DE69723429T2

DE69723429T2 - Verfahren zur verbesserten funktionelle erholung der motorische koordiination, der sprache oder der sinneswahrnehmung nach trauma oder ischämie des zns

Info

Publication number: DE69723429T2
Application number: DE69723429T
Authority: DE
Inventors: F. Marc CHARETTE; P. Seth FINKLESTEIN
Original assignee: General Hospital Corp; Curis Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Stryker Corp
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2017-03-22
Also published as: EP0904093A1; JP4847634B2; DE69723429T3; DE69740089D1; US6407060B1; CA2249368A1; WO1997034626A1; US20030022830A1; AU2552997A; WO1997034618A1; AU734312B2; JP2000506894A; ATE244574T1; DE69723429D1; ES2201287T5; EP0894004B2; ES2201287T3; JP2000507939A; ATE493141T1; AU2582397A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Säugetieren, einschließlich Menschen, im Anschluss an eine ischämische oder traumatische Verletzung des Zentralnervensystems.
Hintergrund der Erfindung
Nunmehr wurden zahlreiche Proteine als morphogenetische oder Wachstumsfaktoren identifiziert und charakterisiert, die die Zellproliferation und/oder -differentiation von Geweben in Vertebraten, einschließlich von Säugetieren, regulieren. Typischerweise üben diese Wachstumsfaktoren ihre Wirkungen auf spezielle Untergruppen von Zellen und/oder Geweben aus. Somit wurden beispielsweise epidermale Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, verschiedene Hormone und viele andere Proteine, die die Zellproliferation oder -differenzierung induzieren oder hemmen, identifiziert, und es wurde gezeigt, dass diese einige Untergruppen von Zellen oder Geweben beeinflussen.
Neurotrophe Faktoren sind Polypeptide, die für die Entwicklung des Nervensystems erforderlich sind. Es ist nunmehr bekannt, dass der erste entdeckte neurotrophe Faktor, der Nervenwachstumsfaktor (Nerve Growth Factor = NGF), Teil einer großen Familie von Wachstumsfaktoren ist, die ebenfalls BDNF, NT3 und NT4/NT5 einschließen. Die in der PCT-Offenlegung Nr. WO 94/03200 als Morphogene definierten dimeren Proteine stellen eine weitere Familie von Proteinen dar, von denen angenommen wird, dass sie eine bedeutende Rolle in der Nervenentwicklung spielen (Jones et al. (1991), Development 111: 531–542; Ozkaynak et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 25220–25227; Lein et al. (1995), Neuron 15: 597–605).
Diese Proteine, die hierin als "morphogene bzw. morphogenetische Proteine" oder "Morphogene" bezeichnet werden, sind dazu in der Lage, als echte Gewebsmorphogene zu dienen und sind dazu in der Lage, von sich aus die Proliferation und Differentiation von Vorläuferzellen zu funktionellem Säugetierkörpergewebe zu induzieren. Die Proteine schließen Mitglieder der Familie der Knochen-morphogenetischen Proteine (Bone Morphogenetic Proteins = BMPs) ein, die ursprünglich durch ihre Fähigkeit identifiziert wurden, eine ektopische Ersatzknochen-Morphogenese zu induzieren.
Die Morphogene werden im Allgemeinen in der Technik als eine Untergruppe der TGF-β-Superfamilie der Wachstumsfaktoren klassifiziert (Hogan (1996), Genes & Development 10, 1580–1594). Mitglieder der Morphogenfamilie von Proteinen schließen das osteogenetische Säugetierprotein-1 (Mammalian Osteogenic Protein-1 = OP-1, ebenfalls als BMP-7 bekannt, und das Drosophila-Homolog 60A), osteogenetisches Protein-2 (OP-2, ebenfalls als BMP-8 bekannt), osteogenetisches Protein-3 (OP-3, BMP-2 (ebenfalls als BMP-2A oder CBMP-2A bekannt, und das Drosophila-Homolog DPP), BMP-3, BMP-4 (ebenfalls als BMP-2B oder CBMP-2B bekannt), BMP-5, BMP-6 und dessen murines Homolog Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12; GDF-3 (ebenfalls als Vgr2 bekannt), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (ebenfalls als CDMP-1 oder MP52 bekannt), GDF-6 (ebenfalls als CDMP-2 bekannt), GDF-7 (ebenfalls als CDMP-3 bekannt), das Xenopus-Homolog Vgl und NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP und NEURAL ein. Die Mitglieder dieser Familie codieren getrennte Polypeptid-Ketten, die gemeinsame strukturelle Merkmale teilen, einschließlich der Prozessierung aus einer Vorläufer-"Proform" zur Gewinnung einer reifen Polypepetid-Kette, die dazu in der Lage ist, zu dimerisieren, und die eine Carboxy-terminale aktive Domäne von ungefähr 97 bis 106 Aminosäuren aufweist. Alle Elemente teilen ein konserviertes Muster von Cysteinen in dieser Domäne und die aktive Form dieser Proteine kann entweder ein Disulfid-verbrücktes Homodimer eines einzigen Familienmitglieds sein oder ein Heterodimer aus zwei unterschiedlichen Mitgliedern (siehe beispielsweise Massague (1990), Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 13198). Siehe ebenso US 5 011 691 ; US 5 266 683 , Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085–2093, Wharton et al. (1991), PNAS 88: 9214–9218), (Ozkaynak (1992), J. Biol. Chem. 267: 25220–25227 und US 5 266 683); (Celeste et al. (1991), PNAS 87: 9843– 9847); (Lyons et al. (1989), PNAS 86: 4554–4558). Diese Offenbarungen beschreiben Aminosäure und DNA-Sequenzen ebenso wie die chemischen und physikalischen Eigenschaften dieser morphogenetischen Proteine. Siehe auch Wozney et al. (1988), Science 242: 1528–1534; BMP-9 (WO 93/00432, offengelegt am 07. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987), Nature 325: 81–84; und Vg-1 (Weeks (1987), Cell 51: 861–867).
Morphogene werden natürlich in einer Vielzahl von Geweben während der Entwicklung exprimiert, einschließlich solcher des sich entwickelnden Nervensystems (Ozkaynak et al. (1990), EMBO J. 9: 2085–2093; Ozkaynak et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 179: 116–123; Ozkaynak et al. (1992), oben).
Gefäßerkrankungen des Nervensystems nehmen in der Häufigkeit unter allen neurologischen Erkrankungen den höchsten Rang ein; sie stellen ungefähr 50% aller neurologischen Krankenhauseinweisungen in Erwachsenenen-Krankenhausabteilungen dar. Das Hauptmerkmal einer cerebrovaskulären Erkrankung ist der Schlaganfall, ein Begriff, der eine plötzliche und dramatische Entwicklung eines fokalen neurologischen Defizits bezeichnet. Die Verlegung einer Nährarterie, die einen Ort des Zentralnervensystems versorgt, durch beispielsweise einen Thrombus oder einen Embolus oder einen Fehler des systemischen Kreislaufs und Hypotension können, wenn diese ernsthaft und lang genug erfolgen, dem Gehirngewebe Blut und Sauerstoff entziehen, was zu einer Störung der physiologischen Funktion, anschließendem Tod von Nervenzellen und Nekrose (Infarkt) des betroffenen Ortes führt. Bei der hämorrhagischen Infarzierung tritt eine Extravasation von Blut in das Gehirngewebe, in den Subarachnoidalraum oder beides auf. Eine Schädigung ergibt sich aus einer physikalischen bzw. physischen Zerstörung des Bereichs, der direkt involviert ist und durch den Druck der Masse des Blutes auf das dieses umgebende Gewebe.
Das neurologische Defizit bei einem Schlaganfall spiegelt sowohl den Ort als auch die Größe des Infarktes oder der Blutung im Gehirn wider. Eine halbseitige Lähmung ist das klassische Anzeichen einer Gefäßerkrankung und tritt bei Schlaganfällen auf, die die Gehirnhemisphäre oder den Hirnstamm miteinbeziehen. Jedoch kann, abhängig von seiner Lokalisierung, ein Schlaganfall ebenfalls viele andere Manifestationen entstehen lassen, die eine halbseitige Lähmung begleiten oder unabhängig von dieser sind, einschließlich Taubheit, Empfindungsdefizit, Dysphasie, Blindheit, Diplopie, Schwindel und Dysarthrie.
Patienten, die unter einem "Schlaganfall" oder einer anderen Form einer cerebralen ischämischen oder traumatischen Verletzung leiden, erholen sich üblicherweise teilweise wieder, bleiben jedoch oftmals mild bis schwer gelähmt. Beispielsweise hat ein Totalinfarkt der mittleren Zerebralarterie in einem Menschen einer kontralaterale halbseitige Lähmung, Hemianästhesie, gleichseitige Hemianopie, globale oder totale sensorimotorische Aphasie (linke Hemisphäre) und Apraktagnosie (rechte Hemisphäre) zur Folge. Wenn sie einmal festgestellt wurden, bleiben die motorischen, sensorischen und Sprachdefizite üblicherweise statisch oder werden nach Verlauf von Monaten oder sogar Jahren nur sehr wenig verbessert. Selten können die Patienten wieder irgendwann effektiv kommunizieren. Gegenwärtig besteht, abgesehen von der physikalischen Therapie, keine Behandlung, die die Prognose eines Patienten, der einen Schlaganfall oder eine ähnliche Verletzung des Zentralnervensystems erlitten hat, zuverlässig verbessert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Wiedergewinnung einer Funktion des Zentralnervensystems in einem Säugetier, wobei diese funktionelle Wiedergewinnung eine klinisch relevante Verbesserung zumindest einer der motorischen Koordinationsfunktionen des Säugetiers umfasst (beispielsweise Haltung, Gleichgewicht, Greifen, Gang), Sinneswahrnehmungen (beispielsweise Sehfähigkeit, Tastsinn, Geschmacksinn, Geruchssinn, Propriozeption) oder Sprache. Eine klinisch relevante Verbesserung kann sich von einer nachweisbaren Verbesserung bis zu einer vollständigen Wiederherstellung einer verschlechterten oder verlorenen Zentralnervensystem-Funktion bewegen.
Die Erfindung ist insbesondere bei der Behandlung von Säugetieren von Nutzen, bei denen Zentralnervensystem-Gewebe aufgrund eines Schlaganfalls oder einer ähnlichen Störung der Butströmung geschädigt oder verloren ging, oder aufgrund der Zufügung eines physischen (beispielsweise mechanischen) Traumas, das das Zentralnervensystem beeinträchtigt. Die hierin bereitgestellten Anwendungen machen sich die Entdeckung zunutze, dass die Verabreichung eines Morphogens, beispielsweise an ein Säugetier, eine signifikante Verbesserung einer Funktion des Zentralnervensystems ergibt, sogar wenn es verabreicht wurde, nachdem das Zentralnervensystem-Gewebe geschädigt wurde. Die Verwendung schließt dimere Proteine ein, wie sie als Morphogene, Induktoren dieser Morphogene oder Agonisten der entsprechenden Morphogenrezeptoren definiert sind oder durch Implantation von Zellen, die durch Exposition gegenüber den Morphogenen stimuliert wurden.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Morphogens in der Herstellung einer Medikamentes zur Behandlung eines Säugetiers, das eine Verletzung des Zentralnervensystems, wie beispielsweise einen Schlaganfall oder eine traumatische Verletzung erlitten hat. Die Verwendung schließt die Verabreichung einer wirksamen Dosis eines Morphogens an das Säugetier zumindest sechs Stunden nach Beginn der Verletzung, beispielsweise 12, 24 oder 48 Stunden oder sogar länger, folgend dem Beginn der Verletzung, ein.
Die Behandlungsvorschrift wird bezüglich der Verabreichungsweise, dem Zeitpunkt der Verabreichung und der Dosierung durchgeführt, so dass die funktionelle Erholung von einer Verschlechterung des Zentralnervensystems verbessert wird. Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Medikamente enthalten therapeutisch wirksame Mengen des Morphogens, des Morphogeninduktors oder der Agonisten der Morphogenrezeptoren. Das heißt, die Medikamente werden eine Menge enthalten, die geeignete Konzentrationen des Mittels für das beeinträchtigte Gewebe des Nervensystems für eine Zeitspanne zur Verfügung stellen, die ausreichend ist, eine nachweisbare Erholung der Funktion des Zentralnervensystems zu stimulieren, bis zu und einschließlich einer vollständigen Wiederherstellung dessen. Die wirksame Menge des Morphogens kann in einer einzigen Verabreichung, in zwei Verabreichungen oder in einer Vielzahl von Verabreichungen bereitgestellt werden. Wenn die effektive Menge eines Morphogens in einer Vielzahl von Verabreichungen bereitgestellt wird, wird das Morphogen vorzugsweise dem Säugetier täglich verabreicht. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird das Morphogen dem Säugetier zweimal wöchentlich verabreicht (beispielsweise alle drei oder vier Tage). In einer weiteren alternativen bevorzugten Ausführungsform wird das Morphogen dem Säugetier einmal pro Woche verabreicht.
Die Erfindung kann dazu verwendet werden, nachteilige Folgen von Verletzungen des Zentralnervensystems, die sich aus einer Vielzahl von Bedingungen ergeben können, zu behandeln. Thrombus, Embolus und systemische Hypotension zählen zu den häufigsten Ursachen von Schlaganfällen. Weitere Verletzungen können durch Hypertension, hypertensive zerebrale vaskuläre Erkrankung, Ruptur eines Aneurisma, ein Angiom, Blutdyskrasie, Herzfehler, Herzstillstand, kardiogenen Schock, Nierenversagen, septischen Schock, Kopftrauma, Rückenmarkstrauma, Insult, Blutungen aus einem Tumor oder einen anderen Verlust von Blutvolumen und/oder -druck einschließen. Die Verabreichung eines Morphogens gemäß der Erfindung bedeutet einen signifikanten klinischen Vorteil, sogar wenn die Verabreichung nach einer signifikanten Zeitspanne folgend der Verletzung eintritt.
Im Allgemeinen sind die in der Erfindung nützlichen Morphogene dimere Proteine, die eine Morphogenese einer oder mehrerer eukaryontischer (beispielsweise Säugetier-) Zellen, Geweben oder Organen induziert. Hierin sind von speziellem Interesse Morphogene, die eine Morphogenese zumindest von Knochen- oder Nervengewebe induzieren. Morphogene umfassen zwei Polypeptide, die, wenn sie gefaltet sind, eine Konfiguration annehmen, die für das sich ergebende dimere Protein ausreichend sind, um morphogenetische Reaktionen in Zellen und Geweben hervorzurufen, die für dieses Morphogen spezifische Rezeptoren zeigen. Das heißt, die Morphogene induzieren im Allgemeinen eine Kaskade von Ereignissen, die all das Nachfolgende in einer morphogenetisch permissiven Umgebung einschließen: Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; Stimulierung der Proliferation differenzierter Zellen; und Unterstützung des Wachstums und der Aufrechterhaltung differenzierter Zellen. "Vorläufer"-Zellen sind nichtfestgelegte Zellen, die zur Differenzierung in ein oder mehrere spezifische Typen differenzierter Zellen in der Lage sind, abhängig von ihrem genomischen Repertoire und der Gewebsspezifität der permissiven Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird. Die Morphogene können weiterhin den Beginn eines Seneszenz- oder Quieszenz-assoziierten Verlustes eines Phänotyps und/oder einer Gewebsfunktion verzögern oder lindern. Morphogene können noch weiter eine phänotypische Expression differenzierter Zellen stimulieren, einschließlich der Expression metabolischer und/oder funktionaler, beispielsweise sekretorischer, Eigenschaften hiervon. Zusätzlich können die Morphogene eine Redifferenzierung festgelegter Zellen unter geeigneten Umgebungsbedingungen induzieren. Wie oben erwähnt, sind Morphogene, die eine Proliferation und/oder Differentiation zumindest von neuralem Gewebe induzieren und/oder das Wachstum, die Aufrechterhaltung und/oder funktionelle Eigenschaften von Nervengewebe unterstützen, hierin von speziellem Interesse. Siehe beispielsweise WO 92/15323, WO 93/04692 und WO 94/03200 für eine ausführlichere Offenbarung bezüglich der gewebsmorphogenetischen Eigenschaften dieser Proteine.
Wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe "Morphogen", "Knochenmorphogen", "Knochen-morphogenetisches Protein", "BMPO", "morphogenes Protein" und "morphogenetisches Protein" alle die Klasse von Proteinen, die durch humanes osteogenetisches Protein typifiziert wird (hOP-1). Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für hOP-1 werden in den SEQ ID NO: 4 bzw. 5 bereitgestellt. Zur Erleichterung der Beschreibung wird hOP-1 hierin nachstehend als ein repräsentatives osteogenetisches Protein bezeichnet. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird jedoch erkennen, dass OP-1 lediglich für die TGF-β-Unterklasse von echten Gewebsmorphogenen repräsentativ ist, die dazu in der Lage sind, als morphogenetische Proteine zu fungieren und soll die Beschreibung nicht einschränken. Andere bekannte und nützliche Proteine schließen BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL und morphogenetisch aktive Aminosäurevarianten hiervon ein. Somit schließen bevorzugte morphogenetische Proteine in einer Ausführungsform ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6. Zusätzlich, wie der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstehen wird, könnte irgendeines der hierin beschriebenen morphogenetischen Proteine ebenfalls als Referenzsequenz verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform schließen die in der Erfindung nützlichen Proteine biologisch aktive Spezies (phylogenetische) Varianten irgendeines der hierin beschriebenen morphogenetischen Proteine ein, einschließlich konservative Aminosäuresequenzvarianten, Proteine, die von degenerierten Nukleotid-Sequenzvarianten codiert werden und morphogenetisch aktive Proteine, die das konservierte 7-Cystein-Skelett teilen, wie es hierin definiert ist, und die von einer DNA-Sequenz codiert werden, die zum Hybridisieren unter Standard-Stringenzbedingungen an eine DNA-Sequenz in der Lage ist, die ein hierin offenbartes morphogenetisches Protein codiert, einschließlich, ohne Einschränkung, OP-1 und BMP-2 oder BMP-4. In einer noch weiteren Ausführungsform schließen nützliche Morphogene solche ein, die die konservierte 7-Cystein-Domäne teilen und zumindest eine 70%ige Aminosäuresequenz-Homologie (Ähnlichkeit) innerhalb der C-terminalen aktiven Domäne einer Referenz-Morphogensequenz teilen, wie sie hierin nachstehend definiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Referenzsequenz OP-1.
