DE69936638T2

DE69936638T2 - IGF-enthaltende injizierbare Formulierungen, enthaltend Succinat als Puffermittel

Info

Publication number: DE69936638T2
Application number: DE69936638T
Authority: DE
Inventors: Bret Shirley; Maninder Hora
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2019-04-03
Also published as: DE69936638D1; DK1069912T3; US20070249522A1; EP1069912A1; EP1069912B1; PT1069912E; WO1999051272A1; ATE367828T1; ES2288018T3; AU3473999A; JP2002510653A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung sind injizierbare Formulierungen pharmazeutischer Wirkstoffe bzw. pharmazeutisch aktiver Mittel zur Verwendung in vivo. Die Formulierungen, welche die Erfindung betrifft, sind dafür konzipiert, die Schmerzen, die mit anderen Komponenten in injizierbaren Formulierungen als den aktiven Komponenten zusammenhängen, zu minimieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Formulierungen, die mit Succinat gepuffert sind und die verringerte Schmerzen bei bzw. nach einer Injektion gewährleisten. Humaner Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (hIGF-I) ist der pharmazeutische Wirkstoff.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine subkutane Injektion schmerzhaft sein kann (Ipp et al. (1990) Pediatrics 85:134–135); Zindel (1989) Conn. Med. 53:741–744); Gazzaniga et al. (1993) Int. Surg. 78:271–275). Es besteht wenig Information über die Ursachen von Schmerzen bei der Injektion aufgrund von Formulierungsvariablen. Es ist postuliert worden, dass schmerzverursachende Faktoren das Injektionsvolumen, die Injektionsgeschwindigkeit, die Osmolalität, den pH, die Injektionsstelle, die Größe und Qualität der Injektionsnadel, das Vorhandensein reizender Substanzen und die Temperatur der Lösung umfassen (Fransson et al. (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:1012–1015).
Die meisten injizierbaren pharmazeutischen Formulierungen enthalten einen Puffer, um den pharmazeutischen Wirkstoff gegen den chemischen Abbau, der auftreten könnte, wenn sich der pH nennenswert ändert, zu stabilisieren. Die am häufigsten verwendeten Puffersysteme in injizierbaren pharmazeutischen Formulierungen sind Citrate, Acetate und Phosphate. Jedoch ist die Injektion derartiger Formulierungen mit Schmerzen in Zusammenhang gebracht worden. Es ist zum Beispiel beschrieben worden, dass die Injektion einer Salzlösung weniger schmerzhaft ist als die Injektion von Citratpuffer (Fleischaker et al. (1993) J. Clin. Pharmacol. 33:182–190).
Frenken et al. ((1993) Am. J. Kidney Dis. 22:553–556) berichteten über eine klinische Studie, in der die Rolle von 20 mM Citrat in der Verursachung von Schmerzen nach subkutaner Verabreichung von Epoetin α bewertet wurde. Die Ergebnisse legten nahe, dass 20 mM Natriumcitrat (pH 6,9) signifikante Schmerzen im Vergleich zu Salzlösung verursachte. Die Ergebnisse einer weiteren Studie durch die gleiche Gruppe legen nahe, dass (1) die Injektion kleinerer Volumina günstig war; (2) die Einstellung der Eprex-Osmolarität zur Herstellung der Isotonizität die Schmerzen nicht verringerte; und (3) der Einschluss von Benzylalkohol in die verdünnte Injektion die Schmerzen verringerte, vermutlich aufgrund anästhetischer Wirkungen (Frenken et al. (1994) Nephrol. Dial. Transplant. 9:1295–1298).
Die Injektion von IGF-I ist mit Schmerzen in Zusammenhang gebracht worden. Die Literatur lehrt, dass Puffer, die in IGF-I-Formulierungen bevorzugt sind, Acetat-, Phosphat-, und Citratpuffer sind. Zum Beispiel erwähnt das U.S. Patent 5,374,620 die mögliche Verwendung eines Succinatpuffers in pharmazeutischen Formulierungen, die IGF-I und GH enthalten. Jedoch lehrt das '620-Patent, dass Natriumacetat, gegebenenfalls in Kombination mit Natriumcitrat, der bevorzugte Puffer ist.
Fransson et al. ((1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:1012–1015) studierten Formulierungen zum Minimieren von Schmerzen bei subkutaner Injektion von hIGF-I. Die Studie bewertete, wie der pH, die Pufferkonzentration und das Vorhandensein von hIGF-I die lokale Toleranz gegenüber subkutaner Injektion der Lösung beeinflussen. Die Studie berichtete, dass (1) ein Puffer mit einer höheren Pufferkapazität (50 mM Phosphat) bei pH 6,0, mit NaCl isotonisch gemacht, signifikant mehr Schmerzen als eine 10 mM Phosphatpufferformulierung verursachte; (2) mit Phosphat auf pH 7 gepufferte hIGF-I-Formulierungen gut toleriert wurden; (3) pH-basierte hIGF-I-Formulierungen von 10 mM Phosphat so gut toleriert wurden wie die Formulierungen mit pH 7; und (4) hIGF-I selbst keine Schmerzen verursachte.
Die WO 94/15584 betrifft injizierbare Formulierungen zur subkutanen Verabreichung von IGF-I, die dazu konzipiert sind, Schmerzen zu verringern. Die Druckschrift lehrt die Verwendung eines Phosphatpuffers zum Verringern der Schmerzen der subkutanen Injektion.
Die EP-A-0 284 249 offenbart eine lyophilisierte Lymphokin-Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eins Lymphokins, wie zum Beispiel eines Interferons, und, unter anderen Bestandteilen, einen Puffer, wie zum Beispiel eine Kombination aus Bernsteinsäure und Natriumsuccinat. US-5,151,265 offenbart eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend nicht-lyophilisiertes Gamma-Interferon. Die Zusammensetzung umfasst einen Puffer, der Citrat, Succinat, Tartrat, Fumarat, Gluconat, Oxalat, Lactat oder Acetat sein kann und die Zusammensetzung bei einem pH von 4,0 bis 6,0 hält. Die WO 96/40894 offenbart Zusammensetzungen zur Behandlung von Insulinresistenz durch Inhibierung der Serinphosphorylierung von Proteinkinase C. Derartige Zusammensetzungen können einen Succinatpuffer umfassen. Die US 5,681,814 offenbart Formulierungen von IGF-I, umfassend einen Osmolyten, einen Stabilisator, eine gepufferte Lösung und gegebenenfalls ein Tensid. Beispiele für den Puffer umfassen Succinat.
Die WO 95/31213 offenbart flüssige Interferon-Beta-Formulierungen, stabilisiert mit einem Polyol, einem nicht-reduzierenden Zucker oder einer Aminosäure. Succinatpufferumfassende Zusammensetzungen sind ebenfalls offenbart. Die JP 09/304379 offenbart prophylaktische Verfahren zum Verringern des Risikos für Thrombose, welche eine Verabreichung von TFPI (Gewebefaktorinhibitor) zum Erzielen höherer Level bzw. Konzentrationen im Plasma einsetzen. Der TFPI kann gemäß beliebiger im Fachgebiet bekannter Mittel, einschließlich Formulierungen, die Puffer einschließen, formuliert werden.
Subjekte, denen IGF-I-Formulierungen, gepuffert durch Phosphat oder Acetat, injiziert werden, berichten über weniger Schmerzen als bei einer Citratformulierung. Dennoch bleibt ein signifikanter Schmerzlevel mit der Injektion von IGF-I-Formulierungen, gepuffert durch Phosphat oder Acetat, assoziiert. Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die in verringertem Schmerz bei bzw. nach einer Injektion resultieren.
Eine spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die die Injektion von hIGF-I bei verringerten Schmerzen erlaubt.
