DE69433742T2

DE69433742T2 - Bmp-10 zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69433742T2
Application number: DE69433742T
Authority: DE
Inventors: J. Anthony CELESTE; M. John WOZNEY
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2014-05-13
Also published as: EP0698095A1; BR9406716A; AU677849B2; NO954525L; FI955420A; FI955420A0; KR100231640B1; JPH09501305A; CA2161807A1; DE69433742D1; AU6910794A; EP0698095B1; KR960701997A; OA10192A; NO954525D0; WO1994026893A1; ATE265529T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Familie gereinigter Proteine mit der Bezeichnung BMP-10, deren kodierende DNA und deren Herstellungsverfahren. Diese Proteine können zur Induzierung von Knochen- und/oder Knorpelbildung und bei der Wundheilung und Gewebereparatur verwendet werden. Diese Proteine können auch zum Steigern der Aktivität von anderen Knochen-morphogenetischen Proteinen verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Suche nach dem Molekül oder den Molekülen, welche für die Knochen- und Knorpel-induktive Aktivität, welche in Knochen- oder anderen Gewebeextrakten vorhanden ist, verantwortlich sind, hat zur Entdeckung einer neuartigen Gruppe an Molekülen geführt, welche Knochen-morphogenetische Proteine (BMPs) genannt werden. Die Strukturen verschiedener Proteine, mit den Bezeichnungen BMP-1 bis BMP-9, wurden vorher aufgeklärt. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen mit deren Vorhandensein im Knochen, weisen darauf hin, dass sie wichtige Regulatoren in Knochenreparaturverfahren und bei der Aufrechterhaltung des Knochengewebes beteiligt sind. Es ist wichtig herauszufinden, ob zusätzliche Proteine existieren, welche bei diesen Prozessen eine Rolle spielen. Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung solch eines Proteins, welchem die Erfinder die Bezeichnung BMP-10 gegeben haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Bovines BMP-10
Die bovine BMP-10 DNA-Sequenz (SEQ ID Nr: 1) und Aminosäurensequenz (SEQ ID Nr: 2) werden in den Sequenzprotokollen hierin dargestellt. BMP-10 Proteine sind zur Induzierung der Bildung von Knorpeln, Knochen und Kombinationen davon fähig. BMP-10 Proteine sind ferner durch ihre Fähigkeit zum Nachweis von Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem unten beschriebenen Rattenknochenbildungstests charakterisiert.
Bovines BMP-10 kann durch Kultivieren einer mit einer DNA-Sequenz transformierten Zelle hergestellt werden, umfassend eine Nukleotid-Sequenz, welche für das reife BMP-10 Polypeptid codiert, umfassend Nukleotid #779 oder #797 bis Nukleotid #1102, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, und durch Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches durch die Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, welche Aminosäure #1 bis #108 um fasst, wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt, im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Substanzen, mit welchen es zusammen hergestellt wird. Zur Herstellung in Säugetierzellen umfasst die DNA-Sequenz ferner eine DNA-Sequenz, welche für ein geeignetes Propeptid 5' zu der Nukleotidsequenz, welche für das reife BMP-Polypeptid codiert, codiert und im Rahmen mit dieser verbunden ist. Das Propeptid kann ein arteigenes BMP-10 Propeptid sein oder es kann ein Propeptid aus einem anderen Protein der TGF-β-Superfamilie sein.
Menschliche BMP-10 ist homolog mit bovinem BMP-10. Die Erfindung schließt daher Verfahren zum Erhalten der DNA-Sequenzen ein, welche für humanes BMP-10 codieren, die durch diese Verfahren erhaltenen DNA-Sequenzen und das humane Protein, welches durch diese DNA-Sequenzen codiert wird. Dieses Verfahren führt dazu die bovine BMP-10 Nukleotidsequenz oder Teile davon für sich zu Nutzen zu machen, um Sonden zu entwerfen, um Bibliotheken bezüglich des humanen Gens oder Codierungssequenzen oder Fragmenten davon unter Verwendung von Standardtechniken zu screenen. Eine DNA-Sequenz, welche für einen Teil des humanen BMP-10 Proteins codiert (SEQ ID Nr. 3) und die entsprechende Aminosäurensequenz (SEQ ID Nr. 4) werden hierin dargestellt. Diese Sequenzen können auch verwendet werden, um Sonden zu entwerfen, um das vollständige humane BMP-10 Gen oder Codierungssequenzen durch Standardtechniken zu erhalten. Humanes BMP-10 kann durch Kultivieren einer mit der BMP-10 DNA-Sequenz transformierten Zelle und Gewinnen und Reinigen von BMP-10 aus dem Kulturmedium hergestellt werden. Das gereinigte exprimierte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialien, mit welchen es zusammen hergestellt wird, als auch von anderen Verunreinigungen.
Vom gewonnenen, gereinigten Protein wird erwogen, dass es eine der Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität zeigt. Die Proteine der Erfindung können ferner durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Bildung von Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem zuvor beschriebenen Rattenknochenbildungstest herbeizuführen.
Die Erfindung stellt daher eine DNA-Sequenz bereit, welche für ein Protein codiert, das durch die Fähigkeit der Induzierung der Bildung eines Knorpels und/oder Knochens charakterisiert ist, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus:

(a) Nukleotide #779 oder #797 bis #1102 von SEQ ID Nr. 1;
(b) Nukleotide #1108 oder #1126 bis #1431 von SEQ ID Nr. 10;
(c) Nukleotide, welche für Aminosäuren #1 bis #108 von SEQ ID Nr. 2 codieren; und
(d) Nukleotide, welche für Aminosäuren #1 bis #108 von SEQ ID Nr. 11 codieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die DNA-Sequenz der Erfindung eine Nukleotidsequenz, welche für ein geeignetes Propeptid 5' codiert und welches im Rahmen mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz verbunden ist. Vorzugsweise ist das Propeptid von einem Mitglied der TGF-β Proteinsuperfamilie.
Die Erfindung stellt ferner ein BMP-10 Protein zur Verfügung, welches durch die oben identifizierten DNA-Sequenzen codiert wird. Vorzugsweise hat das BMP-10 Protein die Form eines Polypeptiddimers, wobei jede Untereinheit eine Aminosäuresequenz für die hierin beschriebenen BMP-10 Proteine umfasst. Das Polypeptiddimer kann auch eine Aminosäuresequenz für ein Knochenmorphogenetisches Protein umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht pharmazeutische Zusammensetzungen vor, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines BMP-10 Proteins in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel oder Träger enthalten. BMP-10 Zusammensetzungen der Erfindung können bei der Bildung von Knorpeln verwendet werden. Diese Zusammensetzungen können weiters für die Bildung von Knochen verwendet werden. BMP-10 Zusammensetzungen können auch bei der Wundheilung und für Gewebereparatur verwendet werden. Zusammensetzungen dieser Erfindung können ferner mindestens einen anderen therapeutisch brauchbaren Wirkstoff enthalten, wie die BMP-Proteine BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, welche zum Beispiel in den US-Patenten 5108922; 5013649; 5116738; 5106748; 5187076 und 5141905 offenbart werden; BMP-8, welches in PCT-Veröffentlichung WO91/18098 offenbart wird; und BMP-9, welches in PCT-Veröffentlichung WO93/00432 offenbart wird.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich zu einem BMP-10 Protein andere therapeutisch brauchbare Wirkstoffe umfassen, einschließlich Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-α und TGF-β) und insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF). Die Zusammensetzungen können auch eine geeignete Matrix umfassen, beispielsweise zum Tragen der Zusammensetzung und zum Bereitstellen einer Oberfläche für den Knochen- und/oder Knorpelwachstum. Die Matrix kann eine langsame Abgabe des osteoinduktiven Proteins und/oder der geeigneten Umgebung zur Darstellung dieser bereitstellen.
Die BMP-10 Zusammensetzungen können auch zum Behandeln einer Anzahl an Knochen- und/oder Knorpeldefekten, Periodontalerkrankung und verschiedenen Wundarten verwendet werden. Diese Verfahren bringen Verabreichen einer wirksamen Menge eines BMP-10 Proteins an einen Patienten mit sich, der solche Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebereparatur benötigt. Diese Verfahren können auch die Verabreichung eines Proteins der Erfindung zusammen mit mindestens einem der neuartigen BMP-Proteine mit sich bringen, welche in den oben beschriebenen, Anmeldungen desselben Anmelders offenbart werden. Zusätzlich können diese Verfahren ebenfalls die Verabreichung eines BMP-10 Proteins mit anderen Wachstumsfaktoren, einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und IGF einschließen.
