DE69133338T2

DE69133338T2 - Bmp-5-derivate

Info

Publication number: DE69133338T2
Application number: DE69133338T
Authority: DE
Inventors: M. John WOZNEY; A. Vicki ROSEN; A. Elizabeth WANG; J. Anthony CELESTE
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1990-09-26
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: WO1992005199A1; EP0550625B1; ATE253589T1; DE69133338D1; EP0550625A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, welche für BMP-5-Proteine codieren (wobei BMP Knochen-morphogenes Protein ist), welche die Fähigkeit aufweisen, Knorpel- und/oder Knochenbildung herbeizuführen, und Verfahren zu ihrem Erhalt. Diese Proteine können verwendet werden, um Knochen- und/oder Knorpelbildung herbeizuführen und bei der Wundheilung und Gewebereparatur.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül, welches für ein BMP-5-Protein codiert, welches aus der Nukleotid-Sequenz aus Nukleotid # 1647 bis Nukleotid #2060 von Tabelle III besteht, oder einer Nukleotid-Sequenz, welche zu den obigen Sequenzen degeneriert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, welche die obigen DNA-Moleküle in operativer Verbindung mit einer Expressions-Steuerungssequenz dafür umfassen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche mit besagten Vektoren transformiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines BMP-5-Proteins, bestehend aus der Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 317 bis Aminosäure # 454, wie in Tabelle III gezeigt, wobei das Verfahren die Schritte: Züchten der transformierten Wirtszelle, wie oben erwähnt, in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren und Reinigen des Proteins aus dem Kulturmedium umfasst. Das Protein wird ferner durch die Fähigkeit gekennzeichnet, Knorpel- und/oder Knochenbildung zu demonstrieren, und durch die Fähigkeit, dass 1 μg des Proteins eine Bewertung von mindestens +2 im Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Test erreicht.
WO90/11366 betrifft spezifische Proteine der BMP (Bone Morphogenic Protein)-Familie mit der Bezeichnung BMP-5, BMP-6 und BMP-7, welche die Fähigkeit haben, Knorpel- und/oder Knochenbildung herbeizuführen.
WO90/11366 offenbart die Aminosäure-Sequenzen dieser Proteine, die entsprechenden DNA-Sequenzen und die Verwendung dieser Proteine in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
WO90/11366 offenbart humane BMP-5 Proteine, welche im Wesentlichen frei von anderen Proteinen sind, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, welche die in Tabelle III dargestellte Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 323 (Asn, Gln, Asn) bis Aminosäure # 454 (endend mit Gly, Cys, His) umfasst. Diese Aminosäuresequenz # 323 bis # 454 wird durch die DNA-Sequenz von Tabelle III von Nukleotid # 1665 bis Nukleotid # 2060 codiert. Die Erfindung beschreibt die in Tabelle III dargestellte Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 317 (Ala, Ala, Asn) bis Aminosäure # 454 (endend mit Gly, Cys, His). Diese Aminosäuresequenz # 317 bis # 454 wird durch die DNA-Sequenz von Tabelle III von Nukleotid # 1647 bis Nukleotid # 2060 codiert.
Das reife BMP-5 Dimer kann ferner gekennzeichnet werden durch ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28000–38000 Dalton, wie durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter Reduktionsbedingungen in SDS-PAGE elektrophoretisiert die reife Untereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 18000–22000 Dalton. Diese Proteine sind in der Lage, Knorpel- und/oder Knochenbildung zu stimulieren, zu fördern oder auf andere Weise herbeizuführen.
Die Erfindung offenbart ferner bovine BMP-5 Proteine, welche die in Tabelle I darstellte Aminosäure-Sequenz von #9 bis Aminosäure # 140 umfassen. Die Aminosäure-Sequenz von # 9 bis # 140 wird durch die DNA-Sequenz von Nukleotid # 32 bis # 427 von Tabelle I codiert. Diese Proteine können ferner durch ein scheinbares Molekulargewicht von 28000–30000 Dalton gekennzeichnet werden, wie durch Natriumdodecysulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter Reduzierungsbedingungen in SDS-PAGE elektrophoretisiert das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 14000–20000 Dalton. Es wird erwogen, dass diese Proteine in der Lage sind, Knorpel- und/oder Knochenbildung herbeizuführen.
Humane BMP-5-Proteine können durch Züchten einer Zelle hergestellt werden, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, welche die Nukleotid-Sequenz enthält, welche gleich oder im Wesentlichen gleich der Nukleotid-Sequenz ist, die in Tabelle III gezeigt wird, umfassend Nukleotid #699 bis Nukleotid # 2060. BMP-5-Proteine, welche die Aminosäure-Sequenz umfassen, die gleich oder im Wesentlichen gleich der in Tabelle III gezeigten von Aminosäure #323 bis # 454 ist, werden gewonnen, isoliert und von dem Kulturmedium gereinigt.
Bovine Proteine können durch Züchten einer Zelle hergestellt werden, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, welche die Nukleotid-Sequenz enthält, welche gleich oder im Wesentlichen gleich der in Tabelle I gezeigten ist, umfassend Nukleotid # 8 bis Nukleotid # 427 und Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches die Aminosäure-Sequenz oder einen Teil davon enthält, wie in Tabelle I gezeigt, umfassend Aminosäure # 9 bis Aminosäure # 140.
Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren, bei welchem die oben beschriebenen Proteine zum Erhalten von verwandtem/-en humanen Protein(en) oder Knorpel- und/oder Knochenwachstums-Protein(en) von anderen Säugern genutzt werden. Solche Verfahren sind den Fachleuten der Gentechnik bekannt. Ein Verfahren zum Erhalten solcher Proteine bezieht Nutzen der humanen BMP-5 Codierungssequenz oder Teile davon von Nukleotid # 699–# 2060 als Sonde zum Screenen von humanen genomischen und/oder cDNA-Bibliotheken ein, um die humane genomische und/oder cDNA-Sequenz zu isolieren. Zusätzliche Verfahren, die nach Stand der Technik bekannt sind, können die bovinen und humanen BMP-5-Proteine einsetzen, um andere Säugetier BMP-5 Knorpel- und/oder Knochenbildungsproteine zu erhalten.
Nach Identifizierung der Nukleotid-Sequenzen werden die Proteine durch Züchten einer Zelle hergestellt, transformiert mit der DNA, welche in dem oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurde, welche DNA unter strengen Bedingungen zu der bovinen BMP-5 Nukleotid-Sequenz hybridisiert, im Wesentlichen wie in Tabelle I gezeigt, oder zur humanen BMP-5 Nukleotid-Sequenz, im Wesentlichen wie in Tabelle III gezeigt, und welche für ein Protein codiert, welches Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit aufweist. Die exprimierten Proteine werden aus den Kulturmedien gewonnen und gereinigt. Die gereinigten BMP-5-Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialien, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen. Die BMP-5-Proteine sind durch die Fähigkeit gekennzeichnet, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu fördern, zu stimulieren oder auf andere Weise herbeizuführen. Es wird ferner erwogen, dass die Fähigkeit dieser Proteine, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen herbeizuführen, durch die Fähigkeit dargelegt werden kann, Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit in dem unten beschriebenen Rattenknochenbildungstest zu demonstrieren. Es wird ferner erwogen, dass die hierin beschriebenen BMP-Proteine Wirksamkeit in diesem Rattenknochenbildungstest bei einer Konzentration von 10 μg–500 μg/ Gramm Knochen demonstrieren können. Insbesondere wird erwogen, dass diese Proteine durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden können, dass 1 μg des Proteins eine Bewertung von mindestens +2 in dem unten beschriebenen Rattenknochenbildungstest unter Verwendung des entweder ursprünglichen oder modifizierten Bewertungsverfahren erreicht.
Die Erfindung offenbart ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines BMP-5-Proteins in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel oder Träger enthalten. Die Zusammensetzungen können verwendet werden, um Knochen- und/oder Knorpelbildung herbeizuführen. Diese Zusammensetzungen können ebenfalls zur Wundheilung und Gewebereparatur verwendet werden. Weitere Zusammensetzungen können zusätzlich zu einem BMP-5-Protein mindestens einen weiteren therapeutisch brauchbaren Wirkstoff wie die als BMP-1, BMP-2A und -2B, BMP-3, BMP-6 und BMP-7 bezeichneten Proteine einschließen. Diese Proteine können in Zusammenarbeit oder vielleicht synergistisch miteinander wirken. Weitere therapeutisch brauchbare Wirkstoffe können Wachstumsfaktoren einschließen, wie Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und von Blutplättchen abstammender Wachstumsfaktor (PDGF).
Die Zusammensetzungen können ebenfalls eine passende Matrix einschließen, zum Beispiel zur Abgabe und/oder als Support der Zusammensetzung und/oder zum Vorsehen einer Oberfläche zur Knochen- und/oder Knorpelbildung. Die Matrix kann langsame Freisetzung der BMP-5-Proteine und/oder die passende Umgebung zur Präsentation der BMP-5-Proteine vorsehen.
Die Zusammensetzungen können zum Behandeln einer Anzahl an Knochen- und/oder Knorpeldefekten und Periodontalerkrankung eingesetzt werden. Sie können ebenfalls zum Behandeln verschiedener Arten von Wunden und bei Gewebereparatur eingesetzt werden. Diese Zusammensetzungen werden zum Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines hierin beschriebenen BMP-Proteins an einen Patienten verwendet, der solcher Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebereparatur bedarf. Diese Verfahren können auch die Verabreichung von hierin beschriebenem BMP-Pro tein zusammen mit mindestens einem der „BMP"-Proteine mit sich bringen, welche in den oben beschriebenen, zusammen besessenen Anmeldungen offenbart werden. Zusätzlich können diese Zusammensetzungen ebenfalls andere Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α , TGF-β und PDGF einschließen.
Auch werden DNA-Sequenzen offenbart, welche für Expression eines oben beschriebenen BMP-Proteins codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz von Nukleotiden in einer 5' bis 3' Richtung ein, veranschaulicht in Tabelle I oder Tabelle III, oder DNA-Sequenzen, welche unter strengen Bedingungen mit der DNA-Sequenz von Tabelle I oder Tabelle III hybridisieren und für ein Protein codieren, welches die Fähigkeit zeigt, Knorpel- und/oder Knochenbildung wie in dem unten beschriebenen Rattenknochenbildungstest herbeizuführen. Es wird erwogen, dass diese Proteine in diesem Test bei einer Konzentration von 10 μg–500 μg/Gramm Knochen Wirksamkeit zeigen können. Insbesondere wird erwogen, dass diese Proteine die Fähigkeit demonstrieren, dass 1 μg des Proteins eine Bewertung von mindestens +2 in dem Rattenknochenbildungstest unter Verwendung des entweder ursprünglichen oder modifizierten Bewertungsverfahrens erreicht. Schließlich werden allele oder andere Variationen der Sequenzen von Tabelle I und III, ob solche Nukleotidveränderungen Veränderungen in der Peptidsequenz ergeben oder nicht, ebenfalls offenbart.
Ein weiterer Aspekt der Verbindung sieht einen Vektor vor, welcher eine DNA-Sequenz wie oben beschrieben, in operativer Verbindung mit einer Expressions-Steuerungssequenz dafür enthält. Diese Vektoren können in einem neuartigen Verfahren zum Herstellen eines hierin beschriebenen BMP-Proteins eingesetzt werden, bei welchem eine Zelllinie, transformiert mit einer DNA-Sequenz, welche Expression eines hierin beschriebenen BMP-Proteins steuert, in operativer Verbindung mit einer Expressions-Steuerungssequenz dafür, in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird und ein hierin beschriebenes Protein daraus gewonnen und gereinigt wird. Dieses Verfahren kann eine Anzahl an bekannten Zellen, sowohl prokaryontische, als auch eukaryontische, als Wirtszellen zur Expression des Polypeptids einsetzen. Die gewonnenen BMP-Proteine werden gereinigt, indem sie von anderen proteinartigen Substanzen, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen isoliert werden.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Erwägung der folgenden detaillierten Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen davon offensichtlich werden.