Eine weitere spezifische Aufgabe der Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, in der der pharmazeutische Wirkstoff stabil ist und somit für ausgedehnte Zeiträume ohne signifikanten physikalischen und/oder biologischen Abbau gelagert werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung der Erfinder, dass pharmazeutische Formulierungen, gepuffert mit Succinat, weniger Schmerzen bei der Injektion verursachen als Formulierungen, die häufiger verwendete Puffer, wie zum Beispiel Phosphat-, Acetat- und Citratpuffer, enthalten. Insbesondere haben die Erfinder entdeckt, dass Succinatpuffer den mit der Injektion von IGF-I-Formulierungen zusammenhängenden bzw. assoziierten Schmerz verringern. Auf der Grundlage dieser Entdeckung ist es nun möglich, pharmazeutische Zusammensetzungen für IGF-I und andere pharmazeutische Wirkstoffe mit reduzierten Schmerzen aufgrund der Injektion zu entwickeln. Bislang legte die medizinische Literatur die Verwendung von Succinatpuffer zum Minimieren der mit einer Injektion zusammenhängenden Schmerzen nicht nahe. Die vorliegende Erfindung stellt eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend humanen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) oder eine biologisch aktive Variante davon und einen Puffer, wobei der Puffer im Wesentlichen aus Succinat in einer Konzentration von 10 mM bis 40 mM und einem Gegenion besteht, wobei die Variante ein Polypeptid mit IGF-I-Aktivität und wenigstens 70% Aminosäuresequenzidentität zu der Aminosäuresequenz für humanes IGF-I ist.
Die Verwendung von Succinat als den Puffer sorgt für verringerte Schmerzen bei bzw. nach einer Injektion. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung IGF-I und Natriumsuccinat.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können für ausgedehnte Zeiträume gelagert werden, wobei die physikalische und biologische Integrität des pharmazeutischen Wirkstoffs aufrecht erhalten bleibt. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verabreichung beliebiger der pharmazeutischen Zusammensetzungen, oben und hierin beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Stabilität von rhIGF-I als Funktion des pH. In dieser Studie wurde ein Citrat-Phosphat-Puffer mit einem pH-Bereich von 4,0–7,0 mit rhIGF formuliert. Die prozentuale Integrität des Hauptpeaks (Peak, der das native Molekül enthält) wurde über einen Zeitraum von 8 Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen. Die Messung erfolgte mittels CN (Cyano)-RP-HPLC.
2. Stabilität von rhIGF-I als Funktion des pH. In dieser Studie wurde ein Citrat-Phosphat-Puffer mit einem pH-Bereich von 4,0–7,0 mit rhIGF formuliert. Die prozentuale mitogene Aktivität wurde über einen Zeitraum von 8 Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen.
3. Wirkung verschiedener Pufferarten bei pH 6,0 und pH 6,5 auf die Stabilität von rhIGF. In dieser Studie wurden verschiedene Puffer mit rhIGF-I formuliert. Die Integrität des Hauptpeaks wurde über einen Zeitraum von acht Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen. Die Integrität wurde mittels CN-RP-HPLC gemessen.
4. Wirkung verschiedener Pufferarten bei pH 6,0 und pH 6,5 auf die Stabilität von rhIGF. Die Messung der verbleibenden Prozent an Monomer (natives Molekül) erfolgte über einen Zeitraum von acht Wochen bei einer Temperatur von 50°C. Die verbleibenden Prozent an Monomer wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE gemessen.
5. Wirkung von Natriumcitrat- und Natriumsuccinatpuffern mit verschiedenen Konzentrationen auf die Stabilität von rhIGF-I. Die Stabilität wurde über einen Zeitraum von acht Wochen bei 50°C gemessen. Die Messung erfolgte mittels Bestimmung der Prozent an Monomer mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE.
6. Wirkung von Natriumcitrat- und Natriumsuccinatpuffern mit verschiedenen Konzentrationen auf die Stabilität von rhIGF-I. Die Stabilität wurde mittels eines Assays der mitogenen Aktivität über einen Zeitraum von acht Wochen bei 50°C gemessen.
7. Daten aus einem Nozizeptoraktivierungsmodell, konzipiert zur Vorhersage der Schmerzen bei einer Injektion, induziert durch Formulierungen. In diesem Modell wird Capsaicin (eine Verbindung, die dafür bekannt ist, Schmerzen bei einer Injektion zu verursachen) (Santos et al. (1997) Neuropeptides 31:381–389) verwendet um eine Standardkurve zu generieren. Dann wurden Formulierungen untersucht und mit einem Wert ausgezeichnet, beruhend auf der Standardkurve. Alle Formulierungen wurden dann mit normaler Salzlösung verglichen. Zwei Puffer wurden untersucht und mit normaler Salzlösung verglichen: 87 mM Essigsäure, 13 mM Natriumacetat, pH 4,0; und 10 mM Natriumsuccinat, 140 mM Natriumchlorid, pH 6,0. C1, C2 und C3 sind verschiedene Konzentrationen an Capsaicin.
8. Lokale Reizwirkungen von pharmazeutischen Formulierungen, die subkutan injiziert wurden. Kaninchen wurde Salzlösung, eine Vehikelkontrolle (Puffer ohne pharmazeutischen Wirkstoff) und ein Testgegenstand (Puffer plus pharmazeutischer Wirkstoff) an drei einzelnen Stellen injiziert. A: 10 mM Natriumsuccinat, 140 mM Natriumchlorid, pH 6,0; B: 10 mM Natriumcitrat, 135 mM Natriumchlorid, pH 6,0; C: 87 mM Essigsäure, 13 mM Natriumacetat, 50 mM Natriumchlorid; D: 1 mM Methionin, 135 mM Natriumchlorid, pH 6,0; E: 10 mM Natriumsuccinat; 125 mM Arginin, 20 mM Natriumchlorid, pH 6,0; und F: 1,9% Saccharose, 97 mM Natriumchlorid, pH 4,8.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend IGF-I und einen Puffer, wobei der Puffer im Wesentlichen aus einem Succinatpuffer besteht.
Pharmazeutische Formulierungen, gepuffert mit Succinat, verursachen weniger Schmerzen bei bzw. nach Injektion als ähnliche Formulierungen, die Nicht-Succinatpuffer, wie zum Beispiel Citrat-, Phosphat-, oder Acetatpuffer, enthalten.
Die Erfindung stellt ferner eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren der Behandlung, Verhinderung oder Diagnose einer Krankheit oder eines Zustandes in einem menschlichen oder tierischen Subjekt durch Injektion bereit.
Mit „Succinatpuffer" ist ein Puffer gemeint, der ein Salz der Bernsteinsäure umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Succinat-Kation Natrium. Jedoch wird angenommen, dass jedes beliebige Kation wirksam ist. Andere mögliche Succinat-Kationen umfassen Kalium, Ammonium, Kalzium und Magnesium. In einer Ausführungsform stellt der pharmazeutische Wirkstoff IGF-I das Kation bereit.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Wesentlichen oder essentiell durch einen Succinatpuffer gepuffert. Es wird jedoch verstanden werden, dass andere Verbindungen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vorhanden sein können, die eine in gewisser Weise relativ geringe Pufferkapazität aufweisen. Beispiele derartiger Verbindungen sind der pharmazeutische Wirkstoff selbst, Stabilisierungsmittel und dergleichen.
Der Succinatpuffer kann in einem Konzentrationsbereich von 10 mM bis zu 40 mM verwendet werden. Geeignete Konzentrationsbereiche umfassen 11–30 mM; 12–25 mM; 13–20 mM; 14–19 mM; und etwa 15 mM. Die bevorzugten Konzentrationsbereiche von Succinatpuffer sind weniger als 40 mM, weniger als 35 mM, weniger als 30 mM, weniger als 25 mM, weniger als 20 mM, und weniger als 15 mM. Es ist am Stärksten bevorzugt, dass die Konzentration des Succinatpuffers etwa 10 mM beträgt.