Die Erfindung stellt daher die Verwendung einer hierin bereitgestellten Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Knochen- und/oder Knorpelbildung in einem Patienten bereit, der diese benötigt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, welche für die Expression eines BMP-10 Proteins codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz von Nukleotiden in einer 5' bis 3' Richtung, veranschaulicht in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 ein, DNA-Sequenzen, welche bis auf die Degeneration des genetischen Codes mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 identisch sind und für das Protein von SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 11 codieren. Ferner sind in der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen eingeschlossen, welche unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 hybridisieren und für ein Protein mit der Fähigkeit zur Induzierung der Bildung eines Knorpels und/oder Knochens codieren. Bevorzugte DNA-Sequenzen umfassen jene, welche unter stringenten Bedingungen hybridisieren [siehe Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389]. Schließlich sind Allelen oder andere Variationen der Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10, ob solche Nukleotidveränderungen Veränderungen in der Peptidsequenz ergeben oder nicht, aber wo die Peptidsequenz noch BMP-10 Wirksamkeit hat, ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt Vektoren ein, welche eine DNA-Sequenz wie oben beschrieben in operativer Assoziation mit einer Expressions-Kontrollsequenz dafür umfassen. Diese Vektoren können in einem neuartigen Verfahren zum Herstellen eines BMP-10 Proteins der Erfindung eingesetzt werden, bei welchem eine Zelllinie, transformiert mit einer DNA-Sequenz, welche für ein BMP-10 Protein codiert, in operativer Assoziation mit einer Expressions-Kontrollsequenz dafür in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird und ein BMP-11 Protein daraus gewonnen und gereinigt wird. Dieses Verfahren kann eine Anzahl an gut bekannten Zellen, sowohl prokaryontische, als auch eukaryontische, als Wirtszellen zur Expression des Polypeptids einsetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Säugetierzelle.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins bereit, welches durch seine Fähigkeit zur Induzierung der Bildung von Knorpeln und/oder Knochen charakterisiert ist, umfassend:

(a) Kultivierung der oben beschriebenen transformierten Wirtszelle; und
(b) Gewinnung des Proteins aus dem Kulturmedium.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner das Reinigen des BMP-10 Proteins.
Die Vektoren können bei Gentherapieanwendungen verwendet werden. In solch einer Verwendung können die Vektoren in die Zellen eines Patienten in vitro transfiziert werden und die Zellen können wieder in einen Patienten eingeführt werden. Alternativ können die Vektoren in vivo durch gezielte Transfektion in einen Patienten eingeführt werden.
Beschreibung der Sequenzen
SEQ ID Nr. 1 ist der Nukleotidsequenz codierende Teil des bovinen BMP-10, abgeleitet von dem Klon λ7r-20.
SEQ ID Nr. 2 ist die Aminosäuresequenz, welche das reife, bovine BMP-10 Polypeptid enthält.
SEQ ID Nr. 3 ist eine partielle Nukleotidsequenz von humanem BMP-10.
SEQ ID Nr. 4 ist eine partielle Aminosäuresequenz für humanes BMP-10 Polypeptid.
SEQ ID Nr. 5 und 6 sind Primer zu bovinem BMP-10, welche verwendet werden, um das humane BMP-10 oder andere BMP-10 Proteine zu isolieren.
SEQ ID Nr. 7 ist eine DNA-Sequenz, die in pMT2 CXM insertiert wird, um eine XhoI-Erkennungsstelle nahe dem SV40 Replikationsursprung hinzuzufügen.
SEQ ID Nr. 8 ist eine DNA-Sequenz, welche in pMT21 insertiert wird, um eine XhoI-Erkennungsstelle oberhalb des DHFR-Gens zu insertieren.
SEQ ID Nr. 9 ist eine DNA-Sequenz, welche einen Teil der EMC Virusleitsequenz umfasst.
SEQ ID Nr. 10 ist eine DNA-Sequenz, welche für das vollständige humane BMP-10 Protein codiert, umfassend das vollständige Propeptid an Nukleotiden #160 bis #1107, und das reife Polypeptid an Nukleotiden #1108 bis #1431, abgeleitet von dem cDNA-Klon HFL-3 und den genomischen Klon 20GEN.3.
SEQ ID Nr. 11 ist die Aminosäuresequenz, codiert durch SEQ ID Nr. 10.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
BMP-10
Die bovine BMP-10 Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) und codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) werden in den Sequenzprotokollen hierin dargestellt. Die Codierungssequenz des reifen, bovinen BMP-10 Proteins fängt am Nukleotid #779 an und verläuft bis Nukleotid #1102. Gereinigte bovine BMP-10 Proteine der vorliegenden Erfindung werden durch Kultivieren einer Wirtszelle, transformiert mit einer DNA-Sequenz, welche die DNA-Codierungssequenz von SEQ ID Nr. 1 von Nukleotid #167 bis #1102 oder von Nukleotid #779 bis #1102 umfasst und Gewinnen und Reinigen eines Proteins aus dem Kulturmedium, welches die Aminosäurese quenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz enthält, wie durch Aminosäuren #–204 bis #108 oder #1 bis #108 von SEQ ID Nr. 2. Eine Wirtszelle kann mit einer Codierungssequenz transformiert werden, welche für ein Propeptid codiert, welches für die Sekretion von Proteinen aus der Wirtszelle geeignet ist, welche in einem korrekten Leserahmen an die Codierungssequenz für das reife BMP-10 Protein gebunden ist. Siehe zum Beispiel US-Patent 5168050, in welchem eine DNA, welche für einen Vorläuferteil eines anderen Säugetierproteins als BMP-2 codiert, an die DNA fusioniert wird, welche für ein reifes BMP-2 Protein codiert. Somit schließt die vorliegende Erfindung chimäre DNA-Moleküle ein, welche eine DNA-Sequenz umfassen, welche für ein Propeptid von einem Mitglied der TGF-β Superfamilie von Proteinen codiert, anders als dem BMP-10, gebunden im korrekten Leserahmen an eine DNA-Sequenz, welche für ein BMP-10 Polypeptid codiert. Der Begriff „chimär" wird verwendet um anzudeuten, dass das Propeptid von einem anderen Polypeptid als BMP-10 stammt.
Die humane BMP-10 Sequenz der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung der ganzen oder Fragmenten der bovinen BMP-10 DNA-Sequenz oder der partiellen humanen BMP-10 Sequenz von SEQ ID Nr. 3 als Sonde erhalten. Somit umfasst die humane BMP-10 DNA-Sequenz die DNA-Sequenz von Nukleotiden #30 bis #167 von SEQ ID Nr. 3. Diese partielle Sequenz der humanen BMP-10 DNA-Sequenz entspricht sehr gut den Nukleotiden #899 bis #1036 der bovinen BMP-10 DNA-Sequenz, welche in SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird. Das humane BMP-10 Protein umfasst die Sequenz der Aminosäuren #1–#46 von SEQ ID Nr. 4.
Es wird erwartet, dass BMP-10, exprimiert durch Säugetierzellen wie CHO-Zellen, als heterogene Population von aktiven Arten von BMP-10 Protein mit variierenden N-Termini vorkommt. Es wird erwartet, dass aktive Arten eine Aminosäuresequenz umfassen werden, welche mit dem Cysteinrest an Aminosäure #7 von SEQ ID Nr. 1 beginnt, oder in die N-terminale Richtung zusätzliche Aminosäuresequenzen umfasst. Somit wird erwartet, dass DNA-Sequenzen, welche für aktive BMP-10 Proteine codieren, eine Nukleotidsequenz umfassen, die Nukleotide #779 oder #797 bis #1102 von SEQ ID Nr. 1 oder Nukleotide #1108 oder #1126 bis #1431 von SEQ ID Nr. 10 umfassen.
Der N-Terminus von humanem BMP-10 ist experimentell durch Expression in E. coli wie folgt bestimmt worden:
[M]NAKGNYXKRTPLYIDFKEI, worin X einen Aminosäurerest ohne klares Signal kennzeichnet, welcher mit einem Cysteinrest an der Position konsistent ist. Somit erscheint es so, dass der N-Terminus diese Arten von BMP-10 an der Aminosäure #1 von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 ist, und eine DNA-Sequenz, welche für diese Arten von BMP-10 codiert, Nukleotide #779 bis 1102 von SEQ ID Nr. 1 oder #1108 bis 1431 von SEQ ID Nr. 10 umfassen würden. Das scheinbare Molekulargewicht von humanem Activin-WC Monomer wurde durch SDS-PAGE als etwa 10–12 kDa auf einem Novex 16%-Trizingel bestimmt. Das Molekulargewicht des Monomers durch Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie ist 12292.5 auf einem Finnigan TSQ 7000. Das humane BMP-10 Protein existiert als klare, farblose Lösung in 0,1% Trifluoressigsäure.
Die BMP-10 Proteine, welche aus dem Kulturmedium gewonnen werden, werden gereinigt, indem man sie von anderen proteinartigen Substanzen isoliert, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, und von anderen vorhandenen Verunreinigungen. BMP-10 Proteine können durch die Fähigkeit der Induzierung der Bildung von Knorpel und/oder Knochen charakterisiert werden, beispielsweise in dem unten beschriebenen Rattenknochenbildungstest.
Die hierin vorgesehenen BMP-10 Proteine schließen auch Faktoren ein, welche durch die Sequenzen codiert werden, die jenen von SEQ ID Nr. 1 ähnlich sind, aber worin Modifikationen natürlich vorgesehen (z. B. Allelen-Variationen in den Nukleotidsequenzen, welche Aminosäureveränderungen im Polypeptid ergeben können) oder absichtlich konstruiert werden. Zum Beispiel können synthetische Polypeptide ganz oder teilweise durchgehende Sequenzen der Aminosäurereste von SEQ ID Nr. 2 duplizieren. Diese Sequenzen können, durch Teilen von primären, sekundären oder tertiären strukturellen und konformativen Merkmalen mit Knochenwachstumsfaktor-Polypeptiden von SEQ ID Nr. 2, damit gemeinsame biologische Knochenwachstumsfaktoreigenschaften besitzen. Somit können sie als biologisch wirksame Substitute für natürlich vorkommende BMP-10 Polypeptide und andere BMP-10 Polypeptide in therapeutischen Verfahren eingesetzt werden.
