ES2562052T3 - Preparación liposómica que contiene camptotecina ligeramente soluble en agua - Google Patents

Abstract

Preparación liposómica que como componentes para la formación de una membrana incluye un fosfolípido y un ácido graso saturado con una longitud de cadena alquílica de 14 a 18, y que lleva como fármaco un compuesto de camptotecina ligeramente soluble en agua, en la cual dicha membrana tiene un fragmento modificado que comprende una cadena de polietilenglicol.

Description

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El liposoma de la presente invención lleva como integrantes de la membrana lípida cualquiera de los fosfolípidos arriba citados y especialmente un ácido graso saturado como componente esencial. Como ejemplos concretos del mismo cabe citar los ácidos mirístico, pentadecílico, palmítico, heptadecílico, esteárico y nonadecanoico. El ácido graso saturado tiene una longitud de cadena alquílica de 14 a 18. El ácido esteárico es particularmente preferido. Se puede usar uno solo o varios tipos de ácidos grasos.

El contenido de cualquier ácido graso o ácidos grasos arriba citados es generalmente del 1 al 30% molar respecto al total de moles de los componentes lípidos (es decir, de la cantidad de lípidos totales). Para asegurar todavía más el efecto de estabilización y retención del compuesto de camptotecina ligeramente soluble en agua en la membrana, el contenido de ácido graso es preferiblemente del 5% molar o más, con mayor preferencia del 10% molar o más, y con aún mayor preferencia del 12% molar o más. El límite superior del contenido de ácido graso es preferiblemente del 26% molar o menos, teniendo en cuenta la estabilidad de la membrana del liposoma.

Hay que advertir que en la presente descripción la expresión “lípidos totales” significa la totalidad de los lípidos incorporados en un liposoma, incluyendo los siguientes lípidos adicionales cuando están incorporados.

La preparación liposómica de la presente invención puede contener componentes adicionales hasta un punto en que no se vea afectado el objeto de la misma. Por ejemplo, además del fosfolípido y del ácido graso arriba mencionados, la preparación liposómica puede llevar otro componente de membrana incorporado al liposoma, que no afecte a la estructura de la membrana arriba descrita. No hay un límite concreto para dicho componente de membrana y como ejemplos del mismo cabe mencionar un lípido cuya molécula lleve un grupo hidrófobo compuesto por una cadena alquílica larga y análogos, y no contenga ningún grupo fosfato, por ejemplo un gliceroglicolípido, esfingoglicolípido y colesterol y sus derivados, incluyendo los hidrogenados. Se puede introducir uno o varios tipos de componentes adicionales de membrana.

Los derivados de colesterol son esteroles que poseen un anillo de ciclopentanohidrofenantreno; como ejemplo de ellos cabe mencionar el colestanol.

Entre ellos el colesterol tiene un efecto estabilizador de la membrana y es de esperar que produzca el efecto de controlar la tasa de liberación de fármacos de una preparación liposómica al plasma en función de la cantidad de colesterol. Por tanto es preferible que contenga colesterol y en general se desea que su contenido llegue hasta una proporción del 50% aproximadamente respecto a la total de moles de los componentes lípidos (proporción de lípidos totales). El contenido de colesterol es preferiblemente del 20 al 50% molar, con mayor preferencia del 30 al 50% molar y sobre todo del 35 al 50% molar.

La membrana también se modifica para variar las propiedades de los lípidos que la constituyen e impartir a la misma unas características deseadas. En concreto la membrana puede incluir un derivado que tenga un grupo modificador unido a un cuerpo hidrófobo compatible con una membrana lípida, el cual es generalmente un lípido. La porción lípida puede ser cualquier fosfolípido u otro lípido que no sea un fosfolípido, o bien cualquier fosfolípido y otros lípidos, y no está particularmente limitada. Como ejemplos cabe citar un fosfolípido, un alcohol alifático de cadena larga, un esterol, polioxipropilenalquilo y un éster graso de glicerina.