In einer noch weiteren Ausführungsform können die in der Erfindung nützlichen Morphogene als morphogenetisch aktive Proteine definiert werden, die irgendeine der hierin definierten generischen Sequenzen aufweisen, einschließlich OPX und der generischen Sequenzen 7 und 8 (SEQ ID NO: 1 bzw. 2) oder der generischen Sequenzen 9 und 10 (SEQ ID NO: 6 bzw. 7). OPX nimmt die Homologien zwischen den verschiedenen Spezies osteogenetischer OP-1- und OP-2-Proteine auf und wird durch die hierin nachstehend beschriebene Aminosäuresequenz und in SEQ ID NO: 3 beschrieben. Die generische Sequenz 9 ist eine 96-Aminosäuresequenz, die das durch hOP-1 definierte 6-Cystein-Skelett enthält (Reste 335 bis 431 von SEQ ID NO: 5) und bei der die verbleibenden Reste die Homologien von OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11 UNIVIN, NODAL, DORSALIN, NEURAL, SCREW und ADMP aufnehmen. Das heißt, jeder der Nicht-Cystein-Reste ist unabhängig aus dem entsprechenden Rest in dieser angesprochenen Proteingruppe ausgewählt. Die generische Sequenz 10 ist eine Sequenz von 102 Aminosäuren, die eine 5-Aminosäuresequenz einschließt, die dem N-Terminus der generischen Sequenz 9 hinzugefügt wurde und definiert das durch hOP-1 definierte 7-Cystein-Skelett (330–431 von SEQ ID NO: 5). Die generischen Sequenzen 7 und 8 sind jeweils 96 und 102 Aminosäure lange Sequenzen, die entweder das 6-Cystein-Skelett (generische Sequenz 7) oder das 7-Cystein-Skelett (generische Sequenz 8), definiert durch hOP-1 enthalten, und bei denen die verbleibenden Reste Nicht-Cystein die Homologien von OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, 60A, DPP, Vgl, BMP-5, BMP-6, Vgr-1 und GDF-1 aufnehmen.
Wie hierin betrachtet, schließt die Familie morphogenetischer Proteine, die hierin beschrieben sind, längere Formen eines vorgegebenen Proteins ein, ebenso wie phylogenetische, beispielsweise Spezies- und Allel-Varianten und biosynthetische Mutanten ein, einschließlich einer C-terminalen Hinzufügung und von Deletionsmutanten und -varianten wie beispielsweise solchen, die das konservierte C-terminale Cystein-Skelett verändern können, vorausgesetzt, dass die Veränderung noch ermöglicht, dass das Protein eine dimere Spezies mit einer Konformation bildet, die zum Induzieren einer Nervengewebsbildung in einem Säugetier in der Lage ist, wenn es einem Säugetier in einer morphogenetisch permissiven Stelle verabreicht wird. Zusätzlich können die in der Erfindung nützlichen morphogenetischen Proteine Formen einschließen, die variierende Glycosylierungsmuster und variierende N-Termini aufweisen, können natürlich vorkommen oder biosynthetisch gewonnen werden und können durch Expression rekombinanter DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erzeugt werden. Die Proteine sind als einzelne Spezies aktiv (beispielsweise als Homodimere, einschließlich Chimären) oder kombiniert als gemischte Spezies, einschließlich von Heterodimeren.
Von speziellem Interesse hierin sind Morphogene, die, wenn sie Nervengewebe eines Säugetiers verabreicht werden, den normalen Zustand der Differenzierung und des Wachstums dieses Gewebes induzieren oder aufrechterhalten. In einer gegenwärtig bevorzugten demonstrativen Ausführungsform induzieren die vorliegenden Morphogene oder reinduzieren diese eine Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse, die in der Bildung von Vertebraten-Zentralnervensystem-Gewebe gipfeln. In anderen bevorzugten demonstrativen Ausführungsformen induzieren die vorliegenden Morphogene in ähnlicher Weise die Bildung anderer Vertebraten-Körpergewebe (beispielsweise Vögel oder Säugetiere) wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Knochen, Knorpel, Knochenmark, Bänder, Zahndentin, Periodontium, Leber, Niere, Lunge, Herz oder gastrointestinale Auskleidung. Die vorliegenden Demonstrationen können im Kontext von sich entwickelndem embryonalem Gewebe oder an einer aseptischen, nicht vernarbten Wundstelle in postembryonalem Gewebe ausgeführt werden. Besonders bevorzugte Morphogene induzieren oder lösen ein Muster einer Bildungskaskade in einem sich entwickelnden Säugetier- oder Vogelembryo aus, der in der Bildung eines oder mehrerer funktionell integrierter Elemente des Zentral- oder peripheren Nervensystems gipfelt. Solche Morphogene können dazu verwendet werden, ein Säugetier, das von einer ischämischen oder traumatischen Verletzung des Zentralnervensystems betroffen ist, zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung kann alternativ mit einem Morphogeninduktor anstelle eines Morphogens ausgeübt werden. Ein "Morphogeninduktor" ist eine Verbindung, die die In-vivo-Produktion (d. h. Transkription, Translation und/oder Sekretion) einer therapeutisch wirksamen Konzentration eines endogenen Morphogens im Körper eines Säugetiers stimuliert. Eine "effektive" Konzentration reicht aus, um die Regeneration oder Aufrechterhaltung von Nervengewebe zu fördern und/oder zusätzlichen Verlust hiervon zu hemmen. Solche Verbindungen sollen Substanzen einschließen, die, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden, auf Zellen einwirken, die normalerweise dazu in der Lage sind, ein Morphogen zu erzeugen und/oder zu sezernieren, das im Genom des Säugetiers codiert ist und die eine Erhöhung der endogenen Konzentration des Morphogens verursachen. Endogene oder verabreichte Morphogene können als Endokrin-, Parakrin- oder Autokrinfaktoren dienen. Das heißt, endogene Morphogene können durch die Zellen synthetisiert werden, in denen die morphogenetischen Reaktionen induziert werden, durch benachbarte Zellen oder durch Zellen in einem entfernten Gewebe, und in diesem Fall wird das sezernierte endogene Morphogen an die Stelle der Morphogenese transportiert, beispielsweise durch den Blutstrom des Individuums. In bevorzugten Ausführungsformen stimuliert der Induktor die Expression und/oder Sekretion eines endogenen Morphogens, um die Mengen hiervon zu erhöhen, die in Nervengewebe verfügbar sind.
In noch weiteren Ausführungsformen kann ein Mittel, das als ein Agonist eines Morphogenrezeptors dient, anstelle des Morphogens selbst verabreicht werden. Ein "Agonist" eines Rezeptors ist eine Verbindung, die an den Rezeptor bindet und für die das Ergebnis einer solchen Bindung dem Ergebnis der Bindung des natürlichen, endogenen Liganden des Rezeptors ähnlich ist. Das heißt, die Verbindung muss nach Wechselwirkung mit dem Rezeptor dieselben oder im Wesentlichen ähnliche Transmembran- und/oder intrazelluläre Wirkungen wie der endogene Ligand erzeugen. Somit bindet ein Agonist eines Morphogenrezeptors an den Rezeptor und eine solche Bindung weist dieselbe oder eine funktionell ähnliche Folge wie eine Morphogenbindung auf (beispielsweise eine Induktion der Morphogenese). Die Aktivität oder Wirkstärke eines Agonisten kann geringer sein als diejenigen des natürlichen Liganden und in diesem Falle wird der Agonist als "Teilagonist" bezeichnet oder sie kann gleich groß oder größer als diejenige des natürlichen Liganden sein, und in diesem Falle wird er als "Vollagonist" bezeichnet. Somit kann beispielsweise ein kleines Peptid bzw. Small Peptide oder ein anderes Molekül, das die Aktivität eines Morphogens bei der Bindung an und Aktivierung des Morphogenrezeptors nachahmen kann, als ein Äquivalent des Morphogens verwendet werden. Vorzugsweise ist der Agonist ein Vollagonist, jedoch können Teilmorphogenrezeptoragonisten ebenfalls in vorteilhafter Weise verwendet werden. Verfahren zum Identifizieren solcher Agonisten sind in der Technik bekannt und schließen Assays für Verbindung ein, die durch Morphogen vermittelte Reaktionen (beispielsweise eine Induktion der Differenzierung des metanephrischen Mesenchyms, Induktionen der Ersatzknochenbildung und dergleichen) induzieren. Ein solcher Agonist wird als ein Morphogen-"Nachahmer", -"Mimetikum" oder -"Analogon" bezeichnet.
Die Morphogene, Induktoren und Agonisten der Erfindung können auf irgendeinem Verabreichungsweg verabreicht werden, der mit dem ausgewählten Mittel kompatibel ist, einschließlich durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre, ophthalmische, intraperitoneale, bukale, rektale, vaginale, intraorbitale, orale, intrazerebrale, intrakraniale, intraspinale, intraventrikuläre, intrathekale, intracisternale, intrakapsuläre, intranasale oder durch Aerosol-Verabreichung und können mit irgendeinem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert werden, der für den Verabreichungsweg geeignet ist. Zusätzlich können verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere bioaktive Mittel mit dem Morphogen gleichzeitig verabreicht werden. Somit können verschiedene bekannte Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise NGF, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α und TGF-β ebenso wie Enzyme, Enzyminhibitoren und/oder Chemoattraktans/chemotaktische Faktoren mit dem Morphogen kombiniert und an den defekten Ort abgegeben werden.
Die Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes gemäß der vorliegenden Erfindung stimuliert in vorteilhafter Weise die Wiederherstellung der Funktion des zentralen Nervensystem, sogar dann, wenn sie Stunden oder sogar Tage im Anschluss an Verletzungen des Zentralnervensystems ausgeübt wird. Die Erfindung verbessert somit die Behandlungsoptionen, die verfügbar sind, wenn die Verletzung des Zentralnervensystems eintritt und vor dem Tod des involvierten Gewebes nicht diagnostiziert oder behandelt wird, signifikant.
Die bevorzugten Verfahren, Materialien und Beispiele, die nunmehr beschrieben werden, sind lediglich veranschaulichend und sollen nicht als einschränkend aufgefasst werden. Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen klarer werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 präsentiert die prozentuale Aminosäuresequenzidentität und die prozentuale Aminosäuresequenzhomologie ("Ähnlichkeit"), die verschiedene Mitglieder der Familie der morphogenetischen Proteine, wie hierin definiert, mit OP-1 in der C-terminalen 7-Cystein-Domäne teilen;
2A–2B sind graphische Liniendarstellungen, die die Anordnung der oberen Gliedmaßen (2A) und der unteren Gliedmaßen (2B)-Scores betroffener (linker) Gliedmaßen von OP-1-behandelten Tieren darstellen (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 8 Injektionen = 80 μg/Tier; N = 7; ausgefüllte Quadrate) und mit Vehiculum bzw. Träger behandelte Tiere (N = 7, nicht-ausgefüllte Quadrate);
3A–3B sind graphische Liniendarstellungen, die Gleichgewichts-Balken- (3A) und Haltungsreflex- (3B) Scores in OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 8 Injektionen = 80 μg/Tier; N = 7; ausgefüllte Quadrate) und Träger-behandelte Tiere (N = 7 Tiere, nichtausgefüllte Quadrate) darstellen;
4 ist eine graphische Liniendarstellung, die das Körpergewicht von OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 8 Injektionen = 80 μg/Tier; N = 7; ausgefüllte Quadrate) und Trägerbehandelte Tiere (N = 7; nicht-ausgefüllte Quadrate) darstellt;
5A–5B sind graphische Liniendarstellungen, die die oberen Gliedmaßen-Anordnungs-Scores ohne (5A) und mit Barthaar-Anordnung (5B) betroffener (linker) Gliedmaßen von Hochdosis-OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 2 Injektionen = 20 μg/Tier; N = 9 Tiere, ausgefüllte Quadrate), von Niederdosis-OP-1-behandelten Tieren (1 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 2 Injektionen = 2 μg/Tier; N = 8 Tiere; nicht-ausgefüllte Quadrate) und von Träger-behandelten Tieren (N = 9, nicht-ausgefüllte Kreise) darstellt;
6 ist eine graphische Liniendarstellung, die die oberen Gliedmaßen-Anordnungs-Scores von betroffenen (linken) Gliedmaßen von Hochdosis-OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 2 Injektionen = 20 μg/Tier; N = 9 Tiere; ausgefüllte Quadrate), von Niederdosis-OP-1-behandelten Tieren (1 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 2 Injektionen = 2 μg/Tier; N = 8 Tiere; nicht-ausgefüllte Quadrate), und von mit Träger behandelten Tieren (N = 9, nicht-ausgefüllte Kreise) darstellt;
7 ist eine graphische Darstellung, die das Körpergewicht von Hochdosis-OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben in 2 Injektionen = 20 μg/Tier; N = 9 Tiere; ausgefüllte Quadrate), von mit niedrigen Dosen von OP-1-behandelten Tieren (1 μg/intracisternale Injektion; Gesamt-OP-1 abgegeben = 2 μg in 2 Injektionen/Tier; N = 8 Tiere; nichtausgefüllte Quadrate) und von mit Träger behandelten Tieren (N = 9, nichtausgefüllte Kreise) darstellt;
8A–8B sind graphische Liniendarstellungen, die die obere Gliedmaßen-Anordnungs-Scores ohne (8A) und mit Barthaar-Anordnung (8B) betroffener (linker) Gliedmaßen von OP-1-behandlten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; N = 6 Tiere; ausgefüllte Quadrate) und von mit Trägerstoff behandelten Tieren (N = 8), nicht-ausgefüllte Quadrate) darstellt;
9 ist eine graphische Liniendarstellung, die die Scores für die Anordnung unterer Gliedmaßen betroffener (linker) Gliedmaßen von betroffenen (linken) Gliedmaßen von OP-1-behandelten Tieren (10 μg/intracisternale Injektion; N = 6 Tiere; ausgefüllte Quadrate) und von mit Trägerstoff behandelten Tieren (N = 8, nicht-ausgefüllte Quadrate) darstellt; und
10 ist eine graphische Liniendarstellung, die das Körpergewicht von mit OP-1 behandelten Tieren darstellt (10 μg/intracisternale Injektion; N = 6 Tiere; ausgefüllte Quadrate) und von mit Trägerstoff behandelten Tieren (N = 8, nicht-ausgefüllte Quadrate).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
A. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung hängt teilweise von der überraschenden Entdeckung ab, dass eine funktionelle Erholung im Anschluss an einen Schlaganfall oder eine traumatische Verletzung des Zentralnervensystems durch Verabreichung eines Morphogens signifikant verbessert wird, sogar dann, wenn es verabreicht wird, nachdem das betroffene Gewebe der Verletzung unterliegt und nachdem die Zentralnervensystemfunktion verschlechtert wurde oder verlorenging. Am überraschendsten beeinflusst bzw. beeinträchtigt (beispielsweise reduziert) die Praxis der Erfindung das Volumen oder den Umfang von betroffenem (von Infarkt betroffenem) Gewebe nicht. Somit profitiert die Erfindung von der Entdeckung, dass eine funktionelle Zentralnervensystem-Wiederherstellung ungeachtet des Verlustes von Gewebe erreicht werden kann, das ursprünglich von einem Schlaganfall oder einem traumatischen verletzungsbedingten Verlust betroffen war. Eine signifikante (nachweisbare, klinisch relevante) Wiederherstellung der ZNS-Funktion kann sogar mit einer einzigen Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis eines Morphogens erreicht werden.
Die Erfindung umfasst die Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Säugetiers, das eine Verletzung des Zentralnervensystems, wie beispielsweise einen Schlaganfall oder eine traumatische Verletzung, erlitten hat. Die Erfindung schließt die Verabreichung eines Morphogens an das betroffene Säugetier zumindest 6 Stunden nach Ausbruch der Verletzung ein; beispielsweise 12, 24, 48 Stunden oder sogar länger, folgend einer Verletzung. Kein praktischer Endpunkt im therapeutischen Fenster, in dem die Erfindung ausgeübt werden kann, wurde bis jetzt etabliert. Die Erfindung kann zur Behandlung einer oder mehrerer Folgen einer Verletzung des Zentralnervensystems verändert werden, die sich aus einer Vielzahl von Bedingungen ergibt. Thrombus, Embolus und systemische Hypotension zählen zu den üblichsten Ursachen für einen Schlaganfall. Weitere Verletzungen können durch Hypertension, hypertensive zerebrale vaskuläre Erkrankung, durch die Ruptur eines Aneurismas, ein Angiom, Blutdyskrasie, einen Herzfehler, Herzstillstand, kardiogenen Schock, Nierenversagen, septischen Schock, Kopftrauma, Rückenmarkstrauma, Insult, Blutungen aus einem Tumor oder einem anderen Verlust eines Blutvolumens oder Blutdruckes verursacht werden. Diese Verletzungen führen zu einer Störung der physiologischen Funktion, anschließend zum Tod von Nervenzellen und einer Nekrose (Infarkt) der betroffenen Areale. Der Begriff "Schlaganfall" bezeichnet die sich ergebenen plötzlichen und dramatischen neurologischen Defizite, die mit irgendeiner der vorhergehenden Verletzungen assoziiert sind.
