ES2299183T3 - Composiciones bioceramicas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SUMINISTRA UN FOSFATO DE CALCIO DE TIPO APATITO POBREMENTE CRISTALINO (PCA) QUE CONTIENE UN AGENTE BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y/O CELULAS, PREFERIBLEMENTE CELULAS PARA LA FORMACION DE TEJIDOS O CELULAS PARA LA DEGRADACION DE TEJIDOS. LAS COMPOSICIONES SUMINISTRADAS POR LA INVENCION SON UTILES PARA UNA GRAN VARIEDAD DE APLICACIONES IN VIVO E IN VITRO, INCLUYENDO LA ADMINISTRACION DE MEDICAMENTOS (POR EJ. A ZONAS OSEAS, AL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, A ZONAS INTRAMUSCULARES, A ZONAS SUBCUTANEAS, A ZONAS INTERPERITONEALES, Y A ZONAS OCULARES), EL CRECIMIENTO DE TEJIDOS (PREFERIBLEMENTE HUESO O CARTILAGO), EL AUMENTO OSEO, ASI COMO PROCEDIMIENTOS DE DIAGNOSIS DE ESTADOS PATOLOGICOS MEDIANTE EL ANALISIS DEL POTENCIAL DE FORMACION DE TEJIDOS DE CELULAS AISLADAS DE UN ANFITRION. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE VEHICULOS DE ADMINISTRACION, DE ALTERACION DE LAS CARACTERISTICAS DE LOS VEHICULOS DE ADMINISTRACION, Y DE LA ADMINISTRACION DE AGENTES BIOLOGICAMENTE ACTIVOS A UNA ZONA. LA INVENCION SUMINISTRA ADEMAS SISTEMAS DE CULTIVOS CELULARES IN VITRO Y MATERIALES DE ENCAPSULACION DE CELULAS. LA INVENCION ES UTIL PARA APLICACIONES TANTO MEDICAS COMO VETERINARIAS.
Description
Composiciones biocerámicas.
Gran parte de la investigación en el área de los
productos biofarmacéuticos está dirigida hacia el desarrollo de
vehículos implantables eficaces para la administración de fármacos y
otras aplicaciones quirúrgicas. Tales vehículos deben ser
biocompatibles y deben ser también capaces de proteger la actividad
de cualquier agente biológicamente activo que estén destinados a
administrar. Muchos agentes biológicamente activos son lábiles y
pierden fácilmente su actividad cuando son incorporados a un
material de administración. La conservación de la actividad de
proteínas ha planteado problemas particularmente difíciles.
En el campo de la administración de fármacos, se
han estudiado las cerámicas de fosfato de calcio como potenciales
vehículos de administración debido a su bien conocida
biocompatibilidad y a su afinidad por los reactivos proteicos (ver,
por ejemplo, IJntema y col., Int. J. Pharm. 112:215, 1994; Itokazu y
col., J. Ohn. Surg. 2:47, 1994; Shinto y col., J. Bone Joint Surg.
74-B:600, 1992; Uchida y col., J. Orth. Res. 10:440,
1992). Sin embargo, las reacciones empleadas para producir los
materiales cerámicos de fosfato de calcio conocidos requieren
típicamente temperaturas y/o presiones elevadas, y requieren
también la presencia de ácidos o bases. Como la mayoría de los
agentes biológicamente activos serán destruidos por una o más de las
condiciones requeridas para producir la cerámica, los agentes
biológicamente activos podrán ser cargados únicamente después de que
el material haya sido producido, lo cual puede limitar la cantidad
y el tipo de agente que puede ser administrado.
Además, aunque varios materiales de fosfato de
calcio han sido referidos como "reabsorbibles", tales
compuestos, que normalmente contienen o derivan de fosfato
tricálcico, fosfato tetracálcico o hidroxiapatita, son de hecho
reabsorbibles sólo débilmente. Del grupo, los compuestos de fosfato
tricálcico han demostrado ser los más reabsorbibles y, después de
muchos años de estudio, no son todavía muy utilizados en el entorno
clínico. Se sabe que los fosfatos tricálcicos tienen perfiles de
reabsorción prolongados y en cierto modo impredecibles, requiriendo
generalmente más de un año para la reabsorción. A no ser que se
lleven a cabo etapas para producir fosfatos tricálcicos
extremadamente porosos o acanalados, estos compuestos no son
sustituidos por hueso. Estudios recientes han llevado a la
conclusión de que la "biodegradación de TCP, que es mayor que la
de [hidroxiapatita], no es suficiente" (Berger y col.,
Biomaterials 16:1241, 1995).
Los compuestos derivados del fosfato
tetracálcico y de la hidroxiapatita son también solamente
reabsorbibles de forma débil. Los informes publicados sobre los
rellenos de fosfato tetracálcico describen generalmente una
reabsorción parcial durante largos periodos de tiempo. Por ejemplo,
según está descrito por Horioglu y col., es común que tales
materiales requieran 30 meses para una reabsorción del 80% (Soc. for
Biomaterials, pág. 198, 18-22 de Marzo de 1995).
Además, muchos informes que describen la "reabsorción" de
materiales de fosfato de calcio no demuestran realmente la
reabsorción, ya que los autores no descartan, por ejemplo, la
migración del vehículo desde el lugar del implante (ver, por
ejemplo, IJntema y col., supra).
En el campo quirúrgico, uno de los objetivos de
la cirugía reconstructora es el poder sustituir el tejido dañado
por nuevo tejido, cultivado quizás a partir de las propias células
del paciente. Por ejemplo, hay investigadores que han intentado
desarrollar sistemas de regeneración de cartílago en los cuales
condrocitos aislados son inyectados en un área lesionada en el
contexto de un soporte polimérico (ver, por ejemplo, Atala y col.,
J. Urol. 150:747, 1993; Freed y col., J. Cell. Biochem. 51:257,
1993 y las referencias citadas en los mismos). Se han estudiado
sistemas de soportes sembrados similares en el contexto de la
reparación ósea, en los cuales se utilizan células osteoblásticas
conjuntamente con soportes poliméricos o cerámicos (ver, por
ejemplo, Elgendy y col., Biomater. 14:263, 1993; Ishaug y col., J.
Biomed. Mater. Res. 28:1445, 1994). Se han estudiado también
composiciones sembradas para determinar su utilidad en el control de
la vejiga y en aplicaciones vesículouretrales (ver, por ejemplo,
Griffith-Cima y col., solicitud PCT publicada nº WO
94/25080).
Los investigadores de este campo han
identificado varias características que son deseables para que los
materiales de soporte sean utilizados en tales composiciones
sembradas. Por ejemplo, Freed y col. (Bio/Technology 12:689, 1994)
enumeran los seis factores siguientes como características
deseables:
- (1)
- la superficie del soporte debe permitir la adhesión celular y el crecimiento celular;
- (2)
- ni el material del soporte ni sus productos de degradación deben provocar inflamación o toxicidad cuando son implantados in vivo;
- (3)
- el material del soporte debe ser procesable de manera reproducible en estructuras tridimensionales;
- (4)
- el material del soporte debe tener una porosidad de al menos un 90%, de tal manera que proporcione un área superficial grande para las interacciones célula-soporte, un espacio suficiente para la regeneración de la matriz extracelular y limitaciones mínimas de la difusión durante el cultivo in vitro;
- (5)
- el material del soporte debe reabsorberse una vez que ha cumplido su finalidad de proporcionar un molde para el tejido que se está regenerando; y
- (6)
- la velocidad de degradación del soporte debe ser ajustable para igualar la velocidad de regeneración del tejido por el tipo celular de interés.
Permanece la necesidad del desarrollo de un
vehículo para la administración de fármacos que sea biocompatible,
totalmente reabsorbible y que no sea nocivo para la actividad del
fármaco. Existe también la necesidad de desarrollar materiales
adecuados para ser utilizados como soportes en la reparación
tisular. La presente invención resuelve estas necesidades
proporcionando materiales y composiciones útiles para la
administración de fármacos y la reparación tisular.
"Amorfo" - - Por "amorfo", según
se utiliza ese término en la presente, se quiere indicar un material
con un carácter amorfo significativo. El carácter amorfo
significativo contempla más de un 75% de contenido amorfo,
preferiblemente más de un 90% de contenido amorfo, y se caracteriza
por un patrón de difracción de rayos X ancho, sin rasgos
distintivos. Se reconoce que puede existir en el material un pequeño
grado de cristalinidad. Sin embargo, para los materiales
precursores amorfos de la presente invención, es preferible que el
grado de cristalinidad sea inferior al deseado en el material del
producto.
"Bioactivo" - - "Bioactivo" se
refiere a un material que induce la formación de tejido duro en y
alrededor del implante. Cuando es implantado en un tejido blando,
la bioactividad puede requerir también la presencia de un factor de
crecimiento o trófico, o la adición al implante de un tipo celular
formador de tejido duro.
"Biocompatible" - - El término
"biocompatible", según se utiliza en la presente, indica que el
material no produce una respuesta nociva sustancial en el huésped.
Existe siempre la preocupación de que, cuando se introduce un
objeto extraño en un ser vivo, el objeto induzca una reacción
inmune, tal como una respuesta inflamatoria que tendrá efectos
negativos en el huésped. Por ejemplo, aunque la hidroxiapatita es
considerada generalmente "biocompatible", se ha observado una
inflamación y una necrosis tisular significativas cuando se insertan
intramuscularmente microvehículos de hidroxiapatita cristalina en
animales (ver, por ejemplo, IJntema y col., Int. J. Pharm. 112:215
(1994)).
