JP5816553B2 - 腱または靭帯の傷害を処置するための血小板由来成長因子組成物および方法 - Google Patents
腱または靭帯の傷害を処置するための血小板由来成長因子組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2008年9月9日に出願された米国仮出願第61/191,641号、2009年1月12日に出願された米国仮出願第61/144,088号および2009年1月12日に出願された米国仮出願第61/144,126号(これらの全体は、参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本発明は、腱または靭帯の傷害、例えば、断裂、切断、引裂、または横切した腱もしくは靭帯、または骨からの腱もしくは靭帯の剥離などを治療するための組成物および方法、特に、血小板由来成長因子(PDGF)と組み合わせて生体適合性マトリックスを含む組成物を投与することによって、腱または靭帯の傷害を治療するための方法に関する。
腱および靭帯は、筋肉と骨または骨と骨をつなぐ強靭な線維であるが、腱および靭帯は、様々な理由で断裂、切断し、または骨から剥離する場合がある。そのような腱または靭帯の傷害は、患部腱/靭帯への直接の外傷、年齢の進行に起因する腱/靭帯の脆弱化、偏心した負荷、繰り返しの運動、酷使および/または応力もしくは活動の増大に起因して、またはこれらの結果として一般に起こり得る。そのような急性傷害は、かなり劇的であり、通常、個体が患部関節を動かすことができないままにする。
本発明は、腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
個体における、骨を伴わない腱傷害または靭帯傷害を治療するための方法であって、前記方法は、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子(PDGF)を含む有効量の組成物を前記個体の傷害の患部に投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約80%の多孔度を有し、前記PDGFの少なくとも約50%が約24時間以内に放出される、方法。
(項目2)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約85%の多孔度を有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約90%の多孔度を有する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約92%の多孔度を有する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約95%の多孔度を有する、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記孔が、約2500um 2 〜約20,000um 2 の範囲の平均面積を有する、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記孔が、約200um〜約600umの範囲の平均周囲長を有する、項目1から6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記孔が、約1μm〜約1mmの範囲の直径を有する、項目1から7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記孔が、少なくとも約5μmの直径を有する、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記孔が相互接続された孔である、項目1から9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記PDGFの少なくとも約60%が、約24時間以内に放出される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記PDGFの少なくとも約70%が、約24時間以内に放出される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記PDGFの少なくとも約80%が、約24時間以内に放出される、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約21日以内に再吸収される、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約18日以内に再吸収される、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約15日以内に再吸収される、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記コラーゲンが可溶性である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記コラーゲンが架橋されている、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記生体適合性マトリックスがグリコサミノグリカンをさらに含む、項目17に記載の方法。
(項目21)
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記組成物が、ゲル、粒子、粉末、シート、パッド、ペースト、パッチ、またはスポンジである、項目1から21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記組成物が流動性である、項目1から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記生体適合性マトリックスがCOLLATAPE(登録商標)である、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記PDGFが、PDGFを含む溶液として存在し、前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.1mg/ml〜約2.0mg/mlである、項目1から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.1mg/ml〜約0.4mg/mlである、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.9mg/ml〜約1.5mg/mlである、項目25に記載の方法。
(項目28)
細胞が、前記組成物に曝された後約4日以内に前記組成物に浸潤する、項目1から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記腱傷害を機械的に安定化させるステップをさらに含む、項目1から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記腱または靭帯の傷害を安定化させるステップが、前記腱または靭帯の傷害を縫合するステップを含み、それによって縫合された前記腱または靭帯は、傷害された前記腱または傷害された前記靭帯の端部が実質的に再接近されるように配置される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記投与するステップが、前記個体の前記傷害の患部に前記有効量の前記組成物を、シリンジを使用して投与するステップを含む、項目1から30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記腱が、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記靭帯が、前十字靭帯(anterior cruciate ligament)、外側側副靭帯(lateral collateral ligament)、後十字靭帯(posterior cruciate ligament)、内側側副靭帯(medial collateral ligament)、頭側十字靭帯(cranial cruciate ligament)、尾方十字靭帯(caudal cruciate ligament)、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯(ulnar collateral ligament)、および外側側副靭帯(radial collateral ligament)からなる群より選択される、項目1から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記腱または靭帯の傷害が、腱もしくは靭帯の断裂、切断、引裂、離層、歪み、または変形である、項目1から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
個体において腱を骨にまたは靭帯を骨に結合させるための方法であって、前記腱と前記骨の界面または前記靭帯と前記骨の界面で、生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子(PDGF)を含む有効量の組成物を前記個体に投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約80%の多孔度を有し、前記PDGFの少なくとも約50%が約24時間以内に放出される、方法。
(項目36)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約85%の多孔度を有する、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約90%の多孔度を有する、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約92%の多孔度を有する、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記生体適合性マトリックスが、少なくとも約95%の多孔度を有する、項目35に記載の方法。
(項目40)
