4 sin calcio ni magnesio (Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco Biological Industries REF02023-1A).
Abreviaturas
NS - Solución salina normal (NaCl al 0,9%), IR - Liberación inmediata, F- Biodisponibilidad absoluta calculada frente al AUC de la IV del vehículo Ir (ratas o cerdos enanos), MS - Microesferas, SC - subcutánea, BA - Biodisponibilidad absoluta, Cmax - Concentración plasmática máxima, MAN- Manitol, HPB - Hidroxipropil p ciclodextrina DEX - Dextrosa, PEP - Péptido - Acetato de COR005, Lys-HCl - Clorhidrato de lisina, Est. - Estimado por UV-Vis., NT - No probado., NE- No aplicable debido a variabilidad
EJEMPLO 1
Se cribó la solubilidad del acetato de veldoreotida en medios acuosos mediante el siguiente método. Se pesó una cantidad fija de 10 miligramos del péptido y se disolvió a temperatura ambiente mediante volúmenes crecientes (incrementales) del medio de prueba hasta que se observó solubilidad completa, es decir, solución clara/transparente y ausencia de cualquier precipitado (los valores de punto final de solubilidad se definieron según la guía de la USP). Tras los resultados de los estudios de cribado, se seleccionaron varios medios para estudios de verificación basados en la valoración cuantitativa de la concentración de péptido por HPLC (solubilidad máxima). Los resultados del estudio de cribado se representan en la tabla 1, mientras que los resultados de los estudios de verificación se incluyen en la tabla 2. Como puede apreciarse a partir de los datos, el acetato de veldoreotida demuestra alta solubilidad en agua y otros medios acuosos, pero tiene una solubilidad limitada en medios isotónicos.
TABLA 1: Cribado de la solubilidad del acetato de veldoreotida
Medios acuosos (a base de agua)
Medio (ml) / 0,01 ml 0,1 ml 0,5 ml 1 ml 10 ml Resultados acetato de veldoreotida Muy Fácilmente Soluble Moderadamente soluble Ligeramente Definición de - 10 mg soluble soluble (0,02 g/ml; (0,01 g/ml; 10 mg/ml) soluble USP (1g/ml) (0,1 g/ml) 20 mg/ml) (0,001 g/ml;
1 mg/ml)
DDW (Agua - + ++ ++ Totalmente bidestilada) soluble WFI - USP (agua para - /- + ++ ++ Soluble inyección)
Dextrosa 5% (USP) - + ++ ++ Totalmente soluble Ácido láctico 37 mM, -/+ + + ++ ++ Totalmente manitol 250 mM (pH soluble 4,3)
TFA al 0,1% -/+ ++ ++ ++ ++ Totalmente soluble Ácido acético al 1% -/+ ++ ++ ++ ++ Totalmente (glacial) soluble HCl 0,1 N - + ++ ++ Soluble HCL 0,9 N - - - - - Insoluble Solución salina de + Ligeramente acetato 100 mM, soluble manitol 250 mM (pH (2-3 mg/ml) 4,3)
Solución salina (USP) - - - - -/+ Muy poco (NaCl al 0,9%) pH 4,5 soluble PBS pH 7,2 - - - - -/+ Muy poco soluble Medios a base de alcoholes y lípidos
Acetona (USP) -/+ + ++ ++ ++ Totalmente soluble Etanol (USP) -/+ + ++ ++ ++ Totalmente soluble Propilenglicol -/+ + ++ ++ +++ Totalmente soluble Glicerol - -/+ + ++ ++ Soluble Ácido caprílico - -/+ + ++ ++ Soluble Ácido oleico - - - - -/+ Muy poco soluble 10% de EtOH (95%) en ++ ++ Escasamente aceite de oliva (o aceite soluble de semilla de algodón)
2% de propilenglicol en ++ ++ Escasamente aceite de oliva (o aceite soluble de semilla de algodón)
Aceites vegetales Insoluble refinados; Oliva,
Algodón, Coco, Canola
TABLA 2: Valoración cuantitativa de la solubilidad del acetato de veldoreotida
Medio Solubilidad (g/litro) - HPLC
Agua 234,49
Fosfato 20 mM *, pH 7,2 211,97
HEPES 20 mM, pH 7,2 211,76
PBS, pH 7,4 3,25
NaCl al 0,9%, pH 4,5 2,31
*Na2HPO4 10 mM NaH2PO410 mM
La tabla 3 resume los valores de solubilidad del acetato de COR005 en diversos medios acuosos, los efectos de aditivos tales como DEX y HPB en la solubilidad del péptido en condiciones salinas y fisiológicas, así como el perfil PK de las formulaciones IR y MS preparadas con estos aditivos en comparación con COR005 sin aditivos como control. Solubilidad del acetato de COR005 en medio acuoso
La solubilidad del acetato de COR005 en agua y en dextrosa al 5% isotónica (véase a continuación) es relativamente alta (al menos 300 mg/ml). Mientras que, en comparación con su alta solubilidad en agua, la solubilidad del acetato de COR005 es significativamente menor en condiciones fisiológicas (acuosas) (en el intervalo de 1 -2 mg/ml) tal como se observa en PBS isotónico pH 7,4 y en solución salina. Téngase en cuenta que ambos medios (PBS o solución salina) contenían concentraciones fisiológicas de cloruro, lo que indica la incompatibilidad y la precipitación por salificación del péptido en presencia de ion cloruro.
Los efectos de los aditivos
Dextrosa: La solubilidad relativamente alta del acetato de COR005 en dextrosa al 5% (en agua) superior a 500 mg/ml indica la solubilidad mejorada del péptido en agua con dextrosa. La adición de dextrosa a la solución salina isotónica da como resultado un aumento en la solubilidad del péptido de desde 2 mg/ml hasta aproximadamente de 6 a 7 mg/ml en dextrosa al 5% diluida en solución salina normal, que tiene una concentración final de dextrosa al 2,5% y solución salina al 0,45% (NaCl). Téngase en cuenta que esta dextrosa diluida 1:1 en solución salina se usó como vehículo en el estudio IR del acetato de COR005 en ratas y cerdos enanos (la relación DEX:PEP fue de 5:1).
Tabla 3
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Los datos PK de las formulaciones IR inyectadas por vía subcutánea en ratas y cerdos enanos muestran que el vehículo de dextrosa aumenta la Cmax y los valores absolutos de biodisponibilidad del acetato de COR005 por encima de otras formulaciones IR (ratas: Cmax de COR005 en dextrosa-544 ng/ml frente a Cmax de 345 ng/ml de COR005 en tampón de ácido láctico como control. Cerdos enanos - Cmax de COR0050,4 mg/Kg en dextrosa- 238 ng/ml y BA 88,4 frente a Cmax de 108 ng/ml y BA 69% de COR005 0,4 mg/Kg en tampón de ácido láctico como control, los BA de COR005 0,1 mg/Kg fueron del 91% frente al 45% respectivamente). Estos datos PK proporcionaron una posible justificación para añadir dextrosa a las formulaciones de MS por dos motivos principales: 1) la dextrosa puede aumentar la solubilidad y la BA del péptido después de su liberación del MS, y 2) la dextrosa se conoce como un agente de porosidad y puede mejorar la permeabilidad de la MS, mejorando así la liberación del péptido de la matriz de MS.
Inesperadamente, los resultados de solubilidad de la dextrosa en PBS fueron significativamente diferentes del efecto de la dextrosa de la solubilidad del péptido en solución salina. Tal como se muestra en la tabla 3, la dextrosa no mejora la solubilidad del péptido en condiciones fisiológicas tal como se observa en el PBS isotónico pH 7,4 con relaciones DEX:PEP de 5:1 y 1:8, donde la solubilidad es solo de 1,6 mg/ml y 2 mg/ml, respectivamente. Una posible razón de la escasa (sin cambios) solubilidad del péptido con dextrosa en PBS es el aumento de la fuerza iónica del PBS en comparación con la solución salina; el p Bs contiene el 0,02% de KCl, el 0,02% de KH2PO4, el 0,115% de Na2HPO4 y el 0,8% de NaCl, mientras que la solución salina contiene solo el 0,9% de NaCl.
La relación de DEX:PEP 1:8 fue la relación utilizada para las formulaciones de MS B12 o PSI13. Esto puede indicar que el perfil PK observado del acetato de COR005 en estas formulaciones de DEX, que mostraron una Cmax y una BA absoluta superiores a la formulación básica de MS B10 (sin DEX), no se debe a una mejor solubilidad del péptido en condiciones fisiológicas, ya que la solubilidad del acetato de COR005 en PBS con DEX añadido es de solo 1­ 2 mg/ml. Por lo tanto, parece haber un efecto de DEX sobre el péptido en las formulaciones de MS que va más allá del efecto de una mayor solubilidad en condiciones fisiológicas.
El mecanismo por el cual la dextrosa potencia la liberación y BA de COR005 de MS se analiza en detalle en los datos resumen de tensión superficial frente a SEM a continuación.
HPB: tal como se muestra en la tabla 3, el aditivo HPB potencia la solubilidad del acetato de COR005 tanto en solución salina como en PBS de manera dependiente de la concentración. Se observó un ligero aumento de la solubilidad con la relación HPB:PEP de 1:2 (formulación de MS B13, véase a continuación) frente a sin HPB (un aumento de desde 2,2 hasta 2,5 mg/ml). El HPB mejora adicionalmente la solubilidad cuando las relaciones de HPB:PEP aumentaron hasta 1:1, 10:1 y 15:1 y hacia arriba, alcanzando finalmente una solubilidad de 10 mg/ml. Obsérvese que la solubilidad de COR005 con la relación HPB:PEP de 1:4 (formulación de MS B14, véase a continuación) estaba en el mismo intervalo de la escasa solubilidad del péptido en PBS solo.
Los datos PK de HPB como aditivo del acetato de COR005 en las formulaciones de IR indican un aumento en Cmax y BA en ratas, y un aumento significativo en cerdos enanos (en ambos casos, esta fue la formulación de IR con la segunda Cmax y BA más altas). Ratas: Cmax de COR005 en HPB: 451 ng/ml frente a Cmax de 345 ng/ml de COR005 en tampón de ácido láctico como control. Cerdos enanos - Cmax de COR005 en HPB- 255 ng/ml y BA del 85,3% frente a Cmax de 108 ng/ml y BA del 69% de COR005 en tampón de ácido láctico como control).
Estos resultados PK proporcionaron una justificación similar para usar HPB en las formulaciones de MS para lograr el mismo efecto que la dextrosa. Tanto la dextrosa como HPB son agentes de porosidad y su composición en la MS podría conducir a una mejora de la permeabilidad de MS y un aumento de la liberación de péptidos. Además, en el caso de HPB, planteamos la hipótesis de que puede mejorar ligeramente la solubilidad del péptido en condiciones fisiológicas (especialmente en el caso de la relación HPB:PEP de 1:2, tal como se representa en los datos de solubilidad), además del efecto de porosidad anticipado.
Sin embargo, inesperadamente, los datos de PK en roedores de MS con HPB como aditivo muestran dos efectos distintos de HPB en la ráfaga y BA en las formulaciones de MS B13 y B14. En el caso de B13, que fue el único de los dos probados en ratas, la formulación de MS preparada con una relación HPB:PEP de 1:2 (esta relación da como resultado un ligero aumento de la solubilidad del péptido en condiciones fisiológicas), la PK en ratas muestra un aumento significativo de la liberación en ráfaga y BA absoluta durante las primeras 24 horas (BA 0-24 horas) en comparación con la formulación básica B10; Cmax de COR005-B13 211 ng/ml y BA (0-24 h) del 11% frente a Cmax de COR005-B1030 ng/ml y BA (0-24 h) del 2%.