Gereinigte humane BMP-5-Proteine werden durch Züchten einer Wirtszelle, transformiert mit der DNA-Sequenz von Tabelle III hergestellt. Die exprimierten BMP-5-Proteine werden aus den Kulturmedien isoliert und gereinigt. Die gereinigten humanen BMP-5-Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Aminosäure-Sequenz bestehen, wie in Tabelle III von Aminosäure # 317 oder # 323 bis # 454 gezeigt. Diese gereinigten BMP-5 humanen Knorpel-/Knochenproteine können durch Züchten einer Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz hergestellt werden, welche die DNA-Sequenz wie in Tabelle III von Nukleotid # 699 bis Nukleotid # 2060 umfasst, oder im Wesentlichen homologe Sequenzen, welche an eine heterologe Steuerungskontrollsequenz operativ gebunden sind, und Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches aus der Aminosäure-Sequenz wie in Tabelle III gezeigt von Aminosäure # 317 oder # 323 bis Aminosäure # 454 besteht.
Die Erfindung sieht die DNA-Sequenz vor, welche aus den Nukleotiden besteht, welche für Aminosäuren # 317 – # 454 von Tabelle III codieren. BMP-5-Proteine können daher durch Züchten einer Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz hergestellt werden, bestehend aus der DNA-Sequenz, wie in Tabelle III gezeigt, von Nukleotid # 1647 bis Nukleotid # 2060, operativ gebunden an eine heterologe Steuerungskontrollsequenz und Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches aus der wie in Tabelle III gezeigten Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 317 bis Aminosäure # 454 besteht. Die gereinigten humanen BMP-5-Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialien, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen.
Gereinigte BMP-5 bovine Knorpel-/Knochenproteine werden durch Züchten einer Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz hergestellt, welche die DNA-Sequenz wie in Tabelle I gezeigt von Nukleotid # 8 bis Nukleotid # 578 umfasst, oder im Wesentlichen homologe Sequenzen, und Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches die Aminosäure-Sequenz wie in Tabelle I gezeigt von Aminosäure # 9 bis Aminosäure # 140 oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz umfasst. Die gereinigten BMP-5 bovinen Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialien, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen.
BMP-5-Proteine werden ferner durch die Fähigkeit gekennzeichnet, Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit zu zeigen. Diese Wirksamkeit kann zum Beispiel im Rattenknochenbildungstest wie in Beispiel III beschrieben demonstriert werden. Es wird ferner erwogen, dass diese Proteine Wirksamkeit in dem Test bei einer Konzentration von 10 μg–500 μg/Gramm gebildetem Knochen demonstrieren. Die Proteine können ferner durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, dass 1 μg des Proteins eine Bewertung von mindestens +2 in diesem Test unter Verwendung des entweder ursprünglichen oder modifizierten, unten beschriebenen Bewertungsverfahrens erreicht.
Das reife BMP-5-Dimer kann ferner durch ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28000–38000 Dalton gekennzeichnet werden, wie durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter Reduktionsbedingungen in SDS-PAGE elektrophoretisiert die reife Untereinheit mit einem Molekulargewicht von etwa 18000–22000 Dalton.
Die hierin offenbarten Proteine schließen ebenfalls Faktoren ein, welche durch die Sequenzen ähnlich denen von Tabelle I und Tabelle III codiert werden, aber in welchen Modifikationen natürlich vorgesehen (z. B. allele Variationen in der Nukleotid-Sequenz, welche Aminosäureveränderungen in dem Polypeptid ergeben können) oder absichtlich konstruiert werden. Ähnlich werden synthetische Polypeptide, welche ganz oder teilweise kontinuierliche Sequenzen des Aminosäurerückstands von Tabelle I oder Tabelle III duplizieren, in der Beschreibung offenbart. Diese Sequenzen können durch Teilen von primären, sekundären oder tertiären strukturellen und übereinstimmenden Merkmalen mit anderen Knorpel-/Knochenproteinen der Erfindung, damit gemeinsame biologische Knochen- und/oder Knorpelwachstumsfaktoreigenschaften besitzen. So können sie als biologisch wirksame Substitute für natürlich auftretende Proteine in therapeutischen Verfahren eingesetzt werden.
Andere spezifische Mutationen der Sequenzen der hierin be schriebenen BMP-Proteine können Modifikationen einer Glykosylierungsstelle einbeziehen. Diese Modifikation kann O-gebundene oder N-gebundene Glykosylierungsstellen einbeziehen. Zum Beispiel ergibt die Abwesenheit von Glykosylierung oder nur teilweiser Glykosylierung an Asparagin-gebundenen Glykosylierungsstellen Aminosäuresubstitution oder Deletion an jeder Asparagingebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstelle, welche in der Sequenz der hierin beschriebenen BMP-Proteine vorhanden ist, zum Beispiel wie in Tabelle I oder Tabelle III gezeigt. Die Asparagin-gebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptid-Sequenzen, welche durch passende zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X üblicherweise eine Aminosäure ist. Eine Vielfalt an Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen einer Glykosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder Aminosäuredeletion an der zweiten Position) ergibt Nicht-Glykosylierung an der modifizierten Tripeptid-Sequenz. Expression von solchen veränderten Nukleotidsequenzen erzeugt Varianten, welche an der Stelle nicht glycosyliert sind.
Die neuartigen DNA-Sequenzen sind frei von Verbindung mit DNA-Sequenzen, welche für andere proteinartige Materialien codieren, und codieren an Expression für die hierin beschriebenen BMP-Proteine. Diese DNA-Sequenzen schließe jene ein, welche in Tabelle I und III in einer 5'- nach 3'-Richtung dargestellt werden. Ferner werden jene Sequenzen beschrieben, welche unter strengen Hybridisierungsbedingungen [siehe T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389] zu der DNA-Sequenz von Tabelle I oder Tabelle III hybridisieren und Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit in dem Rattenknochenbildungstest demonstrieren. Ein Beispiel für solch eine strenge Hybridisierungsbedingung ist Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SCC bei 65°C für eine Stunde. Alternativ ist eine exemplarische strenge Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SCC bei 42°C.
Ähnlich codieren DNA-Sequenzen, welche für Proteine codieren, ähnlich dem Protein, codiert durch die Sequenz von Tabelle I oder Tabelle III, aber welche sich aufgrund von Degenerationen des genetischen Codes oder allelen Variationen (natürlich vorkommenden Basen-Veränderungen in der Art-Population, welche eine Aminosäureveränderung ergeben können oder nicht) in der Codon-Sequenz unterscheiden, ebenfalls für die hierin beschriebenen BMP-Proteine. Die DNA-Sequenzen von Tabelle I und Tabelle III können Variationen enthalten, welche durch Punktmutationen oder durch herbeigeführte Mutationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) verursacht werden, um die Wirksamkeit, Halbwertszeit oder Herstellung der dadurch codierten Polypeptide zu erhöhen.
In einem weiteren Aspekt offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten verwandter humaner Proteine oder anderer Säugetier-BMP-5-Proteine. Ein Verfahren zum Erhalten solcher Proteine bringt zum Beispiel Nutzung der hierin offenbarten humanen BMP-5-Codierungssequenz zum Sondieren einer humanen genomischen Bibliothek unter Verwendung von Standardtechniken für das humane Gen oder Fragmente davon mit sich. So identifizierte Sequenzen können ebenfalls als Sonden verwendet werden, um eine humane Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren, welche das analoge Knorpel-/Knochenprotein synthetisiert. Eine cDNA-Bibliothek wird mit Sonden synthetisiert und gescreent, welche von den humanen oder bovinen Codierungssequenzen abgeleitet werden. Die so identifizierte humane Sequenz wird in eine Wirtszelle transformiert, die Wirtszelle wird gezüchtet und das Protein aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und gereinigt. Vom gereinigten Protein wird vorausgesagt, dass es Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit im Rattenknochenbildungstest von Beispiel III aufweist.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein neuartiges Verfahren zum Herstellen der hierin beschriebenen BMP-Proteine. Dieses Verfahren bezieht Züchten einer geeigneten Zelllinie ein, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, welche für Expression eines hierin beschriebenen BMP-Proteins codiert, unter der Kontrolle von bekannten Steuerungssequenzen. Steuerungssequenzen schließen Promotorfragmente, Terminatorfragmente und andere geeignete Sequenzen ein, welche die Expression des Proteins in einer passenden Wirtszelle steuern. Verfahren zum Züchten geeigneter Zelllinien sind innerhalb der Fähigkeit nach Stand der Technik. Die transformierten Zellen werden gezüchtet und die da durch exprimierten BMP-5-Proteine werden unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Reinigungsverfahren aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt. Die gereinigten BMP-5-Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Substanzen, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen. Gereinigte BMP-5-Proteine sind im Wesentlichen frei von Substanzen, mit welchen die hierin beschriebenen BMP-Proteine in der Natur vorkommen.
Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetierzellen wie Eierstockzellen von Chinesischen Hamstern (CHO) sein. Die Wahl von geeigneten Säugetier-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifikation, Screenen und Produktherstellung und Reinigung sind nach Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gething und Sambrook, Nature, 293: 620–625 (1981) oder alternativ Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750–1759 (1985) oder Howley et al, US-Patent 4419446. Andere geeignete Zelllinien sind die Affen COS-1-Zelllinie und die CV-1-Zelllinie.
Bakterielle Zellen können ebenfalls geeignete Wirte sein. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bazillen und ähnlichem können ebenfalls in diesem Verfahren eingesetzt werden.
Viele Stämme von Hefezellen sind den Fachleuten bekannt und können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der hierin beschriebenen BMP-Polypeptide verfügbar sein. Zusätzlich können, wo gewünscht, Insektenzellen als Wirtszellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Siehe z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277–298 (Plenus Press 1986) und darin zitierte Verweise.
Die vorliegende Erfindung offenbart Vektoren zur Verwendung in dem Expressionsverfahren der hierin beschriebenen BMP-Proteine. Die Vektoren enthalten die oben beschriebenen neuartigen DNA-Sequenzen, welche für die hierin beschriebenen BMP-Knorpel- /Knochenproteine codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren ebenfalls passende Expressionskontrollsequenzen, welche Expression der Proteinsequenzen erlauben. Alternativ können die Vektoren gestutzte oder modifizierte Sequenzen wie oben beschrieben einschließen, welche brauchbar bei der Herstellung der hierin beschriebenen BMP-Proteine sind. Die Vektoren können in dem Verfahren des Transformierens der Zelllinien eingesetzt werden und enthalten ausgewählte Steuerungssequenzen in operativer Verbindung mit den DNA-codierenden Sequenzen, welche in der Lage sind, die Replikation und Expression dafür in ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Brauchbare Steuerungssequenzen für solche Vektoren sind den Fachleuten bekannt und können je nach gewählter Wirtszelle ausgewählt werden. Solch eine Selektion ist Routine und bildet keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Mit solchen Vektoren transformierte Wirtszellen und Nachkommen davon zur Verwendung beim Herstellen von Knorpel-/Knochenproteinen werden ebenfalls durch die Beschreibung umfasst.
Ein Fachmann kann Säugetier-Expressionsvektoren durch Einsetzen der hierin beschriebenen BMP-DNA-Sequenzen und bekannter Vektoren konstruieren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 2: 161–170 (1982)] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645–653 (1985)].