Vorzugsweise liegt der pharmazeutische Wirkstoff IGF-I in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Konzentration vor, die für die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des Wirkstoffs an ein Subjekt nützlich ist. Der pharmazeutische Wirkstoff kann ausgehend von einer beliebigen Quelle, einschließlich Aufreinigung aus einem Säuger, rekombinanter Produktion oder chemischer Synthese, hergestellt werden. In der vorliegenden Erfindung ist der pharmazeutische Wirkstoff humaner IGF-I (hIGF-I) oder eine biologisch aktive Variante davon. Am Stärksten bevorzugt ist der pharmazeutische Wirkstoff rekombinanter hIGF-I (rhIGF-I). Der Begriff „IGF-I", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I, in nativer Form und auf biologisch aktive Varianten. Geeignete biologisch aktive Varianten können IGF-I-Fragmente, -Analoga und -Derivate sein. Vorzugsweise ist der IGF-I von der gleichen Spezies, wie die Spezies, die sich einer Behandlung unterzieht. Jedoch kann der IGF-I der vorliegenden Erfindung durch eine belie bige Tierart, einschließlich Vögel, Hunde, Rinder, Schweine, Pferde und Menschen, kodiert werden.
IGF-I kann ausgehend von einer natürlichen Quelle aufgereinigt werden, chemisch synthetisiert oder rekombinant produziert werden. Humaner IGF-I ist ausgehend von Plasma gereinigt worden und seine vollständige Aminosäuresequenz ist festgestellt (Rinderknecht et al. (1978) J. Biol. Chem. 253:2769–2776). Sequenzen mit ausgedehnten Homologien zu humanen IGF-I sind in IGF-I, der aus dem Plasma anderer Arten gereinigt wurde, vorhanden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können biologisch aktive Varianten von IGF-I umfassen. IGF-I-Varianten unterscheiden sich von natürlicherweise vorkommenden IGF-I-Molekülen aufgrund chemischer Modifikationen oder Aminosäureinsertionen, -deletionen, -substitutionen (einschließlich chemisch modifizierter Aminosäuren) und carboxy- oder aminoterminaler Trunkierungen bzw. Verkürzungen oder Fusionen. Derartiger Varianten sollten im Wesentlichen oder vollständig IGF-I-Aktivitäten beibehalten, die für die günstige Behandlung einer gegebenen Erkrankung hinreichend sind. Insbesondere sollten die Varianten die Fähigkeit zum Binden an IGF-I-Rezeptorstellen beibehalten. IGF-I-Varianten sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 5,374,620 .
Mit „im Wesentlichen" ist eine Aktivität gemeint, die quantitativ verschieden, jedoch qualitativ die gleiche ist. Wenn ein Protein multiple Aktivitäten aufweist, kann eine Variante im Wesentlichen die gleiche Aktivität aufweisen, wenn sie weniger als alle der Aktivitäten aufweist, solange eine von diesen beibehalten wird. Vorzugsweise weist die Variante wenigstens die gleiche Aktivität auf wie das native Molekül.
Die IGF-I-Aktivität kann unter Verwendung von Standard-IGF-I-Bioassays, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gemessen werden. Repräsentative Assays umfassen bekannte Radiorezeptorassays unter Verwendung von Placentamembranen (siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 5,324,639 ; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:973–976; und Marshall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:283–292), einen Bioassay, der die Fähigkeit eines Moleküls misst, den Einbau von tritiiertem Thymidin in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten auf eine Dosis-abhängige Weise zu verstärken (siehe z.B. Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262:5616–5621, hierin durch Bezugnahme aufgenommen).
Mit „IGF-I-Fragment" ist ein Peptid gemeint, das nur ein Teil der intakten IGF-I-Sequenz und -Struktur ist. Es umfasst, ohne Beschränkung darauf, eine C-terminale Deletion oder eine N-terminale Deletion von IGF-I. Der Begriff „Fragment" soll jeden beliebigen Teil des Proteins umfassen, der einen Abschnitt bereitstellt, der die essentielle biologische(n) Funktion(en) des Proteins im Wesentlichen oder vollständig beibehält. Fragmente können ausgehend von jeder beliebigen Quelle, wie zum Beispiel ausgehend von natürlicherweise auftretenden Peptidsequenzen, synthetischen oder chemisch synthetisierten Peptidsequenzen und gentechnisch bearbeiteten Peptidsequenzen, hergestellt werden.
Mit „Analogon" ist ein Analogon von entweder IGF-I oder einem IGF-I-Fragment gemeint, das eine native IGF-I-Sequenz und -Struktur mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen umfasst. Ein Analogon umfasst ein Protein, das dem nativen Protein hinsichtlich der Funktion gleich oder im Wesentlichen ähnlich ist. Zum Beispiel ist ein Analogon eines IGF-I-Proteins ein Protein, das nicht die gleiche Aminosäuresequenz wie das IGF-I-Protein aufweist, welches aber hinreichend homolog ist, um die biologische Aktivität in Wesentlichen oder vollständig beizubehalten. Peptide mit einem oder mehreren Peptoiden (Peptidmemetika) sind auch vom Begriff „Analogon" umfasst (siehe Internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/04282 ).
Geeignete Modifikationen von IGF-I, IGF-I-Fragmenten oder ihren jeweiligen Analoga umfassen, ohne Beschränkung darauf, Glykosylierung, Phosphorylierung, PEGylierung und eine weitere Hinzufügung fremder Gruppierungen, solange die IGF-I-Aktivität im Wesentlichen oder vollständig beibehalten wird. Derartige Modifikationen können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit der Verbindung verbessern, die Toxizität des Moleküls verringern oder eine beliebige unerwünschte Nebenwirkung des Moleküls eliminieren oder abschwächen usw. Derivate und, insbesondere, chemische Gruppierungen, die zur Vermittlung derartiger Wirkungen fähig sind, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. Verfahrensweisen zum Kuppeln derartiger Gruppierungen an ein Molekül sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
IGF-I-Varianten werden im Allgemeinen wenigstens 70%, vorzugsweise 80%, stärker bevorzugt 90–95% oder mehr und, am Stärksten bevorzugt, 98% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz des Referenz-IGF-I-Moleküls aufweisen. Eine Variante kann sich durch nur 10, nur 5, nur 4, 3, 2 oder sogar einen Aminosäurerest unterscheiden. Mit „Sequenzidentität" ist gemeint, dass die gleichen Aminosäurereste in der IGF-I-Variante und dem Referenz-IGF-I-Molekül gefunden werden, wenn ein spezifizierter, zusammenhängender Abschnitt der Aminosäuresequenz der Variante mit der Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls angeglichen („aligned") und verglichen wird. Die Sequenzidentität wird gemäß dem GAP-Programm, Wisconsin Sequence Analysis-Paket, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), unter Verwendung der Standardeinstellungen („default settings") bestimmt.
Zu Zwecken des optimalen Alignments bzw. der optimalen Angleichung der zwei Sequenzen kann der zusammenhängende Abschnitt der Aminosäuresequenz der Variante zusätzliche Aminosäurereste oder deletierte Aminosäurereste aufweisen, bezogen auf die Aminosäuresequenz des Referenzmoleküls. Der zusammenhängende Abschnitt, der zum Vergleich mit der Referenzaminosäuresequenz verwendet wird, wird wenigstens zwanzig (20) zusammenhängende Nukleotide umfassen und kann 30, 40, 50, 100 oder mehr Nukleotide sein. Korrekturen für eine erhöhte Sequenzidentität, zusammenhängend mit dem Einschluss von Lücken in die Aminosäuresequenz der Variante, können durch Festsetzung von Gap- Penalties durchgeführt werden. Verfahren des Sequenzalignments sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Bei Betrachtung der prozentualen Aminosäuresequenzidentität können sich einige Aminosäurerestpositionen als Ergebnis konservativer Aminosäuresubstitutionen, die die Eigenschaften der Proteinfunktion nicht beeinträchtigen, unterscheiden. In diesen Fällen kann die prozentuale Sequenzidentität nach oben angepasst werden, um der Similarität bei konservativ substituierten Aminosäuren Rechnung zu tragen. Derartige Anpassungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Meyers und Miller (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11–17.