前記孔が、約2500um 2 〜約20,000um 2 の範囲の平均面積を有する、項目35から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記孔が、約200um〜約600umの範囲の平均周囲長を有する、項目35から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記孔が、約1μm〜約1mmの範囲の直径を有する、項目35から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記孔が、少なくとも約5μmの直径を有する、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記孔が相互接続された孔である、項目35から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記PDGFの少なくとも約60%が、約24時間以内に放出される、項目35から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記PDGFの少なくとも約70%が、約24時間以内に放出される、項目35から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記PDGFの少なくとも約80%が、約24時間以内に放出される、項目35から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約21日以内に再吸収される、項目35から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約18日以内に再吸収される、項目35から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の約15日以内に再吸収される、項目35から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、項目35から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記コラーゲンが可溶性である、項目35から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記コラーゲンが架橋されている、項目35から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記生体適合性マトリックスがグリコサミノグリカンをさらに含む、項目35から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記組成物が、ゲル、粒子、粉末、シート、パッド、ペースト、パッチ、またはスポンジである、項目35から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記生体適合性マトリックスがCOLLATAPE(登録商標)である、項目35から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記PDGFが、PDGFを含む溶液として存在し、前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.1mg/ml〜約2.0mg/mlである、項目35から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.1mg/ml〜約0.4mg/mlである、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記溶液中のPDGFの濃度が、約0.9mg/ml〜約1.5mg/mlである、項目58に記載の方法。
(項目61)
細胞が、前記組成物に曝された後約4日以内に前記組成物に浸潤する、項目35から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記腱が、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される、項目35から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記靭帯が、前十字靭帯(anterior cruciate ligament)、外側側副靭帯(lateral collateral ligament)、後十字靭帯(posterior cruciate ligament)、内側側副靭帯(medial collateral ligament)、頭側十字靭帯(cranial cruciate ligament)、尾方十字靭帯(caudal cruciate ligament)、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯(ulnar collateral ligament)、および外側側副靭帯(radial collateral ligament)からなる群より選択される、項目35から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記結合が、回旋腱板傷害治療のためである、項目35から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記結合が、前十字靭帯再建のためである、項目35から63のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
個体における、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第1の容器、および血小板由来成長因子(PDGF)溶液を含む第2の容器を投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約80%の多孔度を有し、前記PDGFの少なくとも約50%が約24時間以内に放出される、キット。
(項目67)
個体において腱または靭帯を骨に結合させるためのキットであって、生体適合性マトリックスを含む第1の容器、および血小板由来成長因子(PDGF)溶液を含む第2の容器を投与するステップを含み、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも約80%の多孔度を有し、前記PDGFの少なくとも約50%が約24時間以内に放出される、キット。
個体において、骨を伴わない腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法が本明細書で記載されている。一般に、治療方法は、腱または靭帯の傷害を有する個体に、生体適合性マトリックスおよびPDGFを含む組成物を投与するステップを含む。具体的には、治療方法は、腱または靭帯の傷害の部位に、コラーゲンマトリックスおよびPDGFを含む組成物を投与するステップを含む。
生体適合性マトリックスは、本発明のいくつかの実施形態によれば、足場マトリックスを含む。足場マトリックスは、本発明のいくつかの実施形態によれば、腱/靭帯および/または骨組織を含めた、新組織成長が起こるためのフレームワークまたは足場を提供する。
いくつかの実施形態では、生体適合性マトリックスは、足場マトリックスおよび生体適合性結合剤を含む。生体適合性結合剤は、合わされた物質同士間の粘着を促進するように作用できる物質を含むことができる。生体適合性結合剤は、例えば、生体適合性マトリックスの形成において、骨足場材料の粒子同士間の接着を促進することができる。ある特定の実施形態では、材料が、合わされた物質同士間の粘着を促進するように作用し、腱、靭帯、および骨成長を含めた新規組織成長が起こるためのフレームワークを提供する場合、同じ物質が、足場材料と結合剤の両方として機能することができる。WO2008/005427および米国第11/772,646号(米国公開第2008/00274470号)を参照。
本発明は、個体における腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。一般に、治療方法は、腱または靭帯の傷害を有する個体に、生体適合性マトリックスおよびPGGFを含む組成物を投与するステップを含む。具体的には、治療方法は、腱または靭帯の傷害の部位に、コラーゲンマトリックスおよびPDGFを含む組成物を投与するステップを含む。
本発明の組成物および方法は、いくつかの実施形態によれば、PDGFに加えて、1つまたは複数の生物学的活性剤をさらに含むことができる。PDGFに加えて本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性剤は、有機分子、無機物質、タンパク質、ペプチド、核酸(例えば、遺伝子、遺伝子断片、低分子干渉リボ核酸(siRNA)、遺伝子制御配列、核転写因子、およびアンチセンス分子)、核タンパク質、多糖(例えば、ヘパリン)、糖タンパク質、およびリポタンパク質を含むことができる。例えば、抗癌剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋弛緩剤、プロスタグランジン、栄養因子、骨誘導タンパク質、成長因子、およびワクチンを含めた、本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化合物の非限定例は、米国第11/159,533号(米国公開第20060084602号)に開示されている。本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化合物には、いくつかの実施形態では、骨誘導因子、例えば、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、または他のPDGFが含まれる。他の実施形態によれば、本発明の組成物中に組み込むことができる生物学的活性化因子として、好ましくは、骨誘導因子および骨刺激因子(osteostimulatory factor)、例えば、骨形態形成タンパク質(BMP)、BMP模倣剤、カルシトニン、カルシトニン模倣剤、スタチン、スタチン誘導体、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、成長分化因子、および/または副甲状腺ホルモンなどが挙げられる。本発明の組成物中に組み込むための追加の因子として、いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤、ならびにビスホスホネートを含めた、骨吸収を減少させる骨粗鬆症治療剤、ならびにNF−kB(RANK)配位子に対する抗体が挙げられる。
本発明の方法によって治療することができる腱には、任意の腱が含まれる。腱の非限定例として、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱(回旋腱板複合体)、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱が挙げられる。いくつかの実施形態では、腱は、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝窩腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、および内転筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱(回旋腱板複合体)、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱(回旋腱板複合体)、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、および大腿四頭筋腱からなる群より選択されない。
本発明は、腱または靭帯の傷害を治療するための組成物および方法を提供する。この治療方法は、骨を伴わない傷害された腱または靭帯、例えば、腱/靭帯の切断、腱/靭帯の断裂、引裂を示す腱/靭帯、離層、または任意の他の歪みもしくは変形などの治療を含むことができる。