El polietilenglicol (PEG) se usa porque mejora la retención en la sangre. El peso molecular del PEG no tiene una limitación especial y en general es de 500 a 10.000 daltons. El peso molecular del PEG es preferiblemente de 1.000 a 7.000 daltons y con mayor preferencia de 2.000 a 5.000 daltons.

En la presente invención, la característica de una preparación liposómica designada como “retención en la sangre” es la propiedad de permitir la permanencia del fármaco transportado por la preparación liposómica en la sangre de un huésped al cual le ha sido administrada la preparación. Una vez liberado de un liposoma, el fármaco desaparece rápidamente de la sangre para actuar en el lugar expuesto al fármaco. Por tanto una buena retención en la sangre permitirá la administración de una cantidad reducida del fármaco.

El problema de los liposomas en un cuerpo vivo -es decir la aglomeración debida a la interacción (es decir, a la adsorción) entre los liposomas y una proteína opsónica o una proteína plasmática en la sangre, o el atrapamiento en un sistema retículo-endotelial (SER) del hígado o del bazo – se puede evitar modificando la membrana con el polímero hidrófilo arriba mencionado, lo cual permite aumentar la estabilidad en la sangre y conseguir una liberación altamente selectiva a un tejido o célula diana. En otras palabras, se puede lograr una buena retención en la sangre. Por consiguiente los liposomas se pueden acumular pasivamente en el tejido donde se favorezca la permeabilidad vascular de un tejido tumoral.

La modificación de membrana con PEG arriba mencionada se puede efectuar utilizando un agente modificador que contenga PEG, añadiendo PEG mediante una reacción con PEG de un lípido integrante de la membrana ligado a un grupo funcional, y similares. El proceso para ello no tiene una limitación concreta, pero se prefiere la introducción con el uso de un agente modificador que contenga PEG, tal como un derivado fosfolípido y/o colesterólico de PEG.

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Como ejemplos específicos cabe citar la fosfatidiletanolamina ligada a polietilenglicol (PEG-PE) y el colesterol ligado a polietilenglicol (Col-PEG). Asimismo, cuando la porción de lípido está compuesta por un fosfolípido, la cadena acilo del fosfolípido es preferiblemente un ácido graso saturado. Además la longitud de la cadena acilo es preferiblemente de 14 a 20 átomos de carbono y con mayor preferencia de 16 a 18 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen dipalmitoílo, diestearoílo y palmitoíl-estearoílo.

Entre ellos la PEG-PE es un compuesto para fines generales, fácilmente asequible.

La proporción de modificación de la membrana con la cadena polimérica hidrófila arriba citada puede ser en general del 0,1 al 20% molar respecto a los lípidos totales sin ninguna cadena polimérica hidrófila, preferiblemente es del 0,1 al 5% molar y con mayor preferencia del 0,5 al 5% molar.

Los ejemplos de grupos cargados incluyen, sin limitarse a ellos: grupos funcionales básicos tales como un grupo amino, un grupo amidino y un grupo guanidino; y grupos funcionales ácidos. El grupo cargado se puede introducir usando una sustancia cargada que lleve cualquiera de estos grupos.

Como ejemplos de sustancia cargada con un grupo funcional básico cabe citar: DOTMA, revelado en la patente JP 61-161246 A; DOTAP, revelado en la patente JP 05-508626 A; Transfectam, revelado en la patente JP 02-292246 A; TMAG, revelado en la patente JP 04-108391 A; hidrocloruro de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina, revelado en la patente WO 97/42166; DOSPA, TfxTM-50, DDAB, DC-COL y DMRIE.

Como ejemplos de sustancia cargada con un grupo funcional ácido cabe citar: gangliósidos que incluyen ácido siálico, como el gangliósido GM1 y el gangliósido GM3; y surfactantes ácidos basados en aminoácidos, tales como N-acil-L-glutamina.

Cuando en la sustancia cargada arriba citada un compuesto con un grupo funcional básico está unido a un lípido, la sustancia se denomina lípido cationizado. La parte lípida de un lípido cationizado está estabilizada en la membrana lípida bicapa de un liposoma y su parte funcional básica puede estar presente en las superficies de la membrana (es decir, superficie exterior y/o interior de la membrana) lípida bicapa del vehículo. La modificación de la membrana con un lípido cationizado puede incrementar la adhesión entre la membrana del liposoma y una célula, etcétera.