"Biorreabsorbible" - -
"Biorreabsorbible" se refiere a la capacidad de un material
para ser reabsorbido in vivo. Una reabsorción "total"
significa que no permanecen fragmentos extracelulares
significativos. El proceso de reabsorción implica la eliminación de
los materiales del implante original a través de la acción de los
fluidos, enzimas o células corporales. El fosfato cálcico
reabsorbido puede ser, por ejemplo, depositado de nuevo como
mineral óseo, o ser reutilizado de otro modo en el organismo, o bien
ser excretado. "Potentemente biorreabsorbible", según se
utiliza este término en la presente, significa que al menos un 80%,
preferiblemente un 95-99% y, muy preferiblemente
>99% de la masa total del material implantado intramuscularmente
o subcutáneamente es reabsorbida en un año. En las realizaciones
preferidas de la invención, el fosfato de calcio apatítico
débilmente cristalino (PCA) que se reabsorbe potentemente se
caracteriza porque cuando al menos 1 g (preferiblemente
1-5 g) del material de PCA es implantado en un lugar
subcutáneo o intramuscular, al menos el 80% del material es
reabsorbido en un año. En realizaciones más preferidas, el material
será reabsorbido en nueve meses, seis meses, tres meses e
idealmente en un mes. Además, los materiales particularmente
preferidos se caracterizan porque pueden ser reabsorbidos
totalmente en los periodos de tiempo indicados. Para los fines de
esta descripción, "débilmente" reabsorbible significa que
menos del 80% del material de partida es reabsorbido después de un
año.
"Cantidad eficaz" - - Una cantidad
eficaz de un agente biológicamente activo es una cantidad suficiente
para producir una respuesta biológica deseada.
"Endurecimiento" - -
"Endurecimiento" se refiere al proceso mediante el cual el
precursor hidratado es transformado en un material de PCA
endurecido. Se considera que el material de PCA está
"endurecido" cuando es un sólido sustancialmente no modelable.
Tal material de PCA endurecido tiene una compresibilidad mínima y
tiende a experimentar una deformación plástica en vez de una
deformación elástica.
"Precursor hidratado" - - El término
"precursor hidratado", según se utiliza en la presente, se
refiere a la pasta o masilla formada por la hidratación de los
precursores de PCA secos en presencia de una cantidad limitada de
una solución acuosa (esto es, menos de 1 ml de solución acuosa/1 g
de polvo de precursor aproximadamente). El precursor hidratado
puede contener reactivos y productos en varias combinaciones,
dependiendo del grado hasta el cual haya progresado la conversión.
Las pastas del precursor de PCA "inyectables" y
"modelables" descritas en la presente son precursores
hidratados. Los precursores hidratados "inyectables" preferidos
tienen una consistencia apropiada para su administración a través
de una aguja de calibre 18.
"Fosfato de calcio apatítico débilmente
cristalino", "fosfato de calcio PCA" y "material de
PCA", según se utilizan esos términos en la presente, describen
un fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino sintético. El
material de PCA no se limita necesariamente a una única fase de
fosfato de calcio siempre que tenga el patrón de DRX y FTIR
característico. Un fosfato de calcio PCA tiene sustancialmente el
mismo espectro de difracción de rayos X que el hueso. El espectro
se caracteriza generalmente por sólo dos picos anchos en la región
de 20-35º, uno centrado en 26º y el otro centrado
en 32º. Se caracteriza además por picos de FTIR en 563 cm^{-1},
1034 cm^{-1}, 1638 cm^{-1} y 3432 cm^{-1} (\pm 2 cm^{-1}).
Se observan hombros pronunciados a 603 cm^{-1} y 875 cm^{-1},
con un doblete que tiene el máximo a 1422 cm^{-1} y 1457
cm^{-1}.
"Promotor" - - El término
"promotor", según se utiliza en la presente, describe un
material o tratamiento que estimula el endurecimiento de un
precursor hidratado y que puede incrementar la conversión del ACP en
fosfato de calcio PCA. Algunos promotores participan en la
conversión y se incorporan al material de PCA del producto; otros,
conocidos como promotores "pasivos", no participan.
"Reactivo" - - "Reactivo" se
utiliza en la presente para hacer referencia a la capacidad de un
fosfato de calcio amorfo para formar un precursor hidratado cuando
es mezclado con un líquido, con el fin de experimentar la
conversión en el material de PCA de la presente invención en
presencia de un promotor en asociación con el endurecimiento de los
materiales precursores. Los ACPs preferidos se caracterizan por la
capacidad de convertirse completamente, la capacidad de convertirse
rápidamente con endurecimiento, la capacidad para experimentar la
conversión con compuestos de otro modo inertes y/o la capacidad para
convertirse en un material de PCA sustancialmente homogéneo. Cuando
el ACP reacciona con un segundo fosfato de calcio, la
"conversión" puede incluir la conversión del ACP y del segundo
fosfato de calcio. El grado de endurecimiento y la cinética del
proceso de endurecimiento son también elementos importantes de la
reactividad. Algunos ACPs son más reactivos que otros. Se considera
que un ACP es "altamente reactivo" si experimenta conversión y
endurecimiento para dar lugar a un material de PCA en presencia de
un promotor débil, tal como fosfato dicálcico dihidrato
("DCPD") con una distribución de granos que contiene una
fracción significativa de tamaños de grano mayores de 100 \mum.
Los ACPs altamente reactivos preferidos producen un material de PCA
endurecido en presencia del promotor débil DCPD y agua a 37ºC en
menos de doce horas, siendo el endurecimiento sustancialmente
completo en un tiempo de una a cinco horas aproximadamente e,
idealmente, en 10-30 minutos.
La presente invención proporciona un material de
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino, sintético, que
tiene una excelente biocompatibilidad, unas excelentes
características de reabsorción y capacidad de procesamiento y que
es útil en aplicaciones de administración de fármacos y de siembre
celular (in vivo e in vitro).
El material de PCA sintético utilizado en la
presente invención es compatible con células y con un amplio
abanico de agentes biológicamente activos. El material puede ser
empleado para administrar agentes o células a cualquiera de una
variedad de lugares del organismo, o puede ser utilizado in
vitro. El material se caracteriza por un patrón de difracción
de rayos X distintivo que revela su débil cristalinidad.
Preferiblemente, el material tiene una proporción de calcio
respecto a fosfato en el rango de 1,1 a 1,9 aproximadamente. Más
preferiblemente, esta proporción está en el rango de 1,3 a 1,5
aproximadamente.
El material de PCA utilizado en la presente
invención es potentemente biorreabsorbible. Esto es, cuando un
implante que contiene al menos un 1 g de material es implantado en
forma de pastilla en un lugar intramuscular o subcutáneo, al menos
un 80% aproximadamente, preferiblemente un 90-95% y,
muy preferiblemente, >95% del material es reabsorbido en un año,
preferiblemente en 9 meses, 6 meses, 3 meses e, idealmente, en 1
mes. Más preferiblemente, al menos un 80%, preferiblemente un
90-95% y, muy preferiblemente, >95% de un
implante de 5 g es reabsorbido en estos marcos de tiempo. Se
apreciará que la conformación del material (por ejemplo, en una
esfera en comparación con una varilla o con otra forma) puede
influir sobre su velocidad de reabsorción. Además, la velocidad de
reabsorción del vehículo de administración puede ser variada a
través de su forma de preparación.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, el material de PCA sintético es formado en una reacción
en la cual al menos un precursor de fosfato de calcio amorfo (ACP)
es expuesto a un promotor. En realizaciones particularmente
preferidas el promotor contiene un segundo material de fosfato de
calcio. Las condiciones de reacción empleadas para producir el
material de PCA utilizado en la presente invención son suaves, de
tal manera que agentes biológicos o células pueden ser incorporados
al material durante la reacción de formación, si se desea.
Alternativamente, los agentes pueden ser incorporados después de que
se haya producido el vehículo de administración. El material del
vehículo de administración puede ser modelado en cualquiera de una
variedad de formas de administración útiles, antes o después de la
introducción del agente biológicamente activo o de la célula, y
puede ser administrado al lugar mediante, por ejemplo, inyección o
implantación quirúrgica. El material puede ser introducido en el
lugar en estado húmedo, no endurecido (esto es, como un precursor
hidratado) y se deja que endurezca in situ. El vehículo puede
ser alternativamente endurecido in vitro a una temperatura
elevada, generalmente a o por encima de 37ºC, y posteriormente
implantado quirúrgicamente en un sujeto (animal o humano).
El material de PCA de la presente invención
puede ser fabricado in vitro en presencia o ausencia del
agente biológicamente activo o de la célula. Alternativamente, el
agente biológicamente activo o la célula pueden ser añadidos
después del endurecimiento mediante exposición del vehículo
premodelado al agente.
La presente invención proporciona por tanto
vehículos para la administración de agentes biológicamente activos,
vehículos que contienen un fosfato de calcio PCA y un agente
biológicamente activo. Los vehículos de la invención contienen
opcionalmente, por ejemplo, otros materiales biorreabsorbibles,
modificadores de la tasa de erosión, células u otros factores que
modifican una o más características del vehículo (tales como su
potencia, su adherencia, su inyectabilidad, sus características de
fricción, etc.). Una ventaja del sistema de administración de la
presente invención es que permite conseguir una elevada
concentración local del fármaco, lo cual es particularmente útil
con fármacos que tienen efectos colaterales tóxicos y también con
fármacos lábiles.
La invención proporciona también métodos para
preparar vehículos de administración, para alterar las
características de los vehículos de administración y para
administrar agentes biológicamente activos a un lugar. Los lugares
preferidos de administración incluyen lugares in vitro e
in vivo. Los vehículos de administración de la invención son
adecuados para la administración a lugares humanos o animales. Los
lugares in vivo preferidos incluyen lugares óseos, lugares
intramusculares, lugares intraperitoneales, lugares subcutáneos,
lugares del sistema nervioso central y lugares oculares. Los
implantes pueden contener también componentes adicionales tales
como agentes biológicamente activos o factores que alteren las
características (tales como las características de capacidad de
reabsorción, potencia, adherencia, inyectabilidad, las
características de fricción, etc.).
La invención proporciona también métodos para
preparar tales implantes; métodos para el crecimiento de hueso o
cartílago in vivo o in vitro en lugares naturales o
ectópicos; métodos para el aumento óseo; y se describen también
métodos para el diagnóstico de estados de enfermedad mediante el
análisis del potencial para formar tejidos de células aisladas de
un huésped.