Im Fachgebiet sind umfangreiche Anleitungen hinsichtlich der Herstellung und Verwendung derartiger Analoga, wie untenstehend weiter diskutiert, verfügbar. Ein Fragment von IGF-I wird im Allgemeinen wenigstens etwa 10 zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls, vorzugsweise etwa 15–25 zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls und, am Stärksten bevorzugt, etwa 20–50 oder mehr zusammenhängende Aminosäurereste des Volllängen-IGF-I umfassen. Beim Herstellen von IGF-I-Varianten kann ein Fachmann auf dem Gebiet leicht bestimmen, welche Modifikationen an der nativen Protein-, Nukleotid- oder Aminosäuresequenz in einer Variante resultieren werden, die die Herstellung der hochkonzentrierten Form der IGF-I-Variante gemäß der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren ermöglicht. Diese werden im Allgemeinen konservative Aminosäuresubstitutionen sein, die die Ladung des ersetzten Rests konservieren (z.B. Asparaginsäure für Glutaminsäure).
Etliche IGF-I-Analoga und -Fragmente sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen jene, die zum Beispiel beschrieben sind in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:4904–4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987) 149:398–404; J. Biol. Chem. (1988) 263:6233–6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1989) 165:766–771; Forsbert et al. (1990) Biochem. J. 271:357–363; den U.S. Patenten Nrn. 4,876,242 und 5,077,276 ; und den internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 87/01038 und WO 89/05822 .
Repräsentative Analoga umfassen eines mit einer Deletion von Glu-3 des reifen Moleküls, Analoga mit bis zu 5 Aminosäuren, trunkiert am N-Terminus, ein Analogon mit einer Trunkierung der ersten 3 N-terminalen Aminosäuren (bezeichnet als Des(1-3)-IGF-I, Des-IGF-I, tIGF-I oder Brain-IGF) und ein Analogon, das die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von Humaninsulin an Stelle der ersten 16 Aminosäuren von humanem IGF-I umfasst.
Verfahren zur Herstellung von IGF-I-Fragmenten, -Analoga und -Derivaten sind auf dem Fachgebiet verfügbar. Siehe im Allgemeinen die U.S. Patente Nrn. 4,738,921 , 5,158,875 und 5,077,276 ; die internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 85/00831 , WO 92/04363 , WO 87/01038 und WO 89/05822 ; und die europäischen Patente Nrn. EP 135094 , EP 123228 und EP 128733 .
Der IGF-I kann aus jeder beliebigen Tierart sein, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, Vögel, Hunde, Rinder, Schweine, Pferde und Menschen. Vorzugsweise ist der IGF-I aus einer Säugerart, wenn die Behandlung einer Säuger-IGF-I-reagierenden Erkrankung erfolgt, und stärker bevorzugt ist er aus einem Säuger der gleichen Art, wie der Säuger, der sich einer Behandlung für eine derartige Erkrankung unterzieht. Es ist anerkannt, dass der IGF-I mittels Rekombinationsverfahren unter Verwendung der entsprechenden kodierenden Sequenz für IGF-I aus der Tierart von Interesse hergestellt werden kann. Derartige Rekombinationsverfahren sind nachstehend detaillierter diskutiert.
Biologisch aktive Varianten von IGF-I sollten IGF-I-Aktivitäten, insbesondere die Fähigkeit an IGF-I-Rezeptorstellen zu binden, beibehalten. Die IGF-I-Aktivität kann unter Verwendung von Standard-IGF-I-Bioassays gemessen werden. Repräsentative Assays umfassen bekannte Radiorezeptorassays unter Verwendung von Placentamembranen (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,324,639 ; Hall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:973–976; und Marshall et al. (1974) J. Clin. Endocrinol. and Metab. 39:283–292), einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von tritiiertem Thymidin in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten auf eine dosisabhängige Weise zu verstärken (siehe z.B. Tamura et al. (1989) J. Biol. Chem. 262:5616–5621, hierin durch Bezugnahme aufgenommen) und dergleichen. Vorzugsweise weist die Variante wenigstens die gleiche Aktivität auf wie das native Molekül.
Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendete IGF-I kann in seinen im Wesentlichen gereinigten, nativen, rekombinant produzierten oder chemisch synthetisierten Formen verwendet werden. Zum Beispiel kann der IGF-I direkt aus Blut, wie zum Beispiel aus Serum oder Plasma, mittels bekannter Verfahren isoliert werden. Siehe zum Beispiel Phillips (1980) New Eng. J. Med. 302:371–380; Svoboda et al. (1980) Biochemistry 19:790–797; Cornell und Boughdady (1982) Prep. Biochem. 12:57; Cornell und Boughdady (1984) Prep. Biochem. 14:123; europäisches Patent Nr. EP 123,228 ; und das U.S. Patent Nr. 4,769,361 .
Alternativ kann der IGF-I chemisch synthetisiert werden, und zwar mittels einer von mehreren Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet der Peptide bekannt sind. Siehe zum Beispiel Li et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2216–2220, Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), und Barany und Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Hrsg. Gross und Meienhofer, Band 2 (Academic Press, New York, 1980), S. 3–254, für Festphasen-Peptidsynthesetechniken; und Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin); und Gross und Meienhofer, Hrsg. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Band 1 (Academic Press, New York), für klassische Synthese in der Lösung. Der IGF-I kann auch chemisch mittels des Verfahrens der simultanen multiplen Peptidsynthese hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Houghthen (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131–5135; und das U.S. Patent Nr. 4,631,211 .
Die Genmanipulation („genetic engineering") mittels DNA-Rekombinationstechniken kann der effizienteste Weg zur Herstellung von IGF-I sein. Die humane DNA-Sequenz, die für IGF-I kodiert, ist bekannt und kann zur Expression in Wirtszellen eingeführt werden. Der IGF-I kann mittels DNA-Rekombinationstechniken in E. coli-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen produziert werden. Sekretierter bzw. sezernierter IGF-I kann hergestellt werden, indem der DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, eine Signalsequenz hinzugefügt wird. Weiterhin kann die DNA-Sequenz, die für IGF-I codiert, manipuliert werden, um IGF-I-Fragmente, -Analoga oder –Derivate herzustellen. Derartige DNA-Rekombinationstechniken sind im Allgemeinen im Fachgebiet verfügbar. Siehe zum Beispiel die internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/07424 , worin rekombinantes humanes IGF-I-Protein in Hefe produziert wird.
Die geeignete Konzentration an IGF-I in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hängt von der Löslichkeit im verwendeten spezifischen Puffer und der gewünschten therapeutischen Menge für die gegebene Dosis ab. Typischerweise wird die Konzentration an IGF-I in den erfindungsgemäßen flüssigen Zusammensetzungen von 0,01–200 mg/ml reichen. Vorzugsweise ist die Konzentration an IGF-I 0,1–20,0 mg/ml und stärker bevorzugt 2,0–10,0 mg/ml.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die einen IGF-I und einen Succinatpuffer umfasst, kann auch andere Komponenten enthalten, die eine IGF-Behandlung erleichtern. Derartige Komponenten umfassen IGF-I-Bindungsproteine, IGF-I-Rezeptoren und die säurelabile Untereinheit des IGF-Bindungskomplexes. Es ist allgemein bekannt, dass die IGF-I-Wirkung im Knorpel (Gewebe) durch IGF-I-Bindungsproteine moduliert wird, von denen wenigsten sechs (IGFBP-1 bis IGFBP-6) isoliert wurden (siehe Baxer et al. (1989) Prog. Growth Factors Res. 1:49–68; und Rechler et al. (1992) Growth Regul. 2:55–68). Von diesen ist IGFBP-3 das Hauptbindungsprotein für IGF-I. Sein Vorhandensein kann die stimulatorische Wirkung von IGF-I auf die Proteoglycansynthese verstärken (siehe Chevalier et al. (1996) British J. Rheumat. 35:515–522). Weiterhin ist auch gezeigt worden, dass ein säurelabiles Glycoprotein mit dem Proteinkomplex, gebildet durch IGF-I und seine Bindungsproteine, assoziiert ist. Somit kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung derartige(s) säurelabiles Glycoprotein und IGF-I-Bindungsproteine enthalten, wenn bewiesen wurde, dass sie die gewünschte Wirkung von IGF-I auf die Erhaltung und/oder Regeneration von Knorpel (Gewebe) begünstigen.