Ähnlich könnte ein Fachmann die hierin beschriebenen BMP-Sequenzen manipulieren durch Eliminieren oder Ersetzen der Säugetier-Steuerungssequenzen, welche die codierende Sequenz flankieren, durch bakterielle Sequenzen, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch bakterielle Zellen zu erzeugen. Zum Beispiel könnte die Codierungssequenz weiter manipuliert werden (z. B. an andere bekannte Linker ligatiert oder durch Deletieren von nicht-codierenden Sequenzen davon oder Verändern von Nukleotiden darin durch andere bekannte Techniken). Die modifizierte Codierungssequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor unter Verwendung von Verfahren insertiert werden, wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5230–5233 (1980) beschrieben. Dieser exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert und ein hierin beschriebenes BMP-Protein dadurch exprimiert werden. Für eine Strategie zum Herstellen von extrazellulärer Expression eines hierin beschriebenen BMP-Knorpel- und/oder Knochenproteins in bakteriellen Zellen siehe z. B. Europäische Patentanmeldung EPA 177343.
Ähnliche Manipulationen können zur Konstruktion eines Insektenvektors durchgeführt werden [Siehe z. B. Verfahren, beschrieben in veröffentlichter Europäischer Patentanmeldung 155476] zur Expression in Insektenzellen. Ein Hefevektor könnte ebenfalls unter Einsatz von Hefe-Steuerungssequenzen zur intrazellulären oder extrazellulären Expression der hierin beschriebenen BMP-Faktoren durch Hefezellen konstruiert werden. [Siehe z. B. Verfahren, beschrieben in veröffentlichter PCT-Anmeldung WO86/00639 und Europäische Patentanmeldung EPA 123289].
Ein Verfahren zum Herstellen von hohen Graden eines hierin beschriebenen BMP-Proteins aus Säugetierzellen bezieht die Konstruktion von Zellen ein, welche multiple Kopien des heterologen Gens enthalten, welches für hierin beschriebene BMP-Proteine codiert. Das heterologe Gen kann mit einem amplifizierbaren Marker verbunden werden, zum Beispiel dem Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, für welches Zellen, welche erhöhte Genkopien enthalten, zur Propagierung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601–629 (1982) selektiert werden können. Diese Herangehensweise kann mit einer Anzahl an unterschiedlichen Zelltypen eingesetzt werden.
Zum Beispiel kann ein Plasmid, welches eine DNA-Sequenz für ein hierin beschriebenes BMP-Protein in operativer Verbindung mit anderen Plasmid-Sequenzen enthält, welche Expression dafür ermöglichen, und das DHFR Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)] durch Calciumphosphat-Copräzipitierung und Transfektion, Elektroporation oder Protoplast-Fusion in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII co-eingeführt werden. DHFR-exprimierende Transformanten werden zum Wachstum in Alpha-Medien mit dialysiertem fötalen Kalbserum selektiert und nachfolgend für Amplifikation durch Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX (aufeinander folgende Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX) selektiert, wie in Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben. Proteinexpression sollte mit steigenden Graden an MTX-Resistenz steigen. Transformanten werden geklont und die hierin beschriebenen BMP-Proteine werden aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und gereinigt. Kennzeichnung von exprimierten Proteinen kann unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Kennzeichnung Pulsmarkierung mit [35^S] Methionin oder Cystein oder Polyacrylamidgel-Elektrophorese einschließen. Biologisch wirksame Proteinexpression wird durch den in Beispiel III beschriebenen Rosen-modifizierten Sampath-Reddi Rattenknochenbildungstest überwacht. Es kann ähnlichen Verfahren gefolgt werden, um andere verwandte Proteine herzustellen.
Ein hierin beschriebenes BMP-Protein, welches Knorpel- und/ oder Knochenbildung unter Verhältnissen herbeiführt, wo Knochen- und/oder Knorpel normalerweise nicht gebildet wird, findet Anwendung beim Heilen von Knochenfrakturen und Knorpeldefekten in Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, welches ein hierin beschriebenes BMP-Protein einsetzt, kann prophylaktische Verwendung in geschlossener, als auch offener Frakturreduktion finden und auch in der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken. De novo-Knochenbildung, herbeigeführt durch einen osteogenen Wirkstoff, trägt zur Reparatur von kongenitalen, Trauma-induzierten oder durch onkologische Resektion induzierten kranio-facialen Defekten bei und ist auch in der kosmetischplastischen Chirurgie brauchbar. Ein hierin beschriebenes BMP-Protein kann bei der Behandlung von Periodontal-erkrankung und bei anderen Zahn-Reparaturverfahren verwendet werden. Solche Wirkstoffe können eine Umgebung vorsehen, um Knochen-bildende Zellen anzuziehen, Wachstum von Knochen-bildenden Zellen zu stimulieren oder Differentiation von Progenitoren von Knochenbildenden Zellen herbeizuführen. Eine Vielfalt an osteogenen, Knorpel-herbeiführenden und Knochen-herbeiführenden Faktoren ist beschrieben worden. Siehe z. B. Europäische Patentanmeldungen 148155 und 169016 für deren Diskussion.
Die hierin beschriebenen BMP-Proteine können auch in Wundheilung und verwandter Gewebereparatur verwendet werden. Die Wundarten schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Verbrennungen, Schnitte und Geschwüre. (Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO84/01106 für die Diskussion von Wundheilung und verwandter Gewebereparatur).
Die Erfindung offenbart eine therapeutische Zusammensetzung zum Reparieren von Frakturen und anderen Zuständen bezogen auf Knochen- und/oder Knorpeldefekte oder Periodontalerkrankungen. Zusätzlich offenbart die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen zur Wundheilung und Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der BMP-5-Proteine in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, Träger oder Matrix.
Es wird erwartet, dass die hierin beschriebenen BMP-Proteine in Zusammenarbeit mit oder vielleicht synergistisch miteinander oder mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken können. Therapeutische Zusammensetzungen umfassen daher ein oder mehrere der hierin beschriebenen BMP-Proteine. Weitere therapeutische Zusammensetzungen umfassen daher eine therapeutische Menge von mindestens einem hierin beschriebenen BMP-Protein mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der anderen „BMP"-Proteine, BMP-1, BMP-2 (BMP-2A, BMP-2 Klasse I), BMP-3, BMP-4 (BMP-2B, BMP-2 Klasse II), BMP-6 und BMR-7, welche in den oben beschriebenen gemeinsam besessenen und anhängigen US-Anmeldungen offenbart werden. Solche Zusammensetzungen können hierin beschriebene BMP-Proteine umfassen, oder Teile davon in Kombination mit den oben erwähnten „BMP"-Proteinen oder Teilen davon. Solch eine Kombination kann einzelne getrennte Moleküle von jedem der Proteine oder Heteromoleküle umfassen, wie durch Teile der jeweiligen Proteine gebildete Heterodimere. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung ein hierin beschriebenes BMP-Protein oder einen Teil davon, verbunden mit einem Teil eines „BMP"-Proteins umfassen, um ein Heteromolekül zu bilden.
Weitere therapeutische Zusammensetzungen umfassen die hierin beschriebenen BMP-Proteine oder Teile davon in Kombination mit weiteren Wirkstoffen, welche zur Behandlung des fraglichen Knochen- und/oder Knorpeldefekts, der Wunde oder des Gewebes zuträglich sind. Diese Wirkstoffe schließen verschiedene Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), k-Fibroblastenwachstumsfaktoren (kFGF), Parathormon (PTH), Leukämie hemmenden Faktor (LIP/HILDA DIA) und Insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGF-I und IFG-II) ein. Teile dieser Wirkstoffe können ebenfalls in den therapeutischen Zusammensetzungen verwendet werden.
Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch annehmbarer Proteinzusammensetzungen mit gebührender Berücksichtigung von pH, Isotonie, Stabilität und Ähnlichem liegt innerhalb der Fähigkeiten nach Stand der Technik. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind ebenfalls gegenwärtig wertvoll für veterinäre Anwendungen aufgrund des offensichtlichen Fehlens von Arten-Spezifität bei Knorpel- und Knochenwachstumsfaktorproteinen. Haustiere und Vollblutpferde sind zusätzlich zu Menschen erwünschte Patienten für solche Behandlung mit den hierin beschriebenen BMP-Proteinen.
Die Zusammensetzung wird topisch, systemisch oder lokal als Implantat oder Vorrichtung verabreicht. Bei der Verabreichung hat die therapeutische Zusammensetzung selbstverständlich eine Pyrogen-freie, physiologisch annehmbare Form. Ferner kann die Zusammensetzung wünschenswerterweise eingekapselt sein oder in einer viskosen Form zur Abgabe an die Stelle des Knorpel- und/ oder Knochen- oder Gewebeschadens injiziert werden. Topische Verabreichung kann für Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Vorzugsweise würde die Zusammensetzung für Knochen- und/ oder Knorpelbildung eine Matrix einschließen, welche in der Lage ist, die hierin beschriebenen BMP-Knorpel-/Knochenproteine an die Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens abzugeben, eine Struktur für den sich entwickelnden Knochen oder Knorpel vorzusehen und optimalerweise in der Lage sein, in den Körper resorbiert zu werden. Die Matrix kann langsame Abgabe der BMP-Proteine oder anderer Faktoren vorsehen, welche durch die Zusammensetzung umfasst werden. Solche Matrizes können aus Materialien gebildet werden, welche gegenwärtig für andere implantierte medizinische Anwendungen in Gebrauch sind.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf biologischer Kompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischer Erscheinung und Interface-Eigenschaften. Die besondere Anwendung der Zusammensetzungen wird die passende Formulierung definieren. Potentielle Matrizes für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubar sein und als Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride chemisch definiert werden. Weitere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizes setzen sich aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixbestandteilen zusammen. Weitere potentielle Matrizes sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramiken. Matrizes können aus Kombinationen von allen der oben erwähnten Materialtypen zusammengesetzt sein, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalci umphosphat. Die biologischen Keramiken können in der Zusammensetzung, wie in Calciumaluminatphosphat und der Verarbeitung verändert werden, um Porengröße, Partikelgröße, Partikelform und biologische Abbaubarkeit zu verändern.
Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt unter Erwägung verschiedener Faktoren bestimmt werden, welche die Wirkung der hierin beschriebenen BMP-Proteine modifizieren. Faktoren, welche die Wirkung der hierin beschriebenen BMP-Proteine modifizieren können, schließen die Menge an zu bildendem Knochengewicht, die Stelle der Knochenschädigung, den Zustand des geschädigten Knochens, die Größe einer Wunde, die Art des geschädigten Gewebes, das Alter, Geschlecht und die Diät des Patienten, die Schwere einer Infektion, die Zeit der Verabreichung und weitere klinische Faktoren ein. Die Dosierung kann mit dem Typ der bei der Rekonstitution verwendeten Matrix und dem Typ oder den Typen der in der Zusammensetzung vorhandenen Knochen- und/oder Knorpelproteine variieren. Die Zugabe weiterer bekannter Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF; TGF-α, TGF-β und IGF-I zur Endzusammensetzung kann ebenfalls die Dosierung beeinflussen.
Der Fortschritt kann durch periodische Bewertung von Knorpel- und/oder Knochenwachstum und/oder Reparatur überwacht werden. Der Fortschritt kann zum Beispiel unter Verwendung von Röntgenstrahlen, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetracyclin-Markierung überwacht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der vorliegenden Erfindung beim Gewinnen und Kennzeichnen von bovinen Knorpel- und/oder Knochenproteinen und Einsetzen dieser Proteine, um das/die entsprechende(n) menschliche(n) Protein oder Proteine zu gewinnen und beim Exprimieren der Proteine durch Rekombinant-Techniken.