Andere spezifische Mutationen der hierin beschriebenen Sequenzen von BMP-10 Proteinen beziehen Modifikationen von Glykosylierungsstellen ein. Diese Modifikationen können O-gebundene oder N-gebundene Glykosylierungsstellen einbeziehen. Zum Beispiel ergibt sich das Fehlen von Glykosylierung oder nur teilweise Glykosylierung aus Aminosäuresubstitution oder Deletion an Asparagin-gebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstellen. Die Asparagin-gebundenen Glykosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptid-Sequenzen, welche durch passende zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden, Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X üblicherweise jede Aminosäure ist. Eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen einer Glykosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder Aminosäuredeletion an der zweiten Position) ergibt Nicht-Glykosylierung an der modifizierten Tripeptid-Sequenz. Zusätzlich ergibt die bakterielle Expression des BMP-10 Proteins nicht-glykosyliertes Protein ohne Verändern der Glykosylierungs-Erkennungsstellen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die neuartigen DNA-Sequenzen, welche frei von Assoziation mit DNA-Sequenzen für andere proteinartige Substanzen codieren, und für Expression von BMP-10 Proteinen codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen jene ein, welche in SEQ ID Nr. 1 in einer 5' zu 3' Richtung dargestellt werden und jene Sequenzen, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen dazu hybridisieren, zum Beispiel 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C [siehe Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389] und für ein Protein mit Knorpel- und/oder Knochen-induzierender Aktivität codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen auch jene ein, welche die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 umfassen und jene, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen dazu hybridisieren und für ein Protein mit mit Knorpel- und/oder Knochen-induzierender Aktivität codieren.
Auf ähnliche Weise codieren DNA-Sequenzen, welche für BMP-10 Proteine codieren, codiert durch die Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder BMP-10 Proteinen, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2 umfassen, aber welche sich in der Codonsequenz aufgrund von Degenerationen des genetischen Codes oder Allelen-Variationen (natürlich auftretende Basen-Veränderungen in der Artenpopulation, welche Aminosäureveränderungen ergeben können oder auch nicht) unterscheiden, ebenfalls für die hierin beschriebenen neuartigen Faktoren. Variationen in den DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3, welche durch Punktmutationen verursacht werden oder durch veranlasste Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) herbeigeführt werden, um die Aktivität, Halbwertszeit oder Herstellung der Polypeptide, für die codiert wird, zu verstärken, werden ebenfalls in der Erfindung umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein neuartiges Verfahren zum Herstellen von BMP-10 Proteinen vor. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst Kultivieren einer geeigneten Zelllinie ein, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert worden ist, welche für ein humanes BMP-10 Protein der Erfindung codiert, unter der Kontrolle von bekannten regulatorischen Sequenzen. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und die BMP-10 Proteine werden gewonnen und von dem Kulturmedium gereinigt. Die gereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit welchen sie zusammen hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen.
Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetierzellen, wie Eierstockzellen von Chinesischen Hamstern (CHO) sein. Die Wahl von geeigneten Säugetier-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Screening, Produktherstellung und Reinigung sind nach Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gething und Sambrook, Nature, 293: 620–625 (1981) oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750–1759 (1985) oder Howley et al., US-Patent 4419446. Eine andere geeignete Säugetier-Zelllinie, welche in den begleitenden Beispielen beschrieben wird, ist die Affen COS-1 Zelllinie. Die Säugetierzelle CV-1 kann ebenfalls geeignet sein.
Bakterielle Zellen können ebenfalls geeignete Wirte sein. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bazillen und Ähnlichem können ebenfalls in diesem Verfahren eingesetzt werden. Zur Expression des Proteins in bakteriellen Zellen muss die DNA, welche für das Propeptid des BMP-10 codiert, nicht notwendig sein.
Viele Stämme von Hefezellen, welche den Fachleuten bekannt sind, können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der Poly peptide der vorliegenden Erfindung verfügbar sein. Zusätzlich können, wo gewünscht, Insektenzellen als Wirtszellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Siehe z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277–298 (Plenum Press 1986) und darin zitierte Verweise.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Vektoren zur Verwendung in dem Expressionsverfahren dieser neuartigen BMP-10 Polypeptide vor. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die vollen, oben beschriebenen, neuartigen DNA-Sequenzen, welche für die neuartigen Faktoren der Erfindung codieren. Zusätzlich enthalten die Vektoren passende Expressionskontrollsequenzen, welche Expression der BMP-10 Proteinsequenzen erlauben. Alternativ sind Vektoren, welche modifizierte Sequenzen wie oben beschrieben einschließen, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich könnten die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder andere Sequenzen, welche für BMP-10 Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes BMP-10 Protein zu exprimieren, und zwar durch Deletieren von für BMP-10 codierende Propeptid-Sequenzen und ihr Ersetzen durch Sequenzen, welche für die vollständigen Propeptide von anderen BMP-Proteinen oder anderen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie codieren. Dadurch umfasst die vorliegende Erfindung chimärische DNA-Moleküle, welche für ein Propeptid von einem Mitglied der TGF-β Superfamilie codieren, die in einem korrekten Leserahmen mit einer DNA-Sequenz verbunden sind, welcher für ein BMP-10 Polypeptid codiert.
Die Vektoren können in dem Verfahren zum Transformieren von Zelllinien eingesetzt werden und enthalten ausgewählte regulatorische Sequenzen in operativer Assoziation mit den DNA-Codierungssequenzen der Erfindung, welche in der Lage sind, die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind den Fachleuten bekannt und können je nach Wirtszelle ausgewählt werden. Solche Selektion ist Routine und bildet keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, welches Knorpel und/oder Knochenbildung unter Bedingungen herbeiführt, wo Knochen normalerweise nicht gebildet wird, findet Anwendung beim Heilen von Knochenfrakturen und Knorpeldefekten bei Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, welches ein BMP-10 Protein einsetzt, kann prophylaktische Verwendung in geschlossener, als auch in offener Frakturreduktion finden, und auch bei der verbesserten Fixation von künstlichen Gelenken. De novo Knochenbildung, herbeigeführt durch einen osteogenen Wirkstoff, trägt zur Reparatur von kongenitalen, Trauma-induzierten oder durch onkologische Resektion induzierten kranio-facialen Defekten bei und ist auch in der kosmetisch-plastischen Chirurgie brauchbar. Ein BMP-10 Protein kann bei der Behandlung von Periodontalerkrankung und bei anderen Zahn-Reparaturverfahren verwendet werden. Solche Wirkstoffe können eine Umgebung vorsehen, um Knochen-bildende Zellen anzuziehen, Wachstum von Knochen-bildenden Zellen zu stimulieren oder Differentiation von Progenitoren von Knochen-bildenden Zellen induzieren. BMP-10 Polypeptide der Erfindung können auch bei der Behandlung von Osteoporose brauchbar sein. Eine Vielfalt an osteogenen, Knorpel-herbeiführenden und Knochen-herbeiführenden Faktoren ist beschrieben worden. Siehe z. B. EP-Anmeldungen 148155 und 169016 zur Diskussion davon.
Die Proteine der Erfindung können auch bei Wundheilung und ähnlicher Gewebereparatur verwendet werden. Die Arten von Wunden schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Verbrennungen, Schnitte und Geschwüre. (Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO84/01106 zur Diskussion von Wundheilung und ähnlicher Gewebereparatur).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein therapeutisches Verfahren und Zusammensetzung zum Reparieren von Frakturen und anderen Zuständen bezogen auf Knorpel- und/oder Knochendefekten oder Periodontalerkrankungen. Die Erfindung umfasst ferner therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen zur Wundheilung und Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der BMP-10 Proteine der Erfindung in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, Träger oder Matrix.
Es wird erwartet, dass die Proteine der Erfindung gemeinsam mit oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken können. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen daher eine therapeutische Menge von mindestens einem BMP-10 Protein der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der anderen BMP-Proteine, welche in oben beschriebenen Anmeldungen desselben Anmelders offenbart werden. Solche Kombinationen können getrennte Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle umfassen, welche aus unterschiedlichen BMP-Teilen bestehen. Zum Beispiel kann ein Verfahren und eine Zusammensetzung der Erfindung ein Disulfid gebundenes Dimer umfassen, welches eine BMP-10 Protein Untereinheit und eine Untereinheit von einem der oben beschriebenen „BMP"-Proteine umfasst. Somit schließt die vorliegende Erfindung gereinigtes BMP-10 Polypeptid ein, welches ein Heterodimer ist, wobei eine Untereinheit mindestens die Aminosäuresequenz von Aminosäure #1 bis Aminosäure #108 von SEQ ID Nr. 2 umfasst und eine Untereinheit eine Aminosäuresequenz für ein Knochen-morphogenetisches Protein umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9. Eine weitere Ausführungsform kann ein Heterodimer aus BMP-10 Teilen umfassen. Ferner können BMP-10 Proteine mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden, welche der Behandlung des Knochen- und/oder Knorpeldefekts, Wunde oder fraglichen Gewebes zuträglich sind. Diese Wirkstoffe schließen verschiedene Wachstumsfaktoren ein, wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und k-Fibroblastenwachstumsfaktor (kFGF), Parathormon (PTH), Leukämie-hemmenden Faktor (LIF/HILDA/DIA), insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II). Teile dieser Wirkstoffe können ebenfalls in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch annehmbarer Proteinzusammensetzungen mit gebührender Berücksichtigung von pH, Isotonie, Stabilität und Ähnlichem ist innerhalb des Fachkönnens nach Stand der Technik. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind gegenwärtig aufgrund des Mangels an Artenspezifität bei BMP-Proteinen auch für veterinäre Anwendungen wertvoll. Insbesondere Haustiere und Vollblutpferde sind zusätzlich zu Menschen gewünschte Patienten für solche Behandlung mit BMP-10 der vorliegenden Erfindung.