本発明は、骨中に/骨に腱または靭帯を結合または再結合するため、および腱または靭帯の骨への結合を強化するための方法を提供する。結合方法は、腱と骨および靭帯と骨の界面での腱または靭帯の骨との一体化または整復を含むことができる。いくつかの実施形態では、骨に、または骨中に腱または靭帯を結合するための方法は、生体適合性マトリックス中に配置されたPDGF溶液を含む組成物を提供するステップと、腱/靭帯と骨の界面にこの組成物を適用するステップとを含む。
いくつかの実施形態では、結合方法は、生体適合性マトリックスを含む組成物を提供するステップと、剥離した腱の周囲をラップするステップと、骨中に組成物および腱を挿入するステップと、骨に穴をあけられたトンネル中にPDGF溶液を注入するステップと、縫合で腱を骨に結合するステップとを含む。
本明細書における本発明の方法で使用され、または本明細書におけるキットに含められる縫合糸は、PDGFを含むことができる。PDGFは、PDGFを含む溶液によって縫合糸中に浸漬し、または縫合糸上にコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、PDGFは、約5.0〜約20.0mg/ml、例えば、約7.5〜約15mg/ml、例えば、約10mg/mlの任意の濃度で溶液中に存在する。
別の態様では、本発明は、PDGF溶液を含む第1の容器、および生体適合性マトリックスを含む第2の容器を含むキットを提供する。
様々なコラーゲンマトリックスの構造上の特徴づけ
4つのコラーゲンマトリックスを試験して、微細構造および多孔度の差を求めた。コラーゲンマトリックスは、Kensey Nash Coporationから得た。マトリックスは、主にI型コラーゲンの源であるウシ真皮からの精製コラーゲン抽出物から作製した。マトリックスは、4.5%、5%、6%、および7%(w/v)の様々な濃度のコラーゲンを含むコラーゲンスラリーから作製する。乾燥コラーゲンマトリックス(4.5%、5%、6%、および7%)に液体窒素を流した後、打ち抜いて5mmのディスクにした。ディスクを、3つの異なる配向(頂部が上、底部が上、側部が上)でスタブ上に取り付け、金−パラジウムでコーティングし、走査電子顕微鏡法(SEM)によって調べた。
様々なコラーゲンマトリックスの累積PDGF放出分析
様々なコラーゲンマトリックスからの累積PDGF放出を分析した。コラーゲンマトリックスは、Kensey Nash Corporationから得た。これは、実施例1で上述したものと同じである。各タイプ、すなわち、5%、6%、および7%のコラーゲンマトリックス(8mmのディスク)を27 1/2Gの針で留め、0.3mg/mlのrhPDGF−BB 80μlで水和し、試料を室温で10分間インキュベートした。コラーゲンディスクを2mlのマイクロチューブ内に入れ、溶出バッファー(2%のウシ胎児血清を含有するMEM)2mlを添加してrhPDGF−BBを放出させた。各測定に三つ組の試料を使用した。対照試料は、rhPDGF−BB 80μlを溶出バッファー2mlに添加して構成した。マイクロチューブを37℃のインキュベーター内の軌道振盪機上で振盪した。10分、1時間、8時間、および24時間で、溶離液を各チューブから取り出し、2〜8℃で貯蔵した。等体積の新鮮な溶出バッファーを各チューブに添加した。各コラーゲンマトリックスの貯蔵した溶離液を、製造者の指示書に従って、DuoSet ELISA(R & D System)キットを使用してrhPDGF−BBについてアッセイした。
様々なコラーゲンマトリックスからのPDGF放出の生物学的力価試験
様々なコラーゲンマトリックスから放出されるPDGFの生物学的力価を、細胞増殖アッセイで評価した。試料は、実施例2で上述したプロトコールの変法に従って調製した。溶出バッファーを、2%仔ウシ血清含有D−MEMに変更した。1時間の時点で採取した各物質についての二つ組の試料を使用した。rhPDGF−BBの濃度をDuoSet ELISAアッセイによって求め、その結果を参照として使用して、試料を1μg/mlの濃度に希釈使用した。0.3mg/mlのrhPDGF−BBを参照標準として使用し、すべてのプレートに適用した。1μg/mlの開始濃度を使用して、96ウェルマイクロタイタープレート(ブラックウォールおよびクリアボトム)中に各試料を装填し、次いで同じ横列にわたって1.667倍に連続的に希釈した。ブランク対照として使用した、各プレートの最後の縦列を除いて、約104個のNIH 3T3細胞を各ウェルに添加した。48時間培養した後、ブロモデオキシウリジン(BrdU)標識を各プレートに添加した。さらに24時間培養した後、BrdU細胞増殖アッセイを、製造者の指示書に従って行った。
コラーゲンマトリックスから放出されるPDGFの安定性試験
コラーゲンマトリックスから放出されるrhPDGFの安定性を試験した。各タイプ(5%、6%、および7%)のコラーゲンマトリックス(8mmのディスク)を27 1/2Gの針で留め、1.0mg/mlのrhPDGF−BB 50μlで水和した。溶出バッファー(20mMの酢酸ナトリウム+0.25Nの塩化ナトリウム)0.4mlで満たしたマイクロチューブ内で、各試料を1時間インキュベートした。次いで放出されたPDGFをサイズ排除HPLCによって分析した。三つ組で測定を行った。コラーゲンマトリックスから放出されたrhPDGF−BBについて著しい特性シフトはまったく見出されず、コラーゲンマトリックスから放出されるPDGFの安定性を実証した。
様々なコラーゲンマトリックスの腱細胞浸潤試験
様々なコラーゲンマトリックス中に浸潤する腱細胞の能力を評価した。コラーゲンマトリックスは、Kensey Nash Corporationから得、本明細書に記載したように、5%、6%、および7%(w/v)のコラーゲン濃度を有するコラーゲンスラリーから作製した。コラーゲンシート(1.5〜2.0mmの厚さ)を打ち抜いて直径8mmのディスクにし、インビトロ細胞遊走試験を行った。
コラーゲン/PDGF組成物を用いたアキレス腱傷害の治療
本発明による組成物および方法の効力を評価するために、以下に説明するような例示的試験を使用した。本発明は、コラーゲンマトリックスと混合したrhPDGF−BB溶液を含む組成物およびその使用方法を含む。例えば、コラーゲンマトリックスは、流動性コラーゲンマトリックスであり、架橋ウシ腱コラーゲンおよびグリコサミノグリカン(GAG)マトリックスを含む。流動性組成物は、シリンジまたは適当な手段によって傷害部位に容易に供給される。
この試験に登録されたヒツジのアキレス腱を横切し、その後即時に修復を行った。ヒツジを3つの例示的な試験群(n=8/群)に分け、以下の組成物を使用した:1)再接近させた腱端部(改良Mason Allen縫合デザインで安定化)に配置した、20mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0+/−0.5)中の流動性コラーゲンマトリックス(対照)、2)再接近させた腱端部(改良Mason Allen縫合で安定化)に配置した、0.3mg/mlのrhPDGF−BBを含有する20mMの酢酸ナトリウムバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス、および3)再接近させた腱端部(改良Mason Allen縫合で安定化)に配置した、1.0mg/mlのrhPDGF−BBを含有する20mMの酢酸ナトリウムバッファー中の流動性コラーゲンマトリックス。#1 Ethilonナイロン縫合糸(Ethicon Endo−Surgery, Inc、Cincinnati、OH)などの縫合材料を使用した。模擬アキレス断裂および再結合の生体力学的性能および組織応答を求めた。生体力学的性能および組織応答試験の両方についての動物の処置の割当および数を、表3に略述する。
手術日に、全身麻酔を誘導するためにジアゼパム(0.22mg/kg)およびケタミン(10mg/kg)からなるIV注射を投与した。カフ付き気管内チューブを配置し、再呼吸系を通じて、100%の酸素(2L/分)中のイソフルオラン(1.5%〜3.0%)を用いて全身麻酔を維持した。呼吸を補助するために動物を人工呼吸器上に配置した。胃管を配置することができた。
動物を、屠殺するまで1日2回観察した。第1週の間に、異常治癒および創傷裂開について、手術部位を観察し、写真を得た。手術後の試験期間を通して、一般的な姿勢、食欲、手術した肢の使用(例えば、跛行)、および手術部位の外見について動物を観察した。手術部位で感染症が発症した場合、抗生物質を動物に投与し、観察記録に記録した。当技術分野で公知の方法を使用して、手術して2週間後、4週間後、および8週間後に、手術したアキレス腱および対側の未手術のアキレス腱の両方についての超音波画像をすべての処置部位について得た。インデックス手術(index surgery)の8週間後に、すべての動物を屠殺し、組織を回収した。
実験概要セクションで上に論じた3つの異なる処置群を使用した誘導アキレス腱断裂および再結合の機械的性能を求めた。
試料は、採取した後、食塩水に浸漬したガーゼでラップし、試験するまで−20℃で貯蔵した。高強度ポリメチルメタクリレート(PMMA)を使用して2インチのPVDパイプに中足をポッティングした。ポッティング調製および生体力学的試験の間、15分間隔で食塩水をスプレーして、試料を湿気のある状態に保持した。材料試験システム負荷フレーム(MTS MiniBionix II、Edan Prairie、MN)にしっかり取り付けられた特注設計試験備品にポッティングした中足を取り付けた。アキレス腱の天然の断面を保存し、軟部組織の滑りを最小限にするために、特注設計のクライオクランプ(cryoclamp)を実装し、ポッティングした中足に対して約135°の角度でコンストラクトに一軸性のけん引力を印加した。これは、腱の生理的力ベクトルを模倣するために行った。試験は、クライオクランプに付けられた熱電対が−22℃、すなわち腱とクランプの間の安定したカップリングを保証するのに十分であると以前に報告された温度を記録したとき開始した。試験前に切断された、組織に埋め込まれた縫合糸物質はまったくなかった。したがって、生体力学的結果は、埋め込まれた縫合糸と修復性組織の合わされた機械的寄与を表す。
周期的負荷試験を最初に使用することによって、修復した腱をプレコンディショニングした。力制御プロトコールを使用して、10ニュートン(N)の前負荷をコンストラクトに2分間印加した。これにより、すべてのコンストラクトについての初期構成が指定された。次いで、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、60サイクルにわたって0.25Hzで10〜50Nの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングした。変位対時間曲線の傾きが50サイクルと60サイクルの間で収束することを実証した、本発明者らの実験室における以前の実験に基づいて、60(n=60)サイクルを選択した。対象とするパラメータは、最初と60番目のサイクルの間のピークトゥピーク変位の差として定義されるコンディショニング伸長、および58番目、59番目、および60番目のサイクルの局部的な最小と最大の差の平均として定義されるピークトゥピーク伸長を含んでいた。