BEISPIEL I
Isolierung von bovinem Knorpel/Knochen-herbeiführenden Protein
Zermahlenes Rinderknochenpulver (20–120 Maschenzahl, Helitrex) wird gemäß den Verfahren von M. R. Urist et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 70: 3511 (1973) mit Eliminierung von einigen Extraktionsschritten wie unten ausgewiesen hergestellt. Zehn kg des zermahlenen Pulvers werden in aufeinander folgenden Wechseln von 0,6 N HCl bei 4°C über einen Zeitraum von 48 Stunden mit kräftigem Rühren entmineralisiert. Die sich ergebende Suspension wird für 16 Stunden bei 4°C mit 50 Litern von 2 M CaCl₂ und 10 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure [EDTA] extrahiert und gefolgt von Extraktion für 4 Stunden in 50 Litern von 0,5 M EDTA. Der Rückstand wird drei Mal mit destilliertem Wasser gewaschen, bevor er in 20 Litern von 4 M Guanidin-hydrochlorid [GuCl], 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Iodacetamid, 1 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluor, wie in Clin. Orthop. Rel. Res., 171: 213 (1982) beschrieben, resuspendiert wird. Nach 16 bis 20 Stunden wird der Flüssigkeitsüberstand entfernt und durch weitere 10 Liter GuCl-Puffer ersetzt. Der Rückstand wird für weitere 24 Stunden extrahiert.
Die rohen GuCl-Extrakte werden vereinigt, auf das etwa 20-Fache an einem Pellicon-Apparat mit einer 10000 Molekulargewicht Cut-off-Membran konzentriert und dann in 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,2), dem Ausgangspuffer für die erste Säule dialysiert. Nach gründlicher Dialyse wird das Protein auf eine 4 Liter DEAE-Cellulosesäule geladen und die ungebundenen Fraktionen werden gesammelt.
Die ungebundenen Fraktionen werden konzentriert und gegen 50 mM NaAc, 50 mM NaCl (pH 4,6) in 6 M Harnstoff dialysiert. Die ungebundenen Fraktionen werden auf eine Carboxymethyl-Cellulosesäule angewendet. Nicht an die Säule gebundenes Protein wird durch gründliches Waschen mit Ausgangspuffer entfernt und das Material, welches Protein mit Knochen- und/oder Knorpelbildungswirksamkeit enthält, wie durch den Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Test gemessen (beschrieben in Beispiel III unten), wird durch 50 mM NaAc, 0,25 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 4,6) von der Säule desorbiert. Das Protein aus dieser Schritt-Elution wird 20- bis 40-fach konzentriert, dann 5 Mal mit 80 mM KPO₄, 6 M Harnstoff (pH 6,0) verdünnt. Der pH der Lösung wird mit 500 mM K₂HPO₄ auf 6,0 angepasst. Die Probe wird an einer Hydroxylapatit-Säule (LKB) angewendet, äquilibriert in 80 mM KPO₄, 6 M Harnstoff (pH 6,0), und alles ungebundene Protein wird durch Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer entfernt. Protein mit Knochen- und/oder Knorpelbildungswirksamkeit wird mit 100 mM KPO₄ (pH 7,4) und 6 M Harnstoff eluiert.
Das Protein wird etwa 10-fach konzentriert und festes NaCl wird zu einer Endkonzentration von 0,15 M zugegeben. Dieses Mate rial wird auf eine Heparin-Sepharose-Säule, äquilibriert in 50 mM KPO₄, 150 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) angewendet. Nach gründlichem Waschen der Säule mit Ausgangspuffer wird ein Protein mit Knochen- und/oder Knorpel-herbeiführender Wirksamkeit durch 50 mM KPO₄, 700 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) eluiert. Diese Fraktion wird zu einem minimalen Volumen konzentriert und 0,4 ml Aliquoten werden an Superose 6- und Superose 12-Säulen angewendet, welche in Serie verbunden sind, äquilibriert mit 4 M GuCl, 20 mM Tris (pH 7,2) und die Säulen werden bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,25 ml/Min. entwickelt. Das Protein, welches Knochen- und/oder Knorpel-herbeiführende Wirksamkeit zeigt, entspricht einem etwa 30000 Dalton-Protein.
Die obigen Fraktionen aus den Superose-Säulen werden gepoolt, gegen 50 mM NaAC, 6 M Harnstoff (pH 4,6) dialysiert und an einer Pharmacia MonoS HR-Säule angewendet. Die Säule wird mit einem Gradienten zu 1,0 M NaCl, 50 mM NaAc, 6 M Harnstoff (pH 4,6) entwickelt. Wirksame Knochen- und/oder Knorpelbildungsfraktionen werden gepoolt. Das Material wird an einer 0,46 × 25 cm Vydac C4-Säule in 0,1% TFA angewendet und die Säule wird mit einem Gradienten zu 90% Acetonitril, 0,1% TFA (31,5% Acetonitril, 0,1% TFA zu 49,5 Acetonitril, 0,1% TFA in 60 Minuten bei 1 ml pro Minute) entwickelt. Wirksames Material wird bei etwa 40–44% Acetonitril eluiert. Die Fraktionen wurden auf Knorpel- und/oder Knochenbildungswirksamkeit getestet. Das wirksame Material aus der C4-Umkehrphasensäule wird an einer MonoQ-Säule weiter fraktioniert. Das Protein wird gegen 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH 8,6, dialysiert und dann an einer 0,5 mal 5 cm MonoQ-Säule (Pharmacia) angewendet, welche mit einem Gradienten von 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH 8,6 und 0,5 M NaCl, 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH 8,6, entwickelt wird. Fraktionen werden mit 10% Trifluoressigsäure (TFA) auf pH 3,0 gebracht.
Aliquoten der passenden Fraktionen werden durch eines der folgenden Verfahren iodiert: P. J. McConahey et al., Int. Arch. Allergy, 29: 185–189 (1966); A. E. Bolton et al., Biochem. J., 133: 529 (1973) und D. F. Bowen-Pope, J. Biol. Chem., 237: 5161 (1982). Die in diesen Fraktionen vorhandenen iodierten Proteine werden durch SDS-Gel-Elektrophorese analysiert.
BEISPIEL II
Kennzeichnung von bovinem Knorpel-/Knochen-herbeiführenden Faktor
A. Molekulargewicht
Etwa 5 μg Protein von Beispiel I in 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH 8,6, etwa 0,3 M NaCl werden bezüglich SDS auf 0,1% gebracht und gegen 50 mM Tris/HCl 0,1% SDS, pH 7,5, für 16 Std. dialysiert. Das dialysierte Material wird dann gegen eine Dialysemembran elektrophoretisch konzentriert [Hunkapillar et al., Meth. Enzymol. 91: 227–236 (1983)] mit einer kleinen Menge an I 125 markiertem Gegenstück. Dieses Material (Volumen etwa 100 μl) wird auf ein 12% Polyacrylamidgel geladen und SDS-PAGE unterworfen [Laemmli, U. K. Nature, 227: 680–685 (1970)], ohne die Probe mit Dithiothreitol zu reduzieren. Das Molekulargewicht wird, bezogen auf vorgefärbte Molekulargewichtstandards, bestimmt (Bethesda Research Labs). Nach Autoradiographie des unfixierten Gels wird das etwa 28000–30000 Dalton-Band ausgeschnitten und das Protein elektrophoretisch aus dem Gel eluiert (Hunkapillar et al., supra). Basierend auf ähnlich gereinigten Knochenfraktionen, wie in den gleichzeitig anhängigen, oben beschriebenen „BMP"-Anmeldungen beschrieben, worin Knochen- und/ oder Knorpelwirksamkeit in der 28000–30000 Region gefunden wird, wird gefolgert, dass dieses Band Knochen- und/oder Knorpel-herbeiführende Fraktionen umfasst.
B. Untereinheit-Kennzeichnung
Die Untereinheitszusammensetzung des isolierten bovinen Knochenproteins wird ebenfalls bestimmt. Das oben beschriebene eluierte Protein wird vollständig reduziert und alkyliert in 2% SDS unter Verwendung von Iodacetat und Standardverfahren und durch elektrophoretische Packung rekonzentriert. Die vollständig reduzierte und alkylierte Probe wird dann weiter SDS-PAGE an einem 12% Gel unterzogen und die sich ergebende etwa 14000–20000 Dalton-Region mit einer Dublett-Erscheinung durch Autoradiographie des unfixierten Gels lokalisiert. Ein schwaches Band verbleibt an der 28000–30000 Region. So ergibt das 28000–30000 Dalton Protein eine breite Region von 14000–20000, welche ansonsten auch interpretiert und beschrieben werden kann als zwei breite Bänder von etwa 14000–16000 und 16000–20000 Dalton umfassend.
BEISPIEL III
Rosen-modifizierter Sampath-Reddi-Test
Eine modifizierte Version des Rattenknochenbildungstests, beschrieben in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591–6595 (1983) wird verwendet, um Knochen und/oder Knorpelwirksamkeit der hierin beschriebenen BMP-Proteine zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hierin der Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Test genannt. Der Ethanol-Ausfällungsschritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch Dialysieren (falls die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltrieren (falls die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann wieder in 0,1% TFA gelöst und die sich ergebende Lösung zu 20 mg Rattenmatrix zugegeben. Eine Rattenmatrix-Scheinprobe, welche nicht mit dem Protein behandelt wird, dient als Kontrolle. Dieses Material wird gefroren und gefriergetrocknet und das sich ergebende Pulver wird in #5 Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in den abdominalen Thoraxbereich von 21–49 Tage alten männlichen Long Evans Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 5–12 Tagen entfernt. Die Hälfte eines jeden Implantats wird zur Alkali-Phosphatase-Analyse verwendet [Siehe A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69: 1601 (1972)].
Die andere Hälfte von jedem Implantat wird fixiert und zur histologischen Analyse verarbeitet. Glycolmethacrylat-Abschnitte (1 μm) werden mit Von Kossa und Säure Fuschin oder Toluidine blue eingefärbt, um die Menge an herbeigeführter vorhandener Knochen- und Knorpelbildung in jedem Implantat zu bewerten. Die Begriffe +1 bis +5 repräsentieren den Bereich jedes histologischen Abschnitts eines Implantats, der durch neue Knochen- und/oder Knorpelzellen besetzt ist und neu gebildeten Knochen und Matrix. Zwei Bewertungsverfahren werden hierin beschrieben. Das erste beschreibt das ursprüngliche Bewertungsverfahren, während das zweite das später angenommene Bewertungsverfahren beschreibt. Eine Bewertung von +5 zeigt an, dass mehr als 50% des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, welcher als direkte Folge von Protein im Implantat hergestellt wurde. Eine Bewertung von +4, +3, +2 und +1 würde anzeigen, dass mehr als 40%, 30%, 20% bzw. 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthalten. Das später angenommene Bewertungsverfahren (welches hiernach als das „modifizierte" Bewertungsverfahren bezeichnet wer den kann) ist wie folgt: Drei nicht benachbarte Abschnitte werden von jedem Implantat bewertet und Bemittelt. „+/-" zeigt probeweise Identifizierung von Knorpel oder Knochen an; „+1" zeigt an, dass >10% von jedem Abschnitt neuer Knorpel oder Knochen ist; „+2", >25%; „+3", >50%; „+4", ~75%; „+5", >80%. Ein „-" zeigt an, dass das Implantat nicht zurückgewonnen wird. Die Bewertungen der einzelnen Implantate werden tabellarisch angeordnet, um Testvariabilität anzuzeigen. Es wird erwogen, dass die Dosis-Response-Art der Knorpel- und/oder Knochen-herbeiführendes Protein enthaltenden Proben der Matrixproben zeigen werden, dass die Menge an gebildetem Knochen und/oder Knorpel mit der Menge an Knorpel/Knochen-herbeiführendem Protein in der Probe steigt. Es wird erwogen, dass die Kontrollproben keine Knochen- und/oder Knorpelbildung ergeben werden.