La Figura 1 es una micrografía electrónica de
transmisión de alta resolución del fosfato de calcio amorfo
reactivo que ilustra los granos del tamaño de nanometros en grupos
con límites relativamente poco claros e inmersos parcialmente en
una forma sin definición (flechas).
La Figura 2 es un espectro de dispersión de
energía en una microsonda electrónica del fosfato de calcio amorfo
reactivo de la presente invención después del procedimiento de
calentamiento en vacío que hizo que la proporción Ca/P fuera de
1,58.
La Figura 3 es una curva de solubilidad de un
producto de fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino
derivado del fosfato de calcio amorfo de la presente invención, en
comparación con una hidroxiapatita cristalina. Observar la
solubilidad relativamente más elevada del material de la presente
invención frente a una forma más cristalina de hidroxiapatita,
medida por la cantidad de iones de calcio liberados a la solución a
37ºC.
La Figura 4 son patrones de difracción de rayos
X de (a) fosfato de calcio amorfo reactivo y del (b) difosfato
dicálcico utilizados en una reacción para formar un material
sustitutivo del hueso de la invención.
Las Figuras 5a-d son patrones de
difracción de rayos X que siguen el progreso de la reacción de una
mezcla de fosfato de calcio amorfo reactivo y difosfato dicálcico
para formar un material de PCA de la presente invención.
La Figura 6 es un espectro infrarrojo de (a)
fosfato dicálcico dihidrato, (b) el ACP activado de la invención y
(c) el material de PCA de la presente invención.
La Figura 7 es un patrón de difracción de rayos
X de un hueso existente en la naturaleza.
La Figura 8 es una gráfica de barras que muestra
la distribución del tamaño de partículas de varias formulaciones
descritas en el Ejemplo 5.
La Figura 9 representa la utilización del
material de PCA de la presente invención en una variedad de lugares
óseos.
La Figura 10 presenta fotomicrografías de
defectos tibiales sin tratar (10a) o tratados (10b) con el material
de PCA de la presente invención. En la Figura 10a, las flechas
pequeñas indican un borde del defecto; la cabeza de flecha grande
está en el defecto todavía sin rellenar. En la Figura 10b, las
cabezas de flechas grandes indican un borde del defecto. En ambas
figuras, el aumento es de 4x, el hueso está descalcificado y los
cortes están tratados con hematoxilina y eosina.
La Figura 11 es una fotomicrografía de hueso
trabecular canino crecido en un defecto 8 semanas después de la
cirugía que fue tratado con el vehículo para la administración de
fármacos de la presente invención. (Aumento 10x; descalcificado;
hematoxilina y eosina).
La Figura 12 es una fotomicrografía de un
defecto óseo cortical canino 4 semanas después de la cirugía que
fue tratado con el vehículo para la administración de fármacos de la
presente invención. (Aumento 4x; sin descalcificar, Fucsina Básica
Verde Claro).
La Figura 13 presenta fotomicrografías de
defectos tibiales de conejo sin tratar (Figura 13a) y tratados
(Figura 13b) 4 semanas después de la cirugía. (Aumento 4x;
descalcificado; Tricrómico de Masson).
\newpage
La Figura 14 es una fotomicrografía de una
región externa a un lugar óseo en la cual ha tenido lugar la
formación de cartílago (hematoxilina y eosina).
La Figura 15 es un patrón de difracción de rayos
X del fosfato de calcio PCA preparado según está descrito en el
Ejemplo 1-2.
La Figura 16 es un patrón de difracción de rayos
X del fosfato de calcio PCA preparado según está descrito en el
Ejemplo 1-4.
La Figura 17 es un patrón de difracción de rayos
X del fosfato de calcio PCA preparado a partir del promotor pasivo
Al_{2}O_{3}, en el cual los picos del Al_{2}O_{3} están
indicados por líneas.
La Figura 18 muestra el análisis mediante DRX
del material recuperado de conejos.
La Figura 19 muestra el análisis mediante FTIR
del material recuperado de conejos.
La Figura 20 muestra los resultados de la
formación de hueso nuevo y de la reabsorción del material de
PCA.
El material de PCA de la presente invención está
descrito en las solicitudes copendientes U.S.S.N. 08/650.764 y/o
U.S.S.N. 08/446.182, cada una de las cuales se incorpora a la
presente por referencia. El material está descrito también en un
conjunto de solicitudes relacionadas tituladas "Delivery
Vehicle"; "Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a
Novel Bioceramic"; "Orthopedic and Dental Ceramic Implants";
y "Bioactive Ceramic Composites", cada una de las cuales es de
la misma fecha que la presente y se incorpora aquí por referencia.
A la luz de la amplitud de las descripciones en cada una de estas
solicitudes relacionadas, los detalles de los materiales de PCA de
la invención no serán abordados en la presente. Bastará con un
resumen de sus características.
El material de PCA empleado en la presente
invención se caracteriza por su biocompatibilidad, su capacidad de
reabsorción biológica y su cristalinidad mínima. El material puede
ser muy poroso y rápidamente reabsorbible o bien puede tener
porosidad disminuida y ser reabsorbible lentamente. Su carácter
cristalino es sustancialmente el mismo que el del hueso natural y
carece del mayor grado de cristalinidad observado en los materiales
sustitutos del hueso conocidos en la técnica. El material de PCA de
la invención es también biocompatible y no es nocivo para el
huésped.
El material de PCA de la presente invención
puede ser implantado en un paciente en forma de pasta o masilla
(esto es, como un precursor hidratado). Como la reacción de la
invención que produce el material de PCA endurecido puede ser
iniciada fuera del organismo, y procede lentamente a temperatura
ambiente, se minimiza la posibilidad de que el material se
"establezcla" antes de la aplicación en el lugar quirúrgico y
se convierta en inutilizable. La reacción se acelera
significativamente a la temperatura corporal y el material se
endurece en su lugar. Esta característica es particularmente útil
en el entorno quirúrgico, donde se requiere típicamente el ajuste
personalizado del dispositivo en el lugar del implante. Por ejemplo,
en algunas realizaciones preferidas de la invención, se administra
en el lugar de una fractura un antibiótico y/o un factor
regenerador. En tales realizaciones, la pasta de la invención
conteniendo el agente terapéutico será aplicada a, y utilizada para
rellenar, el lugar de la fractura, así como para administrar el
agente deseado.
Alternativamente, el material de PCA de la
invención puede ser preendurecido fuera del organismo, cargado con
el agente biológico o la(s) célula(s) deseados e
implantado en un tiempo posterior. Este procedimiento es útil en
aquellas situaciones en las cuales no son esenciales formas
personalizadas, y en las que se desea la producción de un gran
número de implantes.
En general, la reacción de formación de la
presente invención es finalizada después de la aplicación en el
lugar quirúrgico. El material se endurece típicamente en menos de
cinco horas, y sustancialmente se endurece un tiempo de una a cinco
horas aproximadamente, bajo condiciones fisiológicas.
Preferiblemente, el material se endurece sustancialmente en
10-30 minutos aproximadamente. La consistencia y la
moldeabilidad del material de PCA, así como la velocidad de la
reacción de formación, pueden variarse de acuerdo con la necesidad
terapéutica mediante la modificación de unos cuantos parámetros
sencillos.
La capacidad de reabsorción del material de PCA
empleado en la presente invención, es atribuible a la combinación
de su porosidad, su composición química y su cristalinidad. Las
apatitas tienen caracteres cristalinos reducidos y muestran una
solubilidad algo incrementada en sistemas acuosos cuando se comparan
con especies más cristalinas. Se cree que la baja cristalinidad del
material de PCA de la invención y/o la presencia de dominios amorfos
estables en el mismo, estimula su capacidad de reabsorción en los
sistemas biológicos.
La capacidad de reabsorción del material de PCA
de la presente invención puede ser modificada alterando su densidad
y/o su porosidad. La porosidad facilita la difusión de sustancias
hacia y desde el interior del material y, en ciertas aplicaciones,
la penetración de células y de prolongaciones celulares en la matriz
el material. Los materiales para administración de fármacos de
menor porosidad tienden a reabsorberse más lentamente in
vivo que los de mayor porosidad. En una realización de la
invención, la porosidad es incrementada mediante la utilización de
una mezcla seca de reactivos con tamaño de partícula controlado; en
otras realizaciones se emplean técnicas de mordentado químico o
físico y lixiviación.
Por tanto, diferentes realizaciones de la
presente invención proporcionan materiales de PCA con diferentes
tasas de reabsorción. La selección de reactivos, de la porosidad, de
la cristalinidad final, y las cantidades y tipos de inhibidores de
la cristalización empleados produce diferentes realizaciones del
material de PCA de la presente invención, de tal manera que, en
diferentes realizaciones, 1 g de material es reabsorbido (esto es,
al menos un 80%, preferiblemente un 90-95% y muy
preferiblemente >95%, reabsorbido) en cualquier periodo de
tiempo deseado desde 2 semanas hasta 1, 3, 6 ó 9 meses, a 1 año.
En una realización preferida de la presente
invención, la reacción que produce el material de PCA es iniciada
por la adición de solución salina fisiológica a una mezcla de dos
componentes secos, de tal manera que se forma una pasta espesa que
se endurece en media hora aproximadamente. Pueden utilizarse en
lugar de solución salina otros agentes acuosos tales como suero,
medio de cultivo de tejidos u otra solución tamponada o agua
destilada. Muy a menudo, el material de PCA reabsorbible resultante
será "deficiente en calcio", con una proporción de calcio
respecto a fosfato menor de 1,5 en comparación con el valor
estequiométrico ideal de 1,67 aproximadamente para la
hidroxiapatita.
La invención proporciona un ensayo para
identificar materiales de PCA y precursores reactivos adecuados.