Esta tendencia también se observó y verificó en los estudios PK en cerdos enanos. En el caso de B14, que tiene una relación HPB:PEP reducida de 1:4, los resultados esperados fueron que una porosidad reducida de las microesferas con una solubilidad más baja para el péptido en condiciones fisiológicas (tal como se representa en la tabla) reduciría en consecuencia la liberación de péptidos y concentraciones plasmáticas a lo largo del tiempo.
Sorprendente e inesperadamente, los datos PK para B14 en cerdos enanos muestran el efecto opuesto: la relación reducida de HPB:PEP da como resultado un aumento significativo de la liberación de péptidos, con los niveles de Cmax, BA y péptidos en plasma significativamente más altos que los valores observados para B13, B12 y la formulación básica de MS B10.
Téngase en cuenta que B14 (HPB:PEP 1:4), así como B12 y PSI13 (cada uno con DEX:PEP 1:8), tienen relaciones relativamente bajas de HPB con respecto a PEP. Estas relaciones bajas no mostraron una solubilidad mejorada del péptido en condiciones fisiológicas. A pesar de la baja solubilidad, hubo un aumento significativo en la liberación de péptido de B14 MS como lo demuestra la alta BA y las concentraciones plasmáticas prolongadas a lo largo del tiempo de acetato de COR005 in vivo, en comparación con los valores para B12 y PSI13. Por lo tanto, parece haber un efecto de HPB sobre el péptido en las formulaciones de MS que va más allá del efecto de una mayor solubilidad en condiciones fisiológicas.
El mecanismo por el cual HPB potencia la liberación y la BA de COR005 de MS se analiza en detalle en los datos resumen de tensión superficial frente a SEM a continuación.
EJEMPLO 2
El efecto del acetato de veldoreotida sobre la densidad, el pH y la tensión superficial del agua se analizó tal como se muestra en la tabla 4. Se ha encontrado que el acetato de veldoreotida se comporta como un péptido anfífilo y reduce la tensión superficial del agua. Sin embargo, la reducción de la tensión superficial del agua no disminuyó de forma dependiente de la dosis, lo que sugiere que el acetato de veldoreotida se comporta como un hidrótropo en lugar de un tensioactivo.
Se usó Tween 80 como un tensioactivo de control para la comparación. Las densidades se midieron en muestras de volumen fijo de 1 ml. Todas las pruebas se realizaron por triplicado a 25°C. El efecto del acetato de veldoreotida sobre el pH de agua bidestilada (DDW) fue el mismo en todas las concentraciones de acetato de veldoreotida. El pH de DDW de 5,0 se redujo hasta pH 4,5. El efecto del acetato de veldoreotida sobre la densidad de DDW (la densidad inicial de DDW fue de 1,003 g/ml) dependió de la concentración de desde 1,4 mg/ml hasta 21,5 mg/ml con una densidad que varió de desde 0,986 hasta 0,998 g/ml respectivamente. Sin embargo, a concentraciones de acetato de veldoreotida de 45 y 102 mg/ml, la densidad aumentó por encima de la densidad inicial del DDW. Estos resultados indicaron que por encima de 45 mg/ml la solución peptídica en DDW se saturó. El efecto del acetato de veldoreotida sobre la tensión superficial de DDW (la tensión superficial inicial fue de 64,9 dinas/cm) fue coherente con el comportamiento del acetato de veldoreotida como péptido anfífilo (tensioactivo). La tensión superficial de DDW se redujo mediante acetato de veldoreotida como máximo de desde 64,9 hasta 45 dinas/cm. Con el fin de dilucidar el significado de este efecto, se utilizó Tween 80 como tensioactivo de referencia. Otros tensioactivos incluyen Polexamer 188. La reducción de la tensión superficial inducida por Tween 80 estaba en el intervalo del 40% (desde 64,9 dinas/cm hasta aproximadamente 39 dinas/cm), en comparación con el acetato de veldoreotida del 30% (desde 64,9 dinas/cm hasta aproximadamente 45 dinas/cm). Téngase en cuenta que, bajo estas condiciones experimentales; el efecto de Tween 80 indicó una relación concentración-efecto. Mientras, el efecto del acetato de veldoreotida sobre la reducción de la tensión superficial estuvo en el mismo intervalo para todas las concentraciones probadas.
TABLA 4: Efecto del acetato de veldoreotida sobre la densidad y la tensión superficial del agua
Elementos probados (temperatura 25°C) Densidad (g/ml) Tensión superficial % de cambio en la tensión Pesado 1 ml (Mettler (dina/cm) método superficial en comparación AT250) capilar con la línea base Agua estéril para inyección (WFI) pH 5,0 1,012 70,9
(Norbrook)
Agua corriente pH 6,0 1,014 71,12
Solución salina estéril (0,9 NaCl) pH 5,0 1,016 65,8
(Teva Medical)
DDW pH 5,0 (Siemens, Labostar, DI 2 1,003 64,9 --Clear, Sistema de agua)
Acetato de veldoreotida 1,4 mg/ml en 0,986 45,2 -30
DDW pH 4,5
Acetato de veldoreotida 12 mg/ml en DDW 0,994 46,9 -28
pH 4,5
Acetato de veldoreotida 21 mg/ml en DDW 0,998 47,1 -27 pH 4,5
Acetato de veldoreotida 45mg/en DDW pH 1,003 45,97 -29
4,5
Acetato de veldoreotida 102 mg/ml en
DW pH 4,5 1,015 49,3 D -24
Tween 8028 mg/ml en DDW (Sigma 0,975 38,8 -40
Aldrich)
Tween 80 14 mg/ml en DDW (Sigma 0,988 39,35 -39
Aldrich)
Tween 807mg/ml en DDW (Sigma Aldrich) 0,9945 39 ,6 -39
(temperatura 5°C)
Agua estéril para inyección (WFI) 0,977 68,5 --Acetato de veldoreotida 200 mg/ml en WFI 1,03 44 -36 Acetato de veldoreotida 200 mg/ml 1,12 51 -26
100 mg/ml HPBCD en WFI
Acetato de veldoreotida 200 mg/ml 1,04 45 -34
50 mg/ml HPBCD en WFI
Dextrosa al 5% en WFI 1,01 62,7 --Acetato de veldoreotida 200 mg/ml en 1,03 54 -14 dextrosa al 5% en WFI
La Tabla 5 muestra la tensión superficial comparativa del acetato de veldoreotida en comparación con octreotida (análogo de somatostatina) y goserelina (análogo de LHRH) en agua para inyección (WFI)
Tabla 5
Medio Tensión superficial del agua (dina/cm) Efecto de la tensión superficial reducida (%) Agua para inyección (WFI - USP) 52 Línea base (WFI) Veldoreotida a 10mg/ml en WFI 33 -37% Octreotida a 10mg/ml en WFI 38 -27% Goserelina a 10mg/ml en WFI 33 -37%
La actividad superficial del acetato de COR005 en formulaciones de microesferas
Los datos de la tabla 4 muestran la actividad superficial del acetato de COR005 altamente concentrado (200 mg/ml), con o sin aditivos en WFI, que emula las condiciones de preparación de la emulsión primaria de las microesferas. Los resultados de las pruebas 1 y 2 (Tabla 4) muestran el efecto del acetato de COR005 sobre la tensión superficial del agua. Cuando el acetato de COR005 se disuelve en agua, la tensión superficial se reduce en aproximadamente el 36 %, desde 68,5 dinas/cm para el agua sola hasta 44 dinas/cm para la solución de agua con acetato de CR005 a 200 mg/ml.
Los datos de la tabla 5 y la figura 3 muestran las propiedades de emulsificación comparativas de COR005 frente a octreotida y goserelina proporcionadas en el presente documento como controles de péptidos anfifílicos. Los datos muestran una actividad superficial única de COR005 en comparación con los péptidos de control. COR-005 tiene una actividad superficial más alta que octreotida y una actividad superficial similar a goserelina (que es un péptido más hidrófobo que octreotida).
La figura 3 muestra fotografías de muestras de emulsificación de COR005 frente a octreotida y goserelina con el 16,6% en peso de aceite de semilla de algodón (CSO), el 74,2% en peso de agua para WFI de inyección y el 9,2% en peso de péptido. Las muestras se mezclaron con una jeringa de 25G y se agitaron en vórtex a temperatura ambiente. Los resultados de la emulsificación muestran la afinidad significativa de COR005 con la interfase aceite/agua, lo que permite que se forme una emulsión. La octreotida muestra una eficacia de emulsificación débil y la goserelina muestra el menor potencial para la formación de emulsión. Estos resultados confirman las propiedades anfifílicas únicas de COR005 como tensioactivo.
Sin estar ligado a ninguna hipótesis en particular, en medios acuosos, COR005 parece tener una afinidad preferida con la superficie interfacial entre el agua y el aire debido a sus aminoácidos hidrófobos, tal como se muestra en la Figura 2 (2 triptófano, 2 fenilalanina y solamente un único catión del tipo amina). En consecuencia, se perderá menos entropía del agua debido a la hidrofobicidad del péptido. La termodinámica del agua se caracteriza por la máxima entropía, el desorden de las moléculas de agua y sus enlaces de hidrógeno dinámicos. Cuando un resto hidrófobo se mezcla con agua, interrumpe el desorden natural de las moléculas de agua y crea "jaulas de hielo" que reducen la entropía del agua y, como resultado, las moléculas de agua repelen el resto hidrófobo hacia la superficie para minimizar la pérdida de entropía.
En sistemas de dispersión tales como agua y aceite o medio acuoso con polímero hidrófobo tal como PLGA, COR005 tendrá una alta afinidad por la superficie interfacial lipófila/hidrófoba debido a sus propiedades anfílicas. El efecto anticipado en la emulsión primaria de la MS sería la creación de tamaños de gota más pequeños en la emulsión primaria, una mayor estabilidad de la emulsión debido a la reducción de la tensión superficial del sistema por el péptido, y una mejor interacción, orientación y dispersión del péptido en el polímero PLGA que es una "superficie" hidrófoba que se forma en la interfase.
El perfil de liberación in vitro observado de COR005 a partir de la formulación básica MS B10 mostró la tasa de liberación más baja. Además, las imágenes SEM (véase a continuación) mostraron una matriz sólida y condensada de la MS de la formulación básica B10, que se correlaciona con el perfil de liberación de péptidos. Además, los datos PK en cerdos enanos demuestran concentraciones plasmáticas escasas de COR005 a lo largo del tiempo para la formulación B10 (Tabla 3).
El efecto de HPB sobre la actividad superficial del acetato de COR005 HPB:PEP 1:2
La adición de HPB en una relación de HPB:PEP 1:2 da como resultado una actividad superficial reducida del péptido. La actividad superficial observada del péptido en agua (44 dinas/cm) sin aditivos aumenta hacia el agua (68 dinas/cm) cuando se añade HPB en una relación de 1:2 (52 dinas/cm). Este resultado indica que HPB está reduciendo el potencial del péptido para actuar como tensioactivo aumentando su solubilidad en agua. El resultado de la actividad superficial reducida del péptido y la mayor solubilidad en agua es que hay menos péptido en la interfase.
El efecto de esto en la emulsión primaria del MS será una tensión superficial relativamente más alta de la emulsión primaria (en comparación con la formulación básica del péptido sin HPB) y una concentración relativamente más baja del péptido en la superficie interfacial del agua con respecto a la solución de polímero. Además, se retendrá relativamente más agua dentro de la matriz de PLGA durante la precipitación de la MS debido a la alta afinidad del agua con HPB.