Wie bei anderen Knorpel- und/oder Knochen-herbeiführenden Proteinen wie den oben erwähnten „BMP"-Proteinen wird von dem gebildeten Knochen und/oder Knorpel erwartet, dass er physikalisch auf den durch die Matrix besetzten Platz beschränkt bleibt. Proben werden ebenfalls durch SDS-Gel-Elektrophorese und isoelektrisches Fokussieren, gefolgt von Autoradiographie analysiert. Die Wirksamkeit wird mit den Proteinbändern und pI korreliert. Um die Reinheit des Proteins in einer bestimmten Fraktion zu schätzen, wird ein Extinktionskoeffizient von 1 OD/ mg-cm als Schätzung für Protein verwendet und das Protein wird an einem SDS-PAGE laufen gelassen, gefolgt von Silberfärbung oder Radioiodierung und Autoradiographie.
BEISPIEL IV
Bovine BMP-5-Proteinzusammensetzung
Die in Beispiel IIB beschriebene Gelscheibe aus der etwa 14000–20000 Dalton-Region wird mit Methanol-Essigsäure-Wasser unter Verwendung von Standardverfahren fixiert, kurz mit Wasser gespült, dann mit 0,1 M Ammoniumbicarbonat neutralisiert. Nach Würfeln der Gelscheibe mit einer Rasierklinge wird das Protein durch Zugeben von 0,2 μg TPCK-behandeltem Trypsin (Worthington) und Inkubieren des Gels für 16 Std. bei 37°C aus der Gelmatrix digeriert. Das sich ergebende Digerierte wird dann unter Verwendung einer C4 Vydac RPHPLC-Säule und 0,1% TPA-Wasser 0,1% TPA Wasser-Acetonitril-Gradient RPHPLC unterworfen. Die sich erge benden Peptid-Peaks wurden durch UV-Extinktion bei 214 und 280 nm überwacht und direkter Amino-terminaler Aminosäure-Sequenz-Analyse unter Verwendung eines Applied Biosystems Gasphasen-Sequenators (Model 470A) unterworfen. Ein tryptisches Fragment wird durch Standardverfahren isoliert, welches die folgende Aminosäuresequenz hat, wie durch die Aminosäure-Drei-Buchstaben Standardsymbole dargestellt, und wo „Xaa" eine unbekannte Aminosäure anzeigt, die Aminosäure in Klammern Ungewissheit anzeigt in der Sequenz:
Xaa-His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe-(Ser)
Die folgenden vier Oligonukleotid-Sonden werden auf Basis der Aminosäure-Sequenz des oben identifizierten tryptischen Fragments entworfen und an einem automatisierten DNA-Synthesizer synthetisiert.

Sonde #1: GTRCTYGANATRCANTC
Sonde #2: GTRCTYGANATRCANAG
Sonde #3: GTRCTYAAYATRCANTC
Sonde #4: GTRCTYAAYATRCANAG

Die Nukleotid-Standardsymbole in den oben identifizierten Sonden sind wie folgt: A, Adenin; C, Cytosin; G, Guanin; T, Thymin; N, Adenin oder Cytosin oder Guanin oder Thymin; R, Adenin oder Guanin; und Y, Cytosin oder Thymin.
Jede der Sonden besteht aus Pools von Oligonukleotiden. Weil der genetische Code degeneriert ist (mehr als ein Codon kann für die gleiche Aminosäure codieren), wird ein Gemisch aus Oligonukleotiden synthetisiert, das alle möglichen Nukleotid-Sequenzen enthält, welche für die Aminosäure-Sequenz des tryptischen codieren. Diese Sonden werden radioaktiv markiert und eingesetzt, um eine bovine cDNA-Bibliothek zu screenen, wie unten beschrieben.
Poly(A) enthaltende RNA wird isoliert durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie aus Gesamt-RNA, isoliert aus fötalen bovinen Knochenzellen durch das Verfahren von Gehron-Robey et al., in Current Advances in Skeletoaenesis, Elsevier Science Publishers (1985). Die Gesamt-RNA wurde von Dr. Marion Young, National In stitute of Dental Research, National Institutes of Health erhalten. Eine cDNA-Bibliothek wird in lambda gt10 (Toole et al., supra) bereitet und auf 50 Platten bei 8000 Rekombinanten pro Platte plattiert. Diese Rekombinanten (400000) werden an doppelten Nitrocellulosefiltern mit einer Kombination aus Sonde 1, 2, 3 und 4 unter Verwendung des Tetramethylammoniumchlorids (TMAC) Hybridisierungsverfahrens gescreent [siehe Wozney et al., Science, 242: 1528–1534 (1988)]. Achtundzwanzig Positive werden erhalten und für Sekundäre wieder plattiert. Es werden wieder doppelte Nitrocelluloserepliken bereitet. Ein Satz Filter wird mit Sonden 1 und 2 gescreent, der andere mit Sonden 3 und 4. Es werden sechs Positive an dem ersteren und 21 Positive mit dem letzteren erhalten. Eine der sechs, genannt HEL5, wird Plaquegereinigt, ein Phagen-Plattenvorrat wird bereitet und Bakteriophage DNA wird isoliert. Diese DNA wird mit EcoRI digeriert und in M13 und pSP65 subkloniert (Promega Biotec, Madison, Wisconsin) [Melton, et al., Nucl. Acids Res. 12: 7035–7056 (1984)]. Die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz dieses Fragments wird in Tabelle I gezeigt.
Die DNA-Sequenzanalyse dieses Fragments in M13 zeigt an, dass es für die oben dargestellte, gewünschte, tryptische Peptidsequenz codiert und dieser abgeleiteten Aminosäure-Sequenz geht eine basischer Rückstand (Lys) voraus, wie durch die Spezifizität von Trypsin vorausgesagt. Der unterstrichene Teil der Sequenz in Tabelle I von Aminosäure # 42 bis # 48 entspricht dem oben identifizierten, tryptischen Fragment, aus welchem die Oligonukleotidsonden entworfen werden. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz Ser-Gly-Ser-His-Gln-Asp-Ser-Ser-Arg, wie in Tabelle I dargestellt, von Aminosäure # 15 bis # 23 ist merklich ähnlich einer tryptischen Fragment-Sequenz Ser-Thr-Pro-Ala-Gln-Asp-Val-Ser-Arg, welche in dem 28000–30000 Dalton gereinigten Knochenniederschlag gefunden wurde, wie in den oben erwähnten, gemeinsam anhängigen „BMP"-Anmeldungen beschrieben. Dieses in Tabelle I dargestellte Fragment ist ein Teil der DNA-Sequenz, welche für das bovine BMP-5-Protein codiert. Die DNA-Sequenz zeigt einen offenen Leserahmen vom 5' Ende des Klons von 420 Basenpaaren an, welche für ein Teilpeptid von 140 Aminosäureresten codiert (die ersten 7 Nukleotide sind von den Adaptoren, welche in dem Klonierungsverfahren verwendet werden). Ein In-Frame Stop-Codon (TAA) zeigt an, dass dieser Klon für den Carboxy-terminalen Teil des bovinen BMP-5 Knorpel-/Knochen-Proteins codiert.
TABELLE 1
Die verbleibenden positiven Klone, isoliert mit den oben beschriebenen Sonden #1, #2, #3 und #4 werden mit HEL5 gescreent und ein weiterer Klon wird identifiziert, der unter reduzierten Hybridisierungsbedingungen [5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardt's, 100 1 g/ml Lachssperma DNA Standard-Hybridisierungspuffer (SHB) bei 65#C, Wäsche in 2 × SSC 0,1% SDS bei 65#C] hybridisiert. Dieser Klon wird Plaque-gereinigt, ein Phagen-Plattenvorrat wird bereitet und Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz eines Teils dieses Klons wird in Tabelle II gezeigt. Diese Sequenz stellt die DNA-Sequenz dar, welche für ein BMP-Knorpel-/Knochenprotein codiert.
Der erste unterstrichene Teil der Sequenz in Tabelle II von Aminosäure # 97 bis Aminosäure # 105 entspricht dem tryptischen Fragment, gefunden in dem 28000–30000 Dalton gereinigten bovinen Kochenpräparat (und seiner reduzierten Form bei etwa 18000–20000 Dalton reduzierten Form), wie in den oben erwähnten gleichzeitig anhängigen „BMP"-Anmeldungen beschrieben. Die zweite unterstrichene Sequenz in Tabelle II von Aminosäure # 124 bis Aminosäure # 130 entspricht dem oben identifizierten tryptischen Fragment, aus welchem die Oligonukleotid-Sonden entworfen werden.
Die DNA-Sequenz von Tabelle II zeigt einen offenen Leserahmen von 666 Basenpaaren an, beginnend vom 5' Ende der Sequenz von Tabelle II, welche für ein Teilpeptid aus 222 Aminosäureresten codieren. Ein Stop-Codon im Rahmen (TGA) zeigt an, dass dieser Klon für den Carboxy-terminalen Teil des hierin beschriebenen bovinen BMP-6-Proteins codiert. Basierend auf den Kenntnissen über andere BMP-Proteine und andere Proteine in der TGF-b-Familie wird vorausgesagt, dass das Vorläufer-Polypeptid an den drei basischen Resten (ArgArgArg) gespalten würde, um ein reifes Peptid zu ergeben, beginnend mit Rest 90 oder 91 der Sequenz von Tabelle II.
Tabelle II
TABELLE II (fortgesetzt)
BEISPIEL V
Humane BMP-5-Proteine
Humane Zelllinien, welche BMP-5- und/oder BMP-6-mRNAs synthetisieren, werden auf folgende Weise identifiziert. RNA wird aus einer Vielfalt von humanen Zelllinien isoliert, nach Poly-(A)-enthaltender RNA durch Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose selektiert, an einem Formaldehyd-Agarosegel elektrophoretisiert und auf Nitrocellulose übertragen. Eine Nitrocellulose-Replik des Gels wird zu einer einzelsträngigen M13 ³²p-markierten Sonde hybridisiert, entsprechend dem oben erwähnten BMP-5 EcoRI-BgIII-Fragment, welches Nukleotide 1–465 der Sequenz von Tabelle I enthält. Ein stark hybridisierendes Band wird in der Bahn entsprechend der humanen Osteosarkom-Zelllinie U-20S RNA nachgewiesen. Eine weitere Nitrocellulose-Replik wird zu einer einzelsträngigen M13 ³²p-markierten Sonde hybridisiert, welche das PstI-SmaI-Fragment von bovinem BMP-6 enthält (entsprechend den Nukleotiden 106–261 von Tabelle II). Es wird gefunden, dass mehrere RNA-Arten in der Bahn, welche U-20S RNA entsprechen, zu dieser Sonde hybridisieren.