Específicamente, los precursores son combinados, hidratados con una
cantidad limitada de agua (a fin de que se forme una pasta o
masilla) y se dejan endurecer para dar lugar al material de PCA. Los
precursores deseables son capaces de endurecerse en un entorno
húmedo a la temperatura corporal o a una temperatura próxima a la
corporal. El producto endurecido es colocado posteriormente
intramuscularmente o subcutáneamente en un animal de ensayo. Los
materiales deseables son aquéllos que, cuando son implantados como
una pastilla de al menos 1 g son reabsorbidos al menos un 80%,
preferiblemente un 90-95% y muy preferiblemente
>95% en 1 año (o menos). Preferiblemente, el material puede ser
totalmente reabsorbido. En general, es más fácil analizar la
reabsorción de cantidades de gramos del material en lugares
subcutáneos.
El material de PCA de la presente invención se
forma en una reacción que emplea al menos un precursor de fosfato
de calcio amorfo (ACP), preferiblemente un ACP activado (ver, por
ejemplo, los Ejemplos 1-4). En algunos casos, la
reacción puede emplear únicamente un ACP precursor, que es
convertido de manera controlada en parte o en la totalidad del
material de PCA de la invención. Alternativamente, la reacción puede
emplear un promotor que comprenda uno o más precursores adicionales
(preferiblemente una o más fuentes de calcio y/o fosfato), que se
combinen con el ACP para dar lugar al material de PCA de la
invención. Además, puede emplearse un promotor no participante con
el fin de facilitar la conversión del ACP activado en el material
del PCA de la invención. En cualquier caso, se prefieren
enormemente las reacciones que pueden ser iniciadas fuera del
organismo, que pueden ser llevadas a cabo en una configuración
semejante a una pasta y que se aceleran significativamente a 37ºC
dando lugar a un producto de fosfato de calcio endurecido.
La conversión del ACP en el material de PCA es
estimulada en presencia de agua. Generalmente, el ACP es
proporcionado como un polvo que se combina con cualquiera de los
demás reactivos (por ejemplo un segundo fosfato de calcio) y es
expuesto a una cantidad limitada de agua, de tal manera que se forma
una pasta o masilla. El precursor hidratado se endurece
posteriormente y el endurecimiento está asociado con la formación
del material de PCA. Es un objetivo de esta invención el
proporcionar métodos que estimulen la conversión del ACP en un
material de PCA de manera controlada, produciendo una pasta o
masilla del precursor hidratado que se endurece predeciblemente y
que tiene utilidad en aplicaciones dentales, ortopédicas, de
administración de fármacos, de terapia celular y/o en otras
aplicaciones. Los promotores utilizados para llevar a cabo esta
conversión pueden ser convertidos ellos mismos en el material de
PCA, o bien pueden participar en otras reacciones químicas o
físicas. Algunos promotores preferidos pueden permanecer también
inalterados durante la conversión, proporcionando una función
catalítica o nucleadora. A este respecto, son particularmente
adecuadas las sustancias que proporcionan superficies reactivas que
estimulan débilmente la cristalización para producir fosfato de
calcio PCA.
Precursores de ACP únicamente: Cuando se
utiliza fosfato de calcio amorfo como único precursor para producir
un material de PCA reabsorbible, es importante controlar la
tendencia natural del ACP para convertirse en hidroxiapatita
altamente cristalina. Por otra parte, el transcurso de la conversión
en el tiempo debe ser suficientemente rápido para que tenga
utilidad quirúrgica. Un procedimiento es combinar un ACP precursor
que contenga un inhibidor de la formación de cristales (por
ejemplo, el ACP del Ejemplo 1) con un ACP que no contenga un
inhibidor de la formación de cristales (por ejemplo, un promotor).
Los reactivos pueden ser mezclados en estado seco, con el tamaño de
partícula apropiado y un exceso del ACP que contiene el inhibidor.
Los reactivos pueden ser expuestos posteriormente a condiciones
para la formación de cristales tales como la adición de agua,
seguido por una elevación de la temperatura (por ejemplo, como
ocurre después de la introducción en el organismo), con el fin de
convertir los reactivos en el material de PCA de la invención. Otros
métodos de conversión controlada implican la utilización de
catalizadores.
Precursor de ACP más fuentes adicionales de
fosfato de calcio: El ACP puede hacerse reaccionar con una
segunda fuente de calcio (incluyendo un segundo ACP) utilizando
cualquier técnica que estimule la reacción. En las realizaciones
preferidas, la segunda fuente de calcio es por sí misma un promotor.
La reacción que está siendo estimulada es la conversión de un
fosfato de calcio amorfo en un fosfato de calcio apatítico
endurecido nanocristalino o débilmente cristalino. Tales reacciones
incluyen reacciones ácido/base, de desplazamiento, de sustitución y
de hidrólisis, así como reaccione puramente físicas y mecánicas (por
ejemplo, triturado, mezclado). Puede emplearse también la
conversión catalítica, tal como la conversión del ACP en un material
de PCA catalizada por la superficie. Bajo cualquier esquema de
reacción, es importante que el ACP conserve el carácter amorfo
significativo a lo largo de toda la reacción. Específicamente, la
cristalinidad global en el ACP de partida no debe ser superior a la
deseada en el producto final. Por tanto, ciertos esquemas de
reacción pueden requerir la estabilización de la naturaleza amorfa
del ACP a lo largo de todo el periodo de la reacción. Ejemplos de
inhibidores de la formación de cristales que son conocidos en la
técnica y son útiles para tal estabilización incluyen carbonato,
pirofosfato y magnesio.
En algunas realizaciones preferidas, el
componente ACP es activado bajo calor con el fin de facilitar la
conversión que es estimulada por el segundo reactivo que contiene
calcio o por otro promotor. Ejemplos de tales segundos reactivos
promotores adecuados incluyen DCPD, otros fosfatos de calcio
cristalinos o débilmente cristalinos, fuentes de calcio, fuentes de
fosfato o un segundo ACP. Pueden emplearse también otros métodos
para estimular la conversión, tal como la catálisis o la
utilización de solventes iónicos o de promotores de la nucleación,
para estimular la reacción entre los sustituyentes. El segundo
reactivo de fosfato de calcio puede tener cualquier estructura
cristalina y debe ser elegido de tal manera que sea reactivo con el
primer ACP, ya sea directamente o a través de la utilización de
vehículos que estimulen la reacción tales como solventes iónicos o
catalizadores. Las condiciones de reacción apropiadas serán
determinadas mediante la demostración de un endurecimiento rápido a
37ºC una vez que los reactivos han sido mezclados y se ha añadido
agua.
La reacción de formación del vehículo para
administración puede ser también diseñada para que produzca un
producto final que sea poroso. En una realización, la utilización de
una mezcla seca de reactivos con tamaño de partícula controlado da
lugar a un material poroso. Pueden emplearse otros métodos para
estimular la porosidad, tal como el mordentado químico o físico y
la lixiviación.
La presente invención proporciona un nuevo
proceso para activar un precipitado de fosfato de calcio amorfo
estándar para dar lugar a sólidos amorfos altamente reactivos. Los
sólidos amorfos pueden ser utilizados en las reacciones
anteriormente descritas para formar un fosfato de calcio apatítico
sintético débilmente cristalino o nanocristalino que proporcione
bioactividad, capacidad de biorreabsorción e integridad estructural.
El nuevo material amorfo puede hacerse reaccionar con otros
fosfatos de calcio a, o por debajo de, 37ºC para formar un material
similar al hueso que consta de fosfato de calcio apatítico
débilmente cristalino.
Las reacciones ácido-base de la
técnica anterior de los fosfatos de calcio cristalinos
convencionales producen sólidos que reaccionan muy poco, con
productos de reacción que son demasiado cristalinos para ser
suficientemente reabsorbibles en los tejidos vivos. Las reacciones
de la técnica anterior son generalmente incompletas y los productos
de reacción no son homogéneos. En contraste, el fosfato de calcio
amorfo de la presente invención reacciona rápidamente y
completamente con una amplia variedad de fosfatos de calcio y otros
materiales portadores de calcio o fósforo para proporcionar un
producto homogéneo.
El origen de la reactividad incrementada del ACP
de la presente invención no se conoce completamente; sin embargo,
se cree que está asociada con la condición de amorfo (falta de
cristalinidad) y, en algunas realizaciones, se crean en el material
por el proceso de la presente invención huecos en los lugares de
pares iónicos. Los huecos pueden proporcionar sitios reactivos para
una reacción posterior. Estas observaciones serán discutidas con
más profundidad posteriormente.
El método de la presente invención permite la
formación inicial de partículas de fosfato de calcio amorfo menores
de 1000 \ring{A}, preferiblemente de 200-500
\ring{A} y muy preferiblemente de 300 \ring{A}, cuyo crecimiento
posterior está restringido por la rápida precipitación del producto
desde la solución. Durante la reacción de las fuentes de iones
calcio y fosfato para formar un fosfato de calcio amorfo, un tercer
ión es introducido en la solución, de tal manera que este tercer
ión es incorporado a la estructura del precipitado amorfo en lugar
del(los) grupo(s) PO_{4}^{3-}
trivalente(s). Como algo del PO_{4}^{3-} es sustituido
por el tercer ión, el PO_{4}^{3-} total disminuye, aumentado de
este modo la proporción Ca/P del precipitado amorfo (en comparación
con el fosfato de calcio amorfo estándar) y modificando la valencia
o el estado de carga del fosfato de calcio. Los sólidos amorfos
pueden ser posteriormente liofilizados rápidamente para conservar
las propiedades químicas y físicas del material. Los sólidos amorfos
pueden ser tratados posteriormente bajo condiciones específicas
seleccionadas para estimular la eliminación de al menos parte del
tercer ión. Cuando el tercer ión es carbonato, condiciones de
temperatura y presión específicas dan lugar a la reducción del
carbono total, presumiblemente como dióxido de carbono gaseoso
procedente del sólido amorfo, mientras que se mantiene la amorfia
del producto.
El material resultante es un sólido amorfo con
una proporción Ca/P más elevada que la que se encuentra típicamente
en los fosfatos de calcio amorfos, en los que la proporción descrita
generalmente en el pasado era de 1,50. Además, la eliminación del
carbono del material tiene como resultado huecos en la estructura
intersticial de los sólidos amorfos, convirtiéndolos en un sólido
altamente reactivo. Puede haber varias fuentes de huecos posibles.