Die Menge an IGFBPs, zu verabreichen mit IGF-I, kann gemäß dem molaren Verhältnis zwischen IGF-I und IGFBPs bestimmt werden. Dieses molekulare Verhältnis kann von 0,5:1 bis 3:1 reichen, vorzugsweise 1:1 sein (siehe US Patent Nr. 5,187,151 ). Alle derartigen Bezugnahmen auf Komponenten, die eine IGF-geförderte Erhaltung und/oder Regeneration von Knorpel (Gewebe) fördern, sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische IGF-I-Zusammensetzung kann ferner ein anderes Therapeutikum oder mehrere andere Therapeutika umfassen, die bei der Behandlung an derer Erkrankungen des Individuums wirksam sind, solange die biochemischen Wirkungen der weiteren Therapeutika die Wirksamkeit der beabsichtigten Wirkung der IGF-I-Behandlung nicht stören. Derartige Mittel umfassen Antibiotika, antiinflammatorische Mittel und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können einen oder mehrere Proteaseinhibitoren umfassen. Ein beispielhafter Proteaseinhibitor ist Natriumpentosanpolysulfat (PPS), ein polysulfatiertes Poysaccharid.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzungen können gegebenenfalls Stabilisatoren umfassen, einschließlich Aminosäuren (wie zum Beispiel Arginin, Lysin und Glycin), Zucker (wie zum Beispiel Saccharose, Mannit und Trehalose), Salze (wie zum Beispiel NaCl und MgCl₂), Tenside, PEG, Konservierungsstoffe, antimikrobielle Mittel, Komplexierungsmittel (wie zum Beispiel EDTA) und Antioxidanzien. Für hIGF-I können die Formulierungen geringe Konzentrationen an Methionin, wie zum Beispiel 1 mM, umfassen, um die Oxidation zu verlangsamen und vor Aggregation oder Präzipitation des Proteins zu schützen.
Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung mit den Zellen des Subjekts isotonisch. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung mit den Erythrocyten eines Subjekts isotonisch. Stärker bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung mit humanen Erythrocyten isotonisch. Somit enthält die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Ausführungsform eine hinreichende Konzentration an wenigstens einem tonisierenden Mittel („tonicifying agent"), sodass die Zusammensetzung isotonisch ist.
Mit „isotonisch" ist eine Lösung gemeint, in der eine Zelle weder schrumpfen noch anschwellen wird. Ein Beispiel für eine isotonische Lösung ist 0,9% Natriumchlorid in Wasser. Typischerweise wird eine isotonische Lösung etwa den gleichen osmotischen Druck wie die Flüssigphase der Zellen oder des Gewebes eines Subjekts aufweisen. Jedoch wird eine Lösung, die mit der intrazellulären Flüssigkeit isotonisch ist, nicht isotonisch sein, wenn sie einen gelösten Stoff enthält, der die Zellmembranen ungehindert permeiert. Um festzustellen, ob eine Lösung isotonisch ist, ist es notwendig, die Konzentration an gelösten Stoffen zu bestimmen, bei der die Zellen ihre normale Größe und Form beibehalten werden. Verfahren zur Feststellung der Isotonizität in einer Lösung sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Setnikar et al. (1959) JAPhA Sci Ed 48:628.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner Natriumchlorid. Natriumchlorid wird eingeschlossen, um der Formulierung Isotonizität zu verleihen. Demgemäß wird die Konzentration an Natriumchlorid in der Formulierung vom Beitrag anderer Komponenten zur Tonizität abhängen. Vorzugsweise ist die Konzentration an Natriumchlorid etwa 140 mM.
Fachleute auf dem Gebiet sind mit einer Vielfalt pharmazeutisch verträglicher gelöster Stoffe vertraut, die zur Bereitstellung der Isotonizität in pharmazeutischen Zusammensetzungen nützlich sind. Somit umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ferner Kom ponenten, die dazu verwendet werden, die Isotonizität bereitzustellen, zum Beispiel Natriumchlorid, Glycin, Mannit, Glycerin, Saccharose und andere Kohlenhydrate, Essigsäure, andere organische Säuren oder deren Salze und relativ geringe Mengen an Citraten oder Phosphaten. Der Durchschnittsfachmann würde weitere Mittel kennen, die zur Bereitstellung der optimalen Tonizität geeignet sind.
Der pH der pharmazeutischen Zusammensetzung beeinflusst sowohl den Level der Schmerzen bei bzw. nach Injektion als auch die Stabilität des pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoffs. Ein gegebener pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoff wird die größte Stabilität in einem bestimmten pH-Bereich eines bestimmten Puffers aufweisen. Der optimale pH, der das gewünschte Gleichgewicht von Stabilität und minimalen oder keinen Schmerzen bei bzw. nach Injektion bereitstellt, kann von Fachleuten auf dem Gebiet festgestellt werden. Jedoch könnte der pH-Bereich Formulierungen von pH 4,0–7,5 umfassen. Geeignete pH-Werte umfassen 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5. Geeignete pH-Bereiche sind 4,5–7,2; 4,6–7,1; 4,7–7,0; 4,8–6,9; 4,9–6,8, 5,0–6,7; 5,1–6,6; 5,2–6,5; 5,3–6,4; 5,4–6,3; 5,5–6,2; 5,7–6,1; und 5,8–6,0. Ein bevorzugter Bereich ist pH 4,6–6,6. Am Stärksten bevorzugt beträgt der pH 5,6. Für Zusammensetzungen, die IGF-I enthalten, beträgt der bevorzugte pH 6,0.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als eine Lösung, Suspension oder Emulsion formuliert sein. Sie kann auch in der Form von lyophilisiertem Pulver, das vor der Verabreichung in eine Lösung, Suspension oder Emulsion umgewandelt werden kann, sein. Die Lagerung kann auch dadurch erleichtert werden, dass Proteine, wie zum Beispiel humanes Albumin, zugesetzt werden, die den Aktivitätsverlust des pharmazeutisch aktiven Proteins verringern können. Somit könnte Albumin als stabilisierendes Protein während des Gefriertrocknungsprozesses wirken. Die Verfahren zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung sind im Allgemeinen im Fachgebiet bekannt. Eine eingehende Diskussion der Formulierung und Auswahl von pharmazeutisch verträglichen Trägern, Stabilisatoren und Isomolyten kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18. Auflage, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania) gefunden werden.
Der pharmazeutische Wirkstoff kann auch in einer Form zur anhaltenden Freisetzung formuliert werden, um das Vorhandensein des pharmazeutischen Wirkstoffs im behandelten Säuger zu verlängern, im Allgemeinen für mehr als einen Tag. Viele Verfahren zur Herstellung einer Formulierung für anhaltende Freisetzung sind im Fachgebiet bekannt und sind offenbart in Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18. Auflage, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania). Im Allgemeinen kann das Mittel in semipermeablen Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren eingeschlossen bzw. eingefangen werden. Die Matrizes können zu Filmen oder Mikrokapseln geformt werden. Beispiele derartiger Matrizes umfassen Polyester, Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547–556), Polylactide ( U.S. Patent Nr. 3,773,919 und EP 58,481 ), Polylactatpo lyglycolat (PLGA), Hydrogele (siehe zum Beispiel Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167–277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98–105), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere, wie zum Beispiel Lupron Depot^TM, und Polt'-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ). Geeignete Mikrokapseln können auch Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly-Methylmethacrylat-Mikrokapseln, hergestellt durch Coacervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, umfassen. Zusätzlich können auch Mikroemulsionen oder kolloidale Wirkstoffabgabesysteme, wie zum Beispiel Liposome und Albuminmikrosphären, verwendet werden. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18. Auflage, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, umfassend den pharmazeutischen Wirkstoff und eine Succinatverbindung, können für ausgedehnte Zeiträume unter Erhaltung der physikalischen und biologischen Integrität des pharmazeutischen Wirkstoffs gelagert werden. Die Lagerung kann in flüssiger Form oder als getrocknete Formulierung, die durch Hinzufügen von Flüssigkeit rekonstituiert werden kann, erfolgen. Wenn pharmazeutische Wirkstoffe Proteine sind, kann die Lagerung durch Trocknungsprozesse, wie zum Beispiel Lyophilisierung, durchgeführt werden. Demgemäß kann das Protein in der Form einer gefriergetrockneten Zusammensetzung gelagert werden. Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Succinatverbindung und den pharmazeutischen Wirkstoff, bereit.