Los ejemplos de polisacáridos solubles en agua incluyen, sin limitarse a ellos, polisacáridos hidrosolubles tales como ácido glucurónico, ácido siálico, dextrano, pululano, amilosa, amilopectina, quitosano, manano, cilcodextrina, pectina y carragenano. Como ejemplos de un derivado del polisacárido hidrosoluble cabe citar los glicolípidos.

La proporción de modificación de la membrana con la sustancia cargada arriba citada o con el polisacárido soluble en agua se puede ajustar apropiadamente según sea necesario.

En la presente invención la cantidad del compuesto de camptotecina ligeramente soluble en agua transportada en el liposoma arriba citado, es decir la relación molar fármaco/lípido en la preparación liposómica, es generalmente de 0,1 o menos, y preferiblemente de 0,001 a 0,03, teniendo en cuenta la estabilidad y la eficiencia de encapsulación del liposoma al incluir el compuesto de camptotecina ligeramente soluble en agua en la membrana del liposoma. Además, cuando la relación molar compuesto de camptotecina ligeramente soluble en agua/ácido graso es menor de 1,0 el efecto de inhibición competitiva debido a la acción extractora de una proteína en la sangre es más claro.

El fármaco transportado por el liposoma, o el fármaco contenido en la preparación liposómica, debe considerarse como el fármaco presente en la preparación liposómica (en forma de dispersión), que es transportado y retenido por el liposoma, es decir, fundamentalmente el fármaco no debe ir contenido en la fase externa de la dispersión, fuera del liposoma, de forma libre e independiente de los liposomas. En la preparación liposómica de la presente invención que contiene como fármaco un compuesto ligeramente soluble en agua, se cree que al menos una parte del fármaco es transportado sustancialmente en una membrana lípida, debido por ejemplo a su incorporación a ella. De todos modos, en la preparación liposómica de la presente invención, el estado en que el fármaco es transportado no está limitado en absoluto, siempre que no se encuentre libremente en la fase acuosa externa de la preparación. Así por ejemplo, el fármaco puede estar incorporado en la fase acuosa interna independientemente de la membrana o bien como tal y ser transportado simultáneamente por ella.

La preparación liposómica de la presente invención se caracteriza porque, vista por microscopía electrónica de transmisión después de congelarla en presencia de glicerina, se observa como partículas de forma irregular, no esférica. Debe advertirse que un liposoma (preparación) sin ningún contenido de ácido graso se observa por el mismo método como partículas que tienen una forma original esférica.

La membrana lípida bicapa del liposoma puede tener la estructura de una vesícula unilaminar (p.ej. una vesícula unilaminar pequeña (VUP) o unilaminar grande (VUG)) o de una vesícula multilaminar (VML) compuesta de varias capas, siendo preferible la estructura de VML.

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En la presente invención la concentración del fármaco en el plasma 1 hora después de la administración es del 10%

o más y preferiblemente del 15% o más respecto al valor inicial. El término “valor inicial” se refiere a la concentración teórica inmediatamente después de la administración de la preparación liposómica de la presente invención y en general se calcula a partir de una cantidad total de plasma según el peso de un huésped, teniendo en cuenta que todo el plasma se diluye con el líquido de la cantidad administrada. Asimismo, la concentración en plasma de cada momento se puede representar en relación al valor inicial y en general se expresa como “% de la dosis”.

La presente invención se emplea para exponer un fármaco a un sitio diana deseado, durante un largo periodo de tiempo. Por consiguiente, en la presente invención, una preparación liposómica que lleva una cantidad efectiva de fármaco se administra a un huésped para prevenir y/o tratar una enfermedad del mismo. La cantidad efectiva de fármaco se puede liberar en el huésped y exponer al sitio diana durante un largo periodo de tiempo a una elevada concentración, administrando la preparación liposómica por vía parenteral al huésped (es decir al paciente) de modo sistémico o tópico. Los ejemplos de huésped al cual puede administrársele la preparación liposómica comprenden mamíferos, preferentemente humanos, monos, ratones y animales domésticos.