El material posee una porosidad que estimula la reactividad por
varios medios, tal como un área superficial incrementada. El
material puede experimentar también un cambio del equilibrio
estequiométrico tras la eliminación del tercer ión. Este cambio
estequiométrico puede tener como resultado un desequilibrio de
cargas que es responsable de la reactividad incrementada del fosfato
de calcio amorfo.
Es deseable mantener el carácter amorfo
sustancial en el material a lo largo del proceso completo. Se ha
encontrado que el sólido es menos reactivo si se introduce
cristalinidad en su totalidad (regiones cristalinas individuales),
o incluso en dominios locales (regiones microcristalinas), en exceso
durante el proceso o en el producto final. El fosfato de calcio
altamente reactivo resultante es amorfo por naturaleza y tiene una
proporción de calcio respecto a fósforo en el rango de 1,55 a 1,65.
En una realización preferida, el fosfato de calcio amorfo tiene una
proporción Ca/P de 1,58 aproximadamente.
El estado amorfo del fosfato de calcio amorfo es
inducido controlando la velocidad y la duración del proceso de
precipitación. El fosfato de calcio amorfo de la presente invención
es precipitado de la solución bajo condiciones en las que la
precipitación inicial es rápida. La precipitación rápida tiene como
resultado la formación de muchos núcleos de fosfato de calcio
extremadamente pequeños. Adicionalmente, un crecimiento rápido del
cristal o del grano da lugar a la producción de más defectos en cada
grano, incrementando también de este modo la solubilidad. En el
extremo final del espectro, el crecimiento del cristal o del grano
es tan rápido y la densidad del defecto es tan significativa que
tiene como resultado un fosfato de calcio amorfo. El fosfato de
calcio amorfo es como un gel e incluye soluciones de sólidos con
composiciones variables. Estos geles no tienen una estructura de
largo alcance, pero son homogéneos cuando se miden en una escala de
Angstroms. Bajo condiciones fisiológicas, estos compuestos amorfos
tienen elevadas solubilidades, tasas elevadas de formación y tasas
elevadas de conversión en fosfato de calcio apatítico
débilmente
cristalino.
cristalino.
Los sólidos de fosfato de calcio amorfo
adquiridos por este método conservan su naturaleza amorfa durante
un tiempo suficientemente largo para ser introducidos en la reacción
final como sólidos sustancialmente amorfos. Pueden ser también
mezclados y reaccionados con otros sólidos o soluciones que
contengan fosfatos con el fin de obtener sólidos que contengan una
distribución homogénea de cristales con un tamaño de nanometros.
Además, en las realizaciones preferidas, como el fosfato de calcio
amorfo reacciona completamente con los demás sólidos, la proporción
Ca/P del sólido resultante constituirá el calcio y el fósforo total
de tal reacción, esto es, habrá una reacción esencialmente
completa. Cuando una concentración molar apropiada de fosfato
procedente de la solución o de los sólidos se hace reaccionar con
el nuevo material de fosfato de calcio amorfo, se obtiene un
material de fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino (Ca/P
1,1-1,9). Por tanto, la presente invención permite
diseñar y modificar y la composición química del producto
resultante, proporcionando así un modo adicional de controlar la
bioactividad del producto final utilizado como vehículo para
administración o como soporte de células.
En una realización de la presente invención, se
prepara una solución que contiene iones calcio y fosfato y un
tercer ión en una concentración, a un pH y a una temperatura que
estimularán la nucleación y precipitación rápidas de fosfato de
calcio. Cuando la precipitación es suficientemente rápida, se forma
un fosfato de calcio amorfo similar a un gel. Como la forma
cristalina termodinámicamente favorecida de la hidroxiapatita es
mejorada por la reducción de la velocidad de reacción, pueden
llevarse a cabo ciertas etapas de procesamiento para incrementar la
velocidad de reacción con el fin de asegurar que se obtenga un
compuesto amorfo. Los factores siguientes, entre otros, deben ser
tenidos en cuenta cuando se diseñe una solución para la
precipitación rápida del fosfato de calcio amorfo de la presente
invención.
Condiciones preferidas: Mezcla rápida de
las fuentes de calcio y fosfato para incrementar la velocidad de
reacción. La velocidad de reacción es incrementada con el fin de
favorecer las fases no estables como producto. El permitir más
tiempo de reacción para que cada uno de los iones se yuxtaponga
correctamente para formar un sólido, tendrá como resultado una
estructura cristalina y estable más termodinámicamente
favorable.
Fuentes preferidas de calcio y fosfato:
La utilización de soluciones muy concentradas o casi sobresaturadas
asegurará el que tenga lugar una reacción más rápida.
Temperatura preferida: Aunque la reacción
puede ser llevada a cabo a temperatura ambiente, temperaturas
próximas al punto de ebullición para incrementar la concentración de
un reactivo representan un medio posible para incrementar la
velocidad de reacción.
En una realización, los iones de calcio, los
iones de fosfato y los iones de carbonato son mezclados rápidamente
en una solución acuosa con el fin de obtener un sólido de fosfato de
calcio amorfo conteniendo carbonato. Las concentraciones relativas
de los iones son seleccionadas para dar lugar a un precipitado que
tenga la proporción Ca/P deseada. El ión carbonato sustituye a un
ión fosfato en el fosfato de calcio amorfo. El fosfato de calcio
amorfo carbonatado puede ser obtenido mediante precipitación a
partir de una solución acuosa de carbonato. Las soluciones acuosas
de carbonato adecuadas incluyen, solamente a manera de ejemplo, una
solución de bicarbonato, una solución de carbonato de sodio, una
solución de carbonato de potasio. Se contempla además como dentro
del ámbito de la invención la utilización de soluciones no
acuosas.
La utilización de un material carbonatado es
deseable porque permite la manipulación de la proporción Ca/P por
la sustitución del PO_{4}^{3-} por el CO_{3}^{2-}.
Adicionalmente, se sabe que la presencia de CO_{3}^{2-} retrasa
el desarrollo de la cristalinidad en el fosfato de calcio amorfo. Es
reconocido, sin embargo, que otros iones o una mezcla de iones
pueden ser adecuados en lugar de, o además de, el ión carbonato
para modificar la proporción Ca/P y para introducir huecos en sitios
reactivos del fosfato de calcio amorfo, tal como, a manera de
ejemplo únicamente, iones nitrato, nitrito, acetato, Mg^{2+} y
P_{2}O_{7}^{4-}.
El precipitado de fosfato de calcio amorfo puede
ser recogido y filtrado antes de la activación. Se prefiere llevar
a cabo esta etapa en una cámara fría o a temperaturas por debajo de
la temperatura ambiente con el fin de conservar el estado amorfo
del precipitado recogido. La recogida puede ser llevada a cabo
típicamente mediante cualquier medio convencional incluyendo, pero
sin limitarse en absoluto a, filtración por gravedad, filtración en
vacío o centrifugación. El precipitado recogido es gelatinoso y es
lavado más de una vez con agua destilada.
El precipitado lavado es secado posteriormente
bajo cualquier condición que mantenga el carácter amorfo del
material. La liofilización es una técnica adecuada, pero no
exclusiva. El precipitado es congelado y, mientras se mantiene
congelado, es secado para eliminar la mayor parte del líquido
retenido. Este procedimiento puede ser realizado colocando el
precipitado congelado en una cámara de vacío durante un periodo de
tiempo dado. La liofilización tiene lugar típicamente a
temperaturas de nitrógeno líquido durante un tiempo en el rango de
12-78 horas, preferiblemente en 24 horas
aproximadamente, y bajo un vacío en el rango de
10^{-1}-10^{-4}, preferiblemente 10^{-2}
torr. Un método preferido incluye la liofilización, ya que las
temperaturas criogénicas utilizadas típicamente en la liofilización
inhiben la cristalización posterior del material. Como resultado,
el fosfato de calcio amorfo obtenido de este modo es un polvo
extremadamente fino que fluye libremente.
El ACP secado puede ser posteriormente activado.
En una realización preferida, cuando está presente carbonato en el
ACP, el polvo de ACP es calentado para expulsar el agua libre
restante y el agua de hidratación y para eliminar el carbono,
presumiblemente mediante la descomposición del CO_{3}^{2-} en
CO_{2} y oxígeno. La etapa de calentamiento se lleva a cabo a una
temperatura menor de 500-600ºC pero superior a
425ºC, con el fin de impedir la conversión del fosfato de calcio
amorfo en hidroxiapatita cristalina. El calentamiento es llevado a
cabo preferiblemente a una temperatura en el rango de
450-460ºC, preferiblemente durante un tiempo de 1/2
hora a 6 horas.
La baja cristalinidad y los huecos en sitios
reactivos (cambios de la porosidad y/o estequiométricos) pueden ser
la causa de la reactividad más elevada observada del fosfato de
calcio amorfo activado de la presente invención. Esto está
ejemplificado por las observaciones siguientes. Se observa que un
fosfato de calcio amorfo que contiene carbonato y que ha sido
calentado a 525ºC posee un incremento de la formación de
hidroxiapatita cristalina y tiene una disminución correspondiente
de la reactividad. El fosfato de calcio amorfo que es calentado
únicamente a 400ºC conserva su característica amorfa, pero presenta
una reactividad disminuida. Presumiblemente, esta disminución de la
reactividad está relacionada con los mayores niveles de carbonato (y
menos huecos en los sitios reactivos) observados mediante IR en las
muestras tratadas a esta temperatura más baja. Estos hallazgos
sugieren que la amorficidad y el contenido en carbono disminuido
(sitios reactivos libres) son un factor en la reactividad. Esto no
tiene la intención de ser en absoluto una base exclusiva de la
reactividad. Se considera que otras bases de la reactividad
observada están dentro del ámbito de la invención. El polvo de
fosfato de calcio amorfo resultante es un material de fosfato de
calcio amorfo altamente reactivo con una proporción Ca/P de entre
1,1-1,9, preferiblemente de 1,55 a 1,65
aproximadamente y muy preferiblemente de 1,58 aproximadamente. El
polvo ha sido caracterizado mediante una variedad de técnicas
analíticas.