Es wird eine cDNA-Bibliothek im Vektor lambda ZAP (Stratagene) aus U-20S Poly(A)-enthaltender RNA unter Verwendung etablierter Techniken (Toole et. al.) bereitet. 750000 Rekombinanten aus dieser Bibliothek werden plattiert und Duplikat-Nitrocellulose-Repliken werden hergestellt. Das SmaI-Fragment von bovinem BMP-6, entsprechend Nukleotiden 259-751 von Tabelle II wird durch Nick-Translation markiert und zu beiden Filtersätzen in SHB bei 65° hybridisiert. Ein Filtersatz wird unter strengen Bedingungen (0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°) gewaschen, der andere unter reduzierten strengen Bedingungen (1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°). Viele Duplikat-hybridisierende Rekombinanten (etwa 162) werden vermerkt. 24 werden aufgenommen und für Sekundäre wieder plattiert. Es werden drei Nitrocellulose-Repliken aus jeder Platte bereitet. Eine wird zur BMP-6 SmaI-Sonde hybridisiert, eine zu einem Nick-translatierten BMP-6 PstI-SacI-Fragment (Nukleotide 106–378 von Tabelle II), und die dritte zu den Nicktranslatierten BMP-5 XbaI-Fragmenten (Nukleotide 1–76 von Tabelle I). Hybridisierung und Waschungen werden unter strengen Bedingungen durchgeführt.
17 Klone, die stärker zur dritten Sonde hybridisieren, als zur zweiten Sonde, werden Plaque-gereinigt. DNA-Sequenzanalyse von einem davon, U2-16, zeigte an, dass dieser für humanes BMP-5 codiert. U2-16 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland am 22. Juni 1989 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68019 hinterlegt. U2-16 enthält ein Insert von etwa 2,1 Kb. Die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz von U2-16 wird unterm in Tabelle III gezeigt. von diesem Klon wird erwartet, dass er die ganze Nukleotid-Sequenz enthält, die nötig ist, um für die BMP-5-Proteine zu codieren. Die cDNA-Sequenz von Tabelle III enthält einen offenen Leserahmen von 1362 bp, welcher für ein Protein aus 454 Aminosäuren codiert, dem eine 5'-nicht-translatierte Region von 700 bp vorausgeht, mit einem Stop-Codon in allen Rahmen, und enthält eine 3'-nicht-translatierte Region von 90 bp, welche dem Stop-Codon im Rahmen (TAA) folgt.
Dieses Protein aus 454 Aminosäuren hat ein Molekulargewicht von etwa 52000 kd, wie durch seine Aminosäure-Sequenz vorausgesagt, und es wird erwogen, dass es das primäre Translationsprodukt darstellt. Basierend auf den Kenntnissen über die anderen BMP-Proteine und andere Proteine innerhalb der TGF-b-Familie, kann Spaltung des Vorläufer-Polypeptids nach dem tribasischen Peptid Lys Arg Lys stattfinden, was ein 132 Aminosäure-reifes Peptid, beginnend mit Aminosäure # 323 „Asn" ergibt. Jedoch ist die Gegenwart von di- oder tribasischer Aminosäure-Sequenz nicht eine absolute Anforderung für proteolytische Verarbeitung, da von einer Anzahl von Prohormonen bekannt ist, dass sie nach einzelnen Argininen verarbeitet werden, welche einer übereinstimmenden Spaltungs-Sequenz Arginin-X-X-Arginin entsprechen. Es wird daher erwogen, dass das Vorläufer-Polypeptid nach der Arg-Ser-Val-Arg-Sequenz proteolytisch verarbeitet wird, was ein Polypeptid ergibt, welches 138 Aminosäuren von Aminosäure # 317 (Ala) bis # 454 (His) umfasst, wie in Tabelle III gezeigt, mit einem errechneten Molekulargewicht von 15,6 kD. Von der Verarbeitung von BMP-5 in die reife Form wird erwartet, dass sie Dimerisation und Entfernung der N-terminalen Region auf eine Weise einbezieht, welche zu dem Verarbeiten des verwandten Proteins TGF-β analog ist [L. E. Gentry, et al., Molec. & Cell. Biol. 8: 4162 (1988); R. Dernyck, et al., Nature 316: 701 (1985)].
Es wird daher erwogen, dass die reifen wirksamen Arten von BMP-5 ein Homodimer von 2 Polypeptid-Untereinheiten umfassen, wobei jede Untereinheit Aminosäure # 323 – # 454 mit einem vor ausgesagten Molekulargewicht von etwa 15000 Daltons umfasst. Weitere wirksame BMP-5-Arten werden erwogen, zum Beispiel Proprotein-Dimere oder Proprotein-Untereinheiten, welche an reife Untereinheiten gebunden sind. Zusätzliche wirksame Arten können Aminosäure # 329 – # 454 enthalten, wobei solche Arten homolog die in dem gereinigten bovinen Material gefundenen tryptischen Sequenzen einschließen. Es werden ebenfalls BMP-5-Proteine erwogen, welche Aminosäuren # 353 – # 454 umfassen, wobei sie den ersten konservierten Cysteinrest einsschließen.
Die unterstrichene Sequenz von Tabelle III von Aminosäure # 329 bis # 337 Ser-Ser-Ser-His-Gln-Asp-Ser-Ser-Arg teilt Homologie mit der bovinen Sequenz von Tabelle I von Aminosäure # 15 bis # 23, wie oben in Beispiel IV diskutiert. Jede dieser Sequenzen teilt Homologie mit einer tryptischen Fragment-Sequenz Ser-Thr-Pro-Ala-Gln-Asp-Val-Ser-Arg, gefunden in dem 28000–30000 Dalton gereinigten Knochenpräparat (und seiner reduzierten Form bei etwa 18000–20000 Dalton) wie in den oben erwähnten, gleichzeitig anhängigen „BMP"-Anmeldungen beschrieben.
Die unterstrichene Sequenz von Tabelle III von Aminosäure # 356 bis # 362 His-Glu-Leu-Tyr-val-Ser-Phe entspricht dem tryptischen Fragment, identifiziert in dem oben beschriebenen bovinen Knochenpräparat, aus welchem die Oligonukleotid-Sonden entworfen werden.
TABELLE III
TABELLE III(a)
TABELLE III(b)
TABELLE III (C)
Die entsprechende bovine und humane BMP-5-Genomsequenz kann unter Verwendung der in Tabelle I und Tabelle III dargestellten cDNA-Sequenzen als Sonden, um genomische Bibliotheken zu screenen, unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Techniken isoliert werden.
Wenn die oben beschriebene tryptische Sequenz His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe-(Ser) identifiziert wurde, wurde vermerkt, dass sie ähnlich der Sequenz His-Pro-Leu-Tyr-Val-Asp-Phe-Ser war, welche in der bovinen und humanen Knorpel-/Knochenprotein BMP-2A-Sequenz gefunden wurde. Humanes BMP-5 teilt Homologie mit anderen BMP-Molekülen, als auch anderen Mitgliedern der TGF-b-Superfamilie von Molekülen. Die Cystein-reichen Carboxy-terminalen 102 Aminosäurereste von humanem BMP-5 teilen die folgenden Homologien mit BMP-Proteinen, offenbart in der oben beschriebenen gleichzeitig anhängigen Anmeldung: 61% Identität mit BMP-2; 43% Identität mit BMP-3, 59% Identität mit BMP-4; 91% Identität mit BMP-6 und 88% Identität mit BMP-7. Humanes BMP-5 teilt ferner die folgenden Homologien: 38% Identität mit TGF-β3; 37% Identität mit TGF-b2; 36% Identität mit TGF-b1; 25% Identität mit Mullerian Inhibiting Substance (MIS), ein testikuläres Glycoprotein, welches Regression des Müller-Gangs während der Entwicklung des männlichen Embryos verursacht; 25% Identität mit Inhibin a; 38% Identität mit Inhibin b_B; 45% Identität mit Inhibin b_A; 56% Identität mit Vgl, einem Xenopus-Faktor, welcher bei mesodermer Induktion in früher Embryogenese beteiligt sein kann (Lyons, et al., PNAS USA 86: 4554–4558 (1989)]; und 57% Identität mit Dpp, dem Produkt des Drosophila decapentaplegischen locus, welcher zur dorsalen-ventralen Spezifikation in früher Embryogenese erforderlich ist und in verschiedenen weiteren Entwicklungsprozessen bei späteren Entwicklungsstadien beteiligt ist [Padgett, et al., Nature 325: 81–84 (1987)].
Die oben beschriebenen Verfahren und zusätzliche Verfahren, welche den Fachleuten bekannt sind, können eingesetzt werden, um weitere verwandte Proteine von Interesse unter Nutzung der bovinen oder humanen Proteine als Sondenquellen zu isolieren. Solche weiteren Proteine können ähnlichen Nutzen bei unter anderem Frakturreparatur, Wundheilung und Gewebereparatur finden.
BEISPIEL VI
Expression der BMP-5-Proteine
Um bovine, humane oder andere hierin offenbarte Säugetierproteine herzustellen, wird die DNA, welche es codiert, in einen passenden Expressionsvektor übertragen und in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch herkömmliche gentechnische Verfahren eingeführt. Es wird erwogen, dass das bevorzugte Expressionssystem für biologisch wirksame, rekombinierte, hierin beschriebene humane Proteine, stabile transformierte Säugetierzellen sein können. Für Übergangsexpression ist die Zelllinie der Wahl SV40, transformiertes African Green Monkey Nieren COS-1 oder COS-7, welches typischerweise mäßige Mengen des Proteins herstellt, codiert innerhalb des Plasmids, für einen Zeitraum von 1–4 Tagen. Für stabile hochgradige Expression wird ferner erwogen, dass die bevorzugten Säugetierzellen Eierstockzellen (CHO) von Chinesischen Hamstern sind.
Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und das dadurch exprimierte BMP-5-Protein wird gewonnen, isoliert und gereinigt. Kennzeichnung von exprimierten Proteinen wird unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt. Zum Beispiel kann Kennzeichnung Pulsmarkierung mit [³5^S] Methionin oder Cystein einschließen und Analyse durch Polyacrylamid-Elektrophorese. Die rekombiniert exprimierten BMP-5-Proteine sind frei von proteinartigem Material, mit welchem sie zusammen hergestellt werden, und mit welchem sie gewöhnlich in der Natur verbunden sind, als auch von anderen Verunreinigungen, wie Materialien, welche in den Kulturmedien gefunden werden.
Um biologisch wirksames, humanes BMP-5 zu exprimieren, wird eine ausgewählte Wirtszelle unter Verwendung von den Fachleuten der Gentechnik bekannten Verfahren mit einer DNA-Sequenz transformiert, welche für ein humanes BMP-5-Protein codiert. Die DNA umfasst die Nukleotid-Sequenz von Nukleotid # 1665 bis # 2060, dargestellt in Tabelle III, welche für Aminosäure # 323 bis # 454 codiert. Die DNA kann die DNA-Sequenz von Nukleotid # 699 bis # 2060 umfassen, dargestellt in Tabelle III. Die transformierten Wirtszellen werden gezüchtet und das BMP-5-Protein, welches die Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 323 bis Aminosäure # 454, dargestellt in Tabelle III umfasst, wird exprimiert. Das exprimierte Protein wird gewonnen, isoliert und von der Kultur und Kulturmedium gereinigt. Das gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen proteinhaltigen Materialien, mit welchen es zusammen hergestellt wird, und von anderen Verunreinigungen.