La liberación en ráfaga observada in vitro e in vivo (Cmax) de COR005 a partir de B13 (HPB:PEP con una relación de 1:2) fue la más alta entre las composiciones básicas B10 y DEX - B12 y PSI13 MS. Además, los datos PK de B13 en ratas muestran que la mayor parte del péptido se liberó durante las primeras 24 horas, "descargando" aproximadamente el 20% del AUC total (0-28 días), seguido de niveles plasmáticos significativamente más bajos durante el resto de los 27 días.
El efecto de HPB sobre la actividad superficial del acetato de COR005 HPB:PEP 1:4
Los resultados de la Prueba 4 (Tabla 4) muestran el efecto de reducir la relación HPB:PEP de 1:2 (Formulación B13) a 1:4 (Formulación B14). Los resultados de tensión superficial muestran que la concentración reducida de HPB:PEP 1:4 (45 dinas/cm) tiene la misma actividad superficial que el acetato CR005 en agua (44 dinas/cm), sin mostrar ningún efecto de HPB sobre las propiedades del tensioactivo peptídico, en esta relación más baja.
En este caso, se esperaría que el péptido tuviera una concentración más alta en la interfase que HPB:PEP 1:2. El efecto anticipado de la relación reducida de HPB:PEP 1:4 sería una liberación in vitro y una BA así como un perfil PK reducidos en comparación con el perfil IVR y PK de la Formulación B13. La suposición básica era que la concentración reducida de HPB en la formulación de MS de HPB:PEP 1:4 formaría una microesfera con un núcleo más denso en comparación con el de HPB:PEP 1:2 porque el complejo de péptido/HPB atraería menos agua. Además, se esperaría que se redujera la permeabilidad de la superficie MS (menos HPB = menos poros). Todos estos posibles efectos de la MS con la relación HPB:PEP 1:4 darían como resultado una liberación en ráfaga reducida seguida de una liberación más lenta a lo largo del tiempo de COR005 de la MS en comparación con el perfil PK de la Formulación B13 (HPB:PEP 1:2 ). En otras palabras, en lugar de tener una liberación rápida del péptido de la MS durante los primeros días, tal como se observa con la Formulación B13, la formulación B14 debería liberar la misma cantidad de péptido a lo largo de un período de tiempo más prolongado.
Inesperadamente, los estudios IVR y PK de esta relación HPB:PEP 1:4 mostraron el efecto contrario: la relación HPB:PEP reducida da como resultado un IVR aumentado (véase la IVR de la serie PSI). También se observó la misma tendencia en los estudios PK: el perfil PK de B14 da como resultado una ráfaga más alta (Cmax), que es mayor que la Formulación B13. Además, los niveles plasmáticos a lo largo del tiempo de COR005 liberados de la Formulación B14 fueron significativamente más altos que los de la Formulación B13, y también por encima de las Formulaciones B10 y B12.
El efecto de DEX sobre la actividad superficial del acetato de COR005 DEX:PEP 1:8
Los resultados de la Prueba 5 (Tabla 4) muestran el efecto de DEX:PEP cuando se añade a la formulación MS en una relación de DEX:PEP 1:8. Los resultados de la tensión superficial muestran que la tensión superficial aparente de la solución DEX:PEP 1:8 (54 dinas/cm) es comparable a la HPB:PEP 1:2 de la Prueba 3 (51 dinas/cm). Este efecto sugiere que se concentra más péptido en la solución a granel que en la interfase. De hecho, la actividad superficial del péptido en estas relaciones de DEX y HPB con respecto a péptido se reduce en comparación con el péptido solo (44 dinas/cm). Los aditivos concentrados en el agua pueden conducir a una mayor atracción de agua alrededor del péptido durante la emulsión primaria. Esto puede conducir a una mayor porosidad de las microesferas debido al contenido de agua relativamente más alto en la matriz interna, tal como se esperaba que ocurriera con la formulación B13.
Sin embargo, los datos PK comparativos de las Formulaciones B12 (DEX:PEP) y B13 (HPB:PEP) no respaldan estas suposiciones. Mientras que la liberación de péptido y los niveles plasmáticos de la Formulación B13 mostraron una liberación en ráfaga alta y una concentración plasmática baja a lo largo del tiempo, la liberación en ráfaga de la Formulación B12 se reduce y los niveles plasmáticos aumentan a lo largo del tiempo significativamente por encima de los de la Formulación B13. Estos resultados inesperados indican que la tensión superficial de la emulsión primaria y la porosidad externa de la MS final no son los únicos factores que afectan al perfil PK del péptido observado.
Por lo tanto, buscamos otro factor que vinculara la porosidad externa de la MS y la tensión superficial del péptido para respaldar (empíricamente) los efectos inesperados de los aditivos observados en los estudios IVR y PK. Este factor se identificó tras los intentos de evaluar los efectos de las diversas condiciones sobre la morfología interna (en lugar de externa) de las diversas formulaciones de MS. Además, las imágenes SEM analizadas a continuación respaldaron la hipótesis de que las mediciones de tensión superficial identificaron una condición de concentración interfacial peptídica variable que se vio afectada por concentraciones cambiantes de los aditivos HPB y DEX. De hecho, solo cuando se repitió la formación de imágenes SEM cortando las microesferas con el fin de exponer su textura interna, se observaron los vínculos entre los datos de actividad superficial y los datos IVR y PK de las formulaciones MS de COR005 (véase a continuación).
La Tabla 6 resume los efectos de los aditivos sobre el perfil de actividad superficial del acetato de COR005 en condiciones fisiológicas (37°C) que emulan la liberación de COR005 en el sitio de inyección.
Tabla 6
Medio Dextrosa (% Relación COR005 Solubilidad Tensión Efecto de la tensión superficial en peso) HPB:PEP (mg/ml) (mg/ml) superficial (% de la línea base) (dina/cm)
5 Ninguna Ninguna ND 57 Línea de base (PBS/5% DEX)
10 3,3 49 -14% (-18% a las 48h) Ninguna Ninguna ND 48 Línea base (PBS) PBS
pH 7,4 Ninguna 3,6 34 -29% Ninguna 10:1 10 8,9 50 4%
1:2 5 45 -6%
1:4 3,9 39 -19%
Los datos representados en la Tabla 6 muestran que las relaciones de ambos aditivos DEX o HPB con respecto al acetato de COR005 no mejoran la solubilidad del acetato de COR005 en condiciones fisiológicas (se mostró en las tablas 3 y 4 que DEX no mejora la solubilidad del péptido en PBS y que HPB mejora la solubilidad del péptido en PBS de una manera dependiente de la concentración). La solubilidad del péptido con aditivos en las concentraciones utilizadas para las formulaciones de MS no respalda la mayor liberación observada y BA del péptido debido a la solubilidad. La tensión superficial de COR005 con HPB en una relación alta de HPB:PEP de 10:1 (50 dinas/cm) confirma la suposición y el efecto observado de HPB sobre la actividad superficial del péptido: el aumento de HPB aumentará la solubilidad del péptido y reducirá la actividad superficial peptídica porque habrá más péptido en la solución a granel en lugar de en la interfase. En el caso de HPB:PEP reducido, desde 1:2 hasta 1:4, la tensión superficial de la solución también se reduce. Menos HPB en el sistema da como resultado una mayor actividad superficial del péptido, con más péptido disponible en la interfase. Estos resultados respaldan los datos IVR y PK observados de la Formulación B13 frente a la Formulación B14. Cuando se añade HPB a MS, la porosidad aumenta y la liberación de péptido se ve afectada por el grado de interacción (complejo de inclusión) entre el péptido y HPB en el microentorno del espacio interno de MS. En el caso de la Formulación B13 donde e1HPB:PEP es relativamente alto, se producen más poros en MS y hay más péptido en la superficie interna de los poros en lugar de dentro de la matriz polimérica. Habrá más agua disponible para la matriz interna (debido a más poros en la cubierta externa) y se produce una rápida difusión de agua a la matriz interna. En la matriz interna, la mayor parte del péptido está disponible para liberarse del polímero debido al efecto de HPB. Esto da como resultado una liberación relativamente rápida del péptido, tal como se observa en la IVR y PK de la Formulación B13, que mostró un aumento en la liberación en ráfaga y rápida durante los primeros días, seguido de concentraciones plasmáticas más bajas a lo largo del tiempo.
La misma tendencia está respaldada por el efecto de la relación HPB:PEP reducida de 1:4 (Formulación B14). La tabla 4 muestra que la actividad superficial del péptido en esta condición (de baja HPB) es similar a la actividad superficial del péptido sin aditivo, 34 frente a 39 dinas/cm respectivamente. En este caso, la porosidad de la MS se reduce en comparación con la Formulación B13 (con más HPB) y se retiene la actividad superficial del péptido, lo que conduce a más péptido orientado en la interfase del poro. Cuando se difunde agua en la MS B14, la liberación del péptido se ve afectada por la liberación de la matriz polimérica interna y del espacio interno de los poros.
Estas observaciones y conclusión están respaldadas por el análisis de la concentración de HPB residual en las formulaciones MS de HPB. De hecho, los datos analíticos (véase a continuación) confirman que se mantuvo la misma relación de HPB:PEP en la MS final de HPB y, por lo tanto, se verifican las condiciones y los datos de la tabla 6.
En cuanto a los resultados de DEX, los datos analíticos del DEX residual en el MS final mostraron una relación DEX:PEP significativamente más baja, lo que indica que la mayor parte del contenido inicial de DEX se eliminó por lavado de la MS durante el procedimiento de preparación. Por lo tanto, a diferencia del caso de HPB, el efecto del DEX sobre la actividad superficial de COR005 en el sitio de inyección parece ser insignificante. El efecto para el DEX se aborda en la sección de análisis SEM a continuación.
EJEMPLO 3 (Ejemplo de referencia)
Se prepararon formulaciones de liberación inmediata de acetato de veldoreotida (Grupos 1M-6M) para su inyección en ratas HSD:SPRAGUE DAWLEY® SD® tal como se muestra en la tabla 8 a continuación. El vehículo de ácido láctico para su uso en las formulaciones tal como se muestra en la tabla 7 a continuación se preparó como sigue:
TABLA 7
Formulación Cantidad Dosis (péptido neto/kg) Tamaño de lote calculado ~2970 viales
Acetato de veldoreotida 6,83 g de péptido neto
D-manitol 0,5 mol/kg 1707.5 g
Solución de (s) - ácido láctico 0,185 mol/kg 683 g 0,5 ml por rata WFI 341.5 g subcutánea 2,8 mg/kg Hidrogenocarbonato de sodio 0,185 mol/kg q.s. pH 4,3 /-0,1
WFI (Farmacopea Europea) 3466,23 g
Concentración final de API 2 mg/ml (1,15 ml por vial)
Las formulaciones para inyección en ratas se prepararon tal como se resume en la tabla 8.
Se inyectaron ratas sujeto (peso medio de aproximadamente 370 gramos por sujeto) según el esquema de dosificación anterior en grupos de 5 ratas por tratamiento. Se extrajeron muestras de sangre de la cola de referencia de las ratas 2 días antes de la dosificación. Para el Grupo 1M, se extrajeron muestras de sangre a los 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas y 24 horas después de la dosificación. Para los Grupos 2M-6M, se extrajeron muestras de sangre de la cola de las ratas a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas después de la dosificación. Las muestras de sangre fueron aproximadamente 300 ul de sangre completa recolectada en tubos comerciales K3 recubiertos con EDTA. También se observaron las reacciones en el sitio de inyección de las ratas sujeto hasta 5-7 días después de la dosificación.