Die Begriffe "Ischämie" oder "ischämische Episode", wie hierin verwendet, bedeuten jeden Umstand, der eine Mangelversorgung eines Gewebes mit Blut nach sich zieht. Somit ergibt sich eine ischämische Episode des Zentralnervensystems aus einer Insuffizienz oder Störung der Blutzufuhr zu irgendeinem Ort des Gehirns, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, einen Ort des Cerebrums, Cerebellums oder Gehirnstamms. Das Rückenmark, das ebenfalls Teil des Zentralnervensystems ist, ist in gleicher Weise gegenüber einer Ischämie, die sich aus einer Verminderung des Blutstroms ergibt, anfällig. Eine ischämische Episode kann durch Konstriktion oder Obstruktion eines Blutgefäßes verursacht sein, wie es im Falle eines Thrombus oder Embolus auftritt. Alternativ kann sich die ischämische Episode aus irgendeiner Form einer verschlechterten Herzfunktion, einschließlich Herzstillstand, wie oben beschrieben, ergeben. Wenn der Mangel bzw. die Defizienz ausreichend schwerwiegend und lang anhaltend ist, kann dies zur Störung der physiologischen Funktion führen, einem anschließenden Tod von Neuronen und einer Nekrose (Infarkt) der betroffenen Areale. Das Ausmaß und der Typ der neurologischen Abnormalität, die sich aus der Verletzung ergibt, hängt vom Ort und der Größe des Infarkts und des Orts bzw. Fokus der Ischämie ab. Wenn die Ischämie mit einem Schlaganfall assoziiert ist, kann diese entweder global oder in ihrem Umfang fokal sein.
Der Begriff "fokale Ischämie", wie hierin in Bezug auf das zentrale Nervensystem verwendet, bedeutet den Zustand, der sich aus einer Blockade einer einzelnen Arterie ergibt, die Blut an das Hirn oder das Rückenmark liefert, was den Tod aller zellulären Elemente (Pannekrose) in dem von der Arterie versorgten Territorium mit sich bringt.
Der Begriff "globale Ischämie", wie hierin bezüglich des zentralen Nervensystems verwendet, bedeutet den Zustand, der sich aus einer allgemeinen Verringerung des Blutstroms an das gesamte Hirn, das Vorderhirn oder das Rückenmark ergibt, was den verzögerten Tod von Neuronen verursacht, insbesondere solchen, die an metabolisch aktiven Orten in diesen gesamten Geweben vorliegen. Die Pathologie jeder dieser Fälle ist sehr unterschiedlich, wie es auch die klinischen Korrelate sind. Die Modelle einer fokalen Ischämie betreffen Patienten mit einer fokalen zerebralen Infarktion, wohingegen Modelle einer globalen Ischämie dem Herzstillstand oder anderen Ursachen einer systemischen Hypotension analog sind.
Es wird erwartet, dass die Erfindung ebenfalls zur Behandlung traumatischer Verletzungen des Zentralnervensystems von Nutzen sein wird, die durch mechanische Kräfte verursacht werden, wie beispielsweise einen Schlag auf den Kopf. Ein Trauma kann einen Gewebsinsult einschließen, ausgewählt aus einer Abrasion, Inzision, Prellung bzw. Quetschung, Einstich, Kompression etc., wie es sich beispielsweise aus einem traumatischen Kontakt mit einem Fremdobjekt an irgendeinem Ort des Säugetierkopfes, Nacken oder der Wirbelsäule oder der diesen zugehörig ist, entstehen kann. Andere Formen einer traumatischen Verletzung können sich aus einer Konstriktion oder Kompression von Säugetier-ZNS-Gewebe durch eine nicht geeignete Akkumulation von Flüssigkeit ergeben (beispielsweise eine Blockade oder Dysfunktion normaler cerebrospinaler Flüssigkeit oder einer Glaskörperflüssigkeitsproduktion, Umsatzes oder Volumenregulierung oder ein subdurales oder intrakraniales Hämatom oder Ödem) ergeben können. In ähnlicher Weise kann sich die traumatische Konstriktion oder Kompression aus dem Vorhandensein einer Masse von abnormalem Gewebe ergeben, wie beispielsweise einem metastatischen oder primären Tumor.
B. Biochemische, strukturelle und funktionelle Eigenschaften nützlicher morphogenetischer Proteine
Wie hierin erwähnt, ist ein Protein wie hierin definiert morphogenetisch, wenn es die Entwicklungskaskade zellulärer und molekularer Ereignisse induziert, die in der Bildung von neuem, organspezifischem Gewebe kulminieren. In einer bevorzugter Ausführungsform ist ein Morphogen ein dimeres Protein, das zwei Polypeptidketten umfasst, wobei jede Kette eine Sequenz aufweist, die zumindest dem konservierten C-Terminalen 6- oder 7-Cysteinskelett von humanem OP-1 entspricht oder funktionell äquivalent ist, eingeschlossen in SEQ ID NO: 5 und/oder die 70% einer Aminosäuresequenz-Homologie mit OP-1 in dieser Region teilt. Die Morphogene sind im Allgemeinen dazu geeignet, eine Kaskade von Ereignissen zu induzieren, die all das Folgende in einer morphogenetisch permissiven Umgebung einschließt: eine Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; eine Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; eine Stimulierung der Proliferation differenzierter Zellen; und eine Förderung des Wachstums und der Aufrechterhaltung differenzierter Zellen. Unter geeigneten Bedingungen sind die Morphogene ebenfalls dazu in der Lage, eine Redifferenzierung festgelegter Zellen zu induzieren, insbesondere von Zellen, die von ihrem "normalen" Differenzierungsweg abgewichen sind. Details, wie die in dieser Erfindung nützlichen Morphogene zuerst identifiziert wurden, ebenso wie eine Beschreibung, wie diese herzustellen, zu verwenden und diese auf eine morphogenetische Aktivität zu testen sind, ist in zahlreichen Publikationen offenbart, einschließlich der US 5 011 691 , 5 266 683 und der internationalen Patentveröffentlichungen WO 92/15323, WO 93/04692; WO 94/03200. Wie hierin offenbart, können die Morphogene aus Material aus natürlicher Quelle oder rekombinant produziertem Material aus prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen unter Verwendung der hierin offenbarten Gensequenzen aufgereinigt werden. Alternativ können die neuen morphogenetischen Sequenzen den hierin offenbarten Verfahren folgend identifiziert werden.
Natürlich vorkommende Proteine, die hierin identifiziert wurden und/oder von denen geschätzt wird, dass sie echte gewebsmorphogenetische Proteine sind und dass sie in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung von Nutzen sind, bilden eine getrennte Untergruppe innerhalb dieser losen evolutionären Gruppierung von Sequenz-verwandten Proteinen, die als die TGF-β-Superfamilie oder Supergen-Familie bekannt ist. Die natürlich vorkommenden Morphogene teilen eine beträchtliche Aminosäure-Sequenzhomologie in ihren C-terminalen Regionen (Domänen). Typischerweise werden die oben erwähnten natürlich vorkommenden Morphogene als Vorläufer translatiert, mit einer N-terminalen Signalpeptidsequenz, die typischerweise als ungefähr 35 Reste Länge beträgt, gefolgt von einer "Pro"-Domäne, die zur Gewinnung des reifen Proteins abgespalten wird, die die biologisch aktive C-terminale Domäne einschließt. Das Signalpeptid wird rasch nach Translation abgespalten, an einer Spaltstelle, die in einer vorgegebenen Sequenz unter Verwendung des Verfahrens von Von Heijne (1986), Nucleic Acids Research 14, 4683–4691, vorhergesagt werden kann. Die Prodomäne ist typischerweise ungefähr dreimal länger als die vollständig prozessierte reife C-terminale Domäne. Unter nativen Bedingungen wird das Protein als reifes Dimer sezerniert und die gespaltene Prodomäne kann damit zur Bildung eines Proteinkomplexes gebunden werden, vermutlich um die Löslichkeit des reifen dimeren Proteins zu verbessern. Typischerweise ist die komplexe Form eines Morphogens löslicher als die reife Form unter physiologischen Bedingungen.
Morphogenetisches Protein aus natürlicher Quelle in seiner reifen, nativen Form ist typischerweise ein glykosyliertes Dimer, das typischerweise ein apparentes bzw. scheinbares Molekülgewicht bzw. eine Molekülmasse von ungefähr 30–36 kDa aufweist, wie es durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Wenn es reduziert ist, lässt das 30-kDA-Protein zwei glykosylierte Polypeptid-Untereinheiten mit scheinbaren Molekülmassen im Bereich von ungefähr 16 kDA und 18 kDA entstehen. Das unglykosylierte dimere Protein, das ebenfalls eine morphogenetische Aktivität aufweist, weist typischerweise ein apparentes Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 27 kDA auf. Wenn es reduziert ist, lässt das 27-kDA-Protein zwei unglykosylierte Polypeptide mit Molekulargewichten entstehen, typischerweise in einem Bereich von ungefähr 14 kDA bis 16 kDA.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst jede der Polypeptidketten eines dimeren morphogenetischen Proteins, wie hierin definiert, eine Aminosäuresequenz, die eine definierte Beziehung mit einer Aminosäuresequenz eines Referenz- bzw. Bezugsmorphogens teilt. In einer Ausführungsform teilen bevorzugte morphogenetische Polypeptidketten eine definierte Beziehung mit einer Sequenz, die in morphogenetisch aktivem humanen OP-1, SEQ ID NO: 5 vorliegen. Jedoch können irgendeines oder mehrere der hierin offenbarten natürlich auftretenden oder biosynthetischen morphogenetischen Proteine in ähnlicher Weise als Bezugssequenz verwendet werden. Bevorzugte morphogenetische Polypeptidketten teilen eine definierte Beziehung mit zumindest der C-terminalen 6-Cystein-Domäne von humanem OP-1, Reste 335–431 von SEQ ID NO: 5. Vorzugsweise teilen die morphogenetischen Polypeptidketten eine definierte Beziehung mit zumindest der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NO: 5. Das heißt, bevorzugte Polypeptidketten in einem dimeren Protein mit einer morphogenetischen Gewebsaktivität umfassen jeweils eine Sequenz, die einer Bezugssequenz entspricht oder zu dieser funktionell äquivalent ist.
Funktionell äquivalente Sequenzen schließen funktionell äquivalente Anordnungen von Cystein-Resten ein, die innerhalb der Bezugssequenz angeordnet sind, einschließlich von Aminosäureinsertionen oder -deletionen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine ändern, die jedoch materiall die Beziehung in der gefalteten Struktur des dimeren Morphogenproteins verschlechtern, einschließlich dessen Fähigkeit, Intra- oder Inter-Ketten Disulfid-Brücken zu bilden, wie es für eine morphogenetische Aktivität notwendig sein kann. Es wurden beispielsweise natürlich vorkommende Morphogene beschrieben, bei denen zumindest eine innere bzw. interne Deletion (eines Restes; BMP2) oder eine Insertion (von vier Resten; GDF-1) vorliegen, was jedoch die biologische Aktivität nicht in Frage stellt. Funktionell äquivalente Sequenzen schließen weiterhin solche ein, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste sich vom entsprechenden Rest einer Bezugssequenz, beispielsweise der C-terminalen 7-Cystein-Domäne (hierin ebenfalls als konserviertes 7-Cystein-Skelett bezeichnet) von humanem OP-1 unterscheiden, vorausgesetzt, dass dieser Unterschied die gewebsmorphogenetische Aktivität nicht zerstört. Demgemäß werden konservative Substitutionen entsprechend der Aminosäure in der Referenzsequenz bevorzugt. Aminosäurereste, die "konservative Substitutionen" für entsprechende Reste in einer Bezugssequenz sind, sind solche, die den entsprechenden Bezugsresten physikalisch oder funktionell ähnlich sind, die beispielsweise eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit zur Ausbildung kovalenter oder Wasserstoffbrücken-Bindungen oder dergleichen aufweisen. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind solche, die die für eine akzeptierte Punktmutation in Dayhoff et al. (1978), 5 Atlas of Protein Sequence and Structure, Ergänzungsband 3, Kapitel 22 (Seiten 354–352), National Biomed. Res. Found., Washington, D. C. 20007, definierten Kriterien erfüllen, deren Lehren durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Beispiele für konservative Substitutionen schließen ein: Konservative Substitutionen schließen typischerweise die Substitution einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften ein, beispielsweise Substitution der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Der Begriff "konservative Variation" schließt ebenfalls die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Stammaminosäure ein, vorausgesetzt, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid gezüchtet werden, ebenfalls mit dem unsubstituierten Polypeptid immunreagieren. Wie hierin an anderer Stelle beschrieben ist, wird die Klasse an morphogenetischen Proteinen, die in der Erfindung von Nutzen sind, durch humanes osteogenetisches Protein (hOP-1) typifiziert. Andere morphogenetische Proteine, die in der Praxis der Erfindung von Nutzen sind, schließen morphogenetisch aktiven Formen von OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-9, DPP, Vgl, Vgr-1, 60A-Protein, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-7, BMP-10, BMP-11, BMP-13, BMP-15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP oder NEURAL und Aminosäuresequenvarianten hiervon ein. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform schließt das osteogenetische Protein irgendeines des folgenden ein: OP-1, OP-3, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9 und Aminosäuresequenzvarianten und Homologe hiervon, einschließlich von Spezieshomologen hierfür.
Veröffentlichungen, die diese Sequenzen offenbaren, ebenso wie deren chemische und physikalische Eigenschaften schließen folgende ein:
OP-1 and OP-2: U.S. Pat. Nr. 5 011 691, U.S. Pat. No. 5 266 683, Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2085–2093; OP-3: WO 94/10203 (PCT US93/10520); BMP-2, BMP-3, BMP-4: WO 88/00205, Wozney et al. (1988) Science 242: 1528–1534); BMP-5 and BMP-6: Celeste et al. (1991) PNAS 87: 9843–9847; Vgr-1: Lyons et al. (1989) PNAS 86: 4554–4558; DPP: Padgett et al. (1987) Nature 325: 81–84; Vg-1: Weeks (1987) Cell 51: 861–867; BMP-9: WO 95/33830 (PCT/US95/07084); BMP-10: WO 94/26893 (PCT/US94/05290); BMP-11: WO 94/26892 (PCT/US94/05288); BMP-12: WO 95/16035 (PCT/US94/14030); BMP-13: WO 95/16035 (PCT/US94/14030); GDF-1: WO 92/00382 (PCT/US91/04096) und Lee et al. (1991) PNAS 88: 4250–4254; GDF-8: WO 94/21681 (PCT/US94/03019); GDF-9: WO 94/15966 (PCT/US94/00685); GDF-10: WO 95/10539 (PCT/US94/11440); GDF-11: WO 96/01845 (PCT/US95/08543); BMP-15: WO 96/36710 (PCT/US96/06540); MP121: WO 96/01316 (PCT/EP95/02552); GDF-5 (CDMP-1, MP52): WO 94/15949 (PCT/US94/00657) und WO 96/14335 (PCT/US94/12814) und WO 93/16099 (PCT/EP93/00350); GDF-6 (CDMP-2, BMP-13): WO 95/01801 (PCT/US94/07762) und WO 96/14335 und WO 95/10635 (PCT/US94/14030); GDF-7 (CDMP-3, BMP-12): WO 95/10802 (PCT/US94/07799) und WO 95/10635 (PCT/US94/14030). In einer anderen Ausführungsform schließen nützliche Proteine biologisch aktive biosynthetische Konstrukte, einschließlich neuer biosynthetischer morphogenetischer Proteine und chimärer Proteine ein, die unter Verwendung von Sequenzen aus zwei oder mehreren bekannten Morphogenen entwickelt wurden. Siehe ebenfalls die biosynthetischen Konstrukte, offenbart im US-Patent Nr. 5 011 691, deren Offenbarung durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist (beispielsweise COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16).
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließen nützliche morphogenetische Proteine solche ein, bei denen die Aminosäuresequenzen eine Sequenz umfassen, die zumindest 70% Aminosäuresequenzhomologie oder – "ähnlichkeit", und vorzugsweise 80% Homologie oder Ähnlichkeit mit einem morphogenetischen Referenzprotein aufweisen, ausgewählt aus den vorhergehenden natürlich vorkommenden Proteinen. Das Bezugsprotein ist vorzugsweise humanes OP-1 und die Bezugssequenz hiervon ist die C-terminale 7-Cystein-Domäne, die in osteogenetisch aktiven Formen von humanem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NO: 5 vorliegt. Nützliche morphogenetische Proteine schließen demgemäß Allel-, phylogenetische Gegenstücke und andere Varianten der bevorzugten Referenzsequenz ein, gleichgültig ob natürlich vorkommend oder biosynthetisch hergestellt (beispielsweise einschließlich "Muteinen" oder "mutierten Proteinen"), ebenso wie Neumitglieder der allgemeinen morphogenetischen Familie von Proteinen, die diejenigen einschließt, die oben dargelegt und identifiziert wurden. Bestimmte besonders bevorzugte morphogenetische Polypeptide teilen zumindest eine 60%ige Aminosäure-Identität mit der bevorzugten Bezugssequenz von humanem OP-1, noch mehr bevorzugt zumindest 65% Aminosäure-Identität hiermit.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein Polypeptid, das unter dem Verdacht steht, ein funktionelles Äquivalent für ein Bezugsmorphogen-Polypeptid zu sein, hiermit aligned bzw. ausgerichtet, unter Verwendung des Verfahrens von Needleman et al. (1970), J. Mol., Biol. 48: 443–453, bequemerweise implementiert durch Computerprogramme wie beispielsweise das Align-Programm (DNAstar, Inc.). Wie oben erwähnt, werden interne Lücken und Aminosäureinsertionen in der Kandidatensequenz für die Zwecke der Berechnung der definierten Beziehung ignoriert, bequemerweise ausgedrückt als als Niveau einer Aminosäuresequenzhomologie oder -identität, zwischen den Kandidaten- und Referenzsequenzen. "Aminosäuresequenzhomologie" ist hierin so zu verstehen, dass sowohl eine Aminosäuresequenzidentität als auch -ähnlichkeit eingeschlossen ist. Homologe Sequenzen teilen identische und/oder ähnliche Aminosäurereste, wobei ähnliche Reste Konservierungs-Substitutionen für oder "erlaubte Punktmutationen" von entsprechenden Aminosäureresten in einer ausgerichteten Bezugssequenz sind. Somit ist eine Kandidatenpolypeptidsequenz, die 70% Aminosäuresequenzhomologie mit einer Bezugssequenz teilt, eine, bei der etwa 70% der ausgerichteten Reste mit den entsprechenden Resten einer Referenzsequenz identisch sind oder konservative Substitutionen hiervon sind. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform ist die Bezugssequenz OP-1.