Das therapeutische Verfahren schließt Verabreichen der Zusammensetzung topisch, systemisch oder örtlich als Implantat oder Vorrichtung ein. Bei der Verabreichung hat die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung selbst verständlich eine Pyrogen-freie, physiologisch annehmbare Form. Ferner kann die Zusammensetzung zur Abgabe an die Stelle des Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschadens wünschenswerterweise eingekapselt sein oder in einer viskosen Form injiziert werden. Topische Verabreichung kann für Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch brauchbare Wirkstoffe als die BMP-10 Proteine, welche ebenfalls gegebenenfalls in die Zusammensetzung wie oben beschrieben eingeschlossen werden können, können alternativ oder zusätzlich, gleichzeitig oder in Folge mit der BMP-Zusammensetzung in den Verfahren der Erfindung verabreicht werden.
Bevorzugt für Knochen- und/oder Knorpelbildung schließt die Zusammensetzung eine Matrix ein, welche in der Lage ist, BMP-10 oder andere BMP-Proteine an der Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens abzugeben indem sie eine Struktur für den sich entwickelnden Knochen und Knorpel vorsieht und optimal in der Lage ist, in den Körper resorbiert zu werden. Die Matrix kann die langsame Abgabe von BMP-10 und/oder anderem Knochen-induktiven Protein, als auch passende Präsentation und angemessene Umgebung für zelluläre Infiltration vorsehen. Solche Matrizes können aus Materialien gebildet werden, welche gegenwärtig für andere implantierte medizinische Anwendungen in Gebrauch sind.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf biologischer Kompatibilität, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischer Erscheinung und Interface-Eigenschaften. Die besondere Anwendung der BMP-10 Zusammensetzungen wird die passende Formulierung definieren. Potentielle Matrizes für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubar sein und als Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride chemisch definiert werden. Weitere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen-, Sehnen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizes setzen sich aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixbestandteilen zusammen. Weitere potentielle Matrizes sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramiken. Matrizes können aus Kombinationen von jeden der oben erwähnten Materialtypen zusammengesetzt sein, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die biologischen Keramiken können in der Zusammensetzung, wie in Calciumaluminatphosphat und der Verarbeitung verändert werden, um Porengröße, Partikelgröße, Partikelform und biologische Abbaubarkeit zu verändern.
Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt unter Erwägung verschiedener Faktoren bestimmt werden, welche die Wirkung des BMP-10 Proteins modifizieren, z. B. die Menge an zu bildenden Knochengewichts, die Stelle des Knochenschadens, der Zustand des verletzten Knochens, die Größe der Wunde, die Art des verletzten Gewebes, das Alter, Geschlecht und die Ernährungsweise des Patienten, die Schwere einer Infektion, die Zeit der Verabreichung und weitere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der bei der Wiederherstellung verwendeten Matrix und des in der Zusammensetzung vorhandenen BMP-Proteins variieren. Die Zugabe von anderen bekannten Wachstumsfaktoren wie z. B. IGF-I (Insulin ähnlich Wachstumsfaktor I) zu der endgültigen Zusammensetzung kann ebenso die Dosierung beeinflussen.
Der Fortschritt kann durch periodische Bewertung von Knochenwachstum und/oder Reparatur überwacht werden. Der Fortschritt kann zum Beispiel unter Verwendung von Röntgenstrahlen, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetracyclin-Markierung überwacht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der vorliegenden Erfindung beim Gewinnen und Charakterisieren von bovinem BMP-10 Protein und seinen Einsatz, um das humane und andere BMP-10 Proteine zu gewinnen, Erhalten der humanen Proteine und Exprimieren der Proteine durch rekombinante Techniken.
Beispiel 1
Bovines BMP-10
800000 Rekombinanten einer bovinen Genombibliothek, konstruiert im Vektor λEMBL3, werden bei einer Dichte von 8000 rekombinanten Bakteriophagen-Plaques pro Platte auf 100 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Repliken der rekombinanten Bakteriophagen-Plaques werden aus diesen Platten bereitet und amplifiziert. Ein Fragment von humaner BMP-7 DNA entsprechend den Nukleotiden #1081 bis #1403 (4, US-Patent 5141905) wird durch das willkürliche Priming-Verfahren von Feinberg et al. [Anal. Biochem. 132: 6–13 (1983)] ³²P-markiert und zu einem Filtersatz in Standardhybridisierungspuffer (SHB) (5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardt's, 100 μg/ml Lachs Sperma DNA) bei 60°C für 2 bis 3 Tage hybridisiert. Die Filter werden unter Bedingungen von verringerter Stringenz (4 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C) gewaschen. Multiple positiv hybridisierende Rekombinanten werden bemerkt. 52 positiv hybridisierende rekombinante Bakteriophagen-Plaques werden ausgewählt und wieder für Sekundäre plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Repliken der rekombinanten Plaques werden aus diesen 52 sekundären Platten bereitet und amplifiziert.
Ein Satz Nitrocellulosefilter wird zur humanen BMP-7 DNA Sonde hybridisiert, wie oben beschrieben, und unter den gleichen Bedingungen reduzierter Stringenz gewaschen. Der andere Filtersatz wird zu einer gemischten BMP-5, BMP-6 und BMP-7 Sonde in SHB bei 65°C über Nacht hybridisiert und mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen (stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen). Die gemischte Sonde besteht aus relativ gleichen Mengen an ³²P-markierten DNA-Fragmenten, welche Nukleotide #1452 bis #2060 (4, US-Patent 5106748) der humanen BMP-5 Sequenz, Nukleotide #1395 bis #1698 (4, US-Patent 5187076) der humanen BMP-6 Sequenz und Nukleotide #1081 bis #1403 (4, US-Patent 5141905) der humanen BMP-7 Sequenz umfassen. Die BMP-5, BMP-6 und BMP-7 DNA Fragmente sind durch das willkürliche Priming-Verfahren ³²P-markiert und gleiche Zählzahlen pro Minute (cpms) von jeder Sonde werden vereinigt und zum SHB zugegeben, welches den anderen Satz Nitrocellulosefilter-Repliken der 52 sekundären Platten enthält.
14 Rekombinanten, welche zur humanen BMP-7 Sonde unter den Bedingungen von reduzierter Stringenz positiv hybridisierten und schwache oder keine Hybridisierung zu der gemischten BMP-5/6/7 Sonde unter Bedingungen von hoher Stringenz aufwiesen, werden zur weiteren Analyse ausgewählt. Alle 14 Rekombinanten, welche diese Hybridisierungsmerkmale aufweisen, werden Plaque-gereinigt und aus jeder wird Bakteriophagen-DNA bereitet. Die positiv hybridisierende Region von einem der Rekombinanten, mit der Bezeichnung λ7r-20, wird an ein 0,5 kb EcoRI/HindIII Restriktionsfragment lokalisiert. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor (pGEM-3) subkloniert und DNA-Sequenzanalyse wird durchgeführt. Die Teil-DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 1) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) von Klon λ7r-20 werden in den Sequenzprotokollen gezeigt.
Der Bakteriophage λ7r-20 ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 am 23. April 1993 hinterlegt worden und erhielt die Eingangsnummer ATCC 75452. Diese Hinterlegung erfüllt die Anforderungen des Budapest Treaty of the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedures und die darunter fallenden Bestimmungen.
Dieser λ7r-20 Klon codiert für mindestens einen Teil des bovinen BMP-10 Proteins der vorliegenden Erfindung. Die Nukleotidsequenz von Klon λ7r-20 enthält einen offenen Leserahmen von wenigstens 938 bp, wie durch die Nukleotide #165–1102 von SEQ ID Nr. 1 definiert (#165–166 sind die letzten 2/3 eines Codons, welches durch ein Intron unterbrochen wird). Der offene Leserahmen codiert wenigstens 312 Aminosäuren eines BMP-10 Proteins. Das codierte 312 Aminosäuren BMP-10 Protein umfasst das vollständig reife bovine BMP-10 Protein (Aminosäure #1 bis #108 von SEQ ID Nr. 2) als auch den C-terminalen Teil des Propeptidteils des primären Translationsproduktes (Aminosäure #–204 bis #–1 von SEQ ID Nr. 2). Eine Konsens-Spleiß-Akzeptor-Sequenz, welche unmittelbar der BMP-10 Codierungssequenz an #165 bis #1102 vorausgeht und ein Im-Rahmen Stop-Codon an der Position #101 bis #103 zeigt das Vorhandensein von Intronsequenzen in der 5'-Richtung des Nukleotids #165 an.
Basierend auf der Kenntnis über andere BMP-Proteine und andere Proteine innerhalb der TGF-β Familie wird vorhergesehen, dass das Vorläufer-Polypeptid an der multibasischen Sequenz ARG-ILE-ARG-ARG in Übereinstimmung mit einer vorgeschlagenen Konsens-proteolytischen Verarbeitungssequenz von ARG-X-X-ARG gespalten würde. Von Spaltung des BMP-10 Vorläufer-Polypeptids wird erwartet, dass es ein 108 Aminosäure reifes Peptid erzeugt, beginnend mit der Aminosäure ASN an Position #1. von der Verarbeitung von BMP-10 in die reife Form wird erwartet, dass es Dimerisation und Entfernung der N-terminalen Region auf eine Weise, analog zu Verarbeitung des verwandten Proteins TGF-β einbezieht [Gentry et al., Molec. & Cell. Biol., 8: 4162 (1988); Derynck et al., Nature, 316: 701 (1985)].