プレコンディショニングした後、1mm/sの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかけた。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、準静的コンストラクト全体の剛性(負荷−変位曲線の傾きとして定義される)、局所的修復組織剛性、破損時点での伸長、および破損時に吸収されたエネルギーを含んでいた。最後に、破損機構を各試料について記録した。試験の前、破損までのランプ手順の間、コンストラクト破損の後に、デジタル画像および/またはビデオを撮った。
一元配置ANOVA、その後にTukeyのポストホック多重比較検定を使用することによって、IFWM対照および0.3mg/mLのPDGFおよび1.0mg/mLのPDGF処置群の間の連続的生体力学的パラメータの有意な差を識別した。有意性をp≦0.05に設定し、すべての分析は、SigmaStat 3.1(Systat Software, Inc.、San Jose、CA)を用いて実施した。
3つの処置群の間で、大きな視覚的な差はまったく識別されなかった。IFWM+0.3mg/mlのrhPDGF−BB群における6つのうち2つ(33%)のコンストラクトは、修復組織の外側側面上に明白な血腫を示した。この血腫の存在は、修復の生体力学的特性に影響し、異常に低い負荷で、血腫の正確な位置で開始する破損によって証明された。データ分析は、これらの血腫のある2つの試料を含めて(n=6)および含めないで(n=4)実施した。0.3mg/mlのrhPDGF−BB群における血腫のある2つの試料を含めた試験の周期的プレコンディショニング成分からの未処理データを表4に示す。コンディショニング伸長(p=0.636)またはピークトゥピーク伸長(p=0.813)の有意な差は、IFWM、IFWM+0.3mg/mlのrhPDGF−BB、またはIFWM+1.0mg/mlのrhPDGF−BB処置群の間でまったく識別されなかった(図6A)。
インビボで8週間後、IFWM+1.0mg/mLのrhPDGF−BBで処置した群について観察された生体力学的データは、IFWM対照およびIFWM+0.3mg/mLのrhPDGF−BB処置群と比較して一貫して増加し、より大きい治癒応答を平均で示した。この投薬効果は、0.3mg/mLおよびIFWM単独の処置群と比べて、それぞれ、55%/22.2%(n=6/n=4)および57.4%の極限破損までの荷重の増大として顕在化した。修復(すなわち、局所的な)組織剛性は、0.3mg/mLのrhPDGF−BBおよびIFWM単独の処置群と比べて、平均でそれぞれ、77.3%/39.7%(n=6/n=4)および45.2%増大した。さらに、IFWM+1.0mg/mLのrhPDGF−BB群についてのこの試験で観察された極限の力は、マトリックス(血小板に富む血漿フィブリンマトリックスと合わせたコラーゲンパッチを使用する24週間の修復(Sarrafianら、Trans ORS、33巻:322頁(2008年)より34.9倍高い))、またはタンパク質(CDMP−2で処置された3週間の修復(Virchenko、Arch Orthop Trauma Surg、128巻:1001〜1006頁(2008年)より1.9倍高い))を利用した他の試験と比較して増大した。
組織の回収およびトリミング
安楽死させた後、手術したアキレス腱を回収し、組織の湾曲を防止するために添え木で支え、組織学的処理のために10%の中性緩衝ホルマリン中に入れた。手術したアキレスに加えて、2つの未手術の対側アキレス腱を回収して組織を分析した。24時間固定した後、メスを使用して各アキレス腱を内側と外側の半分に二分した。アキレスの近位端に刻み目を付けることによって、組織学的処理の間を通して配向を保存した。1.0mg/mlのrhPDGF−BB群中の1頭の動物は、試験と無関係の理由(肺炎)のために、治癒の40日(5.8週間)後に安楽死させた。
標準的なパラフィン組織学技法および装置(Shandon Citadel 2000 ProcessorおよびShandon Histocentre 2、Thermo Shandon, Inc、Pittsburgh、PA)を使用して、すべての試料(n=8)をさらに固定、脱水、浄化、浸潤、および包埋した。Shandon Finesseロータリーミクロトーム(Thermo Shandon, Inc、Pittsburgh、PA)でパラフィンブロックをフェイシングし、約10ミクロンの切片を切断した。合計40切片に対して、1試料当たり5枚の切片を切断した。各組織切片をヘマトキシリン−エオシン(H&E)で染色した。Image Pro Imagingシステム(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)およびNikon E800顕微鏡(AG Heinze、Lake Forest、CA)を使用して、対象とする領域を含む染色したスライド全体について、高分解能デジタル画像をフィールドバイフィールドで得た。
すべての組織切片について、修復性/治癒組織、天然の腱/修復性組織界面、血管新生、炎症、およびコラーゲン密度/線維配向の質を評価した。切片は、処置に対して盲検化して評価した。Image Pro Plusイメージングシステムを使用して、較正した全体のデジタル画像によって腱の退縮も測定した。
腱の退縮
すべての手術した試料を、治癒して8週間後にある程度の腱の退縮を示した。平均で、アキレス腱は、投与なしの群について55.7±16.1mm、0.3mg/mlのrhPDGF−BB用量群について39.8±4.5mm、および1.0mg/mlのrhPDGF−BB用量群について44.4±1.5mm退縮した。
8週間の治癒後に、rhPDGF−BBの用量にかかわらず、すべての試料において流動性コラーゲンは目に見えた。流動性コラーゲンは一般に、修復部位の遠位末端に向かってより多く認められた。少数例において、流動性コラーゲンは、修復部位の中心から修復性組織の背側表面に向けて移動していた。1つの試料において、修復部位の全長にわたって分散した流動性コラーゲンが観察された。軽度の炎症のみが、流動性コラーゲン中およびこの周囲に観察された。炎症は、用量なしの試料と比較して流動性コラーゲン+rhPDGF−BB群(0.3mg/mlおよび1.0mg/mlの用量)においてわずかに増大していると判断された。炎症は一般に、多核異物巨細胞および/または単核炎症(リンパ球、単球および血漿細胞)からなっていた。好中球は一般に観察されなかった。rhPDGF−BBの用量にかかわらず、流動性コラーゲン内に、活性化線維芽細胞による新規コラーゲン産生を伴う線維増殖が観察された。いくつかの線維増殖が流動性コラーゲン内に観察されたが、修復性コラーゲン線維内に不連続があった。天然アキレス腱の近位末端および遠位末端は、修復性組織の新規コラーゲン線維と一般によく一体化されていた。少数例において、遠位の界面は、近位の界面と比較した場合、わずかにより良好な一体化を示した。近位の界面は、軽度の炎症と合わさった、ねじれた天然アキレス腱端部とともに、未成熟コラーゲンを産生する多くの幼若線維芽細胞を含有していた。
要約すると、試験した限られた数の試料に基づいて、0.3mg/mlの用量、1.0mg/mlの用量、および対照(用量なし)群の間で、アキレス腱修復において定性的な差はまったくなかった。rhPDGF−BBの存在は、治癒を妨げず、また、組織学的に負の応答を誘発(illicit)しなかった。0.3mg/mlの用量および1.0mg/mlの用量の処置群の間で同様の治癒があった。すべての手術した試料は、ある程度の腱退縮を示した。流動性コラーゲンは、rhPDGF−BB処置または用量にかかわらず、すべての試料において目に見え、一般に修復部位の遠位末端に向けて位置していた。炎症は、一般に軽度であり、単核の炎症(リンパ球、単球、および血漿細胞)を伴った多核異物巨細胞からなっていた(considered of)。炎症は、用量なしの群と比較した場合、rhPDGF−BB(0.3mg/mlおよび1.0mg/mlの用量)で処置した流動性コラーゲン内でわずかに増大したと判断された。修復性組織において、高密度のコラーゲン線維を伴った、実質的な、進行中の線維増殖があり、これは、rhPDGF−BBの処置または用量に無関係であった。修復性コラーゲン線維のアライメントは一般に、天然アキレスコラーゲン線維方向と平行であった。コラーゲンおよび線維芽細胞密度は、処置同士間で同様であった。豊富な血管分布は、すべての試料において観察された。用量なしの群と比較した場合、0.3mg/mlおよび1.0mg/mlの用量を用いた試料において確認される、より肥大性の血管があることが判断された。少数例では、遠位界面は、近位界面と比較した場合、わずかにより良好な一体化を示し、近位界面では、成熟の低いコラーゲンおよび軽度の炎症と合わさった、ねじれた天然アキレス腱端部が存在した。これは、連続的な腱退縮、および縫合糸の滑りによって生じた同時の局部組織損傷の結果である場合がある。
rhPDGF−BBに応答して正常および疾患一次ヒト腱細胞が増殖する
この試験により、rhPDGF−BBが、腱障害を有する患者に由来する一次腱細胞の増殖および/または走化性を直接活性化したかどうかを判定した。そのような知見は、腱障害におけるrhPDGF−BBの治療可能性の概念を指示することができる。
患者
アキレス腱障害を有する5人の患者および後脛骨腱(PTT)の腱障害を有する5人の患者を含む、腱障害を有する患者10人がこの試験に関与した。膝の完全関節置換を受けた追加の5人の患者も関わった。
その他の場合では処分される腱組織は、臨床的適応症のために実施された再建的手術手順の間に、正常な腱および傷害された腱から得た。これらの組織は、アキレス腱またはPTT腱の腱障害(tendinopathic)部分、ならびに長指屈筋(FDL)腱組織、アキレス腱組織、および膝蓋腱組織の健康な(非腱障害)部分を含んでいた。一次腱細胞外植片培養物を、これらの組織から得、継代3〜5で試験した。腱細胞同一性は、特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRアッセイにおいて、腱細胞特異的遺伝子スクレラキス、およびコラーゲンα1(I)、α2(I)、およびα1(III)に関する遺伝子の発現を評価することによって確認した。
腱細胞単層をトリプシン処理し、0.5%の透析ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地中に再懸濁し、一晩付着させ、次いで滴定濃度のrhPDGF−BBで24時間インキュベートした。市販のアッセイ(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を使用して、細胞中のDNA合成の間のBrdU取り込みに基づいて、細胞増殖速度の変化を評価した。各培養物を、rhPDGF−BBの各用量について三つ組で試験した。