A. Vektor-Konstruktion
Wie oben beschrieben, können zahlreiche nach Stand der Technik bekannte Expressionsvektoren bei der Expression der hierin offenbarten BMP-Proteine genutzt werden. Die in den folgenden Beispielen genutzten Vektoren sind pMT21, ein Derivat von pMT₂ und pEMC2β1, abgeleitet von pMT21, obwohl andere Vektoren in der Praxis der Erfindung geeignet sein können.
pMT₂ wird von pMT2-VWF abgeleitet, welches mit der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD (USA) unter Hinterlegungsnummer ATCC 67122 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden ist. EcoRI-Digestion schneidet das in pMT-VWF vorhandene cDNA-Insert aus, was mPT2 in linearer Form ergibt, welches ligatiert und verwendet werden kann, um E. Coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
pMT21 wird dann unter Verwendung von Loopout/in Mutagenese [Morinaga et al., Biotechnology 84: 636 (1984)] konstruiert. Dies entfernt Basen 1075 bis 1170 (inklusiv). Zusätzlich insertiert es die folgende Sequenz: 5' TCGA 3'. Diese Sequenz vervollständigt eine neue Restriktionsstelle XhoI. Dieses Plasmid enthält nun 3 einzigartige Klonierungsstellen PstI, EcoRI und XhoI.
Zusätzlich wird pMT21 mit EcoRV und XhoI digeriert, die digerierte DNA wird mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und 1igatierenden ClaI-Linkern behandelt (NEBio Labs. CATCGATG). Dies entfernt Basen 2171 bis 2420, ausgehend von der HindIII-Stelle nahe den SV40-Replikationsursprungs- und Verstärker-Sequenzen von pMT2 und führt eine einzigartige ClaI-Stelle ein, aber läßt das Adenovirus VAI-Gen intakt.
pEMC2β1 wird von pMT21 abgeleitet. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI geschnitten, welches das Plasmid, zwei angrenzende Klonierungsstellen, welche sich nach dem IgG-Intron befinden, spaltet. Ein EMCV-Fragment von 508 Basenpaaren wird von pMT₂ECAT₁ [S. K. Jong, et al., V. Virol. 63: 1651–1660 (1989)] mit den Restriktionsenzymen EcoRI und TagαI geschnitten. Ein Paar Oligonukleotide 68 Nukleotide cga ggttaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg attgc in Länge werden synthetisiert, um die EMCV-Sequenz bis zu dem ATG zu duplizieren. Das ATG wird in ein ATT verändert und ein C wird hinzugefügt, was eine XhoI-Stelle am 3'-Ende erzeugt. Eine tagαI-Stelle befindet sich am 5'-Ende. Ligation des MT21 EcoRI bis XhoI-Fragments zum EMCV EcoRI bis TagαI-Fragment der TagαI/XhoI-Oligonukleotide erzeugt den Vektor EMC@B1. Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und Verstärker, den Adenovirus Haupt-Spät-Promotor, eine cDNA-Kopie der Mehrheit der Adenovirus-Tripartite-Leitsequenz, eine kleine Hybrid-intervenierende Sequenz, ein SV40- Polyadenylierungssignal und das Dadenovirus vA I-Gen, DHFR und B-Lactamase-Marker und eine EMC-Sequenz in passender Beziehung, um die hochgradige Expression der gewünschten cDNA in Säugetierzellen zu steuern.
B. BMP-5-Vektorkonstruktion
Ein Derivat der in Tabelle III dargestellten BMP-5 cDNR-Sequenz, welches die Nukleotid-Sequenz von Nukleotid # 699 bis # 2070 umfasst, wird spezifisch amplifiziert. Die Oligonukleotide CGACCTGCAGCCACCATGCATCTGACTGTA und TGCCTGCAGTTTAATATTAGTGGCRGC werden als Primer genutzt, um Amplifikation von Nukleotid-Sequenz # 699 bis # 2070 von Tabelle III von dem oben in Beispiel V beschriebenen Insert von Klon U2-16 zu erlauben. Dieses Verfahren führt die Nukleotid-Sequenz CGACCTGCAGCCACC gleich vor Nukleotid # 699 ein und die Nukleotid-Sequenz CTGCAGGCA gleich nach Nukleotid # 2070. Die Hinzufügung dieser Sequenzen ergibt die Erzeugung von PstI-Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragments. Das sich ergebende amplifizierte DNA-Produkt dieses Verfahrens wird mit der Restriktionsendonuklease PstI digeriert und in die PstI-Stelle des oben beschriebenen pMT2 Derivats pMT21 subkloniert. Der sich ergebende Klon wird als H5/5/pMT bezeichnet.
Das Insert von B5/5/pMT wird durch PstI-Digestion ausgeschnitten und in den Plasmidvektor pSP65 an der PstI-Stelle subkloniert, was BMP5/SP6 ergab. BMP5/SP6 und U2-16 werden mit den Restriktionsendonukleasen NsiI und NdeI digeriert, um den Teil ihrer Inserte auszuschneiden, der den Nukleotiden # 704 bis # 1876 von Tabelle III entspricht. Das sich ergebende 1173 Nukleotid NsiI-NdeI-Fragment von Klon U2-16 wird in die NsiI-NdeI-Stelle von BMP5/SP6 ligatiert, von welcher das entsprechende 1173 Nukleotid NsiI-NdeI-Fragment entfernt worden ist. Der sich ergebende Klon wird als BMP5mix/SP64 bezeichnet.
Direkte DNA-Sequenzanalyse von BMP5mix/SP64 wird durchge führt, um Identität der Nukleotid-Sequenzen, hergestellt durch die Amplifikation von jenen, welche in Tabelle III dargestellt werden, zu bestätigen. Der Klon BMP5mix/SP64 wird mit der Restriktionsendonuklease PstI digeriert, was Ausschnitt eines Inserts ergibt, welches die Nukleotide # 699 bis # 2070 von Tabelle III umfasst und die zusätzlichen Sequenzen, welche die PstI-Erkennungsstellen umfassen, wie oben beschrieben. Das sich ergebende 1382 Nukleotid PstI-Fragment wird in die PstI-Stelle des pMT2-Derivats pMT21 und pEMC2β1 subkloniert. Diese Klone werden als BMP5mix/pMT21#2 und BMp5mix/EMC#11 bezeichnet.
BEISPIEL VII
Transiente COS-Zellexpression
Um transiente Expression von BMP-5-Proteinen zu erhalten, wird ein Vektor, welcher die cDNA für BMP-5, BMP5mix/pMT21#2 enthält, in COS-1 Zellen unter Verwendung des Elektroporationsverfahrens transfiziert. Weitere geeignete Transfektionsverfahren schließen DEAE-Dextran und Lipofektion ein. Etwa 48 Stunden später werden Zellen für Expression von sowohl intrazellulärem, als auch sekretiertem BMP-5-Protein durch metabolische Markierung mit [³⁵S] Methionin und Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Intrazelluläres BMP wird in Zellen analysiert, welche mit Tunicamycin behandelt werden, einem Hemmer von N-verbundener Glycosylierung. In Tunicamycin-behandelten Zellen migriert das nicht-glycosylierte primäre Translationsprodukt als homogenes Band von vorhersehbarer Größe und ist häufig leichter in Polyacrylamidgels zu erkennen, als die glycosylierte Form des Proteins. In jedem Fall wird intrazelluläres Protein in Tunicamycinbehandelten Zellen mit einer Duplikat-Platte aus transfizierten, aber nicht behandelten COS-1 Zellen verglichen.
Die Ergebnisse zeigen, dass intrazelluläre Formen von BMP-5 aus etwa 52 Kd und 57 Kd durch COS-Zellen bereitet werden. Das 52 Kd Protein hat die durch die primäre Sequenz des BMP-5 cDNA-Klons vorausgesagte Größe. Nach Behandlung der Zellen mit Tunicamycin wird nur die 52 Kd-Form von BMP-5 hergestellt, was darauf hinweist, dass das 57 Kd-Protein ein glycosyliertes Derivat des 52 Kd primären Translationsprodukts ist. Das 57 Kd-Protein wird in das konditionierte Medium sekretiert und wird offensichtlich nicht effizient durch COS-1 Zellen in die pro und reifen Peptide verarbeitet.
BEISPIEL VIII CHO-Zellexpression
DHFR-defiziente CHO-Zellen (DUKX B11) werden durch Elektroporation mit oben beschriebenen BMP-5 Expressionsvektoren transfiziert und für Expression von DHFR durch Wachstum in Nukleosidfreien Medien selektiert. Andere Transfektionsverfahren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf CaPO₄-Ausfällung, Protoplast-Fusion, Mikroinjektion und Lipofektion können ebenfalls eingesetzt werden. Um höhere Expressionsgrade zweckdienlicher zu erreichen, können Zellen in Nukleosid-freien Medien, ergänzt mit 5 nM, 20 nM oder 100 nM MTX selektiert werden. Da der DHFR-selektierbare Marker physikalisch an die BMP-5 cDNA als zweites Gen einer bicistronischen Codierungsregion gebunden ist, sollten Zellen, welche DHFR exprimieren, auch das BMP-5 exprimieren, für welches innerhalb des Cistrons aufwärts codiert wird. Entweder einzelne Klone oder Pools von kombinierten Klonen werden expandiert und für Expression von BMP-Protein analysiert. Zellen werden in schrittweise steigenden Konzentrationen von MTX (5 nM, 20 nM, 100 nM, 500 nM, 2 uM, 10 uM und 100 uM) selektiert, um Zelllinien zu erhalten, welche multiple Kopien der Expressionsvektor-DNA durch Genamplifikation enthalten, und somit große Mengen an BMP-5-Protein sekretieren.
Unter Verwendung von Standardverfahren werden Zelllinien für Expression von BMP-5 RNA-Protein oder Wirksamkeit gescreent und hoch exprimierende Zelllinien werden am passenden Selektionsgrad kloniert oder rekloniert, um eine homogenere Zellpopulation zu erhalten. Die sich ergebende Zelllinie wird dann für BMP-5 DNA-Sequenzen und Expression von BMP-5 RNA und Protein weiter gekennzeichnet. Geeignete Zelllinien können dann zum Herstellen von rekombiniertem BMP-Protein verwendet werden.
Die oben beschriebenen BMP-5-Vektoren BMP5mix/pMT21#2 und BMP5mix/EMC#11 werden durch Elektroporation in CHO-Zellen transfiziert und Zellen werden für Expression von DHFR in Nukleosidfreiem Medium selektiert. Klonale Zelllinien werden aus einzelnen Kolonien erhalten und werden nachfolgend schrittweise für Resistenz gegenüber MTX selektiert und werden für Sekretion von BMP-5-Proteinen analysiert. In einigen Fällen können Zelllinien als Pools gehalten und bei späteren Stadien von MTx-Selektion kloniert werden. Eine besondere Zelllinie, welche weiter be schrieben wird, wird als 5E10 bezeichnet und sequenziell für Resistenz gegenüber 0,02 uM, 0,1 mM, 0,5 uM und 2,0 uM MTX selektiert, um amplifizierte Expression von BMP-5 zu erhalten.
Die Menge an BMP-5, gewonnen in konditioniertem Medium aus 5E10 und anderen Zelllinien, die BMP-5 exprimieren, kann durch Einschließen von Heparin, Suramin, Dextransulfat, Pectinsäure, Natriumsulfat oder verwandten Verbindungen im Wachstumsmedium gesteigert werden.
Wie in Beispiel V beschrieben, codiert die cDNA für BMP-5 für ein Protein von etwa 52 kD. Nach Verarbeitung innerhalb der Zelle, was Propeptid-Spaltung, Glycosylierung und Dimer- oder Multimer-Bildung einschließt, aber nicht darauf begrenzt ist, werden multiple BMP-5-Peptide hergestellt. Es gibt mindestens 4 Kandidat-Peptide für verarbeitete Formen des BMP-5-Proteins, welche nach SDS PAGE unter Reduktionsbedingungen erkennbar sind; ein Peptid von etwa 65 kD, ein Peptid von etwa 35 kD und eine Doublette von etwa 22 kD Molekulargewicht. Weitere, weniger reichliche BMP-5-Peptide können ebenfalls vorhanden sein. Durch Vergleich mit der Verarbeitung von anderen verwandten BMP-Molekülen und dem verwandten Protein TGF-beta, stellt das 65 Kd-Protein wahrscheinlich nicht verarbeitetes BMP-5 dar, die 35 Kd Arten stellen das Propeptid dar und die 22 Kd-Doublette stellt das reife Peptid dar.