La vía de administración parenteral se puede elegir por ejemplo entre inyección intravenosa (IV) como instilación, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inyección subcutánea; el método de administración se puede elegir adecuadamente según la edad y el estado del paciente. El vehículo de la presente invención se administra a un paciente que sufre una enfermedad en cantidad suficiente para tratar el estado de la enfermedad en el paciente o al menos prevenirlo. Por ejemplo, la dosis efectiva de un fármaco para encapsularlo en el vehículo se elige dentro de un intervalo de 0,01 mg hasta 100 mg/kg de peso corporal/día. Sin embargo la dosis del vehículo de la presente invención no está limitada a estas cantidades. La administración puede iniciarse tras el comienzo de la enfermedad

o se puede realizar profilácticamente para aliviar el estado de una enfermedad de un paciente al inicio, cuando es de esperar que se produzca la enfermedad. Además el periodo de administración se puede elegir apropiadamente en función de la edad y del estado del paciente.

Un método de administración específico incluye la administración de una composición farmacéutica mediante una jeringa o por instilación. La composición farmacéutica también se puede administrar del modo siguiente: se inserta un catéter en el cuerpo de un paciente o de un huésped, por ejemplo en un lumen tal como un vaso sanguíneo, de forma que el extremo proximal del catéter quede cerca de un sitio diana; y la composición farmacéutica se administra a un sitio diana deseado o en su proximidad, o desde un sitio del que se espera que un flujo de sangre se dirija al sitio diana deseado.

Ejemplos

A continuación la presente invención se describe más en detalle por medio de ejemplos. No obstante los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y ésta no está limitada a estos ejemplos.

(Ejemplos 1 a 3)

(1)

Preparación de la mezcla material

Se pesó fosfatidilcolina de soja hidrogenada (producida por Lipoid GmbH) (citada en lo sucesivo como “FCSH”), colesterol (producido por Solvay S. A.) (citado en lo sucesivo como “Col”), ácido esteárico (producido por NOF CORPORATION) citado en lo sucesivo como “AE”) y 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38, producida por Yakult Honsha Co., Ltd.) (citada en lo sucesivo como “SN-38”) de manera que resultaran las relaciones molares prefijadas mostradas en la tabla 1, y se disolvieron en 200 ml de t-butanol (producido por Kanto Chemical Co., Inc.) que se había calentado a 60ºC. Luego la disolución se enfrió sobre hielo y se liofilizó.

(2)

Dispersión

El producto seco resultante se dispersó previamente añadiendo 200 ml de suero fisiológico y utilizando un mezclador CLEARMIX SINGLE (fabricado por M Technique Co., Ltd.) y calentando a 68ºC. Luego se usó un microfluidificador (fabricado por Microfluidex Inc.) para controlar el diámetro de partícula.

(3)

Introducción de PEG-PE

A 50 ml de la dispersión liposómica resultante se le añadieron 11,32 ml de una solución de suero fisiológico que contenía polietilenglicol (de peso molecular 5.000) – fosfatidiletanolamina (producida por Genzyme Corporation) (citado en lo sucesivo como PEG-PE) a una concentración de 36,74 mg/ml, de modo que la proporción aproximada de PEG-PE introducido en los lípidos totales fue del 2% molar. La mezcla se calentó a 60ºC durante 30 minutos y después se enfrió sobre hielo. Tras la introducción de PEG-PE se reemplazó la fase acuosa externa de la dispersión liposómica empleando una columna de gel suficientemente sustituida con suero fisiológico, con el fin de eliminar la porción de fármaco no encapsulado.

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La tabla 1 muestra las composiciones de membrana, las cantidades de fármaco transportadas (relación fármaco/ lípido y concentraciones de fármaco) y los diámetros de partícula de las preparaciones liposómicas de SN-38 así obtenidas.