腱細胞単層をトリプシン処理し、0.5%の透析ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12培地中に再懸濁し、96ウェルChemoTx(登録商標)使い捨て細胞遊走システム(Neuro Probe、Gaithersburg、MD)の上段のチャンバー内に置いた。下段のチャンバーに、滴定濃度のrhPDGF−BBを入れた。チャンバーを分離している膜を横切って、48時間腱細胞を遊走させた。次いで、96ウェルプレートを遠心沈殿し、3回凍結融解することによって、遊走細胞を溶解した。成育可能な遊走細胞の量を、Promega(Madison、WI)からの市販キットを使用して、細胞質乳酸脱水素酵素(LDH)に基づいて測定した。
一元配置ANOVAを使用することによって、rhPDGF−BBを用いた刺激が、用量依存的な様式で腱細胞増殖に影響するかどうかを判定した。
対照の肺線維芽細胞培養物または対照の一次Tリンパ球培養物ではなく、腱細胞培養物のみがスクレラキシスmRNAを発現した一方で、リンパ球ではなく、腱細胞および線維芽細胞がコラーゲン遺伝子mRNAを発現した。
これらの実験の結果は、健康な組織および腱障害組織に由来する腱細胞は、増殖速度および走化性速度を増大させることによって、rhPDGF−BBに応答することを示す。重要なことに、一部の患者に由来する腱細胞は、PDGFに対して逆説的な応答を示し、より高い用量は、より低い用量より小さい効果を生じた。同様に重要なことに、疾患の腱に由来する腱細胞は、いくつかの場合では、健康な腱に由来する腱細胞に対して、PDGFに差次的に応答性であり、適切な投薬が臨床状況において最も重要となり得ることを示した。
腱を骨に再結合する治療において適用するための、組換えヒト血小板由来成長因子−BB(rhPDGF−BB)と組み合わせた4つのコラーゲンマトリックスの評価
この試験により、前十字靭帯再建などの腱を骨に結合する治療において適用するための、腱−骨界面でrhPDGF−BBとともに使用することができる4つのコラーゲンマトリックスの物理的特性、生体適合性(インビトロおよびインビボ)および安定性(生分解)を評価した。
(i)材料および調製
この試験において、4つのI型コラーゲンマトリックス(パッド)を評価した。3つの線維性コラーゲンマトリックス(A、B、およびC)は、様々なコラーゲン密度(A=4.5%のコラーゲン;B=5%のコラーゲン、C=6%のコラーゲン;Kensey Nash Corporationによって提供された、様々な百分率のコラーゲンスラリーから作製されたBIOBLANKET(商標)コラーゲン)のウシ真皮誘導体であり、4番目の線維性マトリックス(D)は、「高度に多孔質」(90%の多孔度)として特徴づけられるウシ腱誘導体(COLLATAPE(登録商標)、Integra LifeSciences)であった。すべてのコラーゲンシート(1.5〜2.0mmの厚さ)を打ち抜いて直径8mmのディスクにし、物理的特徴づけおよびインビトロ(細胞適合性)評価を行った。インビボ(生体適合性および生分解)評価は、1×1cm2のパッドを利用して実施した。rhPDGF−BB:0.3mg/mlの組換えヒト血小板由来成長因子(rhPDGF−BB)も調製した。
基本培地中の腱細胞懸濁液50μl(50,000細胞)を各コラーゲンディスクに添加した。培地出現を伴うことなく、37℃および5%のCO2雰囲気で1時間インキュベートした後、細胞を播種したディスクを、単独の、またはrhPDGF−BB(30ng/ml)を組み合わせた基本培地2mlで予め満たした24ウェルプレートに移した。12時間静置培養した後、細胞を播種したディスクを含むプレートを、インキュベーター内の軌道振盪機(60rpm)上に配置した。培地交換は、48時間毎に行った。2、4、および6日目に、各物質および処置からの三つ組の試料をATPアッセイのために利用することによって、コラーゲンマトリックス中/上の生細胞数を求めた。4日目に、各物質および処置からの1つの試料を、走査電子顕微鏡(SEM)評価のために使用した。6日目に、各物質および処置からの四つ組の試料を利用して組織学的評価を行った。
合計12匹のニュージーランド白ウサギをこの試験に使用した。前方−内側の切開によって、大腿骨を露出した。骨膜を除去した後、大腿骨の腹側表面の中間点を位置づけ、この中間点に対して約0.5〜0.8cm近位および遠位の2つの範囲(1cm×1cm)を、ラウンドバーおよび骨の過熱を防止するための多量の洗浄を使用して皮質除去した。内側および外側縁部上の皮質除去部位の中間点で2つの穴(0.9mm)をあけた。最後に、5〜0絹縫合糸を2つの穴に通し、次いでコラーゲンパッド(0.3mg/mlのrhPDGF−BB 100μlで予め飽和させた)を縛ることによって、大腿骨の表面にパッドを固定した。手術は両方に行い、その結果、各大腿骨は2つのパッドを受け、各動物は4つの異なるコラーゲンパッドをそれぞれ1つ受けた。大腿骨上のパッドの順序は無作為化した。手術して1、2、および3週間後に、4匹の動物を安楽死させ、パッドおよび周囲組織と一緒に大腿骨を10%の中性緩衝ホルマリン(NBF)中で固定し、メタクリル酸メチル(MMA)中に埋め込み、Goldnerのトリクローム手順で染色した。
(i)インビトロ細胞適合性試験
ATPアッセイにより、コラーゲンディスク上/中の細胞増殖は、rhPDGF−BBの存在下で有意に増大し、培養物中で時間とともに増大し、同じ処置状態下で、異なるマトリックスにわたって有意な差は観察されなかったことが明らかになった。マトリックス単独についてのSEM画像により、多孔度において定性的な差が明らかになり、マトリックスDは最大の多孔度を示し、マトリックスA、B、およびCは、漸減するレベルの多孔度を示した。細胞播種後のマトリックスのそれぞれについてのSEM結果は、異なる密度の3つの線維性マトリックスの表面上でより多くの細胞が観察され、「高度に多孔質な」マトリックス(D)の表面上で最少の細胞が観察されたことを示した。細胞を播種したマトリックスのそれぞれの断面からの組織画像は、SEM観察結果をさらに支持し、漸増密度のマトリックスについて、パッドの外表面に沿った細胞分布を示し、マトリックスDは、マトリックス全体にわたって細胞の最大分布を示した。
組織学的評価により、4つのすべてのコラーゲンパッドは、移植後1週間無傷のままであったことが明らかになった。4つの異なるマトリックスの周囲の組織において、顆粒球および単核細胞の細胞浸潤の増大があった。移植して2週間後に、マトリックスA、B、およびDについて部分的な分解が観察され、明白な細胞浸潤がマトリックスDに伴っていた。移植して3週間後に、マトリックスDは、大部分が分解し、正常な線維芽細胞の中で小さいコラーゲン断片のみが観察された(図9D)。真皮が起源のコラーゲンマトリックス誘導体(A、B、およびC)を受けた部位は分解を示し、これはコラーゲン密度と反比例した。広範な炎症細胞浸潤がこれらのマトリックスについて観察され、これは、3週間の観察期間にわたってより局在的となった(図9A〜9C)。
腱−骨または靭帯−骨再結合のヤギモデルにおける、腱のトンネル固定を増強するための、rhPDGF−BBおよびコラーゲンラップの使用
この試験は、骨幹端を貫く(transmetaphyseal)脛骨トンネル中に長指屈筋腱を挿入および固定する前に、ある用量のrhPDGF−BB中に浸漬したコラーゲンスポンジをラップすることの組織学的および生体力学的利点を評価する。前十字靭帯(anterior curciate ligament)を再建するためにグラフトを添える方法は、Rodeoら、J. Bone Joint Surg. Am.、75巻(12号):1795〜1803頁(1993年)に記載された通りであった。rhPDGF−BBと組み合わせたコラーゲンパッドを使用することによって、脛骨挿入部位内での腱または靭帯のより急速で完全な一体化を促進する。
(i)種
ヤギは、ヒトと同様に、その骨は、骨形成および再吸収のバランスのとれた組合せであり、正常な骨構造に導くリモデリングを起こすので、適当なモデルである。ラットまたはマウスなどのより小さい動物の骨は、リモデリングを起こさず、したがって腱が骨と再一体化するにつれて起こる生物学的プロセスを表さない。さらに、ヤギなどのより大きい動物の腱は、ヒトの手術において使用される技法および器具を使用して、より容易に操作および再結合することができる。
試験物品1は、20mMの酢酸ナトリウムバッファー、pH6.0+/−0.5中の1.0mg/mlのrhPDGF−BBであり、液体形態であり、2℃〜8℃で貯蔵する。試験物品2は、COLLATAPE(登録商標)、Integra LifeSciencesからのコラーゲンであり、固体形態であり、室温で貯蔵する。
コラーゲンのrhDGF−BBとの混合
試験物品および対照物品を混合する。無菌配合物を物品に使用する。すべての混合は室温で実施する。製剤化した試験物品および対照物品は、調製して最大1時間後までに使用する。
(iv)試験システム(動物および動物のケア)
30〜40ポンドの、Q熱検査して健康が証明された、骨格的に成熟したメスの家畜ヤギ(混血、n=24)を使用する。予備実験のために動物はまったく使用しなかった。動物は、ヤギ1頭当たり最低10平方フィートの空間を有するラン内に置いた。ケージは、ステンレス鋼で構築し、定期的に清掃する。周囲温度を60〜80°Fの間に維持し、湿度を30〜70%の間に維持する。
(i)一般的な説明および外科的方法
1ml/10kgで、IMでヤギカクテル[ケタミン(100mg/ml)10cc+キシラジン(20mg/ml)1cc]を使用して、前投薬の30分以内に麻酔を誘導する。誘導後、頭部IVカテーテルを所定位置に配置する。眼の軟膏を角膜上に穏やかに塗布することによって眼の乾燥を最小限にする。気管内チューブ(5−8 ETT)ならびにルーメンチューブを使用してヤギに挿管する。再呼吸回路を使用して100%の酸素で送達される1.5〜2%のイソフルランを使用することによって麻酔を維持する。必要な場合、一回呼吸量(15mL/kg BW)による人工呼吸器上にヤギを置く。麻酔の間全体にわたって、10ml/kg/時間で加温した乳酸リンガー液をヤギに投与する。
動物を、試験の間全体にわたって少なくとも毎日観察する。事前選択判定基準が完成したら観察の記録を開始し、試験の終了まで継続する。歩行運動の変化を含む、一般的な外見および挙動についての変化について各動物を観察する。手術の前、および屠殺時に体重を測定する。体重は、動物の健康をモニターするのに必要な場合、追加の時点で測定する。
(i)分析のための血清採取
外科手術前に1回、および屠殺前に、すべての動物から血液約5mlを無添加(すなわち、「血餅」)チューブに採取する。血液を遠心分離することによって血清を得、2つのアリコートに分割する。さらなる分析のために、血清を−70℃以下で貯蔵する。
適切な試験エンドポイントですべての動物を屠殺する。死亡したことが分かった、または瀕死状態で屠殺された動物に肉眼的剖検を行うことによって、死亡原因を判定する。
USDA動物保護法および実験動物の管理と使用に関する指針(ILAR刊行物、1996年、National Academy Press)に従ってヤギを安楽死させる。1ml/10kg IMで、ヤギカクテル[ケタミン(100mg/ml)10cc+キシラジン(20mg/ml)1cc]を使用してヤギに最初に鎮静剤投与する。次いで、1cc/10ポンドBW IVで、Euthasol(360mg/mlのナトリウムペントバルビタール)を投与する。聴診および反射(まばたき、引っ込めなど)の欠如によって死亡を確認する。