1 betrifft die prozentuale Aminosäuresequenzhomologie (Ähnlichkeit) und die prozentuale Identität innerhalb der C-terminalen 7-Cystein-Domäne verschiedener repräsentativer Mitglieder der TGF-β-Familie unter Verwendung von OP-1 als Bezugssequenz. Die prozentualen Homologien, die in der Figur dargestellt sind, werden mit den Sequenzen berechnet, die im Wesentlichen folgend dem Verfahren von Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453, ausgerichtet wurden, berechnet unter Verwendung des Align-Programms (DNAstar, Inc.). Insertionen und Deletionen aus der Referenzmorphogensequenz, hier die C-terminale, biologisch aktive 7-Cystein-Domäne oder -Skelett von hOP-1, werden für die Zwecke der Berechnung ignoriert.
Wie es für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist, der die Sequenzen für die in 1 aufgelisteten Proteine überblickt, können signifikante Aminosäureaustausche aus der Referenzsequenz vorgenommen werden, während die morphogenetische Aktivität erhalten bleibt. Während beispielsweise die GDF-1-Proteinsequenz nur ungefähr 50% Aminosäureidentität mit der hOP-1-Sequenz, die hierin beschrieben ist, teilt, die GDF-1- Sequenz mehr als 70% Aminosäuresequenzhomologie mit der hOP-1-Sequenz teilt, wobei "Homologie" wie oben definiert ist. Darüber hinaus enthält GDF-1 einen 4-Aminosäure-Insert (Gly-Gly-Pro-Pro) zwischen den beiden Resten, die dem Rest 372 und 373 von OP-1 (SEQ ID) NO: 5) entsprechen. In ähnlicher Weise weist BMP-3 einen "Extra"-Rest auf, nämlich ein Valin, eingefügt zwischen den beiden Resten, die den Resten 385 und 386 von hOP-1 entsprechen (SEQ ID NO: 5). Weiterhin fehlt sowohl BMP-2 als auch BMP-4 der Aminosäurerest, der dem Rest 389 von OP-1 entspricht (SEQ ID NO: 5). Keine dieser "Abweichungen" von der Referenzsequenz scheint die biologische Aktivität zu stören.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Familie von morphogenetischen Polypeptiden, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, und Mitglieder hiervon, durch eine generische Aminosäuresequenz definiert. Beispielsweise nehmen die generische Sequenz 7 (SEQ ID NO: 1) und die generische Sequenz 8 (SEQ ID NO: 2), nachstehend offenbart, die Homologien auf, die zwischen den bevorzugten Mitgliedern der Proteinfamilie, die bis jetzt identifiziert wurden, geteilt werden, einschließlich zumindest OP-1, OP-2, OP-3, CBMP-2A, CBMP-2B, BMP-3, 60A, DPP, Vgl, BMP-5, BMP-6, Vgr-1 und GDF-1. Die Aminosäuresequenzen für diese Proteine sind hierin und/oder in der Technik beschrieben, wie oben zusammengefasst ist. Die generischen Sequenzen schließen sowohl die von diesen Sequenzen in der C-terminalen Domäne geteilte Aminosäureidentität ein, definiert durch die 6- und 7-Cystein-Skelette (generische Sequenzen 7 bzw. 8), ebenso wie alternative Reste für die variablen Positionen innerhalb der Sequenz. Die generischen Sequenzen stellen ein geeignetes Cystein-Skelett bereit, in dem sich inter- oder intramolekulare Disulfid-Brücken bilden können, und enthalten bestimmte entscheidende Aminosäuren, die wahrscheinlich die Tertiärstruktur der gefalteten Proteine beeinflussen. Zusätzlich ermöglichen die generischen Sequenzen ein zusätzliches Cystein an Position 36 (generische Sequenz 7) oder an Position 41 (generische Sequenz 8), wodurch die morphogenetisch aktiven Sequenzen von OP-2 und OP-3 umfasst sind. Generische Sequenz 7 (SEQ ID NO: 1)
wobei jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezifizierter Aminosäuren ausgewählt ist, die wie folgt definiert ist: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa bei Res. 2 = (Tyr oder Lys); Xaa bei Res. 3 = (Val oder Ile); Xaa bei Res. 4 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa bei Res. 6 = (Arg, Gln, Ser, Lys oder Ala); Xaa bei Res. 7 = (Asp oder Glu); Xaa bei Res. 8 = (Leu, Val oder Ile); Xaa bei Res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn oder Ser); Xaa bei Res. 12 = (Asp, Arg, Asn oder Glu); Xaa bei Res. 13 = (Trp oder Ser); Xaa bei Res. 14 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 15 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 16 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res. 18 = (Glu, Gln, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa bei Res. 19 = (Gly oder Ser); Xaa bei Res. 20 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln, Leu oder Gly); Xaa bei Res. 23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa bei Res. 26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln, Ala oder Ser); Xaa bei Res. 28 = (Glu, Lys, Asp, Gln oder Ala); Xaa bei Res. 30 = (Ala, Ser, Pro, Gln, Ile oder Asn); Xaa bei Res. 31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa bei Res. 33 = (Leu, Val oder Met); Xaa bei Res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr oder Pro); Xaa bei Res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala oder Lys); Xaa bei Res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa bei Res. 37 = (Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa bei Res. 38 = (Asn, Ser oder Lys); Xaa bei Res. 39 = (Ala, Ser, Gly oder Pro); Xaa bei Res. 40 = (Thr, Leu oder Ser); Xaa bei Res. 44 = (Ile, Val oder Thr); Xaa bei Res. 45 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa bei Res. 46 = (Gln oder Arg); Xaa bei Res. 47 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa bei Res. 48 = (Leu oder Ile); Xaa bei Res. 49 = (Val oder Met); Xaa bei Res. 50 = (His, Asn oder Arg); Xaa bei Res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa bei Res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val, Gly oder Leu); Xaa bei Res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly oder Phe); Xaa bei Res. 54 = (Pro, Ser oder Val); Xaa bei Res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val, Pro oder Lys); Xaa bei Res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ile oder His); Xaa bei Res. 57 = (Val, Ala oder Ile); Xaa bei Res. 58 = (Pro oder Asp); Xaa bei Res. 59 = (Lys, Leu oder Glu); Xaa bei Res. 60 = (Pro, Val oder Ala); Xaa bei Res. 63 = (Ala oder Val); Xaa bei Res. 65 = (Thr, Ala oder Glu); Xaa bei Res. 66 = (Gln, Lys, Arg oder Glu); Xaa bei Res. 67 = (Leu, Met oder Val); Xaa bei Res. 68 = (Asn, Ser, Asp oder Gly); Xaa bei Res. 69 = (Ala, Pro oder Ser); Xaa bei Res. 70 = (Ile, Thr, Val oder Leu); Xaa bei Res. 71 = (Ser, Ala oder Pro); Xaa bei Res. 72 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa bei Res. 74 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res. 75 = (Phe, Tyr, Leu oder His); Xaa bei Res. 76 = (Asp, Asn oder Leu); Xaa bei Res. 77 = (Asp, Glu, Asn, Arg oder Ser); Xaa bei Res. 78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr oder Asp); Xaa bei Res. 79 = (Ser, Asn, Asp, Glu oder Lys); Xaa bei Res. 80 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa bei Res. 82 = (Ile, Val oder Asn); Xaa bei Res. 84 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His, Arg oder Val); Xaa bei Res. 86 = (Tyr, Glu oder His); Xaa bei Res. 87 = (Arg, Gln, Glu oder Pro); Xaa bei Res. 88 = (Asn, Glu, Trp oder Asp); Xaa bei Res. 90 = (Val, Thr, Ala oder Ile); Xaa bei Res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gln oder Glu); Xaa bei Res. 93 = (Ala, Gly, Glu oder Ser); Xaa bei Res. 95 = (Gly oder Ala) and Xaa bei Res. 97 = (His oder Arg).
Generische Sequenz 8 (SEQ ID NO: 2) schließt die gesamte generische Sequenz 7 (SEQ ID NO: 1) ein und schließt zusätzlich die nachfolgende Sequenz (SEQ ID NO: 8) an ihrem N-Terminus ein.
SEQ ID NO: 8
Demgemäß ist, beginnend mit Rest 7, jedes "Xaa" in der generischen Sequenz 8 eine spezifizierte Aminosäure, definiert wie für die generische Sequenz 7, mit dem Unterschied, dass jede Restnummer, die für die generische Sequenz 7 beschrieben ist, in der generischen Sequenz um 5 verschoben ist. Somit betrifft "Xaa bei Res. 2 = (Tyr oder Lys)" in der generischen Sequenz 7 Xaa bei Res. 7 in der generischen Sequenz 8. In der generischen Sequenz 8 ist Xaa bei Res. 2 gleich (Lys, Arg, Ala oder Gln); Xaa bei Res. 3 = (Lys, Arg oder Met), Xaa bei Res. 4 = (His, Arg oder Gln); und Xaa bei Res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg, Pro, Thr oder Tyr).
In einer anderen Ausführungsform schließen nützliche osteogenetische Proteine solche ein, die durch die generischen Sequenzen 9 und 10 definiert sind (SEQ ID NO: 6 bzw. 7), hierin oben beschrieben. Insbesondere sind die generischen Sequenzen 9 und 10 zusammengesetzte Aminosäuresequenzen der nachfolgenden Proteine: humanes OP-1, humanes OP-2, humanes OP-3, humanes BMP-2, humanes BMP-3, humanes BMP-4, humanes BMP-5, humanes BMP-6, humanes BMP-8, humanes BMP-9, humanes BMP-10, humanes BMP-11, Drosophila 60A, Xenopus Vg-1, Seeigel-UNIVIN, humanes CDMP-1 (Maus-GDF-5), humanes CDMP-2 (Maus-GDF-6, humanes BMP-13), humanes CDMP-3 (Maus-GDF-7, humanes BMP-12), Maus-GDF-3, humanes GDF-1, Maus-GDF-1, Huhn-DORSALIN, Drosophila-dpp, Drosophila-SCREW, Maus-NODAL, Maus-GDF-8, humanes GDF-8, Maus-GDF-9, Maus-GDF-10, humanes GDF-11, Maus-GDF-11, humanes BMP-15 und Ratten-BMP-3b. Wie die generische Sequenz 7 nimmt die generische Sequenz 9 das C-terminale 6-Cystein-Skelett auf und nimmt wie die generische Sequenz 8, die generische Sequenz 10 das 7-Cystein-Skelett auf. Generische Sequenz 9 (SEQ ID NO: 6)
wobei jedes Xaa unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezifizierter Aminosäuren ausgewählt, die wie folgt definiert sind: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa bei Res. 1 = (Phe, Leu oder Glu); Xaa bei Res. 2 = (Try, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val oder Glu); Xaa bei Res. 3 = (Val, Ile, Leu oder Asp); Xaa bei Res. 4 = (Ser, Asp, Glu, Asn, oder Phe); Xaa bei Res. 5 (Phe oder Glu); Xaa bei Res. 6 = (Arg, Gln, Lys, Ser, Ala oder Asn); Xaa bei Res. 7 = (Asp, Glu, Leu, Ala oder Gln); Xaa bei Res. 8 = (Leu, Val, Met, Ile oder Phe); Xaa bei Res. 9 = (Gly, His oder Lys); Xaa bei Res. 10 = (Trp oder Met); Xaa bei Res. 11 = (Gln, Leu, His, Glu, Asn, Asp, Ser oder Gly); Xaa bei Res. 12 = (Asp, Asn, Ser, Lys, Arg, Glu oder His); Xaa bei Res. 13 = (Trp oder Ser); Xaa bei Res. 14 = (Ile, oder Val); Xaa bei Res. 15 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 16 = (Ala, Ser, Tyr oder Trp); Xaa bei Res. 18 = (Glu, Lys, Gln, Met, Pro, Leu, Arg, His oder Lys); Xaa bei Res. 19 = (Gly, Glu, Asp, Lys, Ser, Gln, Arg oder Phe); Xaa bei Res. 20 = (Tyr oder Phe); Xaa bei Res. 21 = (Ala, Ser, Gly, Met, Gln, His, Glu, Asp, Ley, Asn, Lys oder Thr); Xaa bei Res. 22 = (Ala oder Pro); Xaa bei Res. 23 = (Tyr, Phe, Asn, Ala oder Arg); Xaa bei Res. 24 = (Tyr, His, Glu, Phe oder Arg); Xaa bei Res. 26 = (Glu, Asp, Ala, Ser, Tyr, His, Lys, Arg, Gln oder Gly); Xaa bei Res. 28 = (Glu, Asp, Ley, Val, Lys, Gly, Thr, Ala oder Gln); Xaa bei Res. 30 = (Ala, Ser, Ile, Asn, Pro, Glu, Asp, Phe, Gln, oder Leu); Xaa bei Res. 31 = (Phe, Tyr, Leu, Asn, Gly oder Arg); Xaa bei Res. 32 = (Pro, Ser, Ala oder Val); Xaa bei Res. 33 = (Leu, Met, Glu, Phe oder Val); Xaa bei Res. 34 = (Asn, Asp, Thr, Gly, Ala, Arg, Leu oder Pro); Xaa bei Res. 35 = (Ser, Ala, Glu, Asp, Thr, Leu, Lys, Gln oder His); Xaa bei Res. 36 = (Tyr, His, Cys, Ile, Arg, Asp, Asn, Lys, Ser, Glu oder Gly); Xaa bei Res. 37 = (Met, Leu, Phe, Val, Gly oder Tyr); Xaa bei Res. 38 = (Asn, Glu, Thr, Pro, Lys, His, Gly, Met, Val oder Arg); Xaa bei Res. 39 = (Ala, Ser, Gly, Pro oder Phe); Xaa bei Res. 40 = (Thr, Ser, Leu, Pro, His oder Met); Xaa bei Res. 41 = (Asn, Lys, Val, Thr oder Gln); Xaa bei Res. 42 = (His, Tyr oder Lys); Xaa bei Res. 43 = (Ala, Thr, Leu oder Tyr); Xaa bei Res. 44 = (Ile, Thr, Val, Phe, Tyr, Met oder Pro); Xaa bei Res. 45 = (Val, Leu, Met, Ile oder His); Xaa bei Res. 46 = (Gln, Arg oder Thr); Xaa bei Res. 47 = (Thr, Ser, Ala, Asn oder His); Xaa bei Res. 48 = (Leu, Asn oder Ile); Xaa bei Res. 49 = (Val, Met, Leu, Pro oder Ile); Xaa bei Res. 50 = (His, Asn, Arg, Lys, Tyr oder Gln); Xaa bei Res. 51 = (Phe, Leu, Ser, Asn, Met, Ala, Arg, Glu, Gly oder Gln); Xaa bei Res. 52 = (Ile, Met, Leu, Val, Lys, Gln, Ala oder Tyr); Xaa bei Res. 53 = (Asn, Phe, Lys, Glu, Asp, Ala, Gln, Gly, Leu oder Val); Xaa bei Res. 54 = (Pro, Asn, Ser, Val oder Asp); Xaa bei Res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Lys, Arg, Ser, Gly, Thr, Gln, Pro oder His); Xaa bei Res. 56 = (Thr, His, Tyr, Ala, Ile, Lys, Asp, Ser, Gly oder Arg); Xaa bei Res. 57 = (Val, Ile, Thr, Ala, Leu oder Ser); Xaa bei Res. 58 = (Pro, Gly, Ser, Asp oder Ala); Xaa bei Res. 59 = (Lys, Leu, Pro, Ala, Ser, Glu, Arg oder Gly); Xaa bei Res. 60 = (Pro, Ala, Val, Thr oder Ser); Xaa bei Res. 61 = (Cys, Val oder Ser); Xaa bei Res. 63 = (Ala, Val oder Thr); Xaa bei Res. 65 = (Thr, Ala, Glu, Val, Gly, Asp oder Tyr); Xaa bei Res. 66 = (Gln, Lys, Glu, Arg oder Val); Xaa bei Res. 67 = (Leu, Met, Thr oder Tyr); Xaa bei Res. 68 = (Asn, Ser, Gly, Thr, Asp, Glu, Lys oder Val); Xaa bei Res. 69 = (Ala, Pro, Gly oder Ser); Xaa bei Res. 70 = (Ile, Thr, Leu oder Val); Xaa bei Res. 71 = (Ser, Pro, Ala, Thr, Asn oder Gly); Xaa bei Res. 2 = (Val, Ile, Leu oder Met); Xaa bei Res. 74 = (Tyr, Phe, Arg, Thr, Tyr oder Met); Xaa bei Res. 75 = (Phe, Tyr, His, Leu, Ile, Lys, Gln oder Val); Xaa bei Res. 76 = (Asp, Leu, Asn oder Glu); Xaa bei Res. 77 = (Asp, Ser, Arg, Asn, Glu, Ala, Lys, Gly oder Pro); Xaa bei Res. 78 = (Ser, Asn, Asp, Tyr, Ala, Gly, Gln, Met, Glu, Asn oder Lys); Xaa bei Res. 79 = (Ser, Asn, Glu, Asp, Val, Lys, Gly, Gln oder Arg); Xaa bei Res. 80 = (Asn, Lys, Thr, Pro, Val, Ile, Arg, Ser oder Gln); Xaa bei Res. 81 = (Val, Ile, Thr oder Ala); Xaa bei Res. 82 = (Ile, Asn, Val, Leu, Tyr, Asp oder Ala); Xaa bei Res. 83 = (Leu, Tyr, Lys oder Ile); Xaa bei Res. 84 = (Lys, Arg, Asn, Tyr, Phe, Thr, Glu oder Gly); Xaa bei Res. 85 = (Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu oder Val); Xaa bei Res. 86 = (Tyr, His, Glu oder Ile); Xaa bei Res. 87 = (Arg, Glu, Gln, Pro oder Lys); Xaa bei Res. 88 = (Asn, Asp, Ala, Glu, Gly oder Lys); Xaa bei Res. 89 = (Met oder Ala); Xaa bei Res. 90 = (Val, Ile, Ala, Thr, Ser oder Lys); Xaa bei Res. 91 = (Val oder Ala); Xaa bei Res. 92 = (Arg, Lys, Gln, Asp, Glu, Val, Ala, Ser oder Thr); Xaa bei Res. 93 = (Ala, Ser, Glu, Gly, Arg oder Thr); Xaa bei Res. 95 = (Gly, Ala oder Thr); Xaa bei Res. 97 = (His, Arg, Gly, Leu oder Ser). Weiterhin ist nach Res. 53 in rBMP-3b und mGDF-10 ein Ile; nach Res. 54 in GDF-1 ist ein T; nach Res. 54 in BMP-3 is ein V; nach Res. 78 in BMP-8 und Dorsalin ist ein G; alter Res. 37 in hGDF-1 ist Pro; Gly, Gly, Pro.