En la Figura 1, se muestra una micrografía
electrónica de transmisión de alta resolución para mostrar las
características morfológicas y la naturaleza del tamaño en el orden
de Angstroms del fosfato de calcio amorfo reactivo preferido de la
presente invención. Los tamaños de partícula preferidos son menores
de 1000 \ring{A}, preferiblemente en el rango de
300-400 \ring{A}. Observar los límites poco
nítidos que separan las agrupaciones similares a glóbulos, carentes
de bordes y superficies claros, en contraste con los materiales
cristalinos.
La naturaleza amorfa del ACP reactivo de la
invención se caracteriza por un patrón de rayos X carente de picos
pronunciados en cualquier posición de los ángulos de difracción que
corresponden a los fosfatos de calcio cristalinos conocidos (Figura
4a). La medida de la Ca/P llevada a cabo utilizando análisis de
rayos X de longitud de onda dispersa en una microsonda electrónica
del mismo material después del tratamiento con calor hace que la
Ca/P sea de 1,58 (Figura 2).
Estas caracterizaciones demuestran que aunque
haya un cambio en el resto local de ciertos grupos de los sólidos
de fosfato de calcio amorfo, la amorficidad global se mantiene a lo
largo de todo el proceso.
En otra realización preferida, el fosfato de
calcio amorfo altamente reactivo se hace reaccionar con un segundo
fosfato de calcio para obtener un material de PCA. Según se discutió
anteriormente, la hidroxiapatita cristalina es el producto de
reacción termodinámicamente preferido, y se describe normalmente
como no reabsorbible bajo condiciones fisiológicas. La utilización
de un fosfato de calcio amorfo, que puede convertirse rápidamente y
completamente para producir una compuesto apatítico sin una
cristalización significativa, proporciona una nueva vía para un
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino que es
reabsorbible bajo condiciones fisiológicas.
El polvo de fosfato de calcio amorfo de la
presente invención puede ser mezclado con un promotor y convertirse
de este modo para formar un material de PCA. Esta reacción puede
tener lugar a temperatura ambiente después de la mezcla del polvo
con cualquiera de una variedad de fosfatos de calcio ácidos y
básicos en presencia de una cantidad limitada de un fluido tal
como, pero sin limitarse a, agua, solución salina, solución tampón,
suero o medio de cultivo de tejidos. Dependiendo de la cantidad de
fluido añadida, la mezcla de fosfato de calcio amorfo de la
presente invención y un segundo fosfato de calcio tiene como
resultado una pasta con una elevada moldeabilidad y/o una elevada
inyectabilidad con grados variables de consistencia de la pasta.
El método de preparación del promotor y/o del
ACP afectará a la facilidad mediante la cual el precursor hidratado
es convertido en el material de PCA. Según se indicó anteriormente,
el método de mezclado de los reactivos en polvo antes de la adición
del líquido afecta a la reactividad del sistema. De este modo, el
mezclado a mano utilizando un mortero y una mano de mortero no
tiene como resultado un sistema tan reactivo como una trituración
prolongada con una máquina de los polvos reactivos. Por tanto,
cuando se comparan promotores, es importante utilizar condiciones
de preparación estandarizadas.
Se hipotetiza que la conversión del ACP en el
fosfato de calcio PCA reactivo es un fenómeno catalizado por la
superficie. Si es así, puede ser deseable producir un promotor
particular con un área de la superficie reproducible. El área
específica de la superficie del polvo de ACP y del promotor puede
ser controlada con el fin de controlar las condiciones de reacción
y las propiedades del material de PCA final. De este modo, para
controlar la reproducibilidad de la reacción es ventajoso
proporcionar un promotor con una distribución de tamaños de grano
conocida. Las técnicas de tamizado estándar son adecuadas para la
selección de tamaños de grano específicos. Se ha demostrado que el
área de la superficie está correlacionada con la resistencia a la
compresión y, posiblemente, con la porosidad y la capacidad de ser
reabsorbido, del material de PCA.
Pueden utilizarse muchos compuestos que
contienen calcio o fosfato como promotores participantes en la
reacción de enducecimiento. Un promotor de fosfato de calcio puede
tener cualquier estructura cristalina y debe ser elegido para que
sea reactivo con el ACP directamente o mediante la utilización de
promotores intensificadores. Los promotores participantes
preferidos son aquéllos que tienden por sí mismos a experimentar la
conversión en hidroxiapatita a través de una fase de fosfato de
calcio PCA intermedia.
Los fosfatos de calcio apropiados para ser
utilizados como promotores con el ACP descritos en la presente
incluyen fosfatos de calcio neutros, básicos y ácidos,
preferiblemente fosfatos apatíticos, que proporcionan la
estequiometría apropiada para la reacción para obtener un fosfato de
calcio apatítico. En una realización preferida, se utiliza un
fosfato de calcio ácido (pH 5-7). Los fosfatos de
calcio adecuados incluyen, pero no se limitan en absoluto a,
metafosfato de calcio, fosfato dicálcico dihidrato, decafosfato
heptacálcico, fosfatos tricálcicos, pirofosfato de calcio
dihidrato, el material apatítico débilmente cristalino de la
invención, pirofosfato de calcio, fosfato octacálcico, fosfato
tetracálcico y ACPs adicionales. Otros sólidos que proporcionarían
una fuente de fosfato o de calcio tal como, a manera de ejemplo
solamente, CaO, CaCO_{3}, acetato de calcio y H_{3}PO_{4},
pueden ser mezclados para formar un producto final con el fin de
producir una proporción de Ca/P deseada próxima a
1,1-1,9 aproximadamente, preferiblemente de 1,3 a
1,5 aproximadamente. Puede ser deseable también proporcionar el
segundo componente en el estado amorfo o débilmente cristalino.
Algunos promotores de fosfato de calcio pueden
ser preparados como promotores débiles o como promotores potentes.
Por ejemplo, una muestra de DCPD con un tamaño de grano en el rango
de 100-125 \mum (o distribución B3 en el Ejemplo
5) reacciona sólo marginalmente con el ACP altamente reactivo de la
invención bajo ciertas condiciones (ver le Ejemplo 5). El DCPD de
este tamaño de grano puede ser considerado como "promotor
débil". Por tanto, el DCPD puede ser utilizado en este formato
para seleccionar ACPs altamente reactivos.
En algunas realizaciones de la invención, no se
requiere que la reacción emplee un segundo fosfato de calcio
participante para producir un material de PCA. En su lugar, está
dentro del ámbito de la invención estimular simplemente el
endurecimiento y la conversión del ACP reactivo en un material de
PCA mediante la adición de uno o más promotores "pasivos"
(denominados también promotores "no reactivos" o "no
participantes") que no participan en la reacción. Promotores
pasivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, materiales o
tratamientos que han sido descritos previamente como estimulantes
de la conversión de materiales de fosfato de calcio en
hidroxiapatita. Por ejemplo, pueden utilizarse como promotores
pasivos agua, calor, nucleadores y catalizadores. En algunas
realizaciones, los catalizadores proporcionan un área superficial,
cuya presencia estimula el endurecimiento y la conversión del ACP
en fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino. Por ejemplo,
Al_{2}O_{3}, mica, vidrio y arena son, entre otras cosas,
promotores pasivos útiles. En las realizaciones preferidas, se
emplean materiales promotores que son insolubles o que tienen una
baja solubilidad en agua, pueden ser preparados en forma granular
en el rango de 1-200 \mum de diámetro y son
reabsorbibles in vivo. Así, polímeros tales como el ácido
poli L-láctico (PLLA) y el ácido poliglicólico (PGA)
son promotores particularmente deseables.
Cuando se emplea como promotor un segundo
fosfato de calcio, el mismo es a menudo cristalino, según es puesto
en evidencia por la presencia de picos de difracción pronunciados
típicos del fosfato de calcio de interés en el patrón de difracción
de rayos X (Fig. 4b). En contraste, el ACP reactivo es amorfo y no
muestra picos identificables por difracción de rayos X (Fig. 4a). A
pesar de su mayor cristalinidad, sin embargo, la difracción de
rayos X sugiere que el difosfato dicálcico es consumido en la
reacción con el ACP reactivo y el producto material de PCA tiene
una cristalinidad mucho más reducida. De manera similar, cuando se
emplea HA estequiométrico como segunda fuente de fosfato de calcio,
es también consumido en la reacción y se produce un material de PCA
de cristalinidad reducida.
Como al menos uno de los reactivos es amorfo y
altamente reactivo, la reacción de formación de la presente
invención procede a, o por encima de, la temperatura ambiente para
proporcionar un material apatítico endurecido con una
microestructura débilmente cristalina o microcristalina. En las
realizaciones preferidas, la reacción de conversión es también
sustancialmente completa, asegurando de este modo que todo el calcio
y todo el fosfato de la mezcla sean consumidos por el producto PCA
resultante. Este resultado permite la producción fiable de
productos apatíticos simplemente por selección de las proporciones
relativas del fosfato de calcio amorfo de partida y del fosfato de
calcio secundario. Es deseable mantener una proporción de calcio
respecto a fosfato de 1,2-1,68 aproximadamente,
preferiblemente menor de 1,5 y, muy preferiblemente de 1,38
aproximadamente.
El producto material apatítico contiene entornos
lábiles característicos del hueso existente en la naturaleza. En el
hueso existente en la naturaleza, los minerales se caracterizan por
una estructura de tamaño nanométrico, proporcionando áreas
superficiales elevadas para interaccionar con el entorno tisular
circundante, teniendo como resultado la reabsorción y la
remodelación de los tejidos. La presente invención, con sus
cristales de tamaño nanométrico como producto, remeda estrechamente
los minerales óseos existentes en la naturaleza. Además,
propiedades tales como la cristalinidad y las proporciones Ca/P son
diseñadas cuidadosamente en la presente invención para simular las
propiedades de los minerales encontrados en los tejidos vivos del
hueso.