Todas las inyecciones subcutáneas indujeron reacciones en el sitio de inyección. La clasificación de las reacciones en el sitio de inyección se muestra en la tabla 9.
TABLA 8
Grupo Formulación Cantidad Dosis (péptido neto)
de veldoreotida e Volumen total - 2,3 ml 0,28 ml por rata por vía intravenosa 1M Acetato n vehículo
de ácido láctico (Tabla 4) API neto total - 4,6 mg 1,5 mg/kg Volumen total - 2,3 ml
Acetato de veldoreotida en vehículo
de ácido láctico (Tabla 4) 0,23 ml por rata s.c. Acetato de 2M veldoreotida (péptido neto) -3 mg/kg API neto total - 11,5 mg
Acetato de veldoreotida adicional Hidroxipropil-p-ciclodextrina 40 mg/kg (8 mg equivalentes a 6,9 mg de
péptido neto)
Hidroxipropil-p-ciclodextrina
total — 150 mg
Hidroxipropil-p-ciclodextrina 150 mg
Concentración final de hidroxipropilp-ciclodextrina 65 mg/ml
Concentración final de API 5 mg/ml
Acetato de veldoreotida en vehículo
de ácido láctico (Tabla 4)
cetato de veldoreotida adicional (8 Volumen total - 2,3 ml 0,23 ml por rata s.c. Acetato de M A
mg equivalentes a 6,9 mg de API neto total - 11,5 mg veldoreotida (péptido neto) 3 mg/kg péptido neto)
Concentración final de API 5 mg/ml
Acetato de veldoreotida (8 mg
equivalente a 6,9 mg de péptido Volumen total - 4,4 ml 0,34 ml por rata s.c. Acetato de veldoreotida (péptid neto) o neto) -
M Solución salina de NaCl al 0,9% API neto total - 6,9 mg
L-Lisina HCl 1,5 mg/kg L-lisina final HCl 6,8 mg/ml L-Lisina HCl - 6,3 mg/kg Concentración final de API 1,6 mg/ml
Acetato de veldoreotida (11,6 mg Volumen total - 2 ml 0,23 ml por rata s.c. equivalente a 10 mg de péptido
neto) API neto total - 10 mg
Solución salina de NaCl al 0,9%
M Hidroxipropil-p-ciclodextrina 150 mg Acetato de veldoreotida (péptido neto) -Concentración final de hidroxipropil- 3 mg/kg Hidroxipropil-p-ciclodextrina -p-ciclodextrina 75 mg/ml 47 mg/kg Concentración final de API 5 mg/ml
Acetato de veldoreotida (11,6 mg Volumen total - 2 ml
equivalentes a 10 mg de péptido 0,23 ml por rata s.c.
neto) API neto total - 10 mg
Solución salina de NaCl al 0,9% -1 ml
M
Dextrosa al 5% - 1 ml 150 mg
Concentración de solución salina Acetato de veldoreotida (péptido neto) -0,45% 3 mg/kg Dextrosa - 2,5% final
Concentración final de dextrosa 2,5%
Concentración final de API 5 mg/ml
TABLA 9
ID de grupo Dosis (mg/kg) Reacción en el sitio de inyección Péptido - 3
2M Grave Hidroxipropil-p-ciclodextrina - 40
3M Péptido - 3 Grave
Péptido - 3
4M Ligera/leve
L-Lisina HCl— 6
Péptido - 3
5M Grave Hidroxipropil-p-ciclodextrina - 40
Péptido - 3
6M Ligera
Dextrosa - 15
Se observaron reacciones graves en el sitio de inyección con las inyecciones de acetato de veldoreotida formuladas con vehículo de ácido láctico. Sin embargo, las ratas a las que se les inyectó acetato de veldoreotida formulado con L-lisina HCl o dextrosa en solución salina (Grupos 4M y 6M, respectivamente) mostraron reacciones en el sitio de inyección relativamente bajas.
Las muestras de sangre se mantuvieron en hielo después de la recogida hasta el momento de la centrifugación. Las muestras de sangre se procesaron dentro de los 60 minutos posteriores a la recogida de sangre. Las muestras se centrifugaron a 3000 G durante 15 minutos en una centrífuga refrigerada (5°C). El plasma se extrajo de los tubos después de la centrifugación y se colocó en tubos nuevos debidamente etiquetados y se almacenó a de -65°C a -80°C hasta la transferencia.
Las muestras de plasma se analizaron mediante LC-MS/MS para determinar la concentración plasmática de acetato de veldoreotida para los Grupos 1M-6M. El patrón de acetato de veldoreotida se diluyó en serie con metanol:agua (1:9) y se añadió al plasma de rata en blanco para generar patrones de calibración y muestras de QC. Las muestras de calibración se almacenaron a -70°C. A continuación, las muestras congeladas se descongelaron hasta temperatura ambiente. También se prepararon plasma en blanco y blanco de reactivo (agua). Por cada alícuota de 100 ul de muestra, calibrador o muestra de QC, se añadieron 25 ul (~ 100 ng/ml) de patrón interno (acetato de octreotida) en metanol:agua (1:9) y 600 ul de acetonitrilo:ácido fórmico (99:1) y las muestras se agitaron en vórtex durante 30 segundos. Las muestras se diluyeron mezclando 20 ul de muestra de plasma con 180 ul de plasma en blanco y se dividieron en alícuotas de 100 ul antes de añadir el patrón interno y las soluciones de acetonitrilo:ácido fórmico.
A continuación, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm a 8°C. Luego se transfirieron 450 ul de la fase superior (orgánica) a tubos de evaporación y se evaporaron bajo nitrógeno a aproximadamente 50°C. A continuación, las muestras se reconstituyeron en 200 ul de solución de reconstitución (agua:acetonitrilo:ácido fórmico a 70:30:0,2). Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 rpm a 8°C. Se extrajeron 160 ul de cada muestra y se colocaron en un vial de automuestreador con inserto de vidrio cónico y se analizaron mediante LC-MS/MS.
A continuación, se representaron gráficamente las concentraciones plasmáticas de acetato de veldoreotida y se analizaron usando técnicas farmacocinéticas convencionales. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos para los Grupos 1M-6M se muestran en la tabla 10. En la Figura 4 se muestra un gráfico de concentración plasmática (semilogarítmica) frente al tiempo para los Grupos 2M-6M.
TABLA 10
Acetato de Acetato de Acetato de Acetato de Acetato de Acetato de Parámetros COR005 IV COR005 SC 2 M COR005 SC 3 M COR005 SC 4 M COR005 SC 5 M COR005 PK 1 M 3mg/kg (ácido 3mg/kg (en ácido 1,5mg/kg (con 3mg/kg (HPB en SC 6 M 1,5 mg/kg láctico HPB) láctico) LysHCl) NS) 3mg/kg (2,5 Dex 0,45 NS)
N 4 5 5 5 5 5
Dosis 1,5 3 3 1,5 3 3 (mg/kg)
Cmax 3991±664 350=111 345±95 220±54 451±129 544±245 (ng/ml)
CL(ml/h/kg) 782 (-) (-) (-) (-) (-) T1/2(h) 0,66 3,3 2,5 2,8 3,3 2,8 AUC(ng- 1918±6 2703±347 3179±466 1574±213 3254±609 4458=750 h/ml)
F(%) 100 70 83 82 85 116
Los perfiles PK semilogarítmicos comparativos de SC frente a IV de acetato de COR005 muestran que el acetato de COR005 muestra una cinética flip-flop. La pendiente de la tasa de las curvas SC de desplaza a la derecha en comparación con la curva de eliminación de la IV. Por lo tanto, la tasa aparente de absorción del péptido desde el sitio de inyección SC es significativamente más lenta y se prolonga por encima de la tasa de eliminación. Por lo tanto, los valores aparentes de vida media de todas las formulaciones SC son en realidad la vida media de absorción que domina el efecto de la fase de eliminación del perfil farmacocinético.
La figura 5 es un gráfico que ilustra el efecto de la formulación IR de dextrosa/solución salina sobre el perfil PK de COR005 en ratas a 0,3 mg/kg relación DEX:PEP 5:1 (6 m) en comparación con COR005 en tampón de ácido láctico pH de 4 (3 m) utilizado como control. La figura 6 es un gráfico que ilustra el efecto sobre el perfil PK de COR005 en ratas de HPB/solución salina (HPB:PEP 15:1) (5 m) en comparación con COR005 en tampón de ácido láctico pH 4 (3 m) usado como control. La Figura 7 es un gráfico que compara las formulaciones de HPB y DEX sc en cerdos enanos a 0,4 mg/kg en comparación con el COR005 en tampón de ácido láctico pH 4 (3 m) utilizado como control. La figura 8 es un gráfico que compara las formulaciones de HPB en cerdos enanos a 0,4 mg/kg en comparación con el COR005 en tampón de ácido láctico pH 4 (3 m) usado como control. La figura 9 es un gráfico que muestra el efecto de DEX sobre el perfil PK de la formulación IR de acetato de COR005, SC, 0,4 mg/kg en cerdos enanos en comparación con el tampón de ácido láctico pH 4 utilizado como control. La figura 10 es un gráfico que muestra el efecto de DEX en el perfil PK de la formulación IR de acetato de COR005, SC, 0,1 mg/kg en cerdos enanos en comparación con el tampón de ácido láctico pH 4 utilizado como control.
Los perfiles PK comparativos indican que la dextrosa o HPB mejoraron la Cmax plasmática de COR005 y su biodisponibilidad absoluta por encima de los otros vehículos.
La tabla 11 resume los parámetros farmacocinéticos de las formulaciones IR de acetato de COR005 en cerdos enanos (dosis de 0,4 mg/kg) que muestran el efecto de HPB y DEX sobre la Cmax de COR005 y la BA absoluta, con tampón de ácido láctico pH 4 como control. La tabla 12 resume los parámetros farmacocinéticos de las formulaciones IR de acetato de COR005 en cerdos enanos (dosis de 0,1 mg/kg) que muestran el efecto de DEX sobre la Cmax de COR005 y la BA absoluta, con tampón de ácido láctico pH 4 como control.
Tabla 11
IR - acetato de COR 005 Dosis Tmax (h) Cmax (ng/ml) AUClast (h*ng/ml) BAF absoluta (mg/Kg) (%) Tampón de ácido láctico 0,4 1 108 161 69 DEX:PEP 5:1 solución 0,4 0,5 238 205 88,4 salina
HPB:PEP 15:1 solución 0,4 0,25 255 198 85,3 salina
Tabla 12
IR - acetato de COR 005 Dosis Tmax (h) Cmax (ng/ml) AUClast (h*ng/ml) BAF absoluta (mg/Kg) (%) Tampón de ácido láctico 0,1 0,5 29,3 26 45 DEX:PEP 5:1 solución 0,1 1 43,6 53 91,4 salina
El HPB aumenta la vida media de absorción de COR005 (M2 y M5) en comparación con el vehículo de ácido láctico (M3) y dextrosa (M6). Esto indica una liberación más lenta y una absorción prolongada de COR005 del vehículo HPB.
También se analizó la concentración mínima para los Grupos 2M-6M a las 24 horas y se muestra en la tabla 13.