Generische Sequenz 10 (SEQ ID NO: 7) schließt die gesamte generische Sequenz 9 (SEQ ID NO: 6) und schließt zusätzlich die nachfolgende Sequenz (SEQ ID NO: 9) an ihrem N-Terminus ein:
SEQ ID NO: 9
Demgemäß ist, beginnend mit Res. 6, jedes "Xaa" einer generischen Sequenz 10 eine spezifizierte Aminosäure, definiert wie für die generische Sequenz 9 mit dem Unterschied, dass jede Restenummer, die für die generische Sequenz 9 beschrieben ist, um 5 in der generischen Sequenz 10 verschoben ist. Somit betrifft "Xaa bei Res. 1 = (Tyr, Phe, His, Arg, Thr, Lys, Gln, Val oder Glu)" in der generischen Sequenz 9 Xaa bei Res. 6 einer generischen Sequenz 10. In der generischen Sequenz 10 ist Xaa bei Res. 2 = (Lys, Arg, Gln, Ser, His, Glu, Ala oder Cys); Xaa bei Res. 3 = (Lys, Arg, Met, Lys, Thr, Leu, Tyr oder Ala); Xaa bei Res. 4 = (His, Gln, Arg, Lys, Thr, Leu, Val, Pro oder Tyr); und Xaa bei Res. 5 = (Gln, Thr, His, Arg, Pro, Ser, Ala, Gln, Asn, Tyr, Lys, Asp oder Leu).
Auf Grundlage des Alignments des natürlich vorkommenden Morphogens innerhalb der Definition der generischen Sequenz 10 sollte klar sein, dass Lücken und/oder Insertionen einer oder mehrerer Aminosäurereste toleriert werden können (ohne die biologische Aktivität in Frage zu stellen), zumindest zwischen oder einschließend die Reste 11–12, 42–43, 59–60, 68–69 und 83–84.
Wie oben erwähnt, weisen bestimmte gegenwärtig bevorzugte morphogenetische Polypeptidsequenzen, die in dieser Erfindung von Nutzen sind, mehr als 60% Identität, vorzugsweise mehr als 65% Identität mit der Aminosäuresequenz auf, die die bevorzugte Referenzsequenz von hOP-1 definiert. Diese speziell bevorzugten Sequenzen schließen Allel- und phylogenetische Gegenstückvarianten der OP-1- und OP-2-Proteine ein, einschließlich des Drosophila-60A-Proteins, ebenso wie die eng verwandten Proteine BMP-5, BMP-6 und Vgr-1. Demgemäß schließen in bestimmten besonders bevorzugten Ausführungsformen nützliche morphogenetische Proteine aktive Proteine ein, die zwei Polypeptid-Ketten innerhalb der generischen Aminosäuresequenz, die hierin als "OPX" (SEQ ID NO: 3) bezeichnet wird, ein, die das 7-Cystein-Skelett definiert und die Homologien zwischen mehreren identifizierten Varianten von OP-1 und OP-2 aufnimmt. Demgemäß ist jedes "Xaa" an einer vorgegebenen Position in OPX unabhängig von den Resten ausgewählt, die an der entsprechenden Position in der C-terminalen Sequenz von Maus- oder humanem OP-1 oder OP-2 auftreten. Insbesondere ist jedes "Xaa" unabhängig aus einer Gruppe einer oder mehrerer spezifizierter Aminosäuren, wie unten definiert, ausgewählt:
wobei Xaa bei Res. 2 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 3 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 11 = (Arg oder Gln); Xaa bei Res. 16 = (Gln oder Leu); Xaa bei Res. 19 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 23 = (Glu oder Gln); Xaa bei Res. 26 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res. 35 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res. 39 = (Asn oder Asp); Xaa bei Res. 41 = (Tyr oder Cys); Xaa bei Res. 50 = (Val oder Leu); Xaa bei Res. 52 = (Ser oder Thr); Xaa bei Res. 56 = (Phe oder Leu); Xaa bei Res. 57 = (Ile oder Met); Xaa bei Res. 58 = (Asn oder Lys); Xaa bei Res. 60 = (Glu, Asp oder Asn); Xaa bei Res. 61 = (Thr, Ala oder Val); Xaa bei Res. 65 = (Pro oder Ala); Xaa bei Res. 71 = (Gln oder Lys); Xaa bei Res. 73 = (Asn oder Ser); Xaa bei Res. 75 = (Ile oder Thr); Xaa bei Res. 80 = (Phe oder Tyr); Xaa bei Res. 82 = (Asp oder Ser); Xaa bei Res. 84 = (Ser oder Asn); Xaa bei Res. 89 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 91 = (Tyr oder His); and Xaa bei Res. 97 = (Arg oder Lys).
Bei einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen nützliche morphogenetisch aktive Proteine Polypeptidketten mit Aminosäuresequenzen auf, die eine durch eine Nukleinsäure codierte Sequenz umfassen, die unter niederstringenten, mittelstringenten oder hochstringenten Hybridisierungsbedingungen an DNA oder RNA hybridisiert, die Referenzmorphogensequenzen codieren, beispielsweise C-termminale Sequenzen, die die konservierten 7-Cystein-Domänen von OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 60A, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7 und dergleichen definieren. Wie hierin verwendet, sind Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen als Hybridisierung gemäß bekannter Techniken in 40% Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardts-Lösung und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht und Waschen in 0,1 X SSPE, 0,1% SDS bei 50°C definiert. Standard-Stringenzbedinungen sind in Texten zur Standard-Molekularbiologie-Klonierung wohl charakterisiert. Siehe beispielsweise Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Bd. 1 und 2 (D. N. Glover, Hsg., 1985), Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hsg., 1984): Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hsg., 1984); und B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Demgemäß können die in den Materialien und Verfahren dieser Erfindung nützlichen morphogenetischen Proteine Proteine einschließen, die irgendeine der oben beschriebenen Polypeptidketten umfassen, gleichgültig, ob sie aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert oder durch DNA-Rekombinations- oder andere Synthese-Techniken erzeugt wurden und schließen Allel- und phylogenetische Gegenstückvarianten dieser Proteine, ebenso wie biosynthetische Varianten (Muteine) hiervon und verschiedene trunkierte und Fusionskonstrukte ein. Deletions- oder Additionsmutanten werden ebenfalls als aktiv angesehen, einschließlich solcher, die die konservierte C-terminale 6- oder 7-Cystein-Domäne verändern, vorausgesetzt, das die Veränderung die Beziehung dieser Cysteine in der gefalteten Struktur nicht stört. Demgemäß werden solchen aktive Formen als den hierin spezifisch beschriebenen äquivalent betrachtet. Die Proteine können Formen einschließen, die variierende Glycosylierungsmuster, variierende N-Termini, eine Familie von verwandten Proteine mit Bereichen einer Aminosäuresequenzhomologie, und aktive trunkierte oder mutierte Formen nativer oder biosynthetischer Proteine einschließen, die durch Expression rekombinanter DNA in Wirtszellen erzeugt wird.
Die hierin betrachteten Knochen-morphogenetischen Proteine können aus intakter oder trunkierter cDNA oder aus synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und aufgereinigt, gespalten, erneut gefaltet und dimerisiert werden, so dass morphogenetisch aktive Zusammensetzungen gebildet werden. Gegenwärtig schließen bevorzugte Wirtszellen ohne Einschränkung Prokaryonten, einschließlich E. coli und Eukaryonten, einschließlich Hefe und Säugetierzellen, wie beispielsweise CHO-, COS- oder BSC-Zellen ein. Der Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass andere Wirtszellen vorteilhaft verwendet werden können. Ausführliche Beschreibungen der morphogenetischen Proteine, die in der Ausübung dieser Erfindung von Nutzen sind, schließen ein, wie diese herzustellen, zu verwenden und diese auf eine Aktivität zu testen sind, und dies ist in zahlreichen Veröffentlichungen offenbart, einschließlich solcher, die hierin aufgeführt sind, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Demgemäß kann der auf dem Gebiet tätige Gentechniker/Molekularbiologe unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtexten und -verfahren und durch das in der Technik verfügbare Wissen Gene aus cDNA oder genomischen Bibliotheken verschiedener unterschiedlicher biologischer Spezies isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen codieren oder DNAs aus Oligonucleotiden konstruieren, kann darauf diese in verschiedenen Typen von Wirtszellen exprimieren, einschließlich sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten, um große Mengen aktiver Proteine zu erzeugen, die zu Stimulierung von Nervengewebsmorphogenese in einem Säugetier in der Lage sind.
In weiteren Ausführungsformen kann als eine Alternative zur Verabreichung eines morphogenetischen Proteins eine wirksame Menge eines Mittels, das zum Stimulieren oder Induzieren einer erhöhten endogenen Morphogenexpression in einem Säugetier in der Lage ist, durch irgendeinen der hierin beschriebenen Wege verabreicht werden. Ein solcher Induktor eines Morphogens kann einem Säugetier beispielsweise durch systemische Verabreichung an das Säugetier oder durch direkte Verabreichung an das Nervengewebe bereitgestellt werden. Ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Induktoren (stimulierenden Mitteln), die zum Modulieren der Konzentrationen von endogenen Morphogenen in einem gegebenen Gewebe in der Lage sind, ist ausführlich in den veröffentlichten Anmeldungen WO 93/05172 und WO 93/05751 beschrieben, deren Lehren durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind. Kurz gesagt, können Kandidatenverbindungen durch Inkubation in vitro mit einem Testgewebe oder Zellen hiervon identifiziert und getestet werden oder mit einer kultivierten Zelllinie, die hiervon abgeleitet ist, für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, es der Verbindung zu ermöglichen, die Produktion, d. h. Expression und/oder Sekretion eines Morphogens zu beeinflussen, das durch die Zellen dieses Gewebes produziert wird. Geeignetes Gewebe oder kultivierte Zellen eines geeigneten Gewebes können vorzugsweise aus einem Nierenepithel, Ovargewebe, Fibroblasten und Osteoblasten ausgewählt werden. Bei noch weiteren Ausführungsformen kann ein Mittel, das als ein Agonist eines Morphogenrezeptors dient, anstelle des Morphogens selbst verabreicht werden. Ein solches Mittel kann als ein "Morphogen-Nachahmer", "Mimetikum" oder "Analogon" bezeichnet werden. Somit kann beispielsweise ein kleines Peptid oder ein anderes Molekül, das die Aktivität eines Morphogens bei der Bindung an und Aktivierung des Morphogenrezeptors nachahmen kann, als ein Äquivalent des Morphogens verwendet werden. Vorzugsweise ist der Agonist ein Vollagonist, doch können Teil-Morphogenrezeptoragonisten ebenfalls in vorteilhafter Weise verwendet werden. Verfahren zum Identifizieren solcher Agonisten sind in der Technik bekannt und schließen Assays für Verbindungen ein, die Morphogen-vermittelte Reaktionen induzieren (beispielsweise eine Induktion der Differenzierung metanephrischen Mesenchyms, die Induktion von Ersatzknochenbildung). Beispielsweise sind Verfahren zum Identifizieren von Morphogeninduktoren oder Agonisten von Morphogenrezeptoren in der US-Serien-Nr. 08/478 097, eingereicht am 07. Juni 1995 und US-Serien-Nr. 08/507 598, eingereicht am 26. Juli 1995 zu finden, deren Offenbarungen durch diese Bezugnahme mit aufgenommen sind.
Zuletzt können, wie unten beschrieben, in anderen Ausführungsformen Zellen in das Subjekt implantiert werden, das von einer ischämischen oder traumatischen Verletzung des Zentralnervensystems betroffen ist, um als Quelle eines Morphogens zu dienen und/oder um eine Quelle für zusätzliches funktionelles Nervengewebe bereitzustellen. Solche Zellen können Wirts- oder Donor-Zellen sein, die normalerweise Morphogene exprimieren, die so transformiert wurden, dass sie Morphogene exprimieren oder die mit Morphogenen behandelt wurden, so dass sie eine Differenzierung induzieren.
C. Säugetiere, die zur Behandlung geeignet sind
Als allgemeine Angelegenheit kann die vorliegende Erfindung auf die Behandlung irgendeines Säugetiersubjektes angewendet werden, das durch einen Schlaganfall oder eine traumatische Verletzung des Zentralnervensystems beeinträchtigt ist. Das Verfahren kann mit Säugetieren praktiziert werden, in denen der Schlaganfall oder die andere traumatische Verletzung sich zumindest 6 Stunden vor Beginn der Behandlung, beispielsweise 12, 24 oder 48 Stunden oder länger vor der Behandlung ereignete. Die Ausübung der Erfindung verleiht dem beeinträchtigten Säugetier einen signifikanten klinischen Vorteil dahingehend, als die Erfindung eine nachweisbare, klinisch signifikante Wiederherstellung einer Zentralnervensystem-Funktion, wie hierin definiert, mit sich bringt. Die Erfindung ist zur Behandlung jedes Primaten, vorzugsweise eines höheren Primaten wie beispielsweise eines Menschen, geeignet. Zusätzlich kann die Erfindung bei der Behandlung domestizierter Tiere verwendet werden, die als Begleiter des Menschen gehalten werden (beispielsweise Hunde, Katzen, Pferde), die einen signifikanten kommerziellen Wert aufweisen (beispielsweise Ziegen, Schweine, Schafe, Rinder, Sport- oder Zugtiere), die einen signifikanten wissenschaftlichen Wert aufweisen (beispielsweise gefangene freie Exemplare gefährdeter Spezies oder durch Inzucht erzeugte oder gentechnisch veränderte Tierstämme), oder Tiere, die in anderer Weise einen Wert aufweisen. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der medizinischen oder tiermedizinischen Wissenschaften ist darin trainiert zu erkennen, ob ein Tier von einer ischämischen oder traumatischen Verletzung des Zentralnervensystems beeinträchtigt ist oder nicht. Beispielsweise zeigen Routinetests und/oder klinische oder veterinärdiagnostische Auswertungen, ob das Tier eine Verschlechterung oder einen Verlust des Zentralnervensystems erworben hat (beispielsweise neurologische) Funktion. Klinische und nicht-klinische Indikationen, ebenso wie angehäufte Erfahrung bezüglich der offenbarten und anderer Verfahren zur Behandlung sollten den befähigten Fachmann in geeigneter Weise bei der Entscheidung informieren, ob ein vorgegebenes Individuum von einer ischämischen oder traumatischen Verletzung des Zentralnervensystems beeinträchtigt ist und ob irgendeine spezielle Behandlung für die Bedürfnisse des Subjekts am besten geeignet ist, einschließlich einer Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung.
D. Formulierungen und Verfahren der Behandlung
Die Morphogene, Morphogeninduktoren oder Agonisten von Morphogenrezeptoren der vorliegenden Erfindung können durch irgendeinen Weg verabreicht werden, der mit dem speziellen Morphogen, Induktor oder Agonisten, der verwendet wird, kompatibel ist. Somit kann, wie geeignet, die Verabreichung oral oder parenteral sein, einschließlich intravenöser und intraperitonealer Verabreichungswege. Zusätzlich kann die Verabreichung durch periodische Injektionen eines Bolus des Morphogens, Induktors oder Agonisten erfolgen oder kann kontinuierlicher durch intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung aus einem Reservoir durchgeführt werden, das extern ist (beispielsweise ein i.v.-Beutel) oder intern ist (beispielsweise ein bioerodierbares Implantat oder eine Kolonie implantierter, Morphogenproduzierender Zellen).