Es wird daher erwogen, dass die reife aktive Art von BMP-10 ein Homodimer aus zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit Aminosäuren #1 bis #108 mit einem vorhergesehenen Molekulargewicht von etwa 12000 Daltons umfasst. Weitere aktive Arten werden erwogen, welche Aminosäuren #7 bis #108 umfassen, wobei der erste konservierte Cysteinrest eingeschlossen wird. Wie bei anderen Mitgliedern der BMP- und TGF-β Familie von Proteinen weist die Carboxy-terminale Region des bovinen BMP-10 Proteins größere Sequenzkonservierung auf, als der mehr Amino-terminale Teil. Der Prozentsatz an Aminosäure-Identität des BMP-10 Proteins in der Cystein-reichen C-terminalen Domäne (Aminosäuren #7 bis #108) mit der entsprechenden Region von anderen humanen BMP-Proteinen und anderen Proteinen innerhalb der TGF-β Familie ist wie folgt: BMP-2, 56%; BMP-3, 39%; BMP-4, 54%; BMP-5, 48%; BMP-6, 48%; BMP-7, 47%; BMP-8, 46%; BMP-9, 67%; Vg1, 50%; GDF-1, 40%; TGF-β1, 37%; TGF-β2, 37%; TGF-β3, 37%; Inhibin β (B), 36%; Inhibin β(A), 39%.
Beispiel 2
Humanes BMP-10
Von bovinen und humanen Osteoinduktionsfaktor-BMP-10 Genen wird angenommen, dass sie signifikant homolog sind, daher wird die bovine Codierungssequenz oder ein Teil davon als Sonde verwendet, um eine humane Genombibliothek zu screenen, oder als Sonde, um eine humane Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren, welche das analoge humane Knorpel- und/oder Knochen-Protein synthetisiert. Eine humane Genombibliothek, wie Stratagene Katalog #944201, kann mit solch einer Sonde gescreent und mutmaßlich Positive isoliert und DNA-Sequenz erhalten werden. Der Nachweis, dass dieses Rekombinant für einen Teil des humanen BMP-10 codiert, beruht auf den bovin/human Protein- und Genstrukturhomologien.
Sobald ein rekombinanter Bakteriophage, welcher DNA enthält, welche für einen Teil des humanen Knorpel- und/oder Knocheninduktionsfaktor-Moleküls codiert, erhalten wird, kann die humane Codierungssequenz als Sonde verwendet werden, um eine humane Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren, welche BMP-10 mRNA synthetisiert. Alternativ kann die bovine BMP-10 Codierungssequenz als Sonde verwendet werden, um solche humane Zellinie oder Gewebe zu identifizieren. Kurz beschrieben: RNA wird aus einer gewählten Zelle oder Gewebequelle extrahiert und entweder an einem Formaldehyd-Agarosegel Elektrophorese unterworfen und auf Nitrocellulose übertragen, oder mit Formaldehyd umgesetzt und direkt auf Nitrocellulose getüpfelt. Die Nitrocellulose wird dann zu einer Sonde hybridisiert, welche von einer Codierungssequenz des bovinen oder humanen BMP-10 abgeleitet wird. Alternativ wird die bovine BMP-10 Codierungssequenz verwendet, um Oligonukleotid-Primer zu entwerfen, welche spezifisch einen Teil der für BMP-10 codierenden Sequenz amplifizieren werden, welcher sich in der Region befindet, welche sich zwischen den Primern befindet, welche genutzt werden, um die spezifische Amplifizierungsreaktion durchzuführen. Es wird erwogen, dass bovine und humane BMP-10 Sequenzen es einem ermöglichen würden, entsprechende für humanes BMP-10 codierende Sequenzen aus mRNA, cDNA oder genomischen DNA-Vorlagen spezifisch zu amplifizieren. Sobald eine positive Quelle durch eines der oben beschriebenen Verfahren identifiziert worden ist, wird mRNA durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie selektiert und cDNA wird synthetisiert und in λgt10 oder andere λ-Bakteriophagenvektoren kloniert, welche den Fachleuten bekannt sind, z. B. λZAP durch etablierte Techniken (Toole et al., supra). Es ist ebenfalls möglich, die oben beschriebene Oligonukleotid-Primer gerichtete Amplifizierungsumsetzung direkt an einer vorher etablierten humanen cDNA oder Genombibliothek durchzuführen, welche in einen λ-Bakteriophagenvektor kloniert worden ist. In solchen Fällen könnte eine Bibliothek, welche spezifisch amplifiziertes DNA-Produkt ergibt, welches für einen Teil von humanem BMP-10 Protein codiert, direkt gescreent werden, unter Nutzung des Fragments von amplifizierter für BMP-10 codierender DNA als Sonde.
Oligonukleotid-Primer, entworfen auf Basis der DNA-Sequenz des bovinen BMP-10 genomischen Klons λ7r-20, sind vorausgesagt die spezifische Amplifikation von für humanes BMP-10 codierenden Sequenzen zu erlauben. Der folgende Oligonukleotid-Primer ist auf der Basis von Nukleotiden #876 bis #898 der DNA-Sequenz entworfen worden, welche in SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, und an einer automatisierten DNA-Syntheseanlage synthetisiert worden.
Primer A: TGCTCTAGACCTATGAATGTCGTGGTGTTTGC
Die ersten neun Nukleotide von Primer A (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease XbaI, welche genutzt werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz zu erleichtern, welche für das BMP-10 Protein der Erfindung codiert, und werden somit nicht von der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitet.
Der folgende Oligonukleotid-Primer ist auf der Basis von Nukleotiden #1060 bis #1037 der DNA-Sequenz entworfen, welche in SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, und an einem automatisierten DNA-Synthetisator synthetisiert worden.
Primer B: TAGGGATCCCTTGTAGGTGACGACGCCCTTATC
Die ersten neun Nukleotide von Primer B (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease BamHI, welche genutzt werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz zu erleichtern, welche für das BMP-10 Protein der Erfindung codiert, und werden somit nicht von der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz abgeleitet.
Die Standardnukleotidsymbole in den oben identifizierten Primern sind wie folgt: A, Adenosin; C, Cytosin; G, Guanin und T, Thymin.
Die oben identifizierten Primer A und B werden als Primer genutzt, um die Amplifikation eines spezifischen Nukleotids von humaner genomischer DNA zu erlauben. Die Amplifikationsreaktion wird wie folgt durchgeführt:
Humane genomische DNA (Quelle: Peripherblutlymphozyten) wird bei 100°C für fünf Minuten denaturiert und dann vor Zugabe zu einem Reaktionsgemisch, welches 200 μM von jedem Deoxynukleotidtriphosphat (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 1,25 Einheiten Taq DNA Polymerase, 100 pM Oligonukleotid Primer A und 100 pM Oligonukleotid Primer B enthält, auf Eis gekühlt. Dieses Reaktionsgemisch wird dann auf folgende Weise thermischer Cyclisierung unterworfen: 3 Minuten bei 94°C; 1 Minute bei 50°C, 1 Minute bei 72°C für einen Zyklus, dann 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C, 1 Minute bei 72°C für neununddreißig Zyklen.
Die DNA, welche durch diese Umsetzung spezifisch amplifiziert wird, wird von den überschüssigen Oligonukleotid-Primern A und B abgetrennt, welche genutzt werden, um die Amplifikation zu initiieren, und zwar durch die Verwendung eines auf DNA-Reinigungsharz basierenden Protokolls unter den vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen. Das sich ergebende DNA-Produkt wird mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und BamHI verdaut, Phenol-extrahiert, Chloroform-extrahiert. Pufferaustausch und Entfernung von kleinen Fragmenten von DNA, welche sich aus dem XbaI/BamHI Restriktionsverdau ergeben, wird durch Verdünnung des verdauten DNA-Produkts in 10 Mm Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, gefolgt durch Zentrifugation durch einen Centricon^TM 30 Mikrokonzentrierer (W. R. Grace & Co., Beverly, Ma.; Produkt #4209) erreicht. Das sich ergebende XbaI/BamHI verdaute amplifizierte DNA-Produkt wird in einen Plasmidvektor (pBluescript) zwischen den XbaI und BamHI Restriktionsstellen der Polylinkerregion subkloniert. DNA-Sequenzanalyse des sich ergebenden Subklons zeigt an, dass das spezifisch amplifizierte DNA-Sequenzprodukt für einen Teil des humanen BMP-10 Proteins dieser Erfindung codiert. Die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 3) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4) dieses spezifisch amplifizierten DNA-Fragments werden im Sequenzprotokoll dargestellt.
Nukleotide #1 bis #29 dieser Sequenz umfassen einen Teil von Oligonukleotid Primer A und Nukleotide #168 bis #197 umfassen einen Teil von Oligonukleotid Primer B, welche genutzt werden, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Aufgrund der Funktion von Oligonukleotid Primern A und B (entworfen auf der Basis von boviner BMP-10 DNA-Sequenz) beim Initiieren der Amplifikationsumsetzung können sie nicht genau mit der tatsächlichen Sequenz korrespondieren, welche für ein humanes BMP-10 codiert, und werden daher nicht in die obige Aminosäuresequenz Ableitung translatiert. Die DNA-Sequenz von Nukleotid #30 bis #167 von SEQ ID Nr. 3 oder Teile davon, welche spezifisch aus der humanen genomischen DNA-Matrize amplifiziert werden, können als Sonde genutzt werden, um zusätzliche humane BMP-10 codierende Sequenzen aus humanen Genom- oder humanen cDNA Bibliotheken durch Standardhybridisierungs-/Screening-Techniken zu identifizieren, welche den Fachleuten bekannt sind.
Vollständige humane BMP-10
Die vollständige humane BMP-10 DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 10) und codierte Aminosäurensequenz (SEQ ID Nr. 11) werden in den Sequenzprotokollen beschrieben.
Eine Million Rekombinanten einer humanen, fötalen Leber cDNA-Bibliothek (Clonetech Katalog #HL1064a), konstruiert im Vektor λgt10, werden bei einer Dichte von 20000 rekombinanten Bakteriophagen-Plaques pro Platte auf 50 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Repliken der rekombinanten Bakteriophagen-Plaques werden aus diesen Platten bereitet. Eine Oligonukleotidsonde, entworfen auf der Basis von Nukleotiden #85–#114 von SEQ ID Nr. 3, wird an einem automatisierten DNA-Syntheseanlage synthetisiert. Diese Oligonukleotidsonde wird mit γ³²P-ATP radioaktiv markiert und wird zu beiden Sätzen der doppelten Nitrocellulose-Repliken in SHB bei 65°C hybridisiert. Elf positiv hybridisierende Rekombinanten werden bemerkt. Einer der positiv hybridisierenden Rekombinanten mit dem Namen HFL-3 wird Plaque-gereinigt. Bakteriophagen-Plattenvorräte des gereinigten HFL-3 cDNA-Klons werden hergestellt und Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Ein Bakteriophagenvorrat dieses cDNA-Klons ist bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA gemäß den Anforderungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden und als ATCC #75776 bezeichnet worden. Ein Teil der DNA-Sequenz von Klon HFL-3 wird in SEQ ID Nr. 10 dargestellt.
Eine Million Rekombinanten einer humanen Genombibliothek (Stratagene Katalog #944201), konstruiert im Vektor λFIX, werden bei einer Dichte von 20000 rekombinanten Bakteriophagen-Plaques pro Platte auf 50 Platten plattiert. Doppelte Nitrocellulose-Repliken dieser rekombinanten Bakteriophagen-Plaques werden aus diesen Platten bereitet. Eine Oligonukleotidsonde, welche auf der Basis von Nukleotiden #355–#384 von SEQ ID Nr. 10 entworfen ist, wird an einer automatisierten DNA-Syntheseanlage synthetisiert. Diese Oligonukleotidsonde wird mit γ³²P-ATP radioaktiv markiert und zu beiden Sätzen der doppelten Nitrocellulose-Repliken in SHB bei 65°C hybridisiert.
Sechs positiv hybridisierende Rekombinanten werden bemerkt. Einer der positiv hybridisierenden Rekombinanten mit dem Namen 20GEN.3 wird Plaque-gereinigt. Bakteriophagen-Plattenvorräte des gereinigten 20GEN.3 genomischen Klons werden hergestellt und Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Ein Bakteriophagen-Vorrat dieses genomischen Klons ist bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA gemäß den Anforderungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden und als ATCC #75774 bezeichnet worden. Ein Teil der DNA-Sequenz von Klon 20GEN.3 wird in SEQ ID Nr. 10 dargestellt. Von einem Teil der DNA-Sequenz des genomen Klons 20GEN.3 wurde bestimmt, dass er mit einem Teil der DNA-Sequenz des cDNA-Klons HFL-3 identisch ist. Das Ausmaß dieser Überlappung (Nukleotide #219–#316) von SEQ ID Nr. 10 wurde als Basis verwendet, um die partielle Codierungssequenz des BMP-10 Proteins zusammenzustellen. Diese Sequenz wir in SEQ ID Nr. 10 dargestellt und es sollte angemerkt werden, dass die Nukleotide #1–#218 vollständig von der in dem genomischen Klon 20GEN.3 enthaltenden DNA-Sequenz abgeleitet werden und die Nukleotiden #317–#1584 vollständig von der in cDNA-Klon HFL-3 enthaltenen DNA-Sequenz abgeleitet werden, während von den Nukleotiden #219–#316 bestimmt wurde, dass sie sowohl in 20GEN.3 und HFL-3 vorhanden sind. SEQ ID Nr. 10 sagt ein humanes BMP-10 Vorläuferprotein aus mindestens 424 Aminosäuren voraus. Basierend auf den Kenntnissen von anderen BMPs und anderen Proteinen innerhalb der TGF-β Familie wird vorausgesagt, dass das Vorläufer-Polypeptid an der multibasischen Sequenz ARG-ILE-ARG-ARG (Aminosäuren #–4 bis #–1 von SEQ ID Nr. 11) in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Konsens-proteolytischen Verarbeitungssequenz ARG-X-X-ARG gespalten würde. Spaltung des humanen BMP-10 Vorläufer-Polypeptids an dieser Stelle würde ein 108 Aminosäure reifes Peptid erzeugen, beginnend mit der Aminosäure ASN an Position #1 von SEQ ID Nr. 11. von der Verarbeitung von humanem BMP-10 in die reife Form wird erwartet, dass sie Dimerisation und Entfernung der N-terminalen Region auf eine Weise analog zur Verarbeitung des verwandten Proteins TGF-β einbezieht [L. E. Gentry, et al., Molec. & Cell. Biol. 8: 4162 (1988); R. Derynck, et al., Nature 316: 701 (1985). Es wird erwogen, dass die reife aktive Art von humanem BMP-10 ein Homodimer aus zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit Aminosäuren #1–#108 von SEQ ID Nr. 11 umfasst, mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 12000 Daltons. Weitere aktive Arten werden erwogen, welche Aminosäuren #7–#108 umfassen und dadurch den ersten erhaltenen Cysteinrest einschließen. Heterodimere Moleküle, welche eine Untereinheit von BMP-10 und eine weitere Untereinheit eines anderen Mitglieds der BMP/TGF-β Superfamilie umfassen, werden ebenfalls erwogen.
Zusätzliche den Fachleuten bekannte Verfahren können verwendet werden, um andere Arten von BMP-10 Proteinen der Erfindung zu isolieren.
Beispiel 3
W-20 Biotests
A. Beschreibung von W-20 Zellen
Verwendung der W-20 Knochenmark-Stromazellen als Indikator-Zelllinie basiert auf der Umwandlung dieser Zellen zu Osteo blast-ähnlichen Zellen nach Behandlung mit einem BMP-Protein [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5: 305 (1990); und Thies et al., Endocrinology, 130: 1318 (1992)]. Speziell sind W-20 Zellen eine klonale Knochenmark-Stromazelllinie, stammend von erwachsenen Mäusen durch Forscher im Labor von Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA. Behandlung von W-20 Zellen mit bestimmten BMP-Proteinen ergibt (1) erhöhte alkalische Phosphataseproduktion, (2) Induzierung von PTH-stimuliertem cAMP und (3) Herbeiführung von Osteocalcinsynthese durch die Zellen. Während (1) und (2) Merkmale in Verbindung mit dem Osteoblast-Phenotyp darstellen, ist die Fähigkeit, Osteocalcin zu synthetisieren, eine phenotypische Eigenschaft, welche nur durch reife Osteoblasten gezeigt wird. Ferner haben wir bis jetzt Umwandlung von W-20 Stromazellen in Osteoblast-ähnlichen Zellen nur bei Behandlung mit BMPs beobachtet. Auf diese Weise korrelieren die in vitro Wirksamkeiten, welche durch BMP behandelte W-20 Zellen gezeigt werden, mit der für BMPs bekannten in vivo Knochenbildungsaktivität.
Unten werden zwei in vitro Tests beschrieben, welche beim Vergleich von BMP-Aktivitäten von neuartigen osteoinduktiven Molekülen brauchbar sind.
B. W-20 alkalische Phosphatase-Testprotokoll
W-20 Zellen werden in Gewebekulturschalen mit 96 Mulden bei einer Dichte von 10000 Zellen pro Mulde in 200 μl Medium (DME mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin) plattiert. Die Zellen dürfen über Nacht in einem 95% Luft, 5% CO₂ Inkubator bei 37°C anhaften.
Die 200 μl Medium werden mit einer Multikanal-Pipettierhilfe aus jeder Mulde entfernt und mit einem gleichen Volumen an Testprobe, geliefert in DME mit 10% Hitze-inaktiviertem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin ersetzt. Die Testsubstanzen werden dreifach getestet.
Den Testproben und Standards wird ein 24 Stunden Inkubationszeitraum mit den W-20 Indikatorzellen erlaubt. Nach den 24 Stunden werden die Schalen aus dem 37°C Inkubator entfernt und die Testmedien werden von den Zellen entfernt.
Die W-20 Zellschichten werden 3 Mal mit 200 μl pro Mulde an Calcium/Magnesium-freier, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und diese Waschlösungen werden verworfen.
50 μl Glas-destilliertes Wasser werden zu jeder Mulde zugegeben und die Testschalen werden dann in ein Trockeneis/Ethanolbad zum Blitzgefrieren platziert. Sobald gefroren werden die Schalen aus dem Trockeneis/Ethanolbad entfernt und bei 37°C aufgetaut. Dieser Schritt wird 2 weitere Male für insgesamt 3 Frost-Tau-Verfahren wiederholt. Sobald vollständig, ist die Membran-gebundene alkalische Phosphatase für Messung verfügbar.
50 μl Testgemisch (50 mM Glycin, 0,05 Triton X-100, 4 mM MgCl₂, 5 mM p-Nitrophenol-phosphat, pH = 10,3) werden zu jeder Testmulde zugegeben und die Testschalen werden dann für 30 Minuten bei 37°C in einem schüttelnden Wasserbad bei 60 Oszillationen pro Minute inkubiert.
Am Ende der 30 Minuten Inkubation wird die Umsetzung durch Zugeben von 100 μl von 0,2 N NaOH zu jeder Mulde und Platzieren der Testschalen auf Eis gestoppt.
Die spektrophotometrische Absorption für jede Mulde wird bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern abgelesen. Diese Werte werden dann mit bekannten Standards verglichen, um eine Schätzung der alkalischen Phosphataseaktivität in jeder Probe zu ergeben. Zum Beispiel werden unter Verwendung von bekannten Mengen an p-Nitrophenolphosphat Absorptionswerte erzeugt. Dies wird in Tabelle I gezeigt.
Tabelle 1
Absorptionswerte für bekannte Mengen an BMPs können bestimmt werden und können zu μmol an p-Nitrophenolphosphat, gespalten pro Zeiteinheit umgewandelt werden, wie in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Diese Werte werden dann verwendet, um die Wirksamkeiten von bekannten Mengen an BMP-10 mit BMP-2 zu vergleichen.
C. Osteocalcin RIA Protokoll
W-20 Zellen werden bei 10⁶ Zellen pro Mulde in Multiwell Gewebekulturschalen mit 24 Mulden in 2 ml DME plattiert, welches 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin enthält. Die Zellen dürfen über Nacht in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C anhaften.
Am nächsten Tag wird das Medium zu DME gewechselt, welches 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und die Testsubstanz in einem Gesamtvolumen von 2 ml enthält. Jede Testsubstanz wird an dreifache Mulden verabreicht. Die Testsubstanzen werden mit den W-20 Zellen für insgesamt 96 Stunden inkubiert, mit Ersetzen bei 48 Stunden durch die gleichen Testmedien.
Am Ende von 96 Stunden werden 50 μl Testmedium aus jeder Mulde entfernt und bezüglich Osteocalcin-Produktion unter Verwendung eines Radioimmuntests für Maus-Osteocalcin getestet. Die Details des Tests werden in dem Kit beschrieben, welches durch Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072 hergestellt wird. Reagenzien für den Test werden als Produktnummern BT-431 (Maus-Osteocalcin-Standard), BT-432 (Ziege-anti-Maus Osteocalcin), BT-431R (iodiertes Maus-Osteocalcin), BT-415 (normales Ziegenserum) und BT-414 (Esel-anti-Ziege IgG) gefunden. Der RIA für Osteocalcin, synthetisiert durch W-20 Zellen in Antwort auf BMP-Behandlung, wird wie in dem durch den Hersteller vorgesehenen Protokoll beschrieben durchgeführt.
Die erhaltenen Werte für die Testproben werden mit Werten für bekannte Standards von Maus-Osteocalcin verglichen und mit der Menge an Osteocalcin, welche durch W-20 Zellen in Antwort auf Exposition mit bekannten Mengen von BMP-2 produziert werden. Die Werte für BMP-2 induzierte Osteocalcin-Synthese durch W-20 Zellen wird in Tabelle III gezeigt.
Tabelle III
Beispiel 4
Rosen-modifizierter Sampath-Reddi-Test
Eine modifizierte Version des Rattenknochenbildungstests, beschrieben in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591–6595 (1983) wird verwendet, um Knochen und/oder Knorpel Aktivität von BMP Proteinen zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hierin der Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Test genannt. Der Ethanol-Ausfällungsschritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch Dialysieren (falls die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltrieren (falls die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann zu 0,1% TFA äquilibriert. Die sich ergebende Lösung wird zu 20 mg Rattenmatrix zugegeben. Eine Rattenmatrix-Scheinprobe, welche nicht mit dem Protein behandelt wird, dient als Kontrolle. Dieses Material wird gefroren und gefriergetrocknet und das sich ergebende Pulver wird in #5 Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in den abdominalen Thoraxbereich von 21–49 Tage alten männlichen Long Evans Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7–14 Tagen entfernt. Die Hälfte eines jeden Implantats wird zur alkalischen Phosphatase-Analyse verwendet [siehe Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69: 1601 (1972)].
Die andere Hälfte von jedem Implantat wird fixiert und zur histologischen Analyse verarbeitet. 1 μm Glycolmethacrylat-Schnitte werden mit von Kossa und Fuchsinsäure eingefärbt, um die Menge an herbeigeführter Knochen- und Knorpelbildung, welche in jedem Implantat vorhanden ist, zu bewerten. Die Begriffe +1 bis +5 repräsentieren den Bereich jedes histologischen Abschnitts eines Implantats, der durch neue Knochen- und/oder Knorpelzellen und Matrix besetzt ist. Eine Bewertung von +5 zeigt an, dass mehr als 50% des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, welcher als direkte Folge von Protein im Implantat hergestellt wurde. Eine Bewertung von +4, +3, +2 und +1 würde anzeigen, dass mehr als 40%, 30%, 20% bzw. 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthalten.
Die BMP-10 Proteine dieser Erfindung können in diesem Test auf Wirksamkeit getestet werden.
Beispiel 5
Expression von BMP-10
Um bovine, humane oder andere Säugetier-BMP-10 Proteine herzustellen, wird die DNA, welche für sie codiert, in einen passenden Expressionsvektor übertragen und in Säugetierzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch herkömmliche gentechnische Verfahren eingeführt. Es wird erwogen, dass das bevorzugte Expressionssystem für biologisch wirksames, rekombinantes, humanes BMP-10, stabil transformierte Säugetierzellen sein können.
Ein Fachmann kann Säugetier-Expressionsvektoren durch Einsetzen der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 konstruieren, oder anderen DNA-Sequenzen, welche für BMP-10 Proteine codieren, oder anderen modifizierten Sequenzen und bekannten Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2: 161–170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645–653 (1985)] und pMT2 CXM.
Der Säugetier-Expressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023(b) (Wong et al., Science 228: 810–815, 1985), welcher sich vom letzteren dadurch unterscheidet, dass er das Ampicillin-Resistenzgen anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens enthält und ferner eine XhoI-Stelle zur Insertion von cDNA-Klonen enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden (Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689–693) und schließen die Adenovirus VA-Gene, den SV40 Replikationsursprung einschließlich den 72 bp Verstärker, den Adenovirus Major-Late-Promotor, einschließlich einer 5' Spleiß-Stelle und das Meiste der Adeonovirus Tripartite Leitsequenz, welche an Adenovirus Late mRNAs vorhanden ist, eine 3'-Spleiß Akzeptorstelle, ein DHFR-Insert, die SV40 Early Polyadenylierungsstelle (SV40) und pBR322 Sequenzen ein, welche zur Propagierung in E. coli notwendig sind.
Plasmid pMT2 CXM wird durch EcoRI-Verdau von pMT2-VWF erhalten, welcher bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) unter Eingangsnummer ATCC 67122 hinterlegt worden ist. EcoRI-Verdau schneidet das cDNA-Insert aus, welches in pMT2-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillinresistenz umzuwandeln. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. pMT2 CXM wird dann unter Verwendung von Loopout/in Mutagenese [Morinaga et al., Biotechnology 84: 636 (1984)] konstruiert. Dies entfernt Basen 1075 bis 1145 bezüglich der HindIII Stelle nahe dem SV40-Replikationsursprung und Verstärkersequenzen von pMT2. Zusätzlich insertiert es die folgende Sequenz:
5'-PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'
an Nukleotid 1145. Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease XhoI. Ein Derivat von pMT2CXM mit der Bezeichnung pMT23 enthält Erkennungsstellen für die Restriktionsendonukleasen PstI, EcoRI, SalI und XhoI. Plasmid pMT2 CXM und pMT23 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
pEMC2β1, abgeleitet von pMT21, kann auch in der Praxis der Erfindung brauchbar sein. pMT21 wird von pMT2 abgeleitet, welches von pMT2-VWF abgeleitet wird. Wie oben beschrieben, schneidet EcoRI-Verdau das cDNA-Insert aus, welches in pMT-VWF vorhanden ist, was pMT2 in linearer Form ergibt, welches ligiert und verwendet werden kann, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Plasmid pMT2 DNA kann durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden.
pMT21 wird durch die folgenden zwei Modifikationen von pMT2 abgeleitet. Zuerst wird 76 bp der 5' nicht-translatierten Region der DHFR cDNA einschließlich einer Strecke von 19 G Resten von G/C Tailing für cDNA Klonierung deletiert. In diesem Prozess wird eine XhoI-Stelle insertiert, um die folgende Sequenz direkt oberhalb von DHFR zu erhalten:
Zweitens wird eine einzigartige ClaI-Stelle durch Verdau mit EcoRV und XbaI, Behandlung mit Klenow-Fragment von DNR-Polymerase I und Ligation an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingeführt. Dies deletiert ein 250 bp Segment aus der Adenovirus-assoziierten RNA (VAI) Region aber stört nicht VAI RNA Genexpression oder Funktion. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI verdaut und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 abzuleiten.
Ein Teil des EMCV-Leiters wird aus pMT2-ECAT1 [S. K. Jung et al., J. Virol 63: 1651–1660 (1989)] durch Verdau mit EcoRI und PstI erhalten, was ein 2752 bp Fragment ergibt. Dieses Fragment wird mit TaqI verdaut, was ein EcoRI-TaqI Fragment von 508 bp ergibt, welches durch Elektrophorese an niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt wird. Ein 68 bp Adapter und sein komplementärer Strang werden mit einem 5' TaqI hervortretenden Ende und einem 3' XhoI hervortretenden Ende synthetisiert, was die folgende Sequenz hat:
Diese Sequenz stimmt mit der EMC-Virus Leitsequenz von Nukleotid 763 bis 827. Sie verändert auch das ATG an Position 10 innerhalb des EMC Virusleiters zu einem ATT und ihr folgt eine XhoI-Stelle. Eine Drei-Wege Ligation des pMT21 EcoRI-XhoI Fragments, des EMC Virus EcoRI-TaqI Fragments und des 68 bp Oligonukleotid-Adapters TaqI-XhoI Adapters ergibt den Vektor pEMC2β1.
Dieser Vektor enthält den SV40 Replikationsursprung und Verstärker, den Adenovirus Major-Late-Promotor, eine cDNA Kopie der Mehrheit der Adenovirus-Tripartite-Leitsequenz, eine kleine Hybrid-intervenierende Sequenz, ein SV40 Polyadenylierungssignal und das Adenovirus VA I Gen, DHFR und β-Lactamasemarker und eine EMC-Sequenz in passenden Verhältnissen, um die hochgradige Expression der gewünschten cDNA in Säugetierzellen zu steuern.
Die Konstruktion von Vektoren kann Modifikation der BMP-10 DNA-Sequenzen einbeziehen. Zum Beispiel kann BMP-10 cDNA durch Entfernen der nicht-codierenden Nukleotide an den 5' und 3' Enden der Codierungsregion modifiziert werden. Die deletierten nicht-codierenden Nukleotide können durch andere Sequenzen ersetzt werden oder nicht, von welchen bekannt ist, dass sie der Expression zuträglich sind. Diese Vektoren werden zur Expression von BMP-10 Proteinen in passende Wirtszellen transformiert. Zusätzlich kann die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 oder andere Sequenzen, welche für BMP-10 Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes BMP-10 Protein zu exprimieren, durch Deletieren von für BMP-10 codierende Propeptidsequenzen und ihr Ersetzen durch Sequenzen, welche für die vollständigen Propeptide von anderen BMP-Proteinen codieren.
Ein Fachmann kann die Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 10 durch Eliminieren oder Ersetzen der Säugetier-regulatorischen Sequenzen, welche die Codierungssequenz flankieren, mit bakteriellen Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch bakterielle Zellen zu erzeugen. Zum Beispiel könnten die Codierungssequenzen weiter manipuliert werden (z. B. ligiert an andere bekannte Linker oder modifiziert durch Deletieren von nicht-codierenden Sequenzen daraus oder Verändern von Nukleotiden darin durch andere bekannte Techniken). Die modifizierte für BMP-10 codierende Sequenz könnte dann in einen bekannten bakteriellen Vektor unter Verwendung von Verfahren insertiert werden, wie in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5230–5233 (1980) beschrieben. Dieser exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in bakterielle Wirtszellen transformiert werden und dadurch ein BMP-10 Protein exprimieren. Für eine Strategie zum Herstellen extrazellulärer Expression von BMP-10 Proteinen in bakteriellen Zellen siehe z. B. Europäische Patentanmeldung EPA-177343.
Ähnliche Manipulationen können für die Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z. B. Verfahren, welche in veröffentlichter Europäischer Patentanmeldung 155476 beschrieben werden] zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor könnte ebenfalls konstruiert werden, der Regulatorsequenzen von Hefe für intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Faktoren der vorliegenden Erfindung durch Hefezellen einsetzt [siehe z. B. in veröffentlichter PCT-Anmeldung WO-86/00639 und Europäischer Patentanmeldung EPA-123289 beschriebene Verfahren].
Ein Verfahren zum Herstellen von großen Mengen eines BMP-10 Proteins der Erfindung in Säugetierzellen kann die Konstruktion von Zellen einbeziehen, welche multiple Kopien des heterologen BMP-10 Gens enthalten. Das heterologe Gen ist an einen amplifizierbaren Marker gebunden, z. B. das Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Gen, für welches Zellen, welche erhöhte Genkopien enthalten, zur Propagierung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601–692 (1982) selektiert werden können. Diese Herangehensweise kann bei einer Anzahl an unterschiedlichen Zelltypen eingesetzt werden.
Zum Beispiel können ein Plasmid, welches eine DNA-Sequenz für ein BMP-10 Protein der Erfindung in operativer Assoziation mit anderen Plasmidsequenzen enthält, welche Expression davon ermöglichen und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol., 2: 1304 (1982)] in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII durch verschiedene Verfahren, einschließlich Calciumphosphat-Co-Ausfällung und Transfektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion co-eingeführt werden. DHFR exprimierende Transformanten werden bezüglich Wachstum in Alpha-Medien mit dialysiertem fötalen Rinderserum selektiert und nachfolgend bezüglich Amplifikation durch Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX (z. B. aufeinander folgenden Schritten in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX) wie in Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben selektiert. Die Transformanten werden kloniert und biologisch wirksame BMP-10 Expression wird durch den oben in Beispiel 4 beschriebenen Rosen-modifizierten Sampath-Reddi-Rattenknochenbildungstest überwacht. BMP-10 Expression sollte mit zunehmendem Level von MTX-Resistenz steigen. BMP-10 Polypeptide werden unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Standardtechniken wie Pulsmarkierung mit [35S] Methionin oder Cystein und Polyacrylamidgel-Elektrophorese gekennzeichnet. Ähnlichen Verfahren kann gefolgt werden, um andere verwandte BMP-10 Proteine herzustellen.
Beispiel 6
Biologische Aktivität von exprimiertem BMP-10
Um die biologische Aktivität der in Beispiel 5 oben erhaltenen exprimierten BMP-10 Proteine zu messen, werden die Proteine aus der Zellkultur gewonnen und gereinigt, indem man die BMP-10 Proteine von anderen proteinartigen Materialien isoliert, mit welchen sie gemeinsam hergestellt werden, als auch von anderen Verunreinigungen. Das gereinigte Protein kann gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Rattenknochenbildungstest getestet werden.
Die Reinigung wird unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Standardtechniken durchgeführt.
Die Proteinanalyse wird unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, wie SDS-PAGE Acrylamid [Laemmli, Nature 227: 680 (1970)], mit Silber gefärbt [Oakley et al., Anal. Biochem. 105: 361 (1980)] und durch Immunoblot [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 (1979)].
Die vorhergehenden Beschreibungen beschreiben detailliert gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Es wird erwartet, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen in der Praxis davon bei den Fachleuten bei Erwägung dieser Beschreibungen auftreten werden. Von jenen Modifikationen und Variationen wird angenommen, dass sie innerhalb der hieran angehängten Ansprüche umfasst werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, welches durch die Fähigkeit, die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu induzieren, gekennzeichnet ist, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Nukleotiden #779 oder #797 bis #1102 der SEQ ID Nr. 1; (b) den Nukleotiden #1108 oder #1126 bis #1431 der SEQ ID Nr. 10; (c) Nukleotiden, die für die Aminosäuren #1 bis #108 der SEQ ID Nr. 2 codieren; und (d) Nukleotiden, die für die Aminosäuren #1 bis #108 der SEQ ID Nr. 11 codieren.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, welche weiters eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die für ein geeignetes Propeptid codiert, das 5' zur DNA-Sequenz des Anspruchs 1 steht und im Leserahmen mit dieser verbunden ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 2, wobei das Propeptid von einem Mitglied der TGF-β-Superfamilie der Proteine stammt.
Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in funktioneller Verbindung mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz dafür.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 4.
Wirtszelle nach Anspruch 5, welche eine Säugerzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches durch die Fähigkeit die Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu induzieren, gekennzeichnet ist, umfassend (a) das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 5 oder 6; und (b) das Gewinnen des Proteins aus dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 7, welches weiters das Reinigen des BMP-10-Proteins umfasst.
BMP-10-Protein, codiert von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Polypeptid-Dimer, wobei jede Untereinheit eine Aminosäure-Sequenz für das BMP-10-Protein nach Anspruch 9 aufweist.
Polypeptid-Dimer, wobei eine Untereinheit eine Aminosäure-Sequenz für das BMP-10-Protein nach Anspruch 9, und eine Untereinheit eine Aminosäure-Sequenz für ein Knochen-Morphogenese-Protein (bone morphogenetic protein), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9, aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das BMP-10-Protein nach Anspruch 9 oder das Polypeptid nach Anspruch 10 oder 11, in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, welche weiters eine Matrix als Träger für die Zusammensetzung und zur Bereitstellung einer Oberfläche für Knochen- und/oder Knorpel-Wachstum umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Matrix Hydroxyapatit, Kollagen, Polymilchsäure oder Tricalciumphosphat umfasst.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Knochen- und/oder Knorpelbildung bei einem Patienten, der dessen bedarf.