TABLA 13
Grupo Concentración plasmática de acetato de veldoreotida (ng/ml) para cada sujeto
2M 4,44 6,99 7,87 0,00 5,10
3M 60,3 0,00 2,01 8,31 0
4M 0 3,036 0 0 0
5M 7,70 6,235 7,621 3,700 1,65
6M 15,08 2,55 1,25 2,24 4,15
Como puede observarse, la inyección intravenosa de acetato de veldoreotida confirma un CL esperado de 13 ml/min/kg basándose en bibliografía disponible (Véase Afargan et al., Novel Long-Acting Somatostain Analog with Endocrine Selectivity: Potent Suppression of Growth Hormone But Not of Insulin, Endocrinology, 142:1 (2001) 477­ 486). Además, la adición de excipientes mejora el rendimiento farmacocinético del acetato de veldoreotida. Por ejemplo, la adición de dextrosa en solución salina (Grupo 6M) mejora el AUC y produce un valor F superior al 100%. Tal como se ve en las figuras 5-11, la adición de excipientes da como resultado una biodisponibilidad mejorada del acetato de veldoreotida. Además, tal como se muestra en la tabla 13, la adición de excipientes tal como hidroxipropilp-ciclodextrina (Grupos 2M y 5M) y dextrosa (Grupo 6M) da como resultado una concentración mínima medible de acetato de veldoreotida después de 24 horas. Por lo tanto, se ha demostrado que la adición de excipientes no solo reduce las reacciones en sitio de inyección, sino que también mejora la farmacocinética de la veldoreotida de liberación inmediata en un modelo de rata.
EJEMPLO 4
El acetato de veldoreotida se formuló en microesferas de PLGA (ácido poliláctico-co-glicólico) según las formulaciones de la tabla 14.
TABLA 14
Composición Formulaciones
B9 B10 B11 B12 B13 Acetato de veldoreotida, mg 200 200 200 200 200 PLGA (7-17 kDa), mg - 500 - 500 500 PLGA (38-54 kDa), mg 500 - 500 - -Dextrosa al 5% (USP), mg - - 25 25 -Hidroxipropil-p-ciclodextrina, mg - - - - 100
Las formulaciones de la tabla 14 se administraron a ratas mediante inyección usando una aguja 23G para las formulaciones B9 y B10 y una aguja 19G para las formulaciones B11 -B13. Se administró a cada animal un volumen exacto de 0,5 ml de la formulación. Se extrajeron muestras de sangre de la cola en diversos momentos a lo largo de 28 días para determinar la farmacocinética de las formulaciones de acetato de veldoreotida y se monitorizaron las reacciones en el sitio de inyección. Las metodologías empleadas son similares a las descritas en el Ejemplo 3. Análisis farmacocinético de formulaciones de acetato de PLGA-MS-COR005 en plasma de rata
El análisis de la farmacocinética de COR005 se realizó utilizando el software PK Solutions 2.0 (Summit Research Services, CO. EE.UU). El software calcula los resultados utilizando métodos no compartimentales (área) y compartimentales (términos exponenciales) sin suponer ningún modelo compartimental específico. Los parámetros de dosis múltiples y de estado estacionario se proyectan automáticamente a partir de los resultados de dosis única. Los cálculos de los parámetros PK se basaron en dos métodos convencionales de análisis: (1) curve-stripping (o método de residuales) para derivar los términos exponenciales que describen la curva de nivel en sangre y (2) cálculos del área bajo la curva. PK Solutions 2.0 aplica ambos métodos cuando corresponde y compara los resultados uno al lado del otro.
El análisis de datos PK se realizó mediante el perfil PK de cada animal de cada grupo. Los parámetros PK comparativos de los diversos tratamientos se representaron mediante la media ± DE de cada grupo.
La figura 11 muestra un gráfico convencional de la concentración plasmática de COR005 como curvas de tiempo de las medias ± DE de los grupos de tratamiento SC B9-13 formulaciones PLGA-MS de acetato de COR005 (tiempo de 0 a 28 días).
La figura 12 muestra un gráfico de la farmacocinética de "ráfaga" como un gráfico convencional de curvas de tiempo concentración plasmática de COR005 de las medias ± DE de los grupos de tratamiento SC B9-13 PLGA-MS- Acetato de COR005 (tiempo 0 - 24 h) para una sola dosis SC , Ratas (n=16).
La figura 13 muestra el efecto de HPB sobre la liberación en ráfaga (tiempo 0-24 h) de COR005 PLGA MS en comparación con la formulación MS básica.
La tabla 15 resume los parámetros farmacocinéticos de la liberación en ráfaga de acetato de COR005 de formulaciones de MS en ratas, mostrando el efecto de HPB sobre la Cmax de COR005 y la BA absoluta.
Tabla 15
Formulaciones Dosis Cmax "ráfaga" AUC 0-24h "ráfaga" F% BA absoluta de (mg/kg) (ng/ml) (ng*h/ml) la ráfaga MS-PLGA básico Media±DE
B10 (7-17 kDa) (n=4) 22±2,8 30±5 437±80 2% B13
(HPB:PEP MS HPB - PLGA Media±DE
(7-17 kDa) (n=4) 20±1,3 211±25 2771±313 11% 1:2)
La figura 14 es un gráfico que muestra el efecto de DEX sobre la liberación en ráfaga (tiempo 0-24 h) de COR005 PLGA MS en comparación con la formulación MS básica.
La tabla 16 resume los parámetros farmacocinéticos de la liberación en ráfaga de acetato de COR005 de formulaciones MS en ratas, mostrando el efecto de DEX sobre la Cmax de COR005 y BA absoluta.
Tabla 16
Formulaciones Dosis Cmax "ráfaga" AUC 0-24h "ráfaga" F% BA absoluta de (mg/kg) (ng/ml) (ng*h/ml) la ráfaga
B10 MS-PLGA básico 7­
17 kDa Me(dnl_a4±)DE 22±2,8 30±5 437±80 2% B12
(DEX:PEP Dextrosa MS-PLGA Media±DE 20±2,4 113±42 1280±216
7-17 kDa 5% 1:8) (n=4)
La tabla 17 resume los valores de biodisponibilidad absoluta y relativa del perfil PK completo - COR005 MS-PLGA 7­ 17 kDa - Formulación B13 en ratas (tiempo 0-28 días).
Tabla 17
Biodisponibilidad absoluta (AUC 0-t) de COR005 MS - B13 (SC) frente a COR005 IR (IV) AUC(0-t) AUC(0-t) Dosis COR005
ng*h/ml ng*h/ml IR - M1 (IV) 1,5 mg/Kg
IR M1 (IV) MS-B13 (SC)
F= (1,5*12747)/(19,7* 1918)* 100 F= 51% Dosis COR005
1918 12747 MS-B13 (SC)
19,7 mg/kg
Biodisponibilidad relativa (AUC 0-t) de COR005 MS - B13 (SC) frente a COR005 IR M5 (SC) AUC(0-t) AUC(0-t) Dosis COR005
ng*h/ml ng*h/ml IR-M5 (SC)
IR-M5 (SC) MS-B13 (SC) 3 mg/kg
F= (3*12747)/(19,7*3254)*100 F= 60% Dosis COR005
3254 12747 MS B13 (SC)
19,7 mg/kg
Biodisponibilidad absoluta (AUC 0-~) de COR005 MS - B13 (SC) frente a COR005 IR M1 (IV) AUC(0-~) AUC(0-~) Dosis COR005
ng*h/ml ng*h/ml IR - M1 (IV) 1,5 mg/Kg
IR M1 (IV) MS-B13 (SC) F= (1,5*18487)/(19,7*1918)*100 F=73%
Dosis COR005
1918 18487 MS-B13 (SC)
19,7 mg/kg
Biodisponibilidad relativa (AUC 0-~) de COR005 MS - B13 (SC) frente a COR005 IR M5 (SC) AUC(0-~) AUC(0-~) Dosis COR005
ng*h/ml ng*h/ml IR-M5 (SC)
IR-M5 (SC) MS-B13 (SC) 3 mg/kg
F= (3*18487)/(19,7*3254)*100 F=87% Dosis COR005
3254 18487 MS B13 (SC)
19,7 mg/kg
La Tabla 18 resume los efectos de los aditivos HPB y DEX de las formulaciones PLGA-MS de acetato de COR005 en cerdos enanos.
Tabla 18
Parámetros PK
Formulaciones PLGA-MS de COR005 Dosis (mg/Kg) Cmax (ng/ml) F% de BA (AUC 0-7 días)
B10 2,3 1,4 ~1
B13 - HPB:PEP 1:2 2,2 47 26
B14 - HPB: PEP 1:4 1,8 63 ~100
B12(PSI13) - DEX:PEP 1:8 2,9 12,6 21
La Figura 15 muestra el efecto de DEX:PEP 1:8 en cerdos enanos con perfiles PK comparativos de microesferas de PSI13 (B12: DXE:PEP 1:8) en comparación con B10 (formulación MS básica) como control. La Figura 16 muestra el efecto de HPB:PEP 1:2 en cerdos enanos en un gráfico de perfiles PK comparativos de la formulación de microesferas de liberación en ráfaga B13 en comparación con B10 (formulación MS básica) como control. La figura 17 muestra el efecto de HPB:PEP 1:4 en cerdos enanos como gráfico de perfiles PK comparativos de liberación en ráfaga de microesferas de composición B14 en comparación con B10 (formulación MS básica) como control.
Las Tablas 19 y 20 resumen el contenido de péptidos y la eficacia de encapsulación (EE) de muestras a granel de microesferas, medidos por HPLC.
Tabla 19
Muestra Contenido de péptidos (%) Eficacia de encapsulación EE (%) B9 4,52 65
B10 11,53 79
B11 3,95 55
B12 11,53 81
B13 11,82 74
Tabla 20
Teórico PSI-6 PSI-7 PSI-8 PSI-9 PSI-10 PSI-1 (como B14) PSI-13 (como B12) Péptido
teórico, % en 23,7 24,6 28,6 23,7 27,7 22,9 27,5 peso
HPB 3,4 (150)
1:8 HPB: 3,2 (150) 1:10 6,7 (300) 1:4
Ciclodextrina
pép a HPB: pép a
% (mg) granel HPB:pép a granel
granel
3,4 (150)
Dextrosa % 1:8 4,0(187,5) 1:8 (mg) Dex:pép a Dex:pép a granel granel
Resultados
Contenido de
péptido 175
medido, % en , 17,8 19,5 17,3 17,6 16,4 19,3 peso
Eficacia de
encapsulación, 74% 72% 68% 73% 64% 72% 70%
%
Se midió la liberación in vitro (IVR) de acetato de veldoreotida de las microesferas de PLGA. Se añadieron 50 mg de cada lote de microesferas (B9-B13) a 10 ml de tampón fosfato (10 mM, pH = 7,4, sin calcio, magnesio ni cloruro) en un vial de vidrio de 20 ml. Los viales se mantuvieron a 37°C en un agitador de temperatura controlada a 150 rpm. Las muestras se recogieron en diversos puntos de tiempo y se analizaron a través de un espectrofotómetro UV-Vis NANOVUE® a 280 nm frente a una curva de patrón de calibración. La tabla 21 resume los resultados. La figura 18 muestra perfiles IVR comparativos de COR005 de formulaciones de microesferas B9-13.