Die therapeutischen Mittel der Erfindung (d. h. Morphogene, Morphogeninduktoren oder Agonisten von Morphogenrezeptoren) können einem Individuum durch geeignete Mittel verabreicht werden, direkt (beispielsweise lokal, wie durch Injektion, Implantation oder topische Verabreichung an einen Gewebsort) oder systemisch (beispielsweise parenteral oder oral). Wo das Mittel parenteral, beispielsweise intravenös, subkutan, intramolekular, ophthalmisch, intraperitoneal, intramuskulär, bukal, rektal, vaginal, intraorbital, intrazerebral, intracranial, intraspinal, intraventrikulär, intrathekal, intracisternal, intracapsulär, intranasal oder durch Aerosol-Verabreichung verabreicht werden soll, bildet das Mittel vorzugsweise den Teil einer wässrigen Lösung. Die Lösung ist physiologisch verträglich, so dass zusätzlich zur Abgabe des erwünschten Mittels an den Patienten die Lösung ansonsten den Elektrolyt- und/oder Volumenhaushalt des Patienten nicht nachteilig beeinflusst. Das wässrige Medium für das Mittel kann somit normale bzw. physiologische Salzlösung umfassen (beispielsweise 9,85% NaCl, 0,15 M, pH 7–7,4).
Falls es erwünscht ist, kann ein vorgegebenes Morphogen oder ein anderes Mittel durch Verbindung mit einem geeigneten Molekül löslicher gemacht werden. Beispielsweise hat eine Verbindung des reifen Morphogen-Dimers mit der Pro-Domäne die Pro-Form des Morphogens zur Folge, die typischerweise in physiologischen Lösungen löslicher oder dispergierbarer als die entsprechende reife Form ist. Es wird tatsächlich angenommen, dass endogene Morphogene in dieser Form in den Säugetierkörper transportiert (beispielsweise sezerniert und im Kreislauf geführt) werden. Diese lösliche Form des Proteins kann aus einem Kulturmedium Morphogen-sezernierender Säugetierzellen gewonnen werden, beispielsweise durch Zellen, die mit einer Nukleinsäure transfiziert werden, die das Morphogen codiert, und die zu deren Expression befähigt sind. Alternativ kann eine lösliche Spezies durch Komplexieren des reifen, morphogenetisch aktiven Polypeptid-Dimers (oder eines aktiven Fragmentes hiervon) mit einer Morphogen-Prodomäne oder einem Löslichkeits-steigerndem Bruchstück hiervon komplexiert werden. Die Löslichkeits-erhöhenden Prodomän-Fragmente können jedes N-terminale, C-terminale oder interne Fragment der Proregion eines Elements der Morphogenfamilie sein, die mit dem reifen Polypeptid-Dimer komplexiert, um Stabilität und/oder Unlöslichkeit des sich ergebenden nicht-kovalenten oder kovalenten Komplexes zu erhöhen. Typischerweise sind nützliche Fragmente solche, die an der proteolytischen Stelle Arg-Xaa-Xaa-Arg gespalten werden. Eine ausführliche Beschreibung von löslichen Komplexformen morphogenetischer Proteine, einschließlich wie diese herzustellen, zu testen und zu verwenden sind, ist in der WO 94/03600 beschrieben (PCT/US93/07189). Im Falle von OP-1 schließen nützliche Prodomän-Fragmente die intakte Pro-Domäne (Reste 30-292) und die Fragmente 48 bis 292 oder 158 bis 292 ein, alle von SEQ ID NO: 5. Ein weiteres Molekül, das zur Steigerung der Löslichkeit und insbesondere für orale Verabreichungen von Nutzen ist, ist Kasein. Beispielsweise erhöht der Zusatz von 0,2% Kasein die Löslichkeit der reifen aktiven Formen von OP-1 um 80%. Weitere Bestandteile, die in der Milch und/oder verschiedenen Serumproteinen zu finden sind, können ebenfalls von Nutzen sein.
Nützliche Lösungen zur parenteralen Verabreichung können durch irgendeines der in der pharmazeutischen Technik wohl bekannten Verfahren hergestellt werden, die beispielsweise in Remingtons Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., Hrsg.), Mack Publishing, 1990, beschrieben sind. Formulierungen für die therapeutischen Mittel der Erfindung können beispielsweise Polyalkylenglycole, wie beispielsweise Polyethylenglycol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphthalene und dergleichen einschließen. Formulierungen zur direkten Verabreichungen können insbesondere Glycerol oder andere Zusammensetzungen mit hoher Viskosität einschließen, um dabei behilflich zu sein, das Mittel am erwünschten Ort zu halten. Biokompatible, vorzugsweise bioresorbierbare Polymere, die beispielsweise Hyaluronsäure, Collagen, Tricalciumphosphat, Polybutyrat, Lactid und Glycolid-Polymere und Lactid/Glycolid-Copolymere einschließen, können nützliche Trägerstoffe sein, um die Freisetzung des Mittels in vivo zu steuern. Weitere potentiell nützliche parenterale Abgabesysteme für diese Mittel schließen Ethylenvinylacetat-Copolymerteilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen ein. Zubereitungen zur Inhalationsverabreichung enthalten als Trägermittel beispielsweise Lactose oder können wässrige Lösungen sein, die beispielsweise Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat und Desoxycholat enthalten oder ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen oder als Gel, das intranasal aufgebracht werden soll. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können ebenfalls Glycocholat zur bukalen Verabreichung, Methoxysalicylat zur rektalen Verabreichung oder Zitronensäure zur vaginalen Verabreichung einschließen. Suppositorien zur rektalen Verabreichung können ebenfalls durch Vermischen des Morphogens, Induktors oder Agonist mit einem nicht-reizenden Trägerstoff, wie beispielsweise Kakaobutter oder anderen Zusammensetzungen, hergestellt werden, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur flüssig sind.
Formulierungen zur topischen Verabreichung an die Hautoberfläche können durch Dispergieren des Morphogens, Induktors oder Agonist mit einem dermatologisch verträglichen Träger, wie beispielsweise einer Lotion, Creme, Salbe oder Seife, hergestellt werden. Besonders nützlich sind Träger, die zur Bildung eines Films oder einer Schicht über der Haut in der Lage sind, um die Aufbringung zu lokalisieren oder ein Entfernung zu hemmen. Zur topischen Verabreichung an Oberflächen von innerem Gewebe kann das Mittel in einem flüssigen Gewebs-Klebstoff oder einer anderen Substanz dispergiert werden, von der bekannt ist, dass sie die Adsorption an eine Gewebsoberfläche steigert. Beispielsweise können Hydroxypropylcellulose oder Fibrinogen/Thrombin-Lösungen in vorteilhafter Weise verwendet werden. Alternativ können Gewebs-beschichtende Lösungen, wie beispielsweise Pektin enthaltende Zubereitungen, verwendet werden.
Alternativ können die hierin beschriebenen Mittel oral verabreicht werden. Eine orale Verabreichung von Proteinen als Therapeutika wird im Allgemeinen nicht praktiziert, weil die meisten Proteine durch Verdauungsenzyme und Säuren im Säugetierverdauungssystem leicht abgebaut werden, bevor sie in den Blutstrom absorbiert werden können. Jedoch sind die hierin beschriebenen Morphogene typischerweise Säure-stabil und Protease-beständig (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 968 590). Zusätzlich wurde zumindest ein Morphogen, nämlich OP-1, in Brustdrüsenextrakt, Kolostrum und 57-Tage-Milch identifiziert. Darüber hinaus ist OP-1, aufgereinigt aus Brustdrüsenextrakt, morphogenetisch aktiv und ist ebenfalls im Blutstrom nachzuweisen. Die mütterliche Verabreichung über die aufgenommene Milch kann ein natürlicher Abgabeweg von Proteinen der TGF-β-Superfamilie sein. Letterio et al., (1994) Science 264: 1936–1938, berichten, dass TGF-β in der murinen Milch vorliegt, und dass radiomarkiertes TGF-β durch die Magenschleimhaut säugender Kleinkinder absorbiert wird. Markiertes, aufgenommenes TGF-β erscheint rasch in intakter Form in den Körpergeweben von Jugendlichen, einschließlich der Lunge, dem Herz und der Leber. Zuletzt ist das Morphogen in löslicher Form, beispielsweise das reife Morphogen, das mit der Pro-Domäne in Verbindung steht, morphogenetisch aktiv. Diese Erkenntnisse, ebenso wie diejenigen, die in den Beispielen nachstehend offenbart sind, zeigen, dass die orale und parenterale Verabreichung mögliche Mittel zur Verabreichung von Proteinen der TGF-β-Superfamilie, einschließlich der Morphogene, an ein Individuum sind. Zusätzlich ist die in der Milch zu findende Morphogen-Form (und Brustdrüsenextrakt und Kolostrum) leicht löslich, wohingegen die reifen Formen bestimmter Morphogene, die hierin beschrieben sind, typischerweise kaum löslich sind, vielleicht durch Verbindung der reifen, morphogenetisch aktiven Form mit einem Teil oder der gesamten Pro-Domäne der exprimierten, Volle-Länge-Polypeptid-Sequenz und/oder durch Verbindung mit einem oder mehreren Milchbestandteilen. Demgemäß können die hierin bereitgestellten Verbindungen ebenfalls mit Molekülen verbunden werden, die zu deren Löslichkeit in vitro oder in vivo in der Lage sind.
Die hierin bereitgestellten Verbindungen können ebenfalls mit Molekülen verbunden werden, die zum Richten bzw. zum Ins-Ziel-Fassen der Morphogene, Induktoren oder Agonisten zum erwünschten Gewebe in der Lage sind. Beispielsweise kann ein Antikörper, Antikörperfragment oder ein anderes Bindungsprotein, das spezifisch mit einem Oberflächenmolekül auf Zellen des erwünschten Gewebes wechselwirkt, verwendet werden. Nützliche Targeting-Moleküle können entwickelt werden, beispielsweise unter Verwendung der Einketten-Bindungsstellentechnologie, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5 091 513 offenbart ist. Targeting-Moleküle können mit dem Morphogen, Induktor oder Agonisten kovalent oder nicht-kovalent verbunden sein.
Wie durch den Fachmann auf dem Gebiet erkannt wird, enthalten die formulierten Zusammensetzungen therapeutisch wirksame Mengen des Morphogens, Morphogeninduktors oder Agonisten der Morphogenrezeptoren. Das heißt, sie enthalten eine Menge, die geeignete Konzentrationen des Mittels an das beeinträchtigte Nervensystemgewebe für eine Zeitspanne bereitstellt, die ausreichend ist, um eine nachweisbare Wiederherstellung einer Funktion des zentralen Nervensystems zu stimulieren, bis zu und einschließlich einer vollständigen Wiederherstellung dessen. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt werden wird, variieren diese Konzentrationen abhängig von mehreren Faktoren, einschließlich der biologischen Wirksamkeit des ausgewählten Mittels, der chemischen Eigenschaften (beispielsweise Hydrophobie) des speziellen Mittels, dessen Zubereitung, einschließlich eines Gemisches mit einem oder mehreren Trägerstoffen, dem Verabreichungsweg und der ins Auge gefassten Behandlung, einschließlich der Frage, ob der aktive Inhaltsstoff direkt an eine Gewebsstelle verabreicht wird oder ob er systemisch verabreicht werden wird. Die bevorzugte zu verabreichende Dosierung hängt ebenfalls wahrscheinlich von solchen Variablen ab wie dem Zustand der erkrankten oder geschädigten Gewebe und dem Gesamtgesundheitszustand des speziellen Säugetiers. Als allgemeine Regel sind einzelne, tägliche, zweimal wöchentliche oder wöchentliche Dosierungen von 0,00001 bis 1000 mg Morphogen ausreichend, wobei 0,0001 bis 100 mg bevorzugt werden und 0,001 bis 10 mg noch mehr bevorzugt sind. Alternativ kann eine einzige, tägliche, zweimal wöchentliche oder wöchentliche Dosierung von 0,01 bis 1000 μg/kg Körpergewicht, besonders bevorzugt 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht in vorteilhafter Weise verwendet werden. Die vorliegende wirksame Dosis kann in einer Einzeldosis oder in einer Vielzahl (2 oder mehr) von Ratendosierungen verabreicht werden, wie es erwünscht ist oder wie es unter den speziellen Umständen als geeignet erscheint. Eine Bolus-Injektion oder eine diffundierbare Infusionsformulierung kann verwendet werden. Falls es erwünscht ist, wiederholte oder häufige Infusionen zu erleichtern, kann die Implantation eines semi-permantenten Stents (beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intracisternal oder intracapsulär) ratsam sein. In Beispiel 2 nachstehend brachte eine intracisternale Verabreichung von 6 bis 240 μg/kg des Referenzmorphogens (hOP-1) in klarer Weise nachweisbare Wiederherstellungsgrade von einer verlorengegangenen oder verschlechterten Zentralnervensystem-Funktion mit sich. Es sollte erwähnt werden, dass keine offensichtlichen Morphogen-induzierten pathologischen Läsionen entstehen, wenn reifes Morphogen (beispielsweise OP-1, 20 mg) täglich normal wachsenden Ratten für 21 aufeinanderfolgende Tage verabreicht wird. Darüber hinaus erzeugen 10 mg systemische Injektionen des Morphogens (beispielsweise von OP-1), die täglich für 10 Tage normalen neugeborenen Mäusen injiziert wurden, keine groben Abnormalitäten.
Die Morphogene, Induktoren oder Agonisten der Erfindung können natürlich alleine oder in Kombination mit anderen Molekülen injiziert werden, von denen bekannt ist, dass sie in der Behandlung der hierin beschriebenen Zustände von Vorteil sind. Beispielsweise können wohl bekannte Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere bioaktive Mittel ebenfalls mit dem Morphogen verabreicht werden.
Somit können verschiedene bekannte Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise NGF, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-α und TGF-β, ebenso wie Enzyme, Enzyminhibitoren, Antioxidantien, antiinflammatorische Mittel, freie Radikalfänger-Mittel, Antibiotika und/oder Chemoattraktanz/chemotaktische Faktoren in die vorliegende verabreichbare Morphogen-Formulierung eingeschlossen werden. Um die Aufnahme durch das Gewebe des Zentralnervensystems zu erleichtern, können die Morphogene, Induktoren oder Agonisten, die hierin bereitgestellt sind, derivatisiert werden oder an eine lipophile Komponente oder an eine Substanz gebunden werden, die aktiv über die Blut-Hirn-Barriere hinweg transportiert wird.
Die Ausübung der Erfindung, einschließlich zusätzlich bevorzugter Aspekte und Ausführungsformen hiervon, wird durch die nachfolgenden Beispiele noch vollständiger verständlich sein, die hierin lediglich für Veranschaulichungszwecke präsentiert sind, und sollten nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise einschränkend aufgefasst werden.
Beispiel 1: Herstellung löslicher Morphogenproteine-Lösungen für eine in-vivo-Verabreichung
A. Wässrige Lösungen
Während die hierin definierten reifen dimeren morphogenetischen Proteine typischerweise im Wesentlichen nur wenig in physiologischen Puffern löslich sind, können diese zur Bildung injizierbarer Lösungen solubilisiert werden. Eine beispielhafte wässrige Lösung, die ein Morphogen enthält, kann beispielsweise durch Lösen oder Dispergieren des Morphogens in 50% Ethanol hergestellt werden, der Acetonitril 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) oder 0,1% HCl, oder in einem äquivalenten Lösungsmittel enthält. Ein Volumen der sich ergebenden Lösung wird dann beispielsweise zu 10 Volumina Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) zugesetzt, die weiterhin 0,1 bis 0,2% humanes Serumalbumin (HSA) oder ein ähnliches Trägerprotein einschließen kann. Die sich ergebende Lösung wird vorzugsweise umfassend gevortexed, um eine physiologisch verträgliche Morphogen-Zubereitung zu erzeugen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Morphogen, einschließlich OP-1, durch Reduzieren des pHs der Lösung solubilisiert werden. In einer gegenwärtig bevorzugten Formulierung wird das Protein in 0,2 mM Acetatpuffer, pH 4,5, der 5% Mannitol enthält, solubilisiert, um die Lösung isotonischer zu machen. Weitere Standardmittel zur Erzeugung physiologisch verträglicher Formulierungen liegen innerhalb des Fachwissens.
B. Lösliche Komplex-Formulierungen
Eine weitere, gegenwärtig bevorzugte Form des Morphogens, das hierin verwendet wird und das eine verbesserte Löslichkeit in wässrigen Lösungen aufweist, ist ein dimeres morphogenetisches Protein, das zumindest die C-terminale 7-Cystein-Domäne umfasst, die für die Morphogenfamilie charakteristisch ist, komplexiert mit einem Peptid, das eine Pro-Region eines Mitglieds der Morphogenfamilie umfasst, oder ein Löslichkeits-steigerndes Fragment hiervon, oder eine Allel- oder Spezies- oder andere Sequenzvariante hiervon. Das die Löslichkeit steigernde Fragment kann irgendein N-terminales oder C-terminales Fragment der Pro-Region eines Mitglieds der Morphogenfamilie sein, das mit dem reifen Polypeptid-Dimer komplexiert, um die Stabilität des löslichen Komplexes zu steigern. Vorzugsweise wird das dimere morphogenetische Protein mit zwei Proregion-Peptiden komplexiert.
Wie oben und in der veröffentlichten Anmeldung WO 94/03600, deren Lehren durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind, beschrieben wurde, kann der lösliche Komplex aus den Zellkulturmedien (oder eine Körperflüssigkeit) unter geeigneten Bedingungen isoliert werden. Alternativ kann der Komplex in vitro formuliert werden.