Además la figura 1 muestra una microfotografía electrónica de una preparación liposómica obtenida en el ejemplo 3, que fue tomada mediante una técnica de réplica por criofractura en presencia de 25% de glicerina. Se observó que la preparación liposómica tenía una forma no esférica y que era heteromorfa.

(Ejemplo comparativo 1)

Se elaboró una preparación liposómica del mismo modo que en el ejemplo 1, pero sin usar ácido esteárico (AE) en la etapa (1) arriba descrita. En otras palabras, se pesó FCSH, Col y SN-38 tal como indica la tabla 1 y se disolvieron en 200 ml de t-butanol (producido por Kanto Chemical Co., Inc.) a 60ºC, y la disolución se enfrió sobre hielo y se liofilizó. Luego el producto resultante se dispersó previamente añadiendo 200 ml de suero fisiológico y utilizando un mezclador CLEARMIX SINGLE, calentando a 68ºC. Después se usó un microfluidificador para controlar el diámetro de partícula.

A 50 ml de la dispersión liposómica resultante se le añadieron 11,32 ml de una solución de suero fisiológico que contenía 36,74 mg/ml de PEG-PE. La mezcla se calentó a 60ºC durante 30 minutos y después se enfrió sobre hielo. Tras la introducción de PEG-PE se reemplazó la fase acuosa externa de la dispersión liposómica empleando una columna de gel suficientemente sustituida con suero fisiológico, con el fin de eliminar la porción de fármaco no encapsulado.

La tabla 1 muestra la composición de membrana, la cantidad de fármaco transportada (relación fármaco/lípido y concentración de fármaco) y el diámetro de partícula de la preparación liposómica de SN-38 así obtenida.

La fig. 2 muestra una microfotografía electrónica de una preparación liposómica obtenida en el ejemplo comparativo 1, que fue tomada mediante una técnica de réplica por criofractura en presencia de 25% de glicerina. Se observó que la preparación liposómica tenía una forma esférica.

(Ejemplos comparativos 2 y 3)

Se elaboraron preparaciones liposómicas que tenían diferentes composiciones (proporción de lípidos y proporciones de introducción de PEG-PE) y distintas cantidades de fármaco transportado, sin usar ácido esteárico (AE), como en el ejemplo comparativo 1. En otras palabras, se pesó FCSH, Col y SN-38 tal como indica la tabla 1 y se disolvieron en 200 ml de t-butanol (producido por Kanto Chemical Co., Inc.) a 60ºC, y la disolución se enfrió sobre hielo y se liofilizó. Luego el producto resultante se dispersó previamente añadiendo 300 ml de suero fisiológico y utilizando un mezclador CLEARMIX SINGLE, calentando a 68ºC. Después se usó un microfluidificador para controlar el diámetro de partícula.

A 50 ml de cada una de las dispersiones liposómicas resultantes se añadieron respectivamente 2,916 ml (proporción aproximada de introducción de PEG-PE: 0,75% molar) y 7,776 ml (proporción aproximada de introducción de PEG-PE: 2% molar) de una solución de suero fisiológico que contenía 36,74 mg/ml de PEG-PE. Cada mezcla se calentó a 60ºC durante 30 minutos y después se enfrió sobre hielo. Tras la introducción de PEG-PE se reemplazó la fase acuosa externa de la dispersión liposómica empleando una columna de gel suficientemente sustituida con suero fisiológico, con el fin de eliminar la porción de fármaco no encapsulado.

La tabla 1 muestra las composiciones de membrana, las cantidades de fármaco transportadas (relación fármaco/ lípido y concentraciones de fármaco) y los diámetros de partícula de las preparaciones liposómicas de SN-38 así obtenidas.

[Tabla 1]

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En la tabla el término “lípido” se refiere a una mezcla de lípidos (FCSH+Col+AE+PE), incluyendo AE y la porción de PE en PEG-PE.

El contenido de AE se refiere a su proporción respecto a la cantidad total de la mezcla de lípidos (es decir respecto a 5 la cantidad total de lípidos) y está expresada en % molar.