インプラント部位の巨視的観察および写真撮影
安楽死の時点で、移植部位を肉眼で検査し、部位の記述を記録する。デジタル写真撮影を使用して観察結果を記録する。
後膝関節を外し、ストライカーのこぎりを使用することによって、中央骨幹で脛骨を切断する。臨床評価を実施するのに必要である以上に骨の創傷を露出することなく、周囲の筋肉および皮膚を可能な限りトリムする。各試料に、ヤギの番号ならびにこれが右肢であるか左肢であるかの表示を標識する。組織を中性緩衝ホルマリン(10体積の固定液:1体積の組織)中に入れ、スポンサーに発送する。
(i)組織学および病理組織学
組織の処理を行う。簡単に言えば、組織をメタクリル酸メチル(MMA)に埋設し、切片にし、ヘマトキシリン/エオシン、Safranin O/Fast Green、Von Kossa/MacNealおよび/またはVan Giesonを使用して染色して光学顕微鏡評価を行う。評価するための切片の面は、脛骨のトンネルに対して断面および長手方向としてである。各移植部位に残っている物質の量、トンネル壁に沿った腱の石灰化の程度および新規骨成長の量を評価するために、格付けシステムを考案する。ヘマトキシリン/エオシンで染色した切片に隣接する未染色の切片に対してカルセイン視覚化を実施する。
生体力学的試験のために保持した試料を、使用するまで−20℃に凍結させる。トンネルの長軸を、引っ張った腱の方向と合わせるために、脛骨/腱複合体を多軸テーブルに固定する。この方向づけにより、摩擦のいずれの影響も最小限になり、周囲の骨との腱の一体化/石灰化を直接試験することが可能になる。破損までの荷重のピーク測定値を、手作業および術後の放射線撮影によって測定したトンネルの長さに対して正規化する。
この試験により、脛骨トンネル中の模擬指伸筋腱再結合の機械的性能を求める。12頭のボーアヤギをこの試験に利用する。
試料を食塩水に浸漬したガーゼでラップし、試験するまで−20℃で貯蔵する。高ポリメチルメタクリレートを使用して2インチのPVCパイプに脛骨の遠位部分をポッティングする。ポッティング調製および生体力学的試験の間、15分間隔で食塩水をスプレーして、試料を湿気のある状態に保持する。物質試験システム負荷フレーム(MTS MiniBionix、Edan Prairie、MN;図12)に強固に付けられた特注設計試験備品にポッティングした脛骨を取り付ける。腱の天然断面をつかむように設計された特注設計のクライオクランプをこの試験において使用することによって、コンストラクトに一軸性のけん引力を印加する。任意の残っている外側の縫合糸を横切する。
周期的な負荷試験を最初に使用することによって、腱修復をプレコンディショニングする。10ニュートン(N)の前負荷を印加し、コンストラクトの力を約40%緩和させる。これにより、すべてのコンストラクトについての初期構成が指定される。次いで、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、30サイクルにわたって0.25Hzで10〜30Nの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングする。本発明者らの実験室における以前の実験は、変位対時間曲線の傾きは、20サイクルと30サイクルの間で安定となるように思われることを示すので、30(n=30)サイクルを選択する。
プレコンディショニングした後、1mm/sの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかける。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、および準静的剛性(負荷−変位曲線の傾きとして定義される)を含む。最後に、破損機構を各試料について記録する。各試料のデジタル画像を、試験デバイスに装填する際、および破損後に撮って、破損の様式および条件を記録する。
試料サイズによって決定される最適な分解能で各試料をスキャンする。図13を参照。円柱状欠陥に対する近似断面でスライスを得る。半自動輪郭法を使用することによって、欠陥の本来の境界の周囲長に限定される関心体積(VOI)を選択する。最適化した密度閾値およびノイズフィルターを選択し、すべての試料に均一に適用することによって、軟部組織から骨を分割する。総平均密度、骨の平均密度、およびトンネル内の骨体積/総体積を計算する。
BenchTopモデルによる、BIOBLANKE(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックスからのrhPDGF−BB(組換えヒト血小板由来成長因子−BB)の放出特性の評価
この試験の目的は、室温でBenchTopモデルを使用して、様々な密度を有するBIOBLANKET(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックスからのrhPDGF−BB放出を測定することである。
試験デザインを、すべての試料群(BIOBLANKET(商標)マトリックス、COLLATAPE(登録商標)マトリックス、およびコラーゲンマトリックスを含まない対照群)について5分の初期フラッシング時間を示す表10に列挙する。
捕獲試薬は、捕獲試薬原液56μlをDPBS 10mlに添加することによってDPBS中の作業濃度(0.4μg/ml)に希釈し、次いで希釈捕獲試薬100μlを、96ウェルプレートの各ウェルに添加する。プレートをプレートシーラーで密封し、振盪機上で、室温で一晩インキュベートする。吸引および分配マニホールドからの気泡を排出し、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄する。溶出バッファー200μlを各ウェルに添加し、揺り動かしながら室温で2時間(最大4時間)、プレートをブロックする。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄する。
4−パラメータグラフを使用してスタンダードをプロットし、各プレートに対する検量線を使用して、各希釈での各試験試料についてのrhPDGF−BB濃度を計算する。各時点での2つの希釈からの三つ組の試料のそれぞれについての平均値および標準偏差(SD)も計算する。
各時点でのデータの統計的比較を、データ分布に従って適切な方法によって行う。
関節鏡下洗浄のBenchTopモデルを使用した、コラーゲンマトリックスと合わせた組換えヒト血小板由来成長因子−BB(rhPDGF−BB)の放出、安定性、および生物作用能の特徴づけ
この試験は、高流量関節鏡下環境を再現するため、および腱を骨に結合する手順、例えば、前十字靭帯再建手順または回旋腱板傷害治療手順などにおいて適用するために考慮された4つの異なるコラーゲンマトリックスから溶出されるrhPDGF−BBの放出、安定性、および生物作用能を特徴づけるための新規のBench Top関節鏡下モデルを開発するために行った。
3つが異なるコラーゲン濃度の経皮由来のコラーゲンマトリックス(Kensey Nash CorporationからのA=4.5%のコラーゲン;B=5%のコラーゲン、C=6%のコラーゲン)であり、1つがアキレス腱由来のマトリックス(コラーゲンD、Integra LifeSciencesからのCOLLATAPE(登録商標))である、4つのI型コラーゲンマトリックスを評価した。すべてのマトリックスを打ち抜いて8mmのディスクにした。コラーゲンマトリックスからのrhPDGF−BB(Novartis)の放出を評価するために、各ディスクを1mg/mlのrhPDGF−BB 50μl(50μg)で水和し、室温で10分間インキュベートし、溶出バッファー(2%のFBSを含有するMEM)20mlで予め満たしたBench Top関節鏡システム中に装填し(図14参照)、200ml/分の流速で5分間流した。同じ量のrhPDGF−BBを、対照としてこのシステムに添加した。マトリックスを洗浄するのに使用した溶出バッファー試料は、DuoSet ELISAアッセイ(R & D Systems)を使用して分析した。逆相およびサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用することによって、コラーゲンマトリックスから放出されたrhPDGF−BBの特性を引き出して、rhPDGF−BBの天然/変性構造の変化/改変を評価した。ブロモデオキシウリジン(BrdU)細胞増殖アッセイ(Promega)を使用して、コラーゲンマトリックスから放出されるrhPDGF−BBの生物作用能を試験した。NIH3T3線維芽細胞を、rhPDGF−BB(0〜0.24μg/ml)を含有する放出物(releasate)中で培養し、次いでBrdUを添加し、細胞を48時間インキュベートした。
走査電子顕微鏡(SEM)評価による、rhPDGF−BBに応答した様々な密度のBIOBLANKET(商標)マトリックスおよびCOLLATAPE(登録商標)における細胞遊走
この試験により、一次ヒツジ腱細胞を培養することによって、BIOBLANKET(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックス中への細胞遊走の程度を評価する。この腱細胞は、rhPDGF−BBを用いて、または用いずに処理され、引き続いて走査電子顕微鏡(SEM)技法によって評価される。
BIOBLANKET(商標)マトリックスおよびCOLLATAPE(登録商標)中へのヒツジ腱細胞の遊走は、既知量の細胞を含むマトリックスを播種し、次いでこのマトリックスを4日間培養することによって評価した。次いでマトリックスを臨界点乾燥によって処理し、マトリックス中の細胞分布および密度を、走査型電子顕微鏡下で評価した。
石けん、水、および70%のアルコールを使用して、新鮮なヒツジの脚を、浄化、噴霧、および洗浄した。屈筋腱の表面から約3インチの幅の皮膚を切除した。切開部を70%のアルコールで噴霧し、外科的ドレープで覆った。腱鞘の上を切開することによって、腱を露出した。次いで、腱を遠位側から切断した。腱をできる限り長く引っ張り、近位側を切断した。次いで腱を、氷冷のDPBSで満たされた50mlの円錐チューブに入れた。脚および余分の組織を廃棄した。