Lösliche Morphogenkomplexe können aus konditionierten Medien unter Verwendung eines einfachen, Dreischrittchromatographie-Protokolls isoliert werden, das in Abwesenheit von denaturierenden Stoffen durchgeführt wird. Das Protokoll bzw. die Vorschrift schließt ein Laufenlassen des Mediums bzw. der Medien (oder der Körperflüssigkeit) über eine Affinitätssäule, gefolgt von Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographien ein, die im Allgemeinen in der WO 94/03600 beschrieben sind. Die unten beschriebene Affinitätssäule ist eine Zn-IMAC-Säule. Das Beispiel verwendete OP-1 und soll nicht darauf beschränkt sein. Die vorliegende Vorschrift weist allgemeine Anwendbarkeit für die Aufreinigung einer Vielzahl von Morphogenen auf, von denen allen angenommen wird, dass sie unter Verwendung nur geringer Modifikationen der nachstehend beschriebenen Vorschriften isolierbar sind. Ein alternatives Protokoll, das ebenfalls als nützlich ins Auge gefasst wird, schließt eine Immunaffinitätsäule ein, die unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt wird und beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern, die für eine gegebene Morphogenprodomäne spezifisch sind (komplexiert, beispielweise an eine Protein-A-konjugierte Sepharose-Säule). Vorschriften zur Entwicklung von Immunaffinitätsäulen sind in der Technik wohl beschrieben (siehe beispielsweise Guide to Protein Purification, M. Deutscher, Hrsg. Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere die Abschnitte VII und XI hiervon).
In diesem Beispiel wurde OP-1 in Säugetier-(CHO, Chinese hamster ovary = chinesische Hamsterovar-)Zellen, wie in der Technik beschrieben, exprimiert (siehe beispielsweise internationale Anmeldung US 90/05903 (WO 91/05802). Die CHO-Zell-konditionierten Medien, die 0,5% FBS enthalten, werden anfänglich unter Verwendung einer immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) aufgereinigt. Der lösliche OP-1-Komplex aus konditionierten Medien bindet hier selektiv an das Zn-IMAC-Harz und eine hohe Konzentration an Imidazol (50 mM Imidazol, pH 8,0) ist für die effektive Elution des gebundenen Komplexes erforderlich. Das Zn-IMAC-aufgereinigte lösliche OP-1 wird als nächstes auf eine S-Sepharose-Kationen-Austauschsäule aufgebracht, die in 20 mM NaPO₄ (pH 7,0) mit 50 mM NaCl äquilibriert wurde. Das Protein wird dann auf eine Sephacryl S-200HR-Säule aufgebracht, die in TBS äquilibriert wurde. Unter Verwendung des im Wesentlichen selben Protokolls können lösliche Morphogene ebenfalls von einer oder mehreren Körperflüssigkeiten isoliert werden, einschließlich Serum, zerebrospinaler Flüssigkeit oder peritonealer Flüssigkeit.
Der lösliche OP-1-Komplex eluiert mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 110 kDa. Dies stimmt gut mit der vorhergesagten Zusammensetzung des löslichen OP-1-Komplexes mit einem reifen OP-1-Dimer (35–36 kDa) überein, das mit zwei Pro-Domänen (39 kDa jeweils) assoziiert ist. Die Reinheit des Endkomplexes kann durch Laufenlassen der geeigneten Fraktion in einem reduzierten 15%-Polyacrylamidgel verifiziert werden.
Als eine Alternative zur Aufreinigung löslicher Komplexe aus Kulturmedien oder einer Körperflüssigkeit können lösliche Komplexe aus gereinigten Pro-Domänen und reifen dimeren Spezies formuliert werden. Eine erfolgreiche Komplexbildung erfordert anscheinend die Bindung der Bestandteile unter denaturierenden Bedingungen, die ausreichend sind, um die gefaltene Struktur dieser Moleküle zu entspannen, ohne die Disulfid-Brücken zu beeinträchtigen. Vorzugsweise ahmen die Denaturierungsbedingungen die Umgebung eines intrazellulären Vesikels ausreichend nach, so dass die gespaltene Pro-Domäne eine Möglichkeit hat, sich mit der reifen dimeren Spezies unter entspannten Faltungsbedingungen zu verbinden. Die Konzentration an Denaturierungsmittel in der Lösung wird dann in einer kontrollierten, vorzugsweise schrittweisen Art gesenkt, um eine richtige erneute Faltung des Dimers und von Pro-Regionen zu ermöglichen, wohingegen die Verbindung der Pro-Domäne mit dem Dimer aufrechterhalten wird. Nützliche Denaturantien schließen 4–6 M Urea oder Guanidinhydrochlorid (GuHCl) in gepufferten Lösungen von pH 4–10, vorzugsweise 6–8, ein. Der lösliche Komplex wird dann durch kontrollierte Dialyse oder Verdünnung zu einer Lösung gebildet, die eine Enddenaturierungsmittel-Konzentration von weniger als 0,1–2 M Urea oder GuHCl aufweist, vorzugsweise 1–2 M Urea oder GuHCl, die dann vorzugsweise zu einem physiologischen Puffer verdünnt werden kann. Proteinaufreinigungs/Renaturierungsverfahren und Erwägungen sind in der Technik wohl beschrieben und Details bezüglich der Entwicklung einer geeigneten Renaturierungsvorschrift können in einfacher Weise durch den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Ein nützlicher Text bezüglich dieses Gegenstandes ist Guide to Protein Purification, M. Deutscher, Hrsg. Academic Press, San Diego, 1990, insbesondere Abschnitt V. Die Komplexbildung kann ebenfalls durch Zusatz eines oder mehrerer Chaperon-Proteine unterstützt werden.
Die Stabilität des hoch gereinigten löslichen Morphogenkomplexes in einem physiologischen Puffer, beispielsweise Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) kann durch mehrere Mittel gesteigert werden, einschließlich irgendeiner oder mehrerer dreier Klassen von Zusatzstoffen bzw. Additiven. Diese Additive schließen basische Aminosäuren ein (beispielsweise L-Arginin, Lysin und Betain); an nicht ionische Detergentien (beispielsweise Tween 80 oder NonIdet P-120); und Trägerproteine (beispielsweise Serumalbumin und Casein). Nützliche Konzentrationen dieser Additive schließen 1–100 mM, vorzugsweise 10–70 mM, einschließlich 50 mM basische Aminosäure ein; 0,01–1,0%, vorzugsweise 0,05–0,2%, einschließlich 0,1% (V/V) nicht-ionisches Detergens bzw. Tensid; und 0,01–1,0%, vorzugsweise 0,05–0,2%, einschließich 0,1% (G/V) Trägerprotein.
Beispiel 2: Schlaganfallmodell, das den chirurgischen Verschluss der Gehirnarterie einschließt
Das mittlere Cerebralarterien (MCA)-Okklusionsmodell ist ein wohl akzeptiertes Modell für eine fokale ischämische Episode oder für einen Schlaganfall (Gotti et al. (1990), Brain Res. 522: 290–307). Die fokale Ischämie wird durch Obstruktion der Blutströmung durch die MCA erzeugt, was eine Infarktion des Gehirnortes, der von dieser Arterie versorgt wird, zur Folge hat. Das MCA-Modell ergibt für die Fähigkeit oder Leistungsfähigkeit von Arzneistoffen, beispielsweise von Morphogen, eine angemessene Vorhersage, um die funktionelle Erholung bzw. Wiederherstellung bei Menschen, bei denen Zentralnervensystem-Gewebe aufgrund eines Schlaganfalls geschädigt oder verloren ging, zu ändern. Beispielsweise wird das MCA-Modell als ausreichend vorhersagekräftig für die Arzneistoffwirksamkeit zur Wiederherstellung oder nachweisbaren Verbesserung der motorischen Koordination, der Sinneswahrnehmung, der Sprachfähigkeit oder einer anderen Zentralnervensystem-Funktion angesehen, die natürlicherweise Gewebe innerhalb des Territoriums der MCA zugeschrieben wird.
Tiere, die beginnend 24 Stunden nach Verschluss der MCA mit OP-1 behandelt werden, verhielten sich in einer Vielzahl von funktionellen/Verhaltenstests signifikant besser als Träger-behandelte Tiere, wie nachstehend beschrieben wird.
I. Chirurgisches Okklusionsverfahren
Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g (Charles River). Für chirurgische Verfahren wurden die Tiere mit 2 % Halothan in 70% NO₂/30% O₂ anästhetisiert. Die Schwanzarterie wurde kanüliert, um Blutgase und Blutglukose zu überwachen. Die Körpertemperatur wurde unter Verwendung einer rektalen Sonde gemessen und wurde mit einem Heizkissen bei 37 + 0,5°C gehalten. Die proximale rechte mittlere Cerebralarterie (MCA) wurde permanent unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Tamura et al. (1981, J. Cereb. Blood Flow Metab. 1: 53–60) verschlossen. Kurz gesagt, wurde die proximale MCA transcranial ohne Entfernung des zygomatischen Bogens oder durch Umsetzen des Gesichtsnerven exponiert. Die Arterie wurde dann unter Verwendung eines bipolaren Mikrokoagulators aus der Nähe des olfaktorischen Traktes zur unteren Gehirnvene elektrokoaguliert und wurde dann durchschnitten (Bederson, et al. (1986), Stroke 17: 472–476). Die Ratten wurden beobachtet, als sie das Bewusstsein wiedererlangten und wurden dann in ihre Heimatkäfige verbracht. Cefazolinnatrium (40 mg/kg, i. p.), ein Antibiotikum, wurde allen Tieren am Tag vor und gerade nach der Schlaganfall-Chirurgie verabreicht, um einer Infektion vorzubeugen. Während der Schlaganfall-Chirurgie existierten keine Unterschiede bezüglich der Konzentrationen an Blutgasen oder Glucose zwischen den Tieren, die danach OP-1 oder eine Träger-Behandlung empfingen.
II. Verabreichung des Morphogens
Tiere in der Behandlungsgruppe empfingen OP-1 intracisternal in einer Dosis von 1 oder 10 μg/Injektion. Kontrolltiere empfingen Trägerlösungen, denen OP-1 fehlte, jedoch mit allen anderen Bestandteilen in äquivalenten Endkonzentrationen.
Um die Injektion zu verabreichen, wurden die Tiere mit Halothan in 70% NO₂/30% O₂ anästhetisiert und in einem stereotaktischen Rahmen angeordnet. Das Verfahren für eine intracisternale Injektion von OP-1 enthaltenden Lösungen oder nur Trägerstoff enthaltenden Lösungen war identisch. Unter Verwendung einer aseptischen Technik wurden OP-1 (1 oder 10 μg/Injektion) oder ein äquivalentes Volumen von Träger durch perkutane Injektion (10 μl/Injektion) in die Cisterna magna unter Verwendung einer Hamilton-Spritze, die mit einer 26-Zoll-Nadel ausgestattet war (Yamada et al. (1991), J. Cereb. Blood Flow Metab. 11: 472– 478) eingebracht. Vor jeder Injektion wurden 1–2 μl cerebrospinaler Flüssigkeit (cerebrospinal fluid = CSF) durch die Hamilton-Spritze zurückgezogen, um die Nadelanordnung im Subarachnoidalraum zu verifizieren. Vorläufige Studien zeigten, dass ein Farbstoff, 1% Evans-Blau, auf diese Weise verabreicht, frei durch die basalen Cisternen und über die Hirnrinde innerhalb 1 Stunde nach Injektion diffundierte. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip entweder der OP-1-Behandlungsgruppe oder der Trägerbehandlungsgruppe zugeordnet.
In einer ersten Studie wurden intracisternale Injektionen (10 μg/Injektion OP-1 oder Träger) zweimal wöchentlich für 4 Wochen durchgeführt, startend 24 Stunden nach dem Schlaganfall (d. h. an den Post-Schlaganfalltagen 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 und 25). In einer zweiten Studie empfingen Tiere zwei intracisternale Injektionen (2 × 1 μg/Injektion OP-1, 2 × 10 μg/Injektion OP-1 oder 2 × Träger); wobei die erste Injektion 24 Stunden nach dem Schlaganfall verabreicht wurde und die zweite Injektion 4 Tage nach dem Schlaganfall verabreicht wurde. In einer dritten Studie wurde eine einzige Injektion (10 μg/Injektion OP-1 oder Trägerstoff) 24 Stunden nach dem Schlaganfall verabreicht.
III. Verhaltenstest
Um die Tiere an die Behandlung zu gewöhnen, was für ein Verhaltens-/funktionelles Testen notwendig wäre, wurden diese drei Tage vor dem chirurgischen Eingriff für jeweils 10 Minuten/Tag behandelt. Im Anschluss an den chirurgischen Eingriff wurden diese in einzelnen bzw. individuellen Käfigen gehalten. Vier Standardfunktions-Verhaltenstests wurden dazu verwendet, die sensorimotorische und Reflexfunktion nach Infarkt festzustellen. Die Tests wurden in der Literatur vollständig, einschließlich Bederson et al. (1986), Stroke 17: 472–476; DeRyck, et al. (1992), Brain Res. 573: 44–60; Markgraf et al. (1992), Brain Res. 575: 238–246; und Alexis et al. (1995), Stroke 26: 2338–2346, beschrieben.
A. Der Anordnungstest für die vorderen Gliedmaßen
Der vordere-Gliedmaßen-Anordnungs-Test umfasst drei Untertests. Getrennte Scores werden für jede vordere Gließmaße erzielt. Für den visuellen Anordnungssubtest wird das Tier durch den Forscher aufrecht gehalten und in die Nähe einer Tischplatte gebracht. Eine normale Anordnung der Gliedmaße auf dem Tisch wird als "0" gescored, und eine verzögerte Anordnung (< 2 Sek.) wird als "1" gescored und keine oder eine sehr verzögerte Anordnung (> 2 Sek.) wird als " 2" gescored. Getrennte Scores werden zuerst erzielt, wenn das Tier nach vorne gebracht wird, und dann wiederum, wenn das Tier seitwärts auf den Tisch gebracht wurde (maximaler Score pro Gließmaße = 4; in jedem Fall bezeichnen höhere Zahlen größere Defizite). Für den taktilen Anordnungs-Untertest wurde das Tier so gehalten, dass es die Tischplatte nicht sehen oder mit seinen Schnurrhaaren berühren kann. Die dorsale Vorderpfote wird leicht mit der Tischplatte in Berührung gebracht, wenn das Tier zunächst nach vorne gebracht wird und dann seitwärts auf den Tisch gebracht wird. Die Anordnung wird jedesmal wie oben gescored (maximaler Score pro Gliedmaße = 4). Für den propriozeptiven Anordnungsuntertest wird das Tier nur nach vorne gebracht und ein größerer Druck wird auf die dorsale Vorderpfote ausgeübt; die Anordnung wird wie oben gescored (maximaler Score pro Gließmaße = 2). Diese Unterscores werden hinzugefügt, um den totalen Vordergliedmaßenanordnungs-Score pro Gliedmaße anzugeben (Bereich = 010). Bei einigen Tieren wurde der Schnurrhaaranordnungsuntertest durchgeführt, bei dem die Fähigkeit des Tieres, die vordere Gließmaße in Reaktion auf eine Stimulation der Schnurrhaare durch die Tischplatte anzuordnen, getestet wurde (maximaler Score pro Gließmaße = 2). Darauf wurden Unterscores zugefügt, um den Gesamtvordergliedmaßen-Anordnungsscore pro Gliedmaße zu ergeben (Bereich = 0–10, 0–12 mit Schnurrhaar-Untertest).
B. Der hintere Gließmaßen-Anordnungstest
Der hintere Gliedmaßen-Anordnungstest wird in derselben Weise wie der vordere Gliedmaßen-Anordnungstest durchgeführt, schließt jedoch nur taktile und propriozeptive Untertests der hinteren Gliedmaßen ein (maximale Scores 4 bzw. 2; Gesamt-Scorebereich = 0–6).
C. Der modifizierte Balance-Balkentest
Der modifizierte Balance-Balkentest überprüft die Vestibulomotorreflexaktivität, wenn das Tier für 30 Sekunden auf einem schmalen Balken bzw. Stab (30 × 1,3 cm) balanciert. Die Fähigkeit, auf dem Balken zu balancieren, wird wie folgt gescored: 1 – Das Tier balanciert mit allen vier Pfoten oben auf dem Balken; 2 – das Tier legt Pfoten an die Seite des Balken oder schwankt auf dem Balken; 3 – ein oder zwei Gliedmaßen rutschen vom Balken ab; 4 – drei Gliedmaßen rutschen vom Balken ab; 5 – das Tier versucht, mit den Pfoten auf dem Balken zu balancieren, fällt jedoch herunter; 6 – drapiert über dem Balken, fällt dann herunter; 7 – das Tier fällt vom Balken herab ohne einen Versuch, zu balancieren. Die Tiere durchliefen vor dem chirurgischen Eingriff drei Trainingsversuche: Der Score des letzten von diesen wurde als Baseline-Score herangezogen.
D. Der Haltungsreflextest
Der Haltungsreflextest misst sowohl die Reflex- als auch die sensorimotorische Funktion. Die Tiere wurden zunächst am Schwanz hängend über dem Boden gehalten. Tiere, die symmetrisch mit beiden Vordergliedmaßen sich hin zu Boden ausrichten, werden mit "0" gescored. Tiere, die abnormale Haltungen zeigen (Biegen einer Gliedmaße, Drehung des Körpers) werden dann auf ein Kunststoff-unterstütztes Blatt aus Papier angeordnet. Solche Tiere, die dazu in der Lage sind, einer Seite-an-Seite-Bewegung unter sanftem seitlichen Druck zu widerstehen, werden als "1" gescored, wohingegen solche, die nicht dazu in der Lage sind, einer solchen Bewegung zu widerstehen, als "2" gescored werden. Alle funktionellen/Verhaltenstests wurden gerade vor dem Schlaganfall-chirurgischen Eingriff durchgeführt und danach jeden Tag vom Zeitpunkt nach dem Schlaganfall Tag 1 bis Tag 31. Bei jeder Sitzung ließ man die Tiere sich 30 Minuten an den Testraum gewöhnen, bevor der Test begonnen wurde.