Tabla 21
B9 B10 B11 B12 B13 Tiempo (día) IVR (%) IVR (%) IVR (%) IVR (%) IVR (%) 0 10,4% 2,6% 12,7% 11,6% 26,4% 0,08 11,4% 3,1% 15,5% 21,9% 37,0% 0,17 12,0% 3,3% 16,3% 22,2% 37,6% 1 13,3% 5,4% 17,7% 24,9% 39,1% 3 12,6% 8,7% 17,4% 29,6% 41,5% 5 14,1% 12,5% 20,7% 33,5% 43,2% 7 14,0% 14,4% 20,7% 35,4% 44,4% 14 13,7% 20,0% 18,6% 40,4% 43,6%
Los perfiles de IVR comparativos de COR005 de las formulaciones de microesferas B9 a B 13 se representan en la figura 18 y la tabla 21 anterior. Los datos muestran una diferencia significativa entre los dos tipos específicos de PLGA 50:50 que se usaron para las preparaciones de microesferas. La cantidad acumulada del péptido liberado, y la tasa de liberación aumentaron significativamente a partir de las microesferas preparadas con el polímero de bajo peso molecular 7-17 kDa (7-17 KD) en comparación con las microesferas preparadas con el peso molecular más alto 38­ 54 kDa (38-54KD). Los perfiles de liberación in vitro comparativos entre HPB o DEX (B13 y B12 respectivamente) en comparación con la formulación básica B10 (sin aditivos) muestran que los aditivos HPB o DEX aumentaron la tasa de liberación y el péptido acumulado total liberado de las microesferas por encima de la formulación básica. El perfil de liberación in vitro de COR005 a partir de B13, que se preparó con el aditivo HPB, muestra la liberación en ráfaga más alta de aproximadamente el 40%. A la liberación en ráfaga le siguió una tasa de liberación muy baja durante los siguientes 14 días que finalizó con una liberación total de aproximadamente el 45% en el día 14. Téngase en cuenta que el perfil de IVR de B13 se correlaciona con su perfil PK, tal como se muestra en los datos PK en ratas y en cerdos enanos. El perfil de liberación in vitro de COR005 a partir de B12, que se preparó con el aditivo dextrosa, muestra una liberación en ráfaga reducida de aproximadamente el 20% en comparación con B13. A la liberación en ráfaga de B12 le siguió un aumento continuo en la tasa de liberación a lo largo de 14 días, finalizando con una liberación total de alrededor de aproximadamente el 40% en el día 14. Este perfil de liberación in vitro de la liberación en ráfaga comparativa de B12 frente a B13 y B10 se correlaciona con el perfil PK de B12 en ratas y cerdos enanos. El perfil de liberación in vitro de COR005 a partir de la formulación básica - B10, que se preparó sin aditivos, muestra una ráfaga significativamente baja de aproximadamente el 5%. A la liberación en ráfaga de B10 le siguió un aumento continuo de la liberación a lo largo de 14 días, finalizando con una liberación total de aproximadamente el 20% en el día 14. La tasa de liberación observada de B10 y el péptido total acumulado liberado de estas microesferas fueron significativamente menores en comparación con B12 y B13. La liberación en ráfaga in vitro observada de B10 se correlaciona con su perfil PK. B10 muestra una liberación en ráfaga in vivo más baja en comparación con B12 y B13 en ratas y cerdos enanos.
Los resultados de la cinética de "ráfaga" (0-24 horas) de las formulaciones y las reacciones en el sitio de inyección a lo largo de 28 días se muestran en las tablas 22 y 23, respectivamente. Los perfiles farmacocinéticos para las diferentes formulaciones se muestran en las figuras 11 a 18.
TABLA 22
Formulación Dosis media (mg/kg) Cmax "ráfaga" media (ng/ml) AUC0-24h "ráfaga" media (ng*h/ml) B9 19 88 628
B10 22 30 437
B11 17 96 759
B12 20 133 1280
B13 20 211 2771
TABLA 23
Formulación Péptido medio en el sitio ISR "ráfaga" 6 horas ISR "ráfaga" 24 horas ISR 4 días ISR 28 días de inyección (mg,
estimado), IVR
B9 0,65 2-3 2 1-2 Recuperación B10 0,4 2 2 1-2 Recuperación B11 1 2-3 2 1-2 Recuperación B12 1 3-4 3-4 1-2 Recuperación
B13 1 5 5 4 1-2
•Las reacciones en el sitio de inyección se clasifican del 1-5, con 1=tolerado y 5=peor (véase la tabla 24)
TABLA 24
Puntuación ISR 24h Semana Mes
1 NOEL NOEL Recuperación NOEL 2 Inflamación ligera Sin enrojecimiento Recuperación /cicatriz 3 Hinchazón leve Ligero enrojecimiento Ligera alopecia 4 Hinchazón Enrojecimiento leve/ costra Ligero enrojecimiento Alopecia 5 Hinchazón edema Costra/Hemorragia Enrojecimiento y alopecia
Tal como se muestra en la tabla 23, en ratas parece que la tolerabilidad es de < 0,5 mg en el sitio de inyección y aproximadamente 1 mg induce una reacción en el sitio de inyección.
Las microesferas de PLGA de cada lote preparado en este ejemplo también se sometieron a microscopía electrónica (SEM). Las imágenes resultantes se muestran en las Figuras 19-27.
Tal como puede observarse a partir de las figuras 12 y 13, la formulación B13 (acetato de veldoreotida en microesferas de PLGA de bajo peso molecular con hidroxipropil-p-ciclodextrina) mostró una mayor liberación en "ráfaga" en comparación con oras formulaciones de acetato de veldoreotida durante las primeras 24 horas seguida de liberación sostenida durante 28 días con una Cmin definida. Las formulaciones B10 y B12 (acetato de veldoreotida en microesferas de PLGA de bajo peso molecular sin y con dextrosa, respectivamente) mostraron una "ráfaga" más pequeña seguida de una liberación creciente desde aproximadamente las semanas 2 a 4 sin aumentar la reacción en el sitio de inyección, lo que indica liberación sostenida con tolerabilidad mejorada. B12 demostró específicamente una biodisponibilidad significativamente más alta (AUC) que el AUC extrapolado para B13. Sin embargo, las microesferas de PLGA que contenían acetato de veldoreotida preparadas con hidroxipropil-p-ciclodextrina o dextrosa mostraron una liberación mejorada en la fase de "ráfaga" sobre las microesferas de PLGA sin los excipientes. Se sospecha, sin limitarse a la teoría, que estos excipientes dan como resultado una porosidad y área superficial mejoradas de las microesferas. En general, B10 fue la formulación más tolerada, lo que dio como resultado niveles plasmáticos (Cmax) de aproximadamente 30 ng/ml durante la fase de "ráfaga". También es notable que la IVR está inversamente correlacionada con las reacciones en el sitio de inyección y puede usarse para predecir el potencial de reacción en el sitio de inyección para las formulaciones.
Formación de imágenes SEM comparativas de formulaciones PLGA-MS de acetato de COR005 que muestran los efectos de los aditivos
El primer objetivo de la formación de imágenes SEM fue evaluar y comparar la morfología externa de las diversas formulaciones MS y verificar los efectos de los aditivos HPB y DEX en el tamaño de las gotas y la tensión superficial. El segundo objetivo fue evaluar y comparar las estructuras internas de las distintas matrices MS. Más específicamente, identificar posibles diferencias entre las diversas matrices internas que se correlacionan con las interacciones únicas sugeridas entre COR005, los aditivos (DEX y HPB) y el polímero hidrófobo PLGA (durante la emulsión primaria y durante la liberación del péptido en el sitio de inyección, del MS final) y los efectos de estas interacciones en los perfiles IVR y PK observados de COR005 (con o sin aditivos).
La figura 19 muestra una fotomicrografía SEM de la morfología externa de formulaciones de microesferas básicas B10 de acetato de COR005 sin aditivos. La figura 20 muestra una microfotografía de la morfología interna de formulaciones de microesferas básicas B10 de acetato de COR005 sin aditivos. En la figura 20, las flechas indican microesferas que se cortan para mostrar la morfología interna.
Las figuras 19 y 20 representan las morfologías externa e interna de la formulación básica B10. La emulsión primaria de esta formulación MS se basó en mezclar la solución de agua del péptido con el polímero en cloruro de metileno, sin ningún otro aditivo. Téngase en cuenta que en estas condiciones de preparación, COR005 posee su actividad superficial máxima (tal como se representa en las tablas 2, 3 y 4). La figura 19 representa la forma simétrica de la formulación B10 MS y la superficie externa relativamente lisa de la MS con solo unos pocos poros pequeños. Por lo tanto, se realizó otra serie SEM después del corte de muestras de MS con el fin de evaluar la consecuencia de estos poros externos con la morfología interna de la MS. La imagen SEM de la figura 20 muestra la estructura interna expuesta de la MS como resultado del corte criogénico. La matriz interna observada tiene una textura sólida con solo unos pocos poros, lo que se correlaciona con la observación de la superficie externa de esta formulación básica B10. Basándose en estas observaciones de SEM, la formulación B10 se describe mejor como una microesfera con una permeabilidad relativamente baja. Estos resultados respaldan los supuestos de alta afinidad entre el COR005 y el polímero, que dan como resultado una superficie externa relativamente lisa y una matriz interna sólida y condensada. Esta morfología se debe a la actividad superficial única de COR005 como tensioactivo relativamente hidrófobo de agua en aceite y su orientación en la interfase con la solución de cloruro de metileno de polímero como superficie hidrófoba (figura 20 y tablas 3, 4 y 5). Como consecuencia de esta interacción física (no química) de péptido:polímero, la liberación esperada del péptido de la formulación B10 debería ser relativamente lenta. De hecho, los datos de IVR muestran que la tasa de liberación de COR005 de la Formulación B10 es la más lenta en comparación con las formulaciones de HPB y DEX MS. Esta tasa de liberación lenta se correlacionó con el perfil PK in vivo de B10, que tiene la liberación en ráfaga más baja (Cmax) observada en ratas y cerdos enanos y los niveles plasmáticos más bajos observados en los cerdos enanos en comparación con las formulaciones B12, B13 y B14 (tabla 3). Téngase en cuenta que la PK en ratas indicó un aumento de los niveles plasmáticos de COR005 de la formulación B10 MS por encima de las formulaciones B12 y B13; sin embargo, debido a la variabilidad significativa asociada con el grupo de animales B10, los resultados no fueron concluyentes. La correlación determinante entre la liberación lenta de COR005 de la formulación B10 y los niveles plasmáticos deficientes y la BA baja se evidenció en los estudios PK en cerdos enanos tal como se muestra en la tabla 3. La tasa de liberación de COR005 de la formulación B10 básica fue demasiado lenta para superar la tasa de eliminación de COR005 en cerdos enanos y como resultado se obtuvieron niveles plasmáticos deficientes a lo largo del tiempo.
La morfología externa e interna de la formulación B12 con DEX
Las figuras 21 y 22 representan las imágenes SEM de las morfologías externa e interna de la formulación B12 (PLGA-MS-DEX) respectivamente. La imagen representada en la figura 21 muestra una MS representativa de la formulación B12 con una porosidad significativamente alta de la superficie externa como resultado de muchos poros visibles en la superficie, en comparación con los muy pocos poros observados en la formulación B10 básica. En la figura 22, la matriz interna de la formulación B12 se expone después del corte criogénico de la MS. La imagen muestra un número significativamente alto de huecos separados por límites poliméricos intersticiales relativamente delgados, lo que da como resultado una alta densidad de pequeños huecos en la matriz interna y, por lo tanto, un mayor volumen de huecos. El primer impacto esperado de este volumen de huecos aumentado es una densidad polimérica reducida en la matriz interna. Para un volumen dado de MS, más huecos dentro del MS equivalen a menos polímero debido al espacio interno de los huecos. El segundo resultado esperado de este alto volumen de huecos es un contenido reducido de péptido en la MS. Menos polímero en la matriz puede conducir a una menor encapsulación del péptido dentro de la MS. El tercer impacto esperado de este alto volumen de huecos es una liberación rápida del péptido encapsulado de la formulación B12 MS con una duración de liberación menor en comparación con la matriz sólida y más densa de la formulación B10 MS básica.