滅菌技法を使用して、BIOBLANKET(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックスから8mmのディスクを生検パンチを使用して打ち抜いた。各27G1/2針上の1枚のBIOBLANKET(商標)またはCOLLATAPE(登録商標)ディスクを穏やかに突き刺し、開放矩形形状に対して90度の角度で2回曲げることによって、ディスクが滑り落ちる恐れをなくした。BIOBLANKET(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックスディスクが刺さった針を、特別に設計されたチャンバー内の1mlのシリンジヘッドに接続した。腱細胞をトリプシン処理し、2%のFBSおよび106細胞/mlの濃度の抗生物質を含有するDMEM基本培地1ml中に懸濁した(4継代未満)。総量60ng(培地2ml中30ng/ml)のrhPDGF−BBを各ディスクに装填した。BIOBLANKET(商標)およびCOLLATAPE(登録商標)マトリックスディスクに、細胞を播種し、培地を浸漬することなく、インキュベーター内のチャンバー内で1時間インキュベートした。2%のFBSを含有するDMEM培地を調製し、rhPDGF−BB処置群としての合計8ウェルについて、各24ウェル超低付着プレートの8ウェルに2mlを添加した。1時間インキュベートした後、細胞を播種したディスクを装填ボックスから取り出した。止血鉗子を使用して、針先端部をプラスチックの根元から折った。細胞を播種したディスクを、針先端部と一緒に、様々な組成物を含有する培地で予め満たしたウェルに移した。ディスク中に付着した針先は、ディスクを培地中で浮遊させ、その結果、ディスクの両側の細胞は、栄養を均等に供給された。各物質について合計4つの処置を行い、各物質および各処置について三つ組の試料を準備した。37℃および5%のCO2雰囲気で、インキュベーター内で12時間静置培養した後、プレートを、インキュベーター内の軌道振盪機上に、細胞を播種したコラーゲンマトリックスとともに置いた。初回のフィーディングと同じ組成物を含有する培地を、48時間毎に交換した。
培養して4日後に、24ウェルプレートからの細胞を播種した各ディスクを、培地の出現を伴ってクライオバイアルに移した。次いでクライオバイアルから培地を取り出し、DPBS中で2回洗浄した。2.5%のグルタルアルデヒド中で2時間試料を固定した。次いで試料をDPBS中で5回洗浄し、2%の四酸化オスミウム中で2時間、後固定した(post−fixed)。試料を脱イオン水中に10分間浸漬し、脱イオン水で5回洗浄することによって過剰の四酸化オスミウムを除去した。試料を上昇系列のエタノール中で脱水し、次いでPolaron臨界点乾燥機内で乾燥させた。試料に金−パラジウムをコーティングし、Hitachi SEMを用いて見た。
腱細胞は、様々な濃度のコラーゲンスラリーを有するすべてのBIOBLANKET(商標)マトリックスの表面上で成長したが、COLLATAPE(登録商標)マトリックスの内部で成長した。ほとんどの腱細胞は、様々な濃度のコラーゲンスラリーを有するすべてのBIOBLANKET(商標)マトリックス上で成長しながら丸い形状であったが、COLLATAPE(登録商標)マトリックス上で紡錐体形状であった。図15を参照。
ヒツジモデルにおける、rhPDGF−BBおよびI型ウシコラーゲンマトリックスを使用する回旋腱板修復
この試験の目的は、ヒツジモデルを使用して、回旋腱板を修復するために、棘下筋腱の上腕骨へのより強い再結合を促進することを意図した、rhPDGF−BBを装填したマトリックスの効力を求めることであった。実験デザインを以下のように提供する:1)縫合のみ(n=9);2)縫合+コラーゲンマトリックス+バッファー(n=9);3)縫合+コラーゲンマトリックス+0.15mg/ml(または75μg)のrhPDGF−BB(n=9);4)縫合+コラーゲンマトリックス+0.30mg/ml(または150μg)のrhPDGF−BB(n=9);5)縫合糸+コラーゲンマトリックス+1.0mg/ml(または500μg)のrhPDGF−BB(n=9);および6)iCTL(n=9)無傷のコントララテラル対照。縫合のみ、縫合+コラーゲンマトリックス+バッファー、および3つの用量群からの9頭の動物を生体力学的試験に利用し、それぞれ3頭を組織診断試験に利用した。iCTL群はより小さく、生体力学的試験について6頭であり、組織診断試験について3頭であった。
骨格的に成熟したヒツジ(3.5歳以上)の棘下筋腱を外科的に露出し、上腕骨頭から素早く剥離した。腱フットプリント(tendon footprint)を剥皮し、出血を誘導するために3つの穿孔を骨に作った。試験物品を、腱と骨の間の挿入(interpositional)移植片として配置した。2本の縫合糸を、Mason−Allen技法を使用して腱に通し、3つの骨トンネルからなる単列修復によって、腱を上腕骨頭に固定した。標準的な手順を使用して手術部位を閉じ、ヒツジを普通に歩き回らせた。手術して12週間後に動物を屠殺した。
生体力学的な試験
生体力学的な試験に割り当てた動物からの肩を回収し、上腕骨−棘下筋腱のコンストラクトを無傷にしたまますべての筋系を剥皮した。合計51個の肩を生体力学的に評価した。浄化後、食塩水に浸漬したガーゼで試料をラップし、生体力学的試験まで−20℃で貯蔵した。高強度ポリ−メチル−メタクリレート(PMMA)樹脂を使用して、2インチのPVCパイプに上腕骨をポッティングした。試料は、15分間隔で食塩水を噴霧して、ポッティング調製および生体力学的試験の間、水和した状態を保った。物質試験システム負荷フレーム(MTS MiniBionix、Edan Prairie、MN)にしっかり取り付けた特注設計試験備品にポッティングした上腕骨を取り付けた。棘下筋腱の天然断面を保存し、軟部組織の滑りを最小限にするように設計された特注設計のクライオクランプは、ポッティングした上腕骨に対して約135°の角度でコンストラクトに一軸性のけん引力を印加するためであった。これは、腱の生理的力ベクトルを模倣するために行った。試験は、クライオクランプに付けられた熱電対が−22℃、すなわち腱とクランプの間の安定したカップリングを保証するのに十分であると以前に報告された温度を記録したとき開始した。
周期的負荷試験を最初に使用することによって、回旋腱板修復をプレコンディショニングした。10ニュートン(N)の前負荷を力制御で2分間印加し、その後、修復したコンストラクトを、定常状態に達するように、60サイクルにわたって0.25Hzで10〜50Nの力制御プロトコールで周期的にプレコンディショニングした。変位対時間曲線の傾きが50サイクルと60サイクルの間で、繰り返し可能な定常状態の挙動に到達することを実証した、本発明者らの実験室におけるパイロット実験に基づいて、60(n=60)サイクルを選択した。コンディショニング伸長およびピークトゥピーク伸長を、周期的なプレコンディショニング試験の間に求めた。コンディショニング伸長は、1番目のサイクルのピークと60番目のサイクルのピークの間のy変位における距離として定義した。ピークトゥピーク伸長は、58番目、59番目、および60番目のサイクルの局部的な最小から最大の平均として定義した。
プレコンディショニングした後、1mm/sの速度での変位制御下で、修復したコンストラクトに破損するまで負荷をかけた。対象とする生体力学的パラメータは、極限破損までの荷重、および準静的剛性(負荷−変位曲線の傾きとして定義される)を含んでいた。最後に、破損機構を各試料について記録した。適切な場合、デジタル画像を撮った。
一元配置ANOVAおよびポストホックFisher’s LSDおよびTukey検定を使用することによって、無傷の対照を除外した処置群同士間の連続的生体力学的パラメータの有意な差を識別した。有意性をp≦0.05に設定し、すべての分析は、SigmaStat 3.1(Systat Software, Inc.、San Jose、CA)を用いて実施した。
試験の周期的プレコンディショニング成分からの未処理データを表12に示す。0.15mg/mlのPDGFおよび0.30mg/mlのrhPDGF−BB群は、縫合のみ、および縫合+コラーゲンマトリックス群より有意に大きいコンディショニング伸長を受けた(Tukey’s:p≦0.024;Fisher LSD:p≦0.003)。図16A。任意の群同士間で、ピークトゥピーク伸長の有意な差はまったくなかった(p=0.111、図16B)。
0.15mg/mlおよび0.30mg/mlのrhPDGFを用いた上腕骨棘下筋腱再結合の増強は、縫合のみ、縫合+コラーゲンマトリックス+バッファー、および縫合+コラーゲンマトリックス+1.0mg/mlのrhPDGF−BB群と比べて、ヒツジモデルにおいて3カ月後に機械的機能を改善した。より低い用量のrhPDGF−BBの生体力学的完全性の増強は、縫合のみの群と比べて、破損までの荷重の63%の増大、および1.0mg/mlのrhPDGF−BB群と比べて、破損時の負荷の120%の増大として顕在化した。ここで報告したデータは、回旋腱板増強に対する用量依存的効果を支持し、より低いrhPDGF−BB用量は、成長因子のより高い1.0mg/mlの用量と比べてより大きい治癒応答を誘発する。さらに、0.15mg/mlのrhPDGF−BBおよび0.30mg/mlのrhPDGF−BB処置群における破損モードは、0.15mg/mlのrhPDGF−BB群における肩の9個のうちの6個(66.7%)がある程度の骨の裂離を示した一方で、0.30mg/mlのrhPDGF−BB群における肩の9個のうちの5個(55.6%)が、ある程度の骨の裂離を示したように、無傷の、未手術の肩において一貫してみられる破損モードと同様であった。この知見は、より低い用量のPDGF(例えば、rhPDGF−BB)は、12週間の治癒期間の過程にわたって、より大きい上腕骨粗面との腱の(tendinacious)一体化を促進し、より低い用量のPDGFは、回旋腱板修復を増強するのにより適していることを示す。
ヒツジモデルにおける、rhPDGF−BBおよびI型ウシコラーゲンマトリックスを使用する回旋腱板修復:組織学的結果
この試験は、ヒツジ回旋腱板挿入部の治癒および再生を促進するための、I型ウシコラーゲンマトリックスと組み合わせた組換えヒト血小板由来成長因子−BB(rhPDGF−BB)の有効性を評価するために設計した。回旋腱板傷害の最適な治癒は、結合の本来の部位(腱「フットプリント」)での腱の骨への再挿入を伴う。腱線維の骨への再挿入がない場合、治癒した部位は、本来の結合より「弱い」と考えられ、潜在的に機能を制限し、再傷害のより大きい確率に導く。回旋腱板修復後の相対的に高い割合の破損が報告されており(例えば、Boileau P.ら、J Bone Joint Surg Am、87巻:1229〜1240頁(2005年);Galatz L. M.ら、J. Bone Joint Surg Am.、86巻:219〜224頁(2004年);Gazielly D. F.、Clin. Orthop Relat Res、304巻:43〜53頁(1994年);Gerber C. J.ら、Bone Joint Surg Am、82巻:505〜515頁(2000年);およびHarryman D. T.ら、J. Bone Joint Surg Am、73巻:982〜989頁(1991年)を参照)、これは、様々な異なる要因から生じると仮定されている(例えば、Goutalier D.ら、Clin Orthop、304巻:78〜83頁(1994年);Gerber C.ら.、J Bone Joint Surg Br、76巻:371〜380頁(1994年);Warner J. P.ら、J Bone Joint Surg Am、74巻:36〜45頁(1992年)を参照)。腱組織の質および腱から骨までの治癒が、回旋腱板修復の失敗の一因となる最も重要な要因の2つとして提案されており、腱から骨までの治癒を増強するための成長因子または細胞の送達が、これらの傷害の治癒を最適化するための方法として示されている(例えば、Gamradt S. C.ら、Tech in Orthop、22巻:26〜33頁(2007年)およびDovacevic D.ら、Clin. Orthop Relat Res、466巻:622〜633頁(2008年)を参照)。PDGF−BBは、十分に特徴づけられた創傷治癒タンパク質であり、これは、骨(骨芽細胞)および腱(腱細胞)細胞を含めた間葉系起源の細胞に関して、走化性(細胞遊走)および分裂促進性(細胞増殖)であることが公知である。さらに、PDGF−BBは、血管内皮成長因子(VEGF)をアップレギュレートし、再生プロセスの成功にとって本質的である血管新生(血管再生)の増大に導くことが示されている。この試験の目的は、生体力学的および組織学的結果の措置を使用して、腱再結合を増強および改善するための、腱修復部位での、I型ウシコラーゲンマトリックスと合わせたrhPDGF−BBの効力を求めることであった。