IV. Histologische Untersuchung
Am Tag 31 nach MCA-Verschluss wurden die Tiere tief mit Pentobarbital anästhetisiert und transkardial mit heparinisierter Salzlösung, gefolgt von 10% gepuffertem Formalin perfundiert. Die Gehirne wurden entfernt, in drei Stücke geschnitten und in 10% gepuffertem Formalin vor Dehydrierung und Einbettung in Paraffin aufbewahrt. Coronale Schnitte (5 μm) wurden auf einem Gleitmikrotom geschnitten, auf Glasobjektträgern befestigt und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die Gegend der Hirninfarkte auf jedem der sieben Schnitte (+4,7, +2,7, +0,7, –1,3, –3,3, –5,3 und –7,3 im Vergleich zum Bregma) wurde unter Verwendung eines Computerinterface-Bildgebungssystems (Bioquant, R&M Biometnix, Inc., Nashville, TN) bestimmt. Die Gesamtinfarktfläche pro Objektträger wurde durch das "indirekte Verfahren" bestimmt als (Fläche der intakten Kontralateral-Hemisphäre) – (Fläche der intakten ipsilateralen Hemisphäre), um eine Gehirnschrumpfung während der Verarbeitung zu korrigieren (Swanson et al., (1990), J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 290– 293). Das Infarktvolumen wurde dann als Prozentsatz des intakten kontralateralen Hemisphären-Volumens ausgedrückt. Die Volumina der Infarktion in der Rinde und im Striatum wurden ebenfalls getrennt unter Verwendung dieser Verfahren bestimmt.
Der praktische Arzt, der die intracisternalen Injektionen, den Verhaltenstest und die histologische Analyse durchführte, wurde gegenüber den zugeordneten Behandlungen verblindet, bis alle Daten gesammelt waren. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung oder Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwerts ausgedrückt und wurden durch wiederholte Messungen der Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von geeigneten ungepaarten zweiseitigen Tests mit der Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche untersucht.
V. Ergebnisse
Differenz des Gesamtinfarktvolumens und des Körpergewichtes zwischen OP-1-behandelten und Träger-behandelten Tieren
Die rechte seitliche Hirnrinde und das darunterliegende Striatum sowohl von OP-1-behandelten Tieren als auch Träger-behandelten Tieren zeigten große Infarkte im Bereich des MCA. Gehirnregionen, die durch Infarkte schwer geschädigt waren, schlossen die seitliche Rinde, Flächen 1 und 2 (ParI, ParII und die granuläre Inselrinde (GI) ein. Regionen, die durch Infarkte teilweise geschädigt waren, schlossen die vordere Rinde, die Flächen 1, 2 und 3 (FR1, FR2, FR3); eine granuläre Inselrinde (AI); die temporale Rinde, Flächen 1 und 3 (Tel1, Tel3); die laterale Hinterhauptrinde, Fläche 2 (Oc3L); die cortikale vordere Gliedmaßen-Fläche (FL) und das Caudoputamen (cPu; Paxinos und Watson, 1986) ein. Die cortikale Hintergliedmaßenfläche (HL) war im Allgemeinen frei von Infarkten.
Es existierte kein Unterschied im Gesamtinfarktvolumen zwischen Tieren, die mit einer Reihe von intracisternalen OP-1 Verabreichungen behandelt wurden (8 × 10 μg/Injektion) und Träger-behandelten Tieren (26,3 ± 2,5% gegen 28,0 ± 2,0% intaktes contralaterales Hemisphärenvolumen, t = 0,538, p-n.s.). Darüber hinaus existierte kein Unterschied im cortikalen oder Striatum-Infarktvolumen zwischen den OP-1-behandelten Tieren und den Träger-behandelten Tieren, wenn diese Volumina getrennt berechnet wurden (Hirnrinde: 30,9 ± 3,1% gegen 31,9 ± 2,9% intaktes kontralaterales Rindenvolumen, t = 0,254, p-n.s.; Striatum: 66,0 ± 3,0% gegen 66,5 ± 2,9% intaktes kontralaterales Striatum-Volumen, t = 0,121, p-n.s.). Weiterhin zeigte eine Inspektion von Hämatoxilin- und Eosin-gefärbten Schnitten keinen Beweis für eine abnormale Zellproliferation in den Gehirnen von OP-1-behandelten Tieren. (Daten nicht dargestellt).
Der Zeitverlauf des Körpergewichts während des Monats nach der Infarktion von Trägerbehandelten Tieren unterschied sich nicht signifikant zwischen: (a) Tieren, die mit einer Reihe (8 × 10 μg/Tier) von OP-1-Verabreichungen behandelt wurden (4, F = 0,56, p-n.s.); (b) Tieren, die mit zwei Injektionen (Hochdosis = 2 × 10 μg/Tier; niedere Dosis = 2 × 1 μg/Tier) von OP-1 behandelt wurden (7; F = 0,417, p-n.s.); und (c) Tieren, die mit einer einzigen Injektion (10 μg/Tier) OP-1-behandelt wurden (10; F = 0,693, p-n.s.).
Funktionelle Leistung OP-1-behandelter Tiere und Träger-behandelter Tiere
Im Anschluss an die Infarktion zeigten alle Tiere schwere Störungen der sensorimotorischen und Reflexfunktion bei allen vier Verhaltenstests. Für die Gliedmaßenanordnungstests waren die Defizite auf die kontralateralen (linken) Gliedmaßen beschränkt. Tiere, die Träger empfingen, zeigten eine teilweise Genesung bei allen vier Verhaltenstests während des ersten Monats nach dem Schlaganfall (siehe 2A–2B, 3A–3B, 5A–5B, 6, 8A–8B und 9).
(i) Tiere, die zweimal wöchentlich OP-1-Verabreichungen erhielten
Tiere, die zweimal wöchentliche OP-1-Verabreichungen (8 × 10 μg/Injektion) erhielten, erholten sich schneller und in einem größeren Ausmaß als Träger-behandelte Ratten. Eine verbesserte Genesung von OP-1 gegen Träger-behandelte Tiere war am auffälligsten für die vorderen Gliedmaßen (2A; F = 109,0, p = 0,0001) und bei den hinteren Gliedmaßenanordnungsaufgaben (2B; F = 34,8, p = 0,0001) und weniger auffällig, obwohl noch signifikant, für die Balkenbalance (3A; F = 11,7, p = 0,0051). Es existierte jedoch keine Signifikanz zwischen den beiden Gruppen in den Haltungsreflextests (3B; F = 3,7, p-n.s.). Eine gesteigerte Genesung war bei allen Untertests der Gliedmaßenanordnungstests ersichtlich (visuell, taktil und propriozeptiv) im Anschluss an eine OP-1-Behandlung (Daten nicht dargestellt). Eine Verbesserung der Genesung durch OP-1 war bei den Test der sensorimotorischen Funktion der betroffenen Gliedmaßen am auffälligsten und weniger bei den Tests des Reflexes und der Haltungsfunktion auffällig. Die MCA-Infarkte schädigten vordere Gliedmaßen- und hintere Gliedmaßenrinden-Areale nicht vollständig, was mit der Genesung bei den Gliedmaßenanordnungstests im Anschluss an eine fokale Infarktion im MCA-Territorium kompatibel ist.
(ii) Tiere, die zwei OP-1-Verabreichungen erhielten
Tiere, die zwei OP-1-Verabreichungen erhielten (an den Tagen 1 und 4 nach dem Schlaganfall) erholten sich schneller und in einem größeren Umfang als Träger-behandelte Ratten während des Monats des Verhaltenstestes. OP-1 (2 × 1 oder 10 μg/Injektion) induzierte eine signifikante Verbesserung der Genesung von: (a) Vordergliedmaßenanordnung ohne Schnurrhaare (5A; F = 31,835, p = 0,0001; Hochdosis gegen Träger, p < 0,0001; Niederdosis gegen Träger, p < 0,0001), (b) vordere Gliedmaßenanordnung mit Schnurrhaaren (5B; F = 27,462, p = 0,0001; Hochdosis gegen Träger, p < 0,0001; niedere Dosis gegen Träger, p < 0,0001); und (c) hintere Gliedmaßenanordnung (6; F = 14,867, p = 0,0001; hohe Dosis gegen Träger, p < 0,0001; niedere Dosis gegen Träger, p = 0,0036). Obwohl die hohe Dosis einen Trend hin zu einer besseren Genesung als die niedere Dosis in allen drei Verhaltenstests zeigte, waren die Unterschiede zwischen den beiden OP-1-behandelten Gruppen nicht signifikant.
(iii) Tiere, die eine einzige OP-1-Verabreichung empfingen
Langzeitverbesserungen der funktionellen Genesung waren ebenfalls bei einer einzigen Verabreichung von OP-1 ersichtlich. Tiere, die 10 μg OP-1 intracisternal 24 Stunden nach dem Verschluss der MCA erhielten, erholten sich schneller und in einem größeren Umfang während des Monats des Verhaltenstestes als Träger-behandelte Ratte. OP-1 induzierte eine signifikante Steigerung der Genesung von (a) vordere Gliedmaßenanordnung ohne Schnurrhaare (8A; F = 10,853, p = 0,0064); (b) vordere Gliedmaßenanordnung mit Schnurrhaaren (8B; F = 10,629, p = 0,0068); und (c) hintere Gliedmaßenanordnung (9; F = 15,343, p = 0,002).
In der vorliegenden Erfindung verbesserte eine Behandlung einer ischämischen Verletzung des Zentralnervensystems mit OP-1 sowohl die Rate bzw. Geschwindigkeit als auch das Ausmaß der funktionellen Erholung während des ersten Monats nach der Infarktion. Eine einzige Verabreichung einer effektiven Dosis OP-1 war ausreichend, um eine Langzeitverbesserung der funktionellen Genesung zu induzieren.
Eine verbesserte Verhaltensgenesung war ohne Veränderung (beispielsweise ohne Abnahme) des Infarktvolumens bei OP-1-behandelten im Vergleich zu Träger-behandelten Tieren ersichtlich. In all diesen Gruppen begann die OP-1-Verabreichung einen Tag nach der Ischämie außerhalb des "therapeutischen Fensters", während dem OP-1 gemäß den Lehren von WO 93/04692 und/oder WO 94/03200 die Infarktgröße reduzieren kann. Die gegenwärtigen Erkenntnisse zählen zu den ersten Demonstrationen, dass ein exogen verabreichter, biologisch aktiver Faktor die Verhaltensgenesung ohne Reduktion der Infarktgröße bei einem Tiermodell des Schlaganfalls verbessern kann.
Ähnliche Routinemodifikationen können in anderen akzeptierten Modellen des Schlaganfalls oder von traumatischen Verletzungen des Zentralnervensystems durchgeführt werden, um die Leistungsfähigkeit der Morphogen-Behandlung zur Wiederherstellung einer verlorengegangenen oder verschlechterten ZNS-Funktion zu bestätigen.
Äquivalente
Die Erfindung kann in anderen speziellen Formen durchgeführt werden, ohne vom Geist oder den essentiellen Eigenschaften hiervon abzuweichen. Die vorhergehenden Ausführungsformen sollen deswegen in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht als die hierin beschriebene Erfindung einschränkend betrachtet werden. Der Umfang der Erfindung wird somit durch die beigefügten Ansprüche eher als durch die vorhergehende Beschreibung angezeigt und alle Veränderungen, die in die Bedeutung und den Äquivalenzbereich der Ansprüche fallen, sollen hiervon mit umfasst sein.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Wiedererlangung einer Funktion des zentralen Nervensystems in einem Säugetier (beispielsweise einem Menschen), das an einer Verletzung des zentralen Nervensystems leidet, die aus Ischämie oder Trauma ausgewählt ist, wobei a) die funktionelle Wiedererlangung eine Verbesserung einer Funktion des zentralen Nervensystems umfasst, ausgewählt aus einer motorischen Koordinationsfunktion, Sinneswahrnehmung und Sprache; wobei wahlweise die motorische Koordinationsfunktion aus Haltung, Gleichgewicht, Griff und Gang ausgewählt ist und/oder die Sinneswahrnehmung aus Sehvermögen, Hörvermögen, Tastsinn, Geschmack, Propriozeption und Geruchssinn ausgewählt ist; und wobei b) das Morphogen ein dimeres Protein umfasst, das die Eigenschaft aufweist, eine gewebsspezifische Morphogenese in dem Säugetier zu induzieren und zwei gefaltete Polypeptide umfasst, die jeweils eine Aminosäuresequenz mit einer zumindest 70%igen Homologie mit der C-terminalen Sieben-Cystein-Domäne von humanem OP-1, Reste 330– 431 von SEQ ID NO: 5 aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Morphogen: a) in einer einzelnen Verabreichung; oder b) in einer Vielzahl von Verabreichungen; oder c) in zwei Verabreichungen, bereitgestellt wird; und/oder d) das Morphogen zumindest 6, 24 oder 48 Stunden nach dem Eintreten der Verletzung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Morphogen täglich, zweimal wöchentlich oder wöchentlich verabreicht wird.
Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Wiedererlangung einer Funktion des zentralen Nervensystems in einem Säugetier (beispielsweise einem Menschen), das unter einer Verletzung des zentralen Nervensystems leidet, ausgewählt aus Ischämie oder Trauma, wobei a) die funktionelle Wiedererlangung eine Verbesserung einer Funktion des zentralen Nervensystems umfasst, ausgewählt aus einer motorischen Koordinationsfunktion, Sinneswahrnehmung und Sprache; wobei wahlweise die motorische Koordinationsfunktion aus Haltung, Gleichgewicht, Griff und Gang ausgewählt ist und/oder die Sinneswahrnehmung aus Sehvermögen, Hörvermögen, Tastsinn, Geschmackssinn, Propriozeption und Geruch ausgewählt ist; und wobei b) das Morphogen ein dimeres Protein umfasst, das die Eigenschaft aufweist, eine gewebsspezifische Morphogenese in dem Säugetier zu induzieren und zwei gefaltete Polypeptide umfasst, wobei diese jeweils eine Aminosäuresequenz aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Folgendem besteht: a) generische Sequenz 7, definiert durch SEQ ID NO: 1; b) generische Sequenz 8, definiert durch SEQ ID NO: 2; c) generische Sequenz 9, definiert durch SEQ ID NO: 6; und d) generische Sequenz 10, definiert durch SEQ ID NO: 7.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz aus Folgendem ausgewählt ist: a) einer Sequenz mit mehr als 60%iger Aminosäuresequenzidentität mit der C-terminalen Sieben-Cystein-Domäne von humanem OP-1, Reste 330-431 von SEQ ID NO: 5; und b) einer OPX-Sequenz, definiert durch SEQ ID NO: 3, wobei beispielsweise die Aminosäuresequenz diejenige der C-terminalen Sieben-Cystein-Domäne von humanem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NO: 5 oder eine konservative Substitution oder natürlich vorkommende Variante hiervon ist.
Verwendung eines Morphogens zur Herstellung eines Medikamentes zur Verbesserung der Wiedererlangung einer Funktion des zentralen Nervensystems in einem Säugetier (beispielsweise einem Menschen), das unter einer Verletzung des zentralen Nervensystems leidet, die aus Ischämie oder Trauma ausgewählt ist, wobei a) die funktionelle Wiedererlangung eine Verbesserung einer Funktion des zentralen Nervensystems umfasst, ausgewählt aus einer motorischen Koordinationsfunktion, Sinneswahrnehmung und Sprache; wobei wahlweise die motorische Koordinationsfunktion aus Haltung, Gleichgewicht, Griff und Gang ausgewählt ist und/oder die Sinneswahrnehmung aus Sehvermögen, Hörvermögen, Tastsinn, Geschmackssinn, Propriozeption und Geruch ausgewählt ist; und wobei das Morphogen ausgewählt ist aus b) humanem OP-1, Maus-OP-1, humanem OP-2, Maus-OP-2, 60A, GDF-1, BMP-2A, BMP-2B, DPP, Vgl, Vgr-1, BMP-3, BMP-5 und BMP-6; oder c) einer konservativen Substitutionsvariante von humanem OP-1, Maus-OP-1, humanem OP-2, Maus-OP-2, 60A, GDF-1, BMP-2A, BMP-2B, DPP, Vgl, Vgr-1, BMP-3, BMP-5 oder BMP-6.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Morphogen mit Folgendem komplexiert ist: a) zumindest einem Pro-Domänen-Peptid, umfassend ein N-terminales 18-Aminosäure-Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den N-Termini der Prodomänen von OP-1, OP-2, 60A, GDF-1, BMP-2A, BMP-2B, DPP, Vgl, Vgr-1, BMP-3, BMP-5 und BMP-6 besteht; oder b) zumindest einem Pro-Domänen-Polypeptid, das eine konservative Substitutionsvariante eines Pro-Domänen-Polypeptids ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Pro-Domänen von OP-1, OP-2, 60A, GDF-1, BMP-2A, BMP-2B, DPP, Vgl, Vgr-1, BMP-3, BMP-5 und BMP-6; oder c) nicht kovalent mit zumindest einem die Löslichkeit erhöhenden Fragment eines Pro-Domän-Polypeptids, ausgewählt aus den Pro-Domänen von natürlich vorkommenden Morphogenen (beispielsweise mit zwei derartiger Fragmente).
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Morphogen aus einem Kulturüberstand einer Morphogen-sezernierenden Wirtszelle gewonnen wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Morphogen intracisternal, intraventrikulär, intrathekal oder intravenös verabreicht wird.