Sin embargo, inesperadamente, los tres resultados anticipados no se observaron en los datos de IVR y PK de COR005. Los datos de IVR (véase a continuación) muestran una liberación prolongada y constante de COR005 de la formulación B12 sobre la formulación B10 y la PK muestra niveles plasmáticos aumentados a lo largo del tiempo y una BA absoluta más alta de la formulación B12 sobre la Formulación B10.
Estos resultados apuntan al hecho de que en el caso de la emulsión primaria de COR005 con DEX, el péptido no se concentra dentro de la matriz de PLGA sino en la superficie del polímero de los huecos internos. Debido a que COR005 tiene una actividad tensioactiva única que da como resultado una alta afinidad del péptido por el polímero PLGA hidrófobo, se concentra en la interfase del polímero y la fase acuosa interna de la emulsión primaria. En consecuencia, durante la fase de solidificación de la MS sin aditivos; la mayor parte de COR005 se concentrará entre las cadenas poliméricas de PLGA.
Sin embargo, cuando se añade DEX, los muchos huecos creados dentro de la matriz presentan muchos espacios pequeños que dan como resultado un área superficial mejorada dentro de la MS. En este caso, el área superficial total de la MS aumenta de manera significativa por encima del caso de la Formulación B10 MS que tiene una matriz relativamente sólida. Esto da como resultado la liberación significativamente prolongada de COR005 de B12, seguida de un aumento de los niveles plasmáticos durante un período de tiempo prolongado, lo que puede explicarse por la liberación de COR005 desde la superficie interna de los huecos en lugar de las estructuras poliméricas sólidas. Solo cuando el péptido se libera de una superficie, la cinética de esta liberación se correlaciona con la PK.
Otro impacto inesperado de DEX en PLGA MS es su efecto sobre la dispersión y distribución de COR005 durante la emulsión primaria y la solidificación de MS. Se demostró que la dextrosa mejora la solubilidad de COR005 en agua (la tabla 3 muestra la alta solubilidad en solución de dextrosa al 5% de >500 mg/ml). Este efecto puede deberse al potencial enlace de hidrógeno entre la dextrosa y COR005 que cambia la conformación del péptido a una conformación más hidrófila con restos menos hidrófobos expuestos en el exterior de la molécula. En otras palabras, la alta capacidad de enlace de hidrógeno y la afinidad del agua por la dextrosa pueden ayudar a solubilizar el péptido. Este efecto conduce a una mejor dispersión y volumen de distribución del péptido dentro de la MS. Cuando la emulsión primaria se añade a la emulsión secundaria, que es una fase acuosa de PVA, la mayor parte de la dextrosa se filtra de la MS embrionaria a la fase continua. El péptido adoptará de nuevo su conformación hidrófoba original, que tiene una gran afinidad por el PLGA y, por lo tanto, se concentra en las superficies interfaciales de los huecos y dentro de la matriz polimérica. Esto está respaldado por la recuperación muy baja de la dextrosa en la MS final de solo aproximadamente el 0,5% de dextrosa detectada en la MS final del 4% de la carga teórica (Tabla 25 a continuación).
Tabla 25
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La morfología externa e interna de la formulación B13 con HPB
Las figuras 23 y 24 representan las imágenes SEM de morfologías externas e internas de la formulación B13 MS. La figura 25 representa las morfologías externa e interna del placebo MS preparado como control con la misma cantidad de HPB utilizada en la formulación B13 (donde no se añadió acetato de COR005). La morfología externa de la formulación B13, tal como se representa en la figura 23, respalda el efecto esperado de HPB como agente de porosidad en PLGA-MS. Hay muchos poros en la superficie con un amplia intervalo de diámetros de poro. Sin embargo, la figura 24 muestra la estructura interna de la formulación B13 MS después de ser cortada por corte criogénico, lo que señala la diferencia significativa entre la morfología interna de la formulación B13 frente a la formulación B12. La estructura interna de la formulación B13 muestra un aumento significativo en el tamaño de huecos en comparación con el tamaño de los huecos en la Formulación B12 (Figura 22). Además, el número de huecos internos más grandes en la formulación B13 se reduce en comparación con la alta densidad de los muchos huecos pequeños que se encuentran en la formulación B12. Estos resultados muestran que en el caso de la formulación B13, el aumento del área superficial total debido a la creación de huecos internos es menor que en el caso de la formulación B12.
Por lo tanto, se espera que la eficacia de encapsulación de COR005 en la formulación B13 se reduzca en comparación con las formulaciones B10 y B12 debido al área superficial interna. Sin embargo, la eficacia de encapsulación de COR005 fue similar para estas tres formulaciones de MS. Esto significa que COR005 se concentrará con una concentración relativamente alta cerca de la cubierta externa de la MS, lo que puede dar como resultado un aumento de la liberación en ráfaga. Además, la interacción entre HPB y COR005 como complejo de inclusión dará como resultado una mayor concentración del complejo hidrófilo de HPB con el péptido. Debido a esta interacción entre HPB y COR005, el complejo hidrófilo atraerá más agua y limitará la eficacia de solidificación de PLGA, que terminará con una matriz interna con huecos relativamente más grandes, tal como se muestra en las figuras 23 y 24.
El peso molecular de HPB es significativamente mayor (aproximadamente el mismo nivel de COR005) en comparación con DEX y, por lo tanto, su movilidad y dispersión en el espacio interno del MS también serán limitadas, en comparación con un mayor volumen de distribución de DEX. El tamaño aparentemente mayor de los huecos internos, tal como se encuentra en la formulación B13, y el consiguiente efecto de la actividad superficial del péptido asociado con esta área superficial interna se correlacionan con el perfil único de IVR y PK de la Formulación B13. Cuando el agua accede al espacio interno de Formulación B13 MS, se produce una liberación inmediata de péptido debido a la alta presencia de HPB cerca del péptido. La mayor parte del HPB permaneció en la MS final tal como se muestra en la tabla 25, lo que da como resultado la misma relación HPB:PEP que la relación teórica HPB:PEP de 1:2. Además, la actividad superficial del péptido en el sitio de inyección se reduce, tal como se muestra en la tabla 6 en estas condiciones. El resultado de estos dos efectos es que la mayor parte del péptido se concentrará como complejo hidrófilo con el HPB en la superficie del espacio interno de los grandes huecos en la MS.
Estos datos respaldan adicionalmente la liberación inmediata de la mayor parte de la carga de péptido durante la fase temprana de la penetración de agua (postinyección), a la que seguirá una liberación muy deficiente del resto del péptido encapsulado. Además, con el fin de confirmar aún más la interacción COR005:HPB y el impacto de esta interacción única en la actividad superficial del péptido encapsulado, se preparó una formulación de MS "placebo" de B13 que se basó en la combinación de HPB y PLGA como formulación B13 pero sin el péptido COR005. La figura 25 muestra la imagen SEM de la morfología de "MS" de la formulación B13 sin el acetato de COR005. Esta imagen muestra claramente que la encapsulación de HPB sin COR005 da como resultado microcápsulas huecas en lugar de microesferas sólidas. Más específicamente, la HPB retiene agua a medida que la MS se solidifica, ralentizando potencialmente la solidificación de PLGA en la MS embrionaria. Este efecto conduciría a agujeros/poros significativamente más grandes en la matriz de PLGA, tal como se observó para el placebo, mucho más grandes que los de la formulación B13. Esta evidencia respalda adicionalmente la interacción entre HPB y COR005 que da como resultado una superficie interna única e inesperada en las formulaciones de PLGA-MS.
La figura 26 muestra una micrografía SEM de una formulación de microesferas "placebo" similar de la formulación B12, usando DEX y el excipiente, sin el péptido COR005. Estas figuras muestran la estructura externa e interna de las microesferas preparadas solo con el aditivo (sin COR005) en las mismas cantidades de entrada que las formulaciones que contienen péptidos. La morfología externa de las microesferas de placebo muestra muy pocos poros superficiales. Internamente, hay un número limitado de grandes huecos internos. Las microesferas son solo una "cubierta" de polímero con un núcleo hueco. Estas a veces se denominan microcápsulas. Sin estar ligado a ninguna hipótesis en particular, una vez que se forma la emulsión primaria de agua en aceite, la tensión superficial de solo el WFI y el aditivo permite que las gotas más pequeñas confluyan. El poli(alcohol vinílico) (PVA) retiene las microesferas embrionarias (emulsión primaria) como gotas discretas. El procedimiento de evaporación del disolvente es relativamente lento, lo que permite que la emulsión primaria forme dos fases: la fase de agua interna que contiene el aditivo y la fase de solución de polímero externa compuesta por el polímero y cloruro de metileno. La superficie de la MS tiene pocos poros que habrían sido creados por una fina dispersión de gotas de agua dentro de la fase polimérica orgánica.
En las Figuras 23 y 24 vemos el efecto de añadir COR005 junto con HPB. El cambio en la tensión superficial en la fase acuosa interna permite que las gotas más pequeñas de péptido y HPB permanezcan durante todo el procedimiento de evaporación del solvente, estableciendo la estructura interna y superficial tal como se representa. De manera similar, la combinación de dextrosa y COR005 proporciona microesferas con una gran cantidad de pequeños huecos internos (Figura 22).
El paradigma de B14 (PSI12) y el perfil de liberación mejorado y PK de COR005 con HPB
Los datos inesperados de la formulación B13 IVR y su perfil PK, que muestran una liberación inmediata de la mayor parte del contenido de péptido encapsulado seguida de niveles plasmáticos significativamente bajos a lo largo del tiempo, sirvieron de base para el diseño de formulaciones de MS con relaciones reducidas de HPB:PEP. Los resultados contraintuitivos de IVR y PK muestran que la relación reducida de HPB:PEP de desde 1:2 hasta 1:4 e incluso hasta 1:8 da como resultado un aumento inesperado en la liberación de péptidos de la MS. Con el fin de investigar el vínculo entre estos resultados IVR y PK con la actividad superficial única de COR005, se realizó un análisis SEM detallado de la MS con relaciones HPB:PEP reducidas con el objetivo de evaluar su morfología interna. La figura 27 muestra imágenes SEM que comparan la morfología de las matrices internas de las formulaciones de COR005 MS con diversas relaciones de HPB:PEP.
Tal como puede verse a partir de las imágenes SEM comparativas de la figura 27, la relación de HPB:PEP reducida de desde 1:2 (Formulación B13) hasta 1:4 (Formulación B14) y una reducción adicional hasta 1:8 y 1:10 da como resultado un aumento inesperado del número de huecos en la matriz interna de estas microesferas. Además, la relación reducida de desde 1:2 hasta 1:4 conduce a otro resultado contrario a la intuición de una mayor distribución de poros en la superficie externa de MS, tal como puede verse en el ejemplo HPB:PEP 1:4 de B14 en comparación con B13. El efecto inverso/inesperado de la relación HPB:PEP reducida se fortalece adicionalmente en el caso de la relación HPB:PEP mínima de 1:10, tal como se representa en la imagen SEM de esta relación, que muestra una matriz interna que tiene una distribución significativamente más densa de huecos más pequeños.
En conclusión, a medida que se reduce la relación HPB:PEP, más COR005 se orienta hacia la superficie interna de la MS. Esta actividad superficial única da como resultado una liberación aumentada y prolongada del péptido que se debe principalmente a la liberación del péptido desde el área superficial interna llena de huecos aumentada. Como resultado, la liberación del péptido mejorará y se prolongará a lo largo del tiempo, tal como se observó en los estudios IVR y PK en el caso de la formulación B14. Téngase en cuenta que la relación inversa entre la relación HPB:PEP observada mediante el análisis SEM también se correlaciona con el estudio IVR comparativo de estas diversas relaciones HPB:PEP.