Material von einer BMP-5 Zelllinie wird in einem 2-dimensionalen Gelsystem analysiert. In der ersten Dimension werden die Proteine unter nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisiert. Das Material wird dann reduziert und in einem zweiten Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. Proteine, die Disulfid-gebundene Dimere oder Multimere bilden, werden unterhalb einer Diagonale durch das zweite reduzierte Gel laufen. Ergebnisse der Analyse von BMP-5-Protein zeigen an, dass eine signifikante Menge der reifen BMP-5-Peptide Homodimere von etwa 30–35 kD bilden können, die zu der in eindimensional reduzierten Gels beobachteten 22 kD-Doublette reduzieren. Eine Fraktion der reifen Peptide ist in einem Disulfid-gebundenen Komplex mit dem Propeptid ersichtlich. Die Menge dieses Komplexes ist bezogen auf das reife Homodimer geringer. Zusätzlich können einige der nicht verarbeiteten Proteine anscheinend Homodimere oder Homomultimere bilden.
BEISPIEL IX
Reinigung und biologische Wirksamkeit von exprimierten BMP-5-Proteinen
Um die biologische Wirksamkeit der in Beispiel VIII oben erhaltenen exprimierten BMP-5-Proteine zu messen, werden die BMP-5-Proteine aus den Kulturmedien gewonnen und gereinigt, indem man sie von anderen proteinartigen Materialien isoliert, mit welchen sie gemeinsam hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen. BMP-5-Proteine können teilweise an einer Heparin-Sepharose-Säule gereinigt werden und unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Reinigungstechniken weiter gereinigt werden. Das BMP-5-Protein wird mit 20 mg Ratten-Matrix gemischt und dann auf in vivo Knochen- und/oder Knorpelbildungswirksamkeit durch den Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Test untersucht. Eine Schein-Transfektions-Supernatant-Fraktionierung wird als Kontrolle verwendet.
Die Implantate, welche Ratten-Matrix enthalten, zu welchen spezifische Mengen an humanen BMP-5-Proteinen zugegeben worden sind, werden nach etwa sieben Tagen von Ratten entfernt und für histologische Bewertung verarbeitet. Repräsentative Sektionen von jedem Implantat werden für die Gegenwart von neuem Knochenmineral mit Von Kossa und Säure-Fuschin eingefärbt und für die Gegenwart von Knorpel-spezifischer Matrixbildung unter Verwendung von Toluidine blue. Die Arten von Zellen, welche innerhalb der Sektion vorhanden sind, als auch das Ausmaß, zu welchem diese Zellen Phenotyp zeigen, werden bestimmt und wie in Beispiel III beschrieben bewertet.
A. Reinigung von BMP-5-Protein
(1) Als ein Beispiel für BMP-5-Reinigung werden 4 ml des gesammelten Flüssigkeitsüberstandes vom konditionierten Medium nach Transfektion von einer 100 mm Kulturschale durch Ultrafiltration an einer YM 10-Membran etwa 10-fach konzentriert und dann gegen 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4 (Ausgangspuffer) dialysiert. Dieses Material wird dann auf eine 1,1 ml Heparin-Sepharose-Säule in Ausgangspuffer angewendet. Ungebundene Proteine werden durch eine 8 ml Wäsche von Ausgangspuffer entfernt und gebundene Proteine, einschließlich Proteine der Erfindung, werden durch eine 3–4 ml Wäsche von 20 mM Tris, 2,0 M NaCl, pH 7,4 desorbiert.
Die durch die Heparin-Säule gebundenen Proteine werden an einer Centricon 10 etwa 10-fach konzentriert und das Salz wird durch Diafiltration mit 0,1% Trifluoressigsäure reduziert.
Weitere Reinigung kann durch präparative NaDodSO₄/PAGE [Laemmli, Nature 227: 680–685 (1970)] erreicht werden. Zum Beispiel werden etwa 300 μg Protein an einem 1,5 mm dicken Gel angewendet: Gewinnung wird durch zugeben von L-[³⁵S]-Methionin-markiertem BMP-Protein geschätzt, gereinigt über Heparin-Sepharose, wie oben beschrieben. Protein kann durch Kupfereinfärbung einer angrenzenden Bahn visualisiert werden [Lee, et al., Anal. Biochem. 166: 308–312 (1987)]. Passende Bänder werden ausgeschnitten und in 0,1% NaDodSO₄/20 mM Tris, pH 8,0 extrahiert. Der Flüssigkeitsüberstand kann mit 10% CF₃COOH zu pH 3 gesäuert werden und die Proteine werden an 5,0 × 0,46 cm Vydac C₄-Säule entsalzen (The Separations Group, Hesperia, CA), entwickelt mit einem Gradienten aus 0,1% CF₃COOH bis 90% Acetonitril/0,1% CFF₃COOH.
(2) In einem weiteren Beispiel wird lösliches Heparin (100 ug/ml) aus einem BMP-5-Protein in konditionierten Medien aus 5E10(2) 2,0 MTx (oben beschrieben) unter Verwendung von Butyl-TSK hydrophober interaktiver Chromatographie (HIC) entfernt. Die konditionierten Medien werden durch Zugabe von festem NaCl auf 2 M NaCl gebracht. Die konditionierten Medien werden dann auf Butyl-TSK geladen, äquilibriert in 2 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, gewaschen mit 0 M NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, gefolgt von Elution mit 1% Np-40, 6 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 7,4, was etwa 98% Entfernung von löslichem Heparin ergab.
Das sich ergebende Material wird dann Heparin-Sepharose-Chromatographie unterworfen. Das Material wird direkt auf eine Heparinsäule geladen, äquilibriert in 50 mM Tris, 6 M Harnstoff, 0 M NaCl, gewaschen und mit einem Gradienten von 0–2 M NaCl eluiert. Dieses Material wird durch Western Blot analysiert und die BMP-5 enthaltenden Fraktionen (0,3–0,8 M NaCl) werden gepoolt. Der Antikörper wird gegen den C-terminalen mutmaßlich reifen Teil gerichtet. Proteine von 35–40 kD nicht-reduziert, 20–22 kD reduziert und Dimere mit höherem Molekulargewicht werden beobachtet.
Die BMP-5 enthaltenden Fraktionen werden konzentriert und diafiltriert, um die Probe auf 0,1% TFA zu bringen, geladen auf eine Umkehrphasensäule und mit einem Gradienten von 30% bis 60% B (A = 0,1% TFA; B = 0,1% TFA in 90% Acetonitril) in 75 Min. bei 1 ml/Min. eluiert. SDS-PAGE Analyse zeigt mehrere Molekulargewichtsarten von BMP-5 Proteinen, welche unten weiter beschrieben werden. Die reife Art, von welcher erwogen wird, dass sie ein Homodimer aus Aminosäuren # 317–# 454 umfasst, wie in Tabelle III gezeigt, umfasst etwa 46-49% der sich ergebenden Molekulargewichtsarten.
B. Kennzeichnung von BMP-5-Proteinen
Eindimensionale Western Blot-Analyse zeigt mehrere Molekulargewichtsarten, einschließlich 98 kDa, 72 kDa, 50 kDa und 35-40 kDa. Bei Reduktion werden die folgenden Arten gesehen: 68 kDA, 43 kDa und 20–22 kDA. Es wird erwogen, dass die nicht-reduzierte 98 kDa-Art ein Homodimer aus zwei 50 kDa-Untereinheiten umfasst, welche jeweils Aminosäuren # 28 # 454 umfassen, wie in Tabelle III gezeigt. Von der 72 kDa-Art wird erwogen, dass sie ein Heterodimer aus einer 50 kDa-Untereinheit (umfassend Aminosäuren # 28 – # 454 von Tabelle III, wie oben beschrieben), und eine 20 kDa-Untereinheit, umfassend Aminosäuren # 317 – # 454 umfasst, wie in Tabelle III gezeigt. Von der 35-40 kDa-Art wird erwogen, dass sie die reife Art darstellt, welche ein Homodimer aus zwei 20 kDa-Untereinheiten umfasst, welche jeweils Aminosäuren # 317 – # 454 umfassen, wie in Tabelle III gezeigt.
C. BMP-5-Wirksamkeit
BMP-5 (welches 100 ug/ml lösliches Heparin enthält), gereinigt in einem vorbereitenden Versuch über Octyl-Sepharose (HIC) [siehe Beschreibung unten], dann über Heparin-Sepharose auf eine Weise, ähnlich den oben beschriebenen Butyl-, dann Heparin-Schritten, wird mit 20 mg Ratten-Matrix gemischt und für 10 Tage gemäß dem in Beispiel III oben beschriebenen ektopischen Rattentest implantiert. Etwa 1–3 ug BMP-5-Protein aus dem Heparin-Sepharose-Schritt ergibt die Bildung von Knorpel und Knochen. Der Octyl-Sepharose-Reinigungsschritt wird durch Zugeben von festem (NH₄)₂SO₄ zu BMP-5-konditionierten Medien durchgeführt, welche 100 ug/ml lösliches Heparin enthalten, zu einer Endkonzentration von 1 M. Dies wird auf eine Säule aus Octyl-Sepharose geladen, äquilibriert in 1 M (NH₄)₂SO₄, 50 mM Tris, pH 7,4. Die Säule wird mit Ausgangspuffer, dann mit 50 mM Tris, pH 7,4, gewaschen und mit 50 mM Tris, 6 M Harnstoff, 0,2% Octyl-glucosid, pH 7,4, eluiert. Reinigung über Heparin-Sepharose erfolgt durch Schritt-Gradient, gewaschen mit 50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 6 M Harnstoff, pH 7,4, eluiert mit 50 mM Tris, 2 M NaCl, 6 M Harnstoff, pH 7,4. Das implantierte Material ist 2 M NaCl.

Claims

DNA-Molekül, welches für ein BMP-5-Protein codiert, das aus a) der Nukleotid-Sequenz aus Nukleotid # 1647 bis Nukleotid # 2060 der Tabelle III, oder b) einer Nukleotid-Sequenz, die zur Sequenz (a) degeneriert ist, besteht.
Vektor umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 1 in operativer Verbindung mit einer Expressions-Steuerungssequenz dafür.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 2.
Verfahren zur Herstellung eines BMP-5-Proteins, welches aufweist: (a) die Aminosäure-Sequenz von Aminosäure # 317 bis Aminosäure # 454, wie in Tabelle III gezeigt; oder (b) eine Aminosäure-Sequenz, die von der Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 (b) codiert ist, wobei das Verfahren die Schritte (a) Züchten der transformierten Wirtszelle nach Anspruch 3 in einem geeigneten Kulturmedium; und (b) Isolieren und Reinigen des Proteins aus dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Protein weiter durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, eine Knorpel- und/oder Knochenbildung aufzuzeigen.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Protein weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass 1 μg des Proteins eine Bewertung von mindestens +2 im Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Test erreicht.
Verfahren zur Herstellung des DNA-Moleküls nach Anspruch 1, welches das Konstruieren einer cDNA-Bibliothek, die die Ziel-cDNA enthält, das Screenen der cDNA-Bibliothek mit einer geeigneten Sonde, die ein Fragment der für das BMP-5-Protein co dierenden DNA ist, und das Isolieren von Klonen, die das DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthalten, umfasst.