Der Temperaturbereich, bei dem eine Lagerung einer flüssigen Zubereitung aus einem pharmazeutischen Wirkstoff und Succinat möglich ist, ist 2°C bis 8°C, mit einer erwarteten Lagerungslebensdauer von 18–24 Monaten oder länger. Der Temperaturbereich bei dem eine Lagerung einer trockenen Zubereitung aus einem pharmazeutischen Wirkstoff und Succinat möglich ist, ist 2°C bis 30°C, mit einer erwarteten Lagerungslebensdauer von 18 bis 20 Monate oder länger. Die Formulierungen können jedoch bis zu 5 Jahre gelagert werden. Ein weiterer Bereich für die getrocknete Formulierung ist 22°C bis 30°C. Bevorzugte Temperaturen umfassen, ohne Einschränkung darauf, 2°C bis 8°C für flüssige (Formulierung), und Raumtemperatur (d.h. 25°C–30°C) für trockene (Formulierung). Die flüssigen und getrockneten Formulierungen sind für etwa 18–24 Monate oder länger stabil. Es ist gezeigt worden, dass die spezifische offenbarte rhIGF-I-Formulierung für wenigstens ein Jahr bei 2–8°C in flüssiger Form stabil ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise mittels Membranfiltration sterilisiert und wird in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern, wie zum Beispiel versiegelten Vials oder Ampullen, gelagert. In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Kopfraum der Vials beim Befüllen mit Stickstoff gespült bzw. geflutet werden. Die Erfindung umfasst auch Vorrichtungen für die Zweckdienlichkeit der Dosierung, wie zum Beispiel vorgefüllte Spritzen, Autoinjektoren, Blisterpackungen oder nadelfreie Systeme, um die Verabreichung oder Injektion einfacher zu machen.
Eine pharmazeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird einem Subjekt verabreicht. Mit pharmazeutisch wirksame Menge ist eine Menge gemeint, die bei der Behandlung, Verhinderung oder Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustandes hilfreich ist.
Mit dem Begriff „verabreichen" ist ein beliebiges geeignetes Verfahren zur Abgabe eines pharmazeutischen Wirkstoffes an ein Subjekt gemeint, einschließlich parenteraler, intranasaler, intrapulmonaler, oraler, topischer, analer oder chirurgischer Implantation oder Einführung. Typische parenterale Verabreichungswege umfassen intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraarterielle und intraperitonale Injektion oder Infusion. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung mittels Injektion. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Injektion subkutan. Injizierbare Formen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen, ohne Beschränkung darauf, Lösungen, Suspensionen und Emulsionen.
Mit „Subjekt" ist ein beliebiges Tier gemeint. Vorzugsweise ist das Subjekt ein Säuger, am bevorzugtesten ist das Subjekt menschlich. Säuger von besonderer Bedeutung außer Menschen umfassen Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Schafe und Schweine.
Wenn die Verabreichung zum Zwecke der Behandlung erfolgt, kann die Verabreichung entweder für einen prophylaktischen oder therapeutischen Zweck sein. Bei prophylaktischer Bereitstellung wird die Substanz vor einem beliebigen Symptom bereitgestellt. Die prophylaktische Verabreichung der Substanz dient dazu, ein beliebiges nachfolgendes Symptom zu verhindern oder abzuschwächen. Bei therapeutischer Bereitstellung wird die Substanz bei (oder kurz nach) dem Ausbruch bzw. Auftreten („onset") eines Symptoms bereitgestellt. Die therapeutische Verabreichung der Substanz dient dazu, ein beliebiges gegenwärtiges Symptom abzuschwächen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die rekonstituiertes IGF-I umfasst, sollte in einer Einzeldosierung und in einer injizierbaren oder infundierbaren Form, wie zum Beispiel einer Lösung, Suspension oder Emulsion, formuliert sein. Sie kann auch in Form eines lyophilisierten Pulvers formuliert sein, das vor der Verabreichung in eine Lösung, Suspension oder Emulsion umgewandelt werden kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die rekonstituiertes IGF-I umfasst, wird vorzugsweise mittels Membranfiltration sterilisiert und wird in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern, wie zum Beispiel versiegelten Vials oder Ampullen, gelagert.
Ein pharmazeutisch verträglicher Träger sollte mit dem pharmazeutischen Wirkstoff und dem Succinatpuffer gemischt werden. Mit „pharmazeutisch verträglicher Träger" ist ein Träger gemeint, der herkömmlicherweise auf dem Fachgebiet verwendet wird, um die Lagerung, Verabreichung und/oder die Heilungswirkung der therapeutischen Inhaltsstoffe zu erleichtern bzw. zu begünstigen. Ein Träger kann auch beliebige unerwünschte Nebenwirkungen des IGF-I verringern. Ein geeigneter Träger sollte stabil sein, d.h. unfähig zur Reaktion mit anderen Inhaltsstoffen in der Formulierung. Er sollte keine signifikante lokale oder systemische abträgliche Wirkung bzw. Nebenwirkung bei Empfängern in den Dosierungen und Konzentrationen, die zur Behandlung eingesetzt werden, hervorrufen. Derartige Träger sind allgemein im Fachgebiet bekannt. Geeignete Träger für diese Erfindung sind jene herkömmlicherweise verwendeten großen stabilen Makromoleküle, wie zum Beispiel Albumin, Gelatine, Kollagen, Polysaccharid, Monosaccharide, Polyvinylpyrrolidon, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, polymere Aminosäuren, fixierte Öle, Ethyloleat, Liposomen, Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Dextrose, Dextran, Cellulose, Mannit, Sorbit, Polyethylenglycol (PEG) und dergleichen. Träger für langsame Freisetzung, wie zum Beispiel Hyaluronsäure, können auch geeignet sein. Siehe insbesondere Prisell et al. (1992) Int. J. Pharmaceu. 85:51–56 und das U.S. Patent Nr. 5,166,331 . Der Einschluss von Hyaluronsäure und anderen Polymeren kann eine zusätzliche günstige Wirkung auf die auf IGF-I reagierende Erkrankung Osteoarthritis haben. Siehe insbesondere Bragantini (1987) Clin. Trials J. 24(4):333–340; Dougados et al. (1993) Osteoarthritis and Cartilage 1:97–103; und Lussier et al. (1996) J. Rheum. 23:1570–1585.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin ein Solubilisierungsmittel oder einen sogenannten Löslichkeitsverstärker umfassen. Verbindungen, die eine Guanidiniumgruppe enthalten, am bevorzugtesten Arginin, sind geeignete Löslichkeitsverstärker.
Das Verfahren zur Formulierung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Eine eingehende Diskussion der Formulierung und Auswahl pharmazeutisch verträglicher Träger, Stabilisatoren und Isomolyte kann in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania, 1990) gefunden werden.
Die IGF-I umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in einer Therapie nützlich, die auf die Behandlung von IGF-I-reagierenden Zuständen gerichtet ist. Mit „IGF-I-reagierender Zustand" bzw. „auf IGF-I reagierender Zustand" („IGF-I-responsive condition") ist ein beliebiger Zustand gemeint, der kurzzeitig oder langzeitig entweder positiv oder negativ auf IGF-I reagiert. Derartige IGF-I-reagierende Zustände können ein normaler Zustand sein. Zum Beispiel kann sich ein Säuger einer IGF-I-Therapie zur Erhöhung der normalen Muskelmasse unterziehen, wenn eine größere Muskelmasse wünschenswert ist, wie zum Beispiel bei einem Athleten. Im Gegensatz dazu kann der IGF-I-reagierende Zustand ein abnormaler Zustand, der chronisch ist, sein und somit mehr oder weniger kontinuierlich auftritt, oder der akut ist, wie er auf eine Verletzung an einer Stelle folgt, wie zum Beispiel eine Gelenks- oder Knochenverletzung.