El PCA producido durante la reacción de la
invención está asociado con el endurecimiento del material precursor
hidratado. Debe señalarse, sin embargo, que aunque la conversión
completa del precursor ACP es una realización preferida, el
endurecimiento de los precursores hidratados puede tener lugar antes
de la conversión completa o incluso en ausencia de una conversión
completa. Se considera que tales reacciones de conversión parcial,
pero no obstante de endurecimiento, están dentro del ámbito de la
invención.
Según se mencionó anteriormente, la combinación
de ACP seco con cualquier otro reactivo y una cantidad limitada de
solución acuosa produce un precursor hidratado. Seleccionando la
cantidad de líquido apropiada para ser añadida a los reactivos,
puede ajustarse la viscosidad del mismo de acuerdo con la necesidad.
El precursor hidratado puede ser preparado con una consistencia
inyectable o modelable. Una consistencia inyectable significa tan
denso como sea posible mientras sea capaz de pasar a través de una
aguja de calibre 16 a 18. Muy a menudo, ésta será una consistencia
similar a la de la "pasta de dientes". Modelable se refiere a
una consistencia que permite al material conservar su forma. En el
caso extremo de una consistencia modelable, el precursor hidratado
tendrá la consistencia de una masilla de vidriero o de compuestos
para calafatear. El precursor hidratado puede ser también preparado
con un líquido suficiente para que sea a la vez inyectable y
modelable. En la forma de pasta, el material tiene características
de flujo notablemente mejoradas respecto a las composiciones de la
técnica anterior. Las características de flujo son similares a las
de la pasta de dientes, mientras que los materiales de la técnica
anterior presentan generalmente una consistencia granular o similar
a la harina de avena. El precursor hidratado puede ser preparado
antes de su utilización, hasta un periodo de varias horas si se
mantiene a temperatura ambiente y se minimiza la evaporación. El
tiempo de almacenamiento puede ser prolongado manteniendo la pasta
a temperaturas reducidas en el refrigerador en el rango de
1-10ºC, siempre que se lleven a cabo etapas para
minimizar la pérdida por evaporación.
En algunas realizaciones preferidas (por
ejemplo, Ejemplos 9-14 siguientes), la reacción es
endotérmica y tiene lugar lentamente a temperatura ambiente, pero
se acelera significativamente a la temperatura corporal. Esto es
particularmente útil en una situación quirúrgica, ya que la pasta
formada mezclando los reactivos con agua permanece inyectable
durante un periodo de tiempo considerable (hasta varias horas)
mientras es mantenida a, o por debajo de, la temperatura ambiente.
Por tanto, a temperatura ambiente (22ºC aproximadamente) la pasta
se endurece después de un tiempo mayor de una hora y permanece
modelable y/o inyectable durante más de 10 minutos, preferiblemente
durante más de una hora y, muy preferiblemente durante más de tres
horas. Después de la inyección en el lugar del implante (37ºC
aproximadamente), la pasta se endurece en menos de una hora
aproximadamente, preferiblemente en 10-30 minutos
aproximadamente.
El material de PCA de la presente invención
puede ser formado como un compuesto ("composite") con otras
sustancias. Los compuestos ("composites") pueden ser deseables
para cambiar cualquier número de parámetros físicos del vehículo
incluyendo, pero sin limitarse a, la potencia, el tiempo de
reabsorción, la adherencia, la inyectabilidad, las características
de fricción o la capacidad para transportar el agente terapéutico o
la cinética de liberación. En general, los expertos en la técnica
de la fabricación de compuestos comprenderán los métodos y conceptos
importantes en la fabricación de compuestos. Pueden obtenerse
directrices adicionales para la preparación de compuestos del
material de PCA en la solicitud de patente de Estados Unidos
copendiente titulada "Bioresorbable Ceramic Composites",
registrada en la misma fecha que la presente e incorporada a ésta
por referencia.
Además de la aplicación quirúrgica en forma de
plasta, los implantes de la invención pueden ser preformados fuera
del organismo, endurecidos e implantados en forma sólida. Los
dispositivos preformados pueden ser modelados a mano, moldeados o
maquinados. La carga del agente terapéutico puede ser realizada por
la adición del agente directamente al tampón o vehículo utilizado
para preparar el precursor hidratado. Alternativamente, después del
endurecimiento, el vehículo puede ser expuesto al agente terapéutico
utilizando métodos de revestimiento por inmersión, laminado o
pulverización.
Cualquier agente biológicamente útil puede ser
administrado desde el implante del material de PCA de la invención.
En general, el único requisito es que la sustancia permanezca activa
en presencia del material durante la fabricación o que sea capaz de
ser activada o reactivada posteriormente. Como la pasta de la
invención puede ser preparada con un gran número de vehículos
acuosos o sustituyentes, a las personas en la técnica les serán
familiares los aditivos específicos que pueden ser incluidos con el
fin de mejorar la estabilidad del agente. La estabilidad y/o la
compatibilidad de un agente particular con el material de la
invención, así como las estrategias de fabricación, pueden ser
analizadas empíricamente in vitro. Específicamente, el agente
puede ser incorporado al material de la invención mediante uno o
más de los métodos descritos en la presente. Después del
endurecimiento del vehículo a 37ºC, la sustancia puede ser lixiviada
desde el material a un medio de análisis tal como agua o un tampón
apropiado y el compuesto recogido a partir del material por difusión
al medio de análisis. El medio de análisis puede ser posteriormente
analizado para determinar la presencia del agente activo. En
algunos casos, el material será desmenuzado, pulverizado o
fragmentado de otro modo antes de ponerlo en contacto con el medio
de análisis. Otros medios de análisis que no requieren difusión del
agente, tales como el crecimiento de células sobre el material u
otros ensayos físicos, químicos o biológicos serán conocidos por
las personas con práctica en la profesión para compuestos
específicos.
Los agentes biológicamente activos utilizados en
la práctica de la presente invención son seleccionados del grupo de
proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, nucleoproteínas,
polisacáridos, glicoproteínas y análogos de los mismos sintéticos o
producidos biológicamente. Se incluyen también agentes químicos que
tengan efectos biológicos (por ejemplo, antibióticos, colorantes,
etc.). Las proteínas pueden ser preparadas mediante técnicas
sintéticas, bioquímicas o recombinantes. Preferiblemente, aunque no
necesariamente, el agente biológicamente activo es uno que haya
sido considerado seguro y eficaz para ser utilizado por una agencia
u organismo gubernamental apropiado. Por ejemplo, los fármacos
aprobados para uso humano en Estados Unidos están enumerados por la
Food and Drug Administration (FDA) bajo 21 C.F.R. \NAK\NAK
330.5, 331-361 y 440-460; los
fármacos aprobados para uso veterinario en Estados Unidos están
enumerados por la FDA bajo 21 C.F.R. \NAK\NAK
500-582.
El término "agente biológicamente activo"
incluye sustancias farmacológicamente activas que producen un efecto
local o sistémico en animales, plantas o virus. El término indica
por tanto cualquier sustancia destinada a ser utilizada en el
diagnóstico, la cura, el alivio, el tratamiento o la prevención de
una enfermedad o en la mejora del desarrollo y de condiciones
físicas o mentales deseables en animales, plantas o virus. El
término "animal" utilizado en la presente quiere indicar
mamíferos tales como primates (incluyendo humanos), ovejas,
caballos, ganado, cerdos, perros, gatos, ratas y ratones; aves;
reptiles; peces; insectos; arácnidos; protistas (por ejemplo,
protozoos) y bacterias procarióticas.
Las clases de compuestos biológicamente activos
que pueden ser cargados en el vehículo de administración de la
presente invención pueden ser seleccionadas del grupo que consta de
sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas,
inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos,
antiácidos, inmunosupresores, sustancias antivirales, inhibidores
enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos,
lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes
musculares y sustancias antipakinsonianas, antiespasmódicos y
contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes,
diuréticos, mióticos y anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma,
compuestos antiparasitarios y/o antiprotozoos, antihipertensivos,
analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios,
antihistamínicos, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo,
antinertígicas y antimareo causado por movimiento, anestésicos
locales, productos oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos,
sustancias antipsicóticas, antieméticos, agentes para la producción
de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos,
factores de crecimiento, inmunosupresores, inmunoactivadores,
antimitóticos, neurotransmisores, proteínas, modificadores de la
respuesta celular, vacunas, ácidos nucleicos, genes, fragmentos
génicos, secuencias reguladoras de genes (tales como promotores,
intensificadores u otros lugares reguladores), moléculas antisentido
y otros restos bioactivos o componentes de las rutas
biosintéticas.
biosintéticas.
Un listado más completo de las clases de
compuestos adecuados para ser cargados en los vehículos de
administración pueden encontrarse en la Pharmazeutische Wirkstoffe
(Von Kleemann y col. (eds.), Stuttgart, New York, 1987), o en
cualquiera de una variedad de libros de texto de farmacología
disponibles, tales como Lippincott's Illustrated Pharmacology
Reviews (Harvey y col. (eds.), J.B. Lippincott Co., Philadelphia,
1992) o en Examination & Board Review Pharmacology (Katzing y
col., Appleton & Lange, Connecticut, 1993), cada uno de los
cuales se incorpora a la presente por referencia. Ejemplos de
sustancias biológicamente activas particulares se presentan a
continuación:
Los factores angiogénicos son sustancias
que estimulan el crecimiento de la vasculatura e incluyen compuestos
tales como veg-f y algunos factores de
crecimiento y mitógenos.
Las sustancias anti-SIDA
son sustancias utilizadas para tratar o prevenir el Síndrome de
Deficiencia Autoinmune (SIDA). Ejemplos de tales sustancias
incluyen CD4,
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT),
9-(2-hidroxietoximetil)-guanina
(aciclovir), ácido fosfonofórmico, 1-adamantanamina,
péptido T y 2',3'-didesoxicitidina.