Área superficial
El área superficial de las microesferas se midió usando adsorción de gas nitrógeno en un instrumento Micromeritics ASAP 2020. Se añaden entre 15-25 mg de microesferas al tubo de análisis de la máquina y se sella dentro del tubo con una frita de sellado especializada. El análisis se realizó en dos fases: desgasificación y medición de la adsorción de nitrógeno. La desgasificación es un procedimiento que aplica calor y vacío para eliminar la humedad y otros gases atrapados en el interior de las microesferas. Las microesferas se desgasificaron a vacío (100 pmHg) y se calentaron a 35°C durante 150 min. Posteriormente, el tubo de muestra se transfirió a la válvula de análisis del instrumento. El tubo de muestra se baja a un Dewar de nitrógeno líquido para enfriar la muestra hasta 77°K. Se añade nitrógeno gas de manera controlada y se monitoriza la presión del tubo con el fin de generar una isoterma de adsorción. A partir de la isoterma se aplica la teoría de Brunauer-Emmett-Teller (BET) con el fin de calcular un área superficial por unidad de masa. El tiempo de análisis es de aproximadamente 4 horas, el tiempo total de ejecución es de 6,5 horas por muestra.
El concepto de tensión superficial que afecta a la estructura de poros se confirma nuevamente con la medición del área superficial. Los resultados de esta prueba en varias microesferas diferentes preparadas sin excipiente (PSI-7) y con DEX o HPB (PSI-6 y PSI-12) tal como se describió anteriormente se resumen en la tabla 26.
Tabla 26
Formulación MS Excipiente Área superficial BET (m2/g) PSI-7 Ninguno 5,084
PSI-6 3,4% DEX (DEX:PEP = 1:8) 9,7437
PSI-12 6,7% HPB (HPB:PEP = 1:4) 77,7176
Los niveles más altos de área superficial son indicativos de un mayor número de huecos internos en las microesferas.
Las microesferas que comprenden acetato de veldoreotida y dextrosa o HPB como excipientes tienen un área superficial de la pluralidad de microesferas poliméricas de desde aproximadamente 7 m2/g hasta aproximadamente 12 m2/g, tal como desde aproximadamente 7 m2/g hasta aproximadamente 10 m2/g.
En comparación, las microesferas preparadas a partir de PLGA y acetato de octreotida con el 0, el 0,2% o el 1% de glucosa tenían un área superficial de 4,4, 4,7 o 4,9 m2/g, respectivamente (Biomaterials, 2004, 25, 1919-1927).
EJEMPLO 5 (Ejemplo de referencia)
La veldoreotida se formuló como emulsión de agua en aceite usando el 80% (% en peso) de aceite de semilla de algodón, el 20% (% en peso) de agua para inyección (WFI) y el 1% (% en peso) de acetato de veldoreotida. Específicamente, se disolvieron 10 mg de acetato de veldoreotida en 200 ul de WFI en un vial de vidrio de 5 ml, se añadieron 800 mg de aceite de semilla de algodón y la mezcla resultante se agitó con agitación magnética a temperatura ambiente durante 15 minutos a 1000 rpm. A continuación, la emulsión se observó al microscopio óptico y se almacenó en refrigeración. La emulsión resultante era estable y resultó inyectable mediante una aguja 27G.
El acetato de veldoreotida también se formuló como hidrogel utilizando sal sódica de carboximetilcelulosa al 0,7% (p/v) (SIGMA C5013) de alta viscosidad, hidroxipropil-p-ciclodextrina al 37,5% (p/v) y acetato de veldoreotida al 0,5% (p/v). Específicamente, se mezclaron 10 mg de acetato de veldoreotida con 75 mg de hidroxipropil-p-ciclodextrina en 2 ml de WFI y se mezclaron en un vial de vidrio de 5 ml hasta que se tornó transparente. Los 14 mg de sal sódica de carboximetilcelulosa se añadieron lentamente vertiéndolos en la mezcla con agitación magnética a temperatura ambiente seguido de almacenamiento en refrigeración. También se encontró que el hidrogel resultante era inyectable a través de una aguja 27G. Sorprendentemente, se encontró que el orden de formulación era crítico para la estabilidad del gel. La combinación de acetato de veldoreotida con hidroxipropil-p-ciclodextrina seguida de la adición de carboximetilcelulosa dio como resultado un hidrogel más fuerte que la adición de carboximetilcelulosa al acetato de veldoreotida primero o la combinación simultánea de los componentes. Curiosamente, la combinación de hidroxipropilp-ciclodextrina con carboximetilcelulosa sola no dio como resultado la formación de gel. Por lo tanto, se cree que, sin estar ligado a la teoría, el polímero interactúa con la ciclodextrina y el péptido debido a sus propiedades únicas para dar como resultado la formación de un gel estable.
Tanto la formulación de emulsión como el hidrogel se inyectaron en ratas a una dosis de 1 mg por sitio de inyección usando agujas 27G, una formulación en cada lado de la rata. No se observó hinchazón en el sitio de inyección para ninguna de las formulaciones hasta 48 horas después de la dosificación. A las 48 horas después de la dosificación, se observó hinchazón en el sitio de inyección solo para el hidrogel y no para la emulsión. A las 72 horas después de la dosificación, se observó hinchazón y una pequeña herida en la formulación de gel. Los sitios de inyección para la formulación de emulsión no mostraron ninguna reacción significativa en el sitio de inyección sin que se observara hinchazón ni alopecia.
Las ratas se sacrificaron y se les realizó la necropsia para valorar por vía subdérmica la reacción en el sitio de inyección. En el sitio de inyección del hidrogel, a las 72 horas se encontró edema y signos de inflamación local, incluyendo un engrosamiento de la subdermis. En el sitio de inyección de la emulsión, a las 48 horas, el tejido subdérmico era benigno sin que se observaran signos de hinchazón, edema, inflamación o engrosamiento de la subdermis.
EJEMPLO 6 (Ejemplo de referencia)
El acetato de veldoreotida se formuló en liposomas (vesículas multilaminares) combinando acetato de veldoreotida y 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) en una relación de 1:10, combinando 7 mg de acetato de veldoreotida y 70 mg de DMPC (14:0 PC (DMPC) 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina 850345 de Avanti, 7% en peso) en 1 ml de WFI en un vial de vidrio de 5 ml. La mezcla se agitó a 1000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente usando agitación magnética. Esta formulación se analizó usando formación de imágenes SEM tal como se muestra en la figura 28. Los liposomas se almacenaron en refrigeración.
A dos ratas se les inyectó acetato de veldoreotida en el vehículo de ácido láctico del ejemplo 3. A tres ratas SD® se les inyectaron liposomas de acetato de veldoreotida. Se hicieron inyecciones administradas a aproximadamente 4,5 mg/kg de acetato de veldoreotida. Se extrajeron muestras de plasma a las 1,4, 8, 12, 24 y 48 horas y se analizaron tal como se explicó anteriormente para determinar la concentración plasmática de acetato de veldoreotida en ng/ml. Los datos se muestran de forma gráfica en la figura 29.
Los liposomas demostraron ser un vehículo de suministro adecuado para la liberación sostenida de acetato de veldoreotida con concentraciones terapéuticas (> 1-5 ng/ml) durante al menos 48 horas, lo que puede correlacionarse con una forma farmacéutica de una vez por semana para seres humanos. Puede entenderse que los liposomas pueden formarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica y que la relación de acetato de veldoreotida con respecto al agente liposomal puede variar al menos de 1:5 a 1:20. Además, puede usarse cualquier vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
EJEMPLO 7
Se prepararon microesferas de PLGA que contenían acetato de veldoreotida. Se disolvieron 500 mg de PLGA 50:50 (7-17 kDa) en 5 ml de fase oleosa de diclorometano). Una solución acuosa que pone en contacto 50 mg de acetato de veldoreotida en 1 ml de DDW preparada por separado (fase acuosa interna). La primera fase acuosa se emulsionó en la fase oleosa (que contenía PLGA), usando un homogeneizador de alta velocidad (Polytron) a 2-8°C usando diferentes velocidades y duraciones de tiempo para formar una emulsión primaria de agua en aceite. La emulsión primaria se añadió (gota a gota) a los 100 ml de fase acuosa externa que contenía una solución de PVA al 1 % en PBS para formar una emulsión secundaria. La justificación para disolver el PVA en PBS fue para reducir al mínimo la fuga de acetato de veldoreotida del agua a la fase externa. A continuación, las microesferas húmedas se agitaron a 1000 rpm durante 2 h en hielo para permitir la evaporación de DCM y la solidificación de las microesferas. Las microesferas húmedas se recogieron por centrifugación después de tres ciclos de lavado en PBS y luego se suspendieron en 6 ml de manitol al 2% y se liofilizaron. Se disolvió una muestra de las microesferas secadas en DDW:acetona 1:1 y la cantidad extraída de péptido se estimó mediante el espectrofotómetro naoVue. La carga final de fármaco de acetato de veldoreotida en microesferas fue del 6% en peso y el % de eficacia de encapsulación (EE)% fue del 77%.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende:
veldoreotida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma;
un excipiente seleccionado de hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPBCD) o dextrosa; y
una microesfera polimérica, que comprende poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), en donde la veldoreotida o la sal farmacéuticamente aceptable de la misma y el excipiente están encapsulados en la microesfera polimérica; y en donde el área superficial de la microesfera polimérica es de desde 7 m2/g hasta 12 m2/g.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la microesfera polimérica comprende poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que tiene un peso molecular promedio de entre 7 y 17 kilodaltons.
3. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el excipiente es dextrosa.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en donde la cantidad de dextrosa es de desde el 0,1% en peso hasta el 1,0% en peso basándose en el peso total de la microesfera polimérica.
5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el diámetro de la microesfera polimérica es de desde 10 micrómetros hasta 100 micrómetros.
6. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde la composición comprende acetato de veldoreotida.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde la microesfera polimérica comprende una pluralidad de huecos internos separados por delgados límites intersticiales.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde la composición comprende acetato de veldoreotida.
9. Un procedimiento para fabricar microesferas poliméricas que comprende las etapas de:
(i) mezclar un azúcar seleccionado de hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPBCD) o dextrosa con veldoreotida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma en agua para formar una primera mezcla acuosa;
(ii) mezclar un polímero de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica;
(iii) mezclar la primera mezcla acuosa en la solución polimérica para formar una primera mezcla de dispersión que comprende una emulsión primaria de agua en aceite;
(iv) mezclar poli(alcohol vinílico) (PVA) en solución salina tamponada con fosfato o en solución salina para formar una segunda mezcla acuosa;
(v) mezclar la emulsión primaria en la segunda mezcla acuosa de PVA para formar una emulsión doble de agua en aceite en agua proporcionando así una mezcla de dispersión secundaria; y
(vi) permitir que el disolvente orgánico en la mezcla de dispersión secundaria se evapore para formar microesferas poliméricas que comprenden veldoreotida o sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el azúcar es dextrosa y la relación en masa de dextrosa con respecto a veldoreotida o sal farmacéuticamente aceptable de la misma es de desde 1:4 hasta 1:16.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el azúcar es dextrosa y la relación en masa de dextrosa con respecto a veldoreotida o sal farmacéuticamente aceptable de la misma es de desde 1:6 hasta 1:10.
12. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el azúcar es dextrosa y la relación en masa de dextrosa con respecto a veldoreotida o sal farmacéuticamente aceptable de la misma es de 1:8.
13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la sal farmacéuticamente aceptable de veldoreotida es acetato de veldoreotida.
14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde la solución polimérica comprende poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que tiene un peso molecular promedio de entre 7 y 17 kilodaltons.
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