Zustände, die gegenüber IGF-I reaktiv sind, umfassen akute oder chronische Zustände, einschließlich, aber ohne Beschränkung darauf, hyperglykämische Störungen, einschließlich aller Formen von Diabetes; chronische Lungenerkrankung; akute und chronische Nierenerkrankungen; akutes und chronisches Leberversagen; Leberzirrhose; inflammatorische Reaktionen, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Arthritis psoriatica, Reiter's Syndrom und entzündliche Darmerkrankung; Kurzdarm; ischemische Verletzungen, die das Herz, die Leber oder das Gehirn betreffen, oder solche die aus Nierentubulinekrose („renal tubular necrosis") resultieren; immunologische Störungen, wie Immundeffizienzen, einschließlich verringerter Immuntoleranz, oder Chemotherapie-induziertem Gewebeschaden; Organabstoßung nach Transplantation; Erkrankungen oder Insuffizienzien der Herzstruktur oder -funktion, wie zum Beispiel chronische Herzzustände, Kardiomyopathie, Schlaganfall und dekompensierte Herzinsuffizienz; Wachstumsverzögerung; Osteoporose; Wundheilung; Knochenschädigung; ophthalmische Zustände; Unfruchtbarkeit; neurodegenerative Krankheiten, wie zum Beispiel Motoneuronerkrankung, Multiple Sklerose, Muskeldystrophie, diabetische Neuropathie, demyelinisierende periphere Neuropathien, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, und eine Folgeerscheinung von traumatischen Rückenmarksläsionen; und Erkrankungen des Gelenkflächenknorpels, wie zum Beispiel Osteoarthritis und Verletzungen, die mit einem Trauma zusammenhängen. Eine IGF-I-reagierende Erkrankung kann von einer Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, umfassend den IGF-I-Sirup oder rekonstituierten IGF-I, daraus erhalten, profitieren.
Mit „Behandlung" ist die Behandlung eines bestehenden Normalzustandes, der durch den pharmazeutischen Wirkstoff verstärkt wird, die therapeutische Behandlung eines bestehenden abnormalen Zustandes und sind präventive oder prophylaktische Verfahrensweisen, die vor dem Auftreten einer abnormalen Erkrankung durchgeführt werden, gemeint.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Behandlung eines beliebigen Säugers verwendet werden. Beispielhafte Säuger umfassen Katzen, Hunde, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine und, stärker bevorzugt, Menschen.
BEISPIELE
Methoden
Der IGF-I zur Verwendung in diesen Versuchen wurde rekombinant im Hefestamm Pichia pastoris produziert und aufgereinigt, wie es im Wesentlichen in den U.S. Patenten Nrn. 5,324,639 , 5,324,660 und 5,650,496 und der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/40776 beschrieben ist.
Umkehrphasen-HPLC
Die Abtrennung und Quantifizierung von rhIGF-I-Arten wurde mit Cyano-Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie (CN-RP-HPLC) bewerkstelligt. Die Abtrennungen wurden an einer Cyanosäule vom Typ Zorbax 300SB-CN, 4,6 mm ID × 15 cm, 5 μ, bei einer Probendetektion bei 214 nm bewerkstelligt. Die Proben wurden in Wasser auf eine allgemeine Konzentration von 0,8 mg/ml verdünnt und die Injektionsvolumina betrugen 20 l (~16 μg Protein pro Injektion). Die Flution wurde mit einem Gradienten von Acetonitril/Wasser/0,2% Trifluoressigsäure (TFA) von näherungsweise 25% Acetonitril (ACN) auf 34% ACN über 25 Minuten hinweg erreicht.
Das CN-RP-HPLC-Profil von rhIGF-I enthält Peaks, die „authentischen" rhIGF-I darstellen, der vollständig aktiv ist, und andere Peaks, die minore rhIGF-I-Arten enthalten. Diese minoren Arten sind Varianten von „authentischem" rhIGF-I, die kleine chemische Änderungen des Proteinmoleküls (z.B. oxidierte Methioninreste, Glycosilierung usw.) enthalten. Zur Zeit 0 umfasst der chromatographische Peak, der „authentischem" rhIGF-I entspricht, näherungsweise 95% der Gesamtfläche aller Peaks. Dieser Peak, der „authentischen" rhIGF-I enthält wird als der „Hautpeak" bezeichnet. Um die Kinetiken des rhIGF-I-Abbaus mittels CN-RP-HPLC in Stabilitätsstudien abzuschätzen, wurde die prozentuale Hauptpeakfläche als Funktion der Zeit unter einem gegebenen Satz von Lagerungsbedingungen verfolgt. Wenn rhIGF-I abgebaut wird, wird gefunden, dass die prozentuale Hauptpeakfläche abnimmt, während gefunden wird, dass die prozentuale Fläche der Peaks, die rhIGF-I-Abbauprodukten entsprechen, ansteigt.
Nicht-reduzierende SDS-PAGE
Covalente Aggregate von rhIGF-I die aufgrund der Bildung von intermolekularen Disulfiden auftreten, können auf nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gelen detektiert werden. Zu dieser Analyse wurde nicht-reduzierende 18% Tris-Glycin-SDS-PAGE durchgeführt. Die Gele wurden bei konstanter Spannung laufen gelassen und wurden mit kolloidalem Coomassie gefärbt. Die entfärbten Gele wurden mit einem Densitometer abgetastet bzw. gescannt und die Banden wurden in Peakflächen umgewandelt.
Zur Zeit 0 umfasst rhIGF-I eine einzelne monomere Bande auf der nicht-reduzierenden SDS-PAGE. Diese Bande (d.h. die Monomerbande) umfasst 100% der gesamten Peakfläche zur Zeit 0. Um die Kinetiken des rhIGF-I-Abbaus mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE-Instabilitätsstudien zu bestimmen, wurde die prozentuale Monomerfläche als Funktion der Zeit unter einem gegebenen Satz von Lagerungsbedingungen verfolgt. Wenn rhIGF-I abgebaut wird, wird festgestellt, dass sich die prozentuale Monomerfläche verringert und es wird festgestellt, dass die prozentuale Fläche anderer Banden, die rhIGF-I-Abbauprodukten (z.B. Dimere, Trimere usw.) entsprechen, ansteigt.
Mitogener Bioassay
Die Bioaktivitäten von rhIGF-I-Proben wurden unter Verwendung eines mitogenen Assays gemäß der Verfahrensweise von W. Lopacynski et al. (1993) Regulatory Peptides, 48:207–216 bestimmt. Dieser Assay basiert auf der dosisabhängigen Induktion einer Zellproliferation durch rhIGF-I. Die Reaktion wird mit dem MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Farbstoff gemessen, der durch die mitochondrialen Enzyme von lebenden MG-63-Zellen (American Type Culture Collection (ATCC CRL 1427)) zu einem gefärbten Produkt reduziert wird. Der Assay ist gegen einen WHO-Referenz(standard) standardisiert worden, um die Aktivität von rhIGF-I in internationalen Einheiten (IU) bereitzustellen. Die %-Aktivität von rhIGF-I wird in Stabilitätsstudien durch Vergleich der Probenaktivität mit einem Referenzstandard bekannter Aktivität bestimmt.
Beispiel 1
Diese Beispiel illustriert die Stabilität von rhIGF-I als Funktion des Formulierungs-pH. Für die 1 wurde Citrat-Phosphat-Puffer in einem pH-Bereich von 4,0–7,0 mit rhIGF-I formuliert. Die prozentuale Integrität des Hauptpeaks (Peak, der das native Molekül enthält) wurde über einen Zeitraum von acht Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen. Die Messung erfolgte mittels CN (Cyano)-RP-HPLC. Für die 2 wurde Citrat-Phosphat-Puffer in einem pH-Bereich von 4–7 mit rhIGF-I formuliert. Die prozentuale Aktivität wurde über einen Zeitraum von acht Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen. Die Messung der Aktivität erfolgte mittels dem mitogenen Bioassay. Die Ergebnisse von Beispiel 1 zeigen an, dass pH 6,0 die Erhaltung einer adäquaten Stabilität von rhIGF-I in einer pharmazeutischen Formulierung ermöglicht.