Las sustancias anticancerosas son
sustancias utilizadas para tratar o prevenir el cáncer. Ejemplos de
tales sustancias incluyen antimetabolitos (tales como, por ejemplo,
metotrexato, fluorouracilo, 5-fluorouracilo,
citarabina, mercaptopurina, 6-mercaptopurina,
6-tioguanina), antibióticos (tales como, por
ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina), agentes alquilantes (tales
como, por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, mostaza de
uracilo, busulfán, carmustina, lomustina), venenos del huso
mitótico (tales como, por ejemplo, vinblastina, vincristina),
hormonas (tales como, por ejemplo, hidroxiprogesterona, acetato de
medroxiprogesterona, acetato de megestrol, dietilestilbestrol,
propionato de testosterona, fluoximesterona) y otros agentes (tales
como, por ejemplo, vindesina, hidroxiurea, procarbazina,
aminoglutetimida, melfalán, clorambucilo, acarbazina (DTIC:
dimetiltriazenomidazol carboxamida), arabinóxido de citosina).
Los antibióticos son reconocidos en la
técnica y son sustancias que inhiben el crecimiento de, o destruyen,
microorganismos. Los antibióticos pueden ser producidos
sintéticamente o por microorganismos. Ejemplos de antibióticos
incluyen agentes bactericidas tales como aminoglucósidos (por
ejemplo, gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina,
amikacina, neomicina), bacitracina, carbapenems (por ejemplo,
imipenem/cislastatina), cefalosporinas, colistina, metenamina,
monobactámicos (por ejemplo, aztreonam), penicilinas (por ejemplo,
penicilina G, penicilina V, meticilina, nafcilina, oxacilina,
cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina,
ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina), polimixina B,
quinolonas y vancomicina; y agentes bacteriostáticos tales como
cloranfenicol, ciindamian, macrólidos (por ejemplo, eritromicina,
azitromicina, claritromicina), lincomian, nitrofurantoína,
sulfonamidas, tetraciclinas (por ejemplo, tetraciclina, doxiciclina,
minociclina, demeclocilina) y trimetoprim. Están también incluidos
metronidazol, fluoroquinolonas y ritampina. Los antibióticos son
proporcionados algunas veces en forma insoluble, la cual puede ser
utilizada cuando se desea una administración retardada.
Los agentes antivirales son sustancias
capaces de destruir o suprimir la replicación de los virus. Ejemplos
de agentes antivirales incluyen
a-metil-P-adamantano
metilamina,
1,-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3
carboxamida,
9-[2-hidroxi-etoxi]metilguanina,
adamantanamina,
5-yodo-2'-desoxiuridina,
trifluorotimidina, interferón y arabinósido de adenina. Agentes
particulares útiles en el tratamiento de los virus herpes incluyen
aciclovir, vidarabina, idoxuridina y ganciclovir.
Los inhibidores enzimáticos son
sustancias que inhiben una reacción enzimática. Ejemplos de
inhibidores enzimáticos incluyen cloruro de edrofonio,
N-metilfisostigmina, bromuro de neostigmina, sulfato
de fisostigmina, tacrina HCl, 1-hidroximaleato de
tacrina, yodotubercidina, p-bromotetramisol,
clorhidrato de
10-(alfa-dietilaminopropionil)-fenotiazina,
cloruro de calmidazolio,
hemicolinio-3,3,5-dinitrocatecol,
inhibidor I de la diacilglicerol quinasa, inhibidor II de la
diacilglicerol quinasa, 3-fenilpropargilamina,
acetato de
N^{6}-monometil-L-arginina,
carbidopa, 3-hidroxibencilhidrazina HCl,
hidralazina HCl, clorgilina HCl, deprenilo HCl,L(-)-, deprenilo
HCl,D(+)-, hidroxilamina HCl, fosfato de iproniazida,
6-MeO-tetrahidro-9H-pirido-indol,
nialamida, pargilina HCl, quinacrina HCl, semicarbazida HCl,
tranilcipromina HCl, clorhidrato de
N,N,-dietilaminoetil-2,2-difenilvalerato,
3-isobutil-1-metilxantina,
papaverina HCl, indometacina, clorhidrato de
2-ciclooctil-2-hidroxietilamina,
2,3-dicloro-a-metilbencilamina
(DCMB), clorhidrato de
8,9-dicloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-2-benzazepina,
p-aminoglutetimida, tartrato de
p-aminoglutetimida,R(+)-, tartrato de
p-aminoglutetimida,S(-)-,
3-yodotirosina,
alfa-metiltirosina,L-,
alfa-metiltirosina,DL-, acetazolamida,
diclorfenamida,
6-hidroxi-2-benzotiazolsulfonamida
y alopurinol.
Los neurotoxinas son sustancias que
tienen un efecto tóxico a través de su acción sobre el sistema
nervioso, por ejemplo sobre las células nerviosas. Las neurotoxinas
incluyen neurotoxinas adrenérgicas, neurotoxinas colinérgicas,
neurotoxinas dopaminérgicas, bloqueantes de los canales de calcio y
otras neurotoxinas. Ejemplos de neurotoxinas adrenérgicas incluyen
clorhidrato de
N-(2-cloroetil)-N-etil-2-bromobencilamina.
Ejemplos de neurotoxinas colinérgicas incluyen el clorhidrato de la
mostaza de acetiletilcolina. Ejemplos de neurotoxinas
dopaminérgicas incluyen 6-hidroxidopamina HBr,
clorhidrato de
1-metil-4-(2-metilfenil)-1,2,3,6-tetrahidro-piridina,
percolato de
1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio,
N-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahidropiridina
HCl, percolato de
1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridinio,
N-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahidropiridina
HCl, yoduro de
1-metil-4-fenilpiridinio.
Ejemplos de bloqueantes de los canales de calcio incluyen
\Omega-conotoxina y verapamilo.
Los opioides son sustancias con efectos
similares a los opiáceos que no derivan del opio. Los opioides
incluyen agonistas de opioides y antagonistas de opioides. Los
agonistas de opioides incluyen sulfato de codeína, citrato de
fentanilo, bitartrato de hidrocodona, loperamida HCl, sulfato de
morfina, noscapina, norcodeína, normorfina, tebaína. Los
antagonistas de opioides incluyen nor-binaltorfimina
HCl, buprenorfina, clornaltrexamina 2HCl, funaltrexamiona HCl,
nalbufina HCl, nalorfina HCl, naloxona HCl, naloxonazina, naltrexona
HCl y naltrindol HCl.
Los hipnóticos son sustancias que
producen un efecto hipnótico. Los hipnóticos incluyen pentobarbital
sódico, fenobarbital, secobarbital, tiopental y mezclas de los
mismos, hipnóticos heterocíclicos, dioxopiperidinas, glutarimidas,
dietil isovaleramida, a-bromoisovaleril urea,
uretanos y disulfanos.
Los antihistamínicos son sustancias que
inhiben competitivamente los efectos de la histamina. Ejemplos
incluyen pirilamina, clorfeniramina, tetrahidrazolina, etcétera.
Los lubricantes son sustancias que
incrementan la lubricidad del entorno en el cual son administradas.
Ejemplos de lubricantes biológicamente activos incluyen agua y
solución salina.
Los tranquilizantes son sustancias que
proporcionan un efecto tranquilizante. Ejemplos de tranquilizantes
incluyen clorpromazina, promazina, flufenazina, reserpina,
deserpidina y meprobamato.
Los anticonvulsivantes son sustancias que
tienen un efecto de prevención, reducción o eliminación de
convulsiones. Ejemplos de tales agentes incluyen primidona,
fenitoína, valproato, Chk y etosuximida.
Los antiinflamatorios son compuestos que
inhiben la inflamación. Tipos diferentes de fármacos
antiinflamatorios bloquean diferentes mediadores químicos. Ejemplos
de agentes antiinflamatorios incluyen fármacos antiinflamatorios no
esteroides (NSAIDS), tales como aspirina, fenilbutazona,
indometacina, sulindac, tolmetina, ibuprofeno, piroxicam,
fenamatos, que tienen actividades antiinflamatorias, analgésicas y
antipiréticas. Están también incluidos analgésicos no narcóticos
tales como acetaminofeno y fenacetina, aunque la actividad
antiinflamatoria de estos fármacos es más débil. Ciertos
antiinflamatorios de acción lenta tales como sales de oro,
cloroquina, D-penicilamina y metotrexato son útiles
en el tratamiento de la artritis. Los antiinflamatorios específicos
para la gota incluyen colchicina, alopurinol, probenecid y
sulfinpirazona.
Los relajantes musculares y los
agentes anti-Parkinsonianos son agentes que
relajan los músculos o reducen o eliminan los síntomas asociados
con la enfermedad de Parkinson. Ejemplos de tales agentes incluyen
mefenesina, metocarbamol, clorhidrato de ciclobenzaprina,
clorhidrato de trihexilfenidilo, levodopa/carbidopa y
biperideno.
Los antiespasmódicos y contracturantes
musculares son sustancias capaces de prevenir o aliviar los
espasmos o contracciones musculares. Ejemplos de tales agentes
incluyen atropina, escopolamina, oxifenonio y papaverina.
Los mióticos y anticolinérgicos
son compuestos que producen broncodilatación. Ejemplos incluyen
ecotiofato, pilocarpina, salicilato de fisostigmina,
diisopropilfluorofosfato, epinefrina, neostigmina, carbacol,
metacolina, betanecol, etcétera.
Los compuestos antiglaucoma incluyen
betaxalol, pilocarpina, timolol, sales de timolol y combinaciones
de timolol y/o sus sales con pilocarpina.
Los antiparasitarios, antiprotozoos y
antifúngicos incluyen ivermectina, pirimetamina,
trisulfapirimidina, clindamicina, anfotericina B, nistatina,
flucitosina, ketoconazol, fluconazol, natamicina, miconazol,
metronidazol, fluorato de diloxanida, paromomicina, clorquina,
emetina, deshidroemetina, estibogluconato de sodio (para la
leishmaniasis), melarsoprol (para la tripanosomiasis), nifurtimox
(para la tripanosomiasis), suramina