La tasa introducción de PEG-PE se refiere a la proporción de la cantidad de PEG-PE respecto a la cantidad total de la mezcla de lípidos, y está expresada en % molar.

10 La proporción de un fármaco transportado en una preparación, es decir la relación molar fármaco/lípido, se refiere a la relación molar de SN-38 respecto a la mezcla de lípidos y la concentración del fármaco se refiere a la cantidad de SN-38 (µg) por ml de una preparación liposómica.

La concentración de fármaco en una preparación o en el plasma se obtuvo midiendo la intensidad de fluorescencia

15 del SN-38 mediante un espectrofluorímetro. En concreto, se diluyó una muestra 10 veces con metanol y a 20 ml de la muestra diluida se le añadieron 2 ml de metanol. La fluorescencia de la solución resultante se midió a una longitud de onda de excitación de 380 nm y a una longitud de onda de fluorescencia de 430 nm.

El diámetro de partícula es un valor que se obtiene sometiendo la preparación liposómica a una medición con un

20 granulómetro de difracción y dispersión de la luz (Coulter LS230, fabricado por Beckman Coulter, Inc.), y significa el diámetro medio de partícula.

(Ejemplo de ensayo 1) Retención en la sangre

25 La preparación liposómica obtenida del modo anteriormente descrito se inyectó en las venas caudales de ratones (BALB/c, hembra, de 5 semanas de edad, CLEA Japón Inc.) en una cantidad correspondiente a 0,4 mg/kg de SN-38. Se extrajo sangre a las 1, 6 y 24 horas después de la inyección y se centrifugó (3.000 rpm, 10 minutos, 4ºC) para recoger el plasma. El plasma se conservó en un refrigerador hasta la subsiguiente medición de la intensidad de fluorescencia.

30 Se midió la concentración de SN-38 en cada plasma. Los resultados se indican en la tabla 1 y en la fig. 3.

Tal como muestra la fig. 3, las preparaciones liposómicas de la presente invención que contenían AE en sus componentes de membrana presentaron unas concentraciones de SN-38 en plasma aproximadamente tres a cuatro 35 veces más altas después de 1 hora y aproximadamente dos a tres veces más altas a las 24 horas, en comparación con las preparaciones liposómicas que no contenían AE. Además, al representar la concentración en “% de la dosis” las preparaciones liposómicas de la presente invención que contenían AE dieron concentraciones de SN-38 en plasma del 19 al 21% aproximadamente después de 1 hora, mientras que las preparaciones liposómicas que no contenían AE dieron concentraciones de SN-38 en plasma del 4 al 6% aproximadamente. Así pues, se confirmó que

40 la preparación liposómica que contenía AE según la presente invención es capaz de mantener la concentración de SN-38 en el plasma a niveles elevados durante un largo periodo de tiempo.

También se observó una mejora de la retención en la sangre debida al incremento de la tasa de introducción de PEG-PE al usar la preparación liposómica que contenía SN-38. En cambio la retención en la sangre permaneció a

45 un bajo nivel cuando se introdujo solamente PEG-PE.

(Ejemplo 4)

Se repitieron los procedimientos del ejemplo 3 para preparar otro lote del mismo ejemplo. La tabla 2 muestra los

50 pesos y la composición de la membrana, la cantidad de fármaco transportada (la relación molar fármaco/lípido y la concentración del fármaco) y el diámetro de partícula de la preparación liposómica de SN-38 así obtenida.

[Tabla 2]

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(Ejemplo de ensayo 2) Estabilidad al almacenamiento

La preparación liposómica así obtenida (FCSH:Col:AE = 7:7:5) se sometió a un ensayo de estabilidad acelerado a 25ºC y el contenido de SN-38 en la preparación se midió con un espectrofluorímetro. La fig. 4 muestra los resultados 5 correspondientes.

Tal como muestra la fig. 4 el contenido de SN-38 no disminuyó durante 2 semanas. Por lo tanto se confirmó que la preparación liposómica de la presente invención tiene una estabilidad excelente.

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Claims (1)

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