Beispiel 2
Dieses Beispiel illustriert die Stabilität von rhIGF-I bei pH 6,0 und pH 6,5 als Funktion von Pufferarten. Für 3 wurden verschiedene Puffer mit rhIGF-I formuliert. Die Integrität des Hauptpeaks wurde über einen Zeitraum von acht Wochen bei einer Temperatur von 50°C gemessen. Die Integrität wurde mittels CN-RP-HPLC gemessen. Für die 4 erfolgte die Messung der Prozent an verbleibendem Monomer (natives Molekül) über einen Zeitraum von 8 Wochen bei einer Temperatur von 50°C. Die Prozent an verbleibendem Monomer wurden mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE gemessen. Die Ergebnisse in diesem Beispiel zeigen an, dass (1) pH 6,0-Formulierungen eine größere Stabilität als pH 6,5–Formulierungen bereitstellen; und (2) Natriumcitrat- und Natriumsuccinatpuffer mit rhIGF-I bei pH 6,0 in hohem Maße kompatibel sind.
Beispiel 3
Diese Beispiel illustriert die Stabilität von rhIGF-I als Funktion der Natriumcitrat- und Natriumsuccinatkonzentration bei pH 6,0. Für die 5 wurde die Stabilität über einen Zeitraum von acht Wochen bei 50°C gemessen. Die Messung erfolgte mittels Untersuchung der Prozent an Monomer mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE. Für die 6 wurde die Stabilität mittels eines Aktivitätsassays über einen Zeitraum von 8 Wochen bei 50°C gemessen. Die Messung der Aktivität erfolgte mittels des mitogenen Assays. Die Ergebnisse in diesem Beispiel zeigen an, dass Succinatpuffer mit rhIGF-I kompatibler sind als Citratpuffer, und dass eine Konzentration von 10 mM für die rhIGF-I-Stabilität optimal ist.
Beispiel 4
Diese Beispiel zeigt Daten aus einem Nozizeptoraktivierungsmodell, das zur Vorhersage der Schmerzen der Injektion, erzeugt durch die Formulierungen, konzipiert ist. In diesem Modell wird Kapsaizin (eine Verbindung die dafür bekannt ist, Schmerzen bei der Injektion zu verursachen) verwendet, um eine Standardkurve zu generieren. Die Formulierungen wurden dann untersucht und mit einem Wert, basierend auf der Standardkurve, ausgezeichnet. Alle Formulierungen wurden dann mit normaler Salzlösung verglichen. Zwei Puffer wurden untersucht und mit normaler Salzlösung verglichen: 0,1 M Natriumacetat, pH 4,0; und 10 mM Natriumsuccinat, 140 mM Natriumchlorid, pH 6,0. Die Acetatformulierung erzeugte eine Reaktion außerhalb der Standardkurve, was signifikante Injektionsschmerzen anzeigte. Es wurde gefunden, dass die Formulierung mit 10 mM Succinat nicht schmerzhafter war als normale Salzlösung.
Beispiel 5
Die in diesem Beispiel beschriebene Studie wurde durchgeführt, um die potentiellen lokalen Reizwirkungen von pharmazeutischen Formulierungen in New Zealand White-Kaninchen bei Verabreichung mittels subkutaner Injektion für sieben aufeinander folgende Tage zu bewerten. Testgegenstände (Puffer plus IGF), Vehikelkontrollen (Puffer alleine) und Salzlösung wurden jedem Kaninchen an drei verschiedenen Stellen gegeben. Den Kaninchen wurden 0,5 ml der/des geeigneten Salzlösung/Vehikels/Testgegenstands, jeweils an den bezeichneten Teststellen, ein Mal täglich für sieben aufeinander folgende Tage über eine subkutane Injektion verabreicht. Die Teststellen wurden auf Anzeichen von Erythemen und Ödemen untersucht und die Anzeichen wurden täglich vor der Dosierung und an den Tagen acht und neun gemäß einem Einstufungssystem, basierend auf Draize (Appraisal of the Safety of Chemicals in Food, Drugs, and Cosmetics (1959), Association of Food and Drug Officials of the United States, S. 49–51), bewertet. Alle Injektionsstellen und jegliche starken („gross") Lesionen wurden herausgetrennt und zu Paraffinblöcken verarbeitet. Die Gewebsschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und durch einen zugelassenen Veterinärpathologen mikroskopisch untersucht. Die histologische Bearbeitung wurde von Histo Technics, Powell, Ohio durchgeführt. Die Ergebnisse der Histopathologie zeigen an, dass Salzlösungs- und Vehikelkontrolle-Injektionsstellen eine relativ geringe Entzündung aufwiesen und vergleichbar waren, mit Ausnahme einer Salzlösungs-Kontrollstelle mit schwerer Entzündung. Die Testgegenstand-Injektionsstellen, die die stärkste Entzündung aufwiesen, traten bei den Testgegenständen C und D auf. Die verbleibenden Testgegenstände unterschieden sich nicht nennenswert voneinander, verursachten aber eine geringfügig stärkere Entzündung als die Salzlösung und die Vehikelkontrollgegenstände. Die Vehikelkontrollen A, B, D, E und F waren mit Salzlösung vergleichbar. Demgemäß war es, obgleich eine geringfügige äußerliche Hautreizung an mehreren Stellen sporadisch über die Studie hinweg bemerkt wurde, nicht nötigerweise ein Anzeichen der resultierenden Histopathologie. Unter Betonung der Histopathologie an der Injektionsstelle wurden die Testgegenstände C und D als herausragend angesehen, mit nur mäßiger Entzündung im Vergleich zu den verbleibenden Testgegenständen, welche nur eine geringfügig stärkere Entzündung gegenüber ihren jeweiligen Salzlösungs-/Vehikelkontrollen aufwiesen.
Die folgenden Formulierungen wurden verwendet:

(1) Salzlösung wurde als eine 0,9%ige Lösung verwendet;
(2) Die Testgegenstände umfassten den Vehikelpuffer (unten) plus 8,0 mg/ml rhIGF-I; und
(3) Vehikelkontrolle A – 10 mM Natriumsuccinat, 140 mM Natriumchlorid, pH 6,0; Vehikelkontrolle B – 10 mM Natriumcitrat, 135 mM Natriumchlorid, pH 6,0; Vehikelkontrolle C – 0,1 M Natriumacetat, 50 mM Natriumchlorid; Vehikelkontrolle D – 1 mM Methionin, 135 mM Natriumchlorid, pH 6,0; Vehikelkontrolle E – 10 mM Natriumsuccinat, 125 mM Arginin, 20 mM Natriumchlorid, pH 6,0; und Vehikelkontrolle F – 7,4 mM Ammoniumcitrat, 1,9% Saccharose, 97 mM Natriumchlorid, pH 4,8.

Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Succinat (Testgegenstand A) ein effektives Medium zur Subkutaninjektion bereitstellte.

Claims

Injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend humanen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) oder eine biologisch aktive Variante davon und einen Puffer, wobei der Puffer im Wesentlichen aus Succinat in einer Konzentration von 10 mM bis 40 mM und einem Gegenion besteht, und wobei die Variante ein Polypeptid mit IGF-1-Aktivität und wenigstens 70% Aminosäuresequenzidentität zur Aminosäuresequenz für humanes IGF-1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gegenion ausgewählt ist auch Natrium, Kalium, Ammonium und dem IGF-1.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Succinatkonzentration 10 mM bis 30 mM ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Succinatkonzentration 10 mM bis 20 mM ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Succinatkonzentration etwa 10 mM ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung einen pH von 4,0 bis 7,0 hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der pH 4,6 bis 6,6 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der pH etwa 6,0 ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine hinreichende Konzentration an wenigs tens einem tonisierenden Mittel, sodass die Zusammensetzung isotonisch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das tonisierende Mittel Natriumchlorid ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das humane IGF-1 rekombinantes humanes IGF-1 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 11, wobei die Zusammensetzung einen pH von etwa 6,0 hat, die Konzentration des Succinats etwa 10 mM ist und die Zusammensetzung ferner etwa 140 mM Natriumchlorid umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung eine Flüssigkeit ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zusammensetzung lyophilisiert ist.