合計17頭の骨格的に成熟したヒツジを試験の一部として含めた。動物に、外科的な剥離、その後、骨トンネルを通す縫合を使用して、上腕骨のより大きい粗面への右棘下筋腱の即時の再結合を行った。第1のセットの実験では、実験動物(n=3)の腱−骨界面に、20mMの酢酸ナトリウム(酢酸塩)バッファー中、0.15(n=3)または0.3(n=3)mg/mlの濃度を有するrhPDGF−BBと合わせたI型コラーゲン担体を投与した。すべての動物についての生存時間は、12週間であった。処置の割り当てを表14に示す。
治癒の12週間後に動物を人道的に安楽死させ、手術した(右)肩を回収し、組織学的な処理のために10%の中性緩衝ホルマリン中に入れた。腱用メスおよび上腕骨用ダイヤモンドブレードソー(Exakt Technologies、Oklahoma City、OK)を使用して、棘下筋腱およびその上腕骨結合部位を通して頭側の半分と尾側の半分に各肩を二分した。トリミングの間に各試料のデジタル画像を撮った。一方の半分(頭側または尾側の面のいずれか)を、脱灰組織診断のために処理し、他方の半分を、未脱灰組織分析のために処理した。
頭側または尾側の面のいずれかを脱灰組織診断のために処理し、パラフィン中に埋め込んだ。標準的なパラフィン組織学技法および装置(Sakura Tissue TEK V.I.P. Processor、Sakura Finetek USA, Inc.、Torrance、CA、およびShandon Histocentre 2、Thermo Shandon, Inc、Pittsburgh、PA)を使用して、試料を固定、脱灰、脱水、浄化、浸潤、および包埋した。パラフィンブロックを、Shandon Finesseロータリーミクロトーム(Thermo Shandon, Inc、Pittsburgh、PA)でフェイシングし、約8mmの切片を切断した。約250ミクロンの空間的厚さの増分で、各肩から5つの組織切片を得た。Image Pro Imagingシステム(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)、Nikon E800顕微鏡(AG Heinze、Lake Forest、CA)、およびSpotデジタルカメラ(Diagnostic Instruments、Sterling Heights、MI)、メモリー機能を拡張したPentium(登録商標) IBM系コンピューター(Dell Computer Corp.、Round Rock、TX)を使用して、全体の対象とする染色したスライドおよび領域について、フィールドバイフィールドで高分解能デジタル画像を得た。
腱退縮の程度(もしあれば)、修復性/治癒組織の評価、腱骨界面、処置に対する組織の応答、血管新生、炎症、コラーゲン方向づけ/線維のアライメント、ならびに挿入部位でのシャーペー線維の嵌合および存在を評価するための格付けスケールに従って、すべての組織切片を格付けした。切片を、処置に対して盲検化して最初に評価し、互いに比較して総合的な治癒に対して評価し、治癒スコアを与えた。各スコアについての判定基準の説明を表16に示す。Image Pro Plusイメージングシステム(Media Cybernetics、Silver Spring、MD)を使用して、較正した全体のデジタル画像によって腱の退縮の程度(もしあれば)も測定した。
(i)
第1のセットの実験(コラーゲンマトリックス+0.15mg/mlのrhPDGF−BBまたは0.3mg/mlのrhPDGF−BB)では、処置にかかわらず、すべての手術した試料が治癒の12週間後にある程度の腱退縮を示した。平均で、棘下筋腱は、0.15mg/mlのrhPDGF−BB用量群について、骨溝から41.8±3.5mm(平均±標準偏差)、および0.3mg/mlのrhPDGF−BB用量群について、45.2±8.9mm退縮した。
第2のセットの実験(縫合、縫合+コラーゲンマトリックス+酢酸バッファー、縫合+コラーゲンマトリックス+rhPDGF−BB、または無傷の対照)では、棘下筋腱は、縫合のみの群について骨溝から28.1±2.8mm、縫合+コラーゲンマトリックス+酢酸バッファー群について、39.0±4.6mm、および縫合+コラーゲンマトリックス+rhPDGF−BB群について40.9±8.3mm退縮した。
rhPDGF−BBを浸漬したコラーゲンマトリックスを用いた上腕骨(humural)棘下筋腱再結合の増強により、縫合−組織界面での破損は防止されなかった。治癒の12週間後に、すべての試料において、腱は、上腕骨から退縮し、修復性線維性血管性組織によって置換された。これは、退縮が、手術後の最初の数週間以内に起こったことを示す。
Claims (18)
- 骨傷害を伴わない靭帯傷害の治療において使用するための組成物であって、前記組成物は、溶液中に生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子(PDGF)を含み、前記溶液中のPDGFの濃度は、0.1mg/ml〜2.0mg/mlであり、
(i)前記生体適合性マトリックスは、均質であり、a)コラーゲン、またはb)コラーゲンおよびグリコサミノグリカンからなり、
(ii)前記生体適合性マトリックスは孔を有し、
(iii)前記生体適合性マトリックスは、少なくとも80%の多孔度を有し、かつ
(iv)前記PDGFの少なくとも50%が24時間以内に放出される、
組成物。 - 靭帯の骨への結合において使用するための組成物であって、前記組成物は、溶液中に生体適合性マトリックスおよび血小板由来成長因子(PDGF)を含み、前記溶液中のPDGFの濃度は、0.1mg/ml〜2.0mg/mlであり、
(i)前記生体適合性マトリックスは、均質であり、a)コラーゲン、またはb)コラーゲンおよびグリコサミノグリカンからなり、
(ii)前記生体適合性マトリックスは孔を有し、
(iii)前記生体適合性マトリックスは、少なくとも80%の多孔度を有し、かつ
(iv)前記PDGFの少なくとも50%が24時間以内に放出される、
組成物。 - 前記生体適合性マトリックスが、少なくとも85%の多孔度を有する、請求項1または2に記載の組成物。
- (i)前記孔が、2500μm2〜20,000μm2の範囲の平均面積を有するか、
(ii)前記孔が、200μm〜600μmの範囲の平均周囲長を有するか、そして/または
(iii)前記孔が、1μm〜1mmの範囲の直径を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記孔が相互接続された孔である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PDGFの少なくとも60%が、24時間以内に放出される、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記生体適合性マトリックスが、インビボ投与の21日以内に再吸収される、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記生体適合性マトリックスがコラーゲンを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記コラーゲンが、ウシI型コラーゲンである、請求項8に記載の組成物。
- 前記コラーゲンが可溶性である、請求項8に記載の組成物。
- 前記コラーゲンが架橋されている、請求項8に記載の組成物。
- 前記グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸である、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、ゲル、粒子、粉末、シート、パッド、ペースト、パッチ、またはスポンジである、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が流動性である、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記靭帯が、前十字靭帯(anterior cruciate ligament)、外側側副靭帯(lateral collateral ligament)、後十字靭帯(posterior cruciate ligament)、内側側副靭帯(medial collateral ligament)、頭側十字靭帯(cranial cruciate ligament)、尾方十字靭帯(caudal cruciate ligament)、輪状甲状靭帯、歯周靭帯、毛様体小帯、前仙腸靭帯、後仙腸靭帯、仙結節靭帯、仙棘靭帯、恥骨弓靭帯、上恥骨靭帯、提靭帯、掌側橈骨手根靭帯、背側橈骨手根靭帯、内側側副靭帯(ulnar collateral ligament)、および外側側副靭帯(radial collateral ligament)からなる群より選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、骨傷害を伴わない靭帯傷害の治療において使用するためのものであり、前記靭帯の傷害が、靭帯の断裂、切断、引裂、離層、歪み、または変形である、請求項1または3から15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、靭帯の骨への結合において使用するためのものであり、前記結合が、前十字靭帯再構成のためである、請求項2から15のいずれか一項に記載の組成物。
- (i)個体において骨傷害を伴わない靭帯傷害を治療するための、あるいは(ii)個体において靭帯を骨に結合させるためのキットであって、前記キットは、生体適合性マトリックスを含む第1の容器、および血小板由来成長因子(PDGF)溶液を含む第2の容器を含み、
ここで、前記生体適合性マトリックスは、均質であり、a)コラーゲン、またはb)コラーゲンおよびグリコサミノグリカンからなり、
ここで、前記PDGF溶液の濃度は、0.1mg/ml〜2.0mg/mlであり、
ここで、前記生体適合性マトリックスは孔を有し、前記生体適合性マトリックスは、少なくとも80%の多孔度を有し、前記PDGFの少なくとも50%が24時間以内に放出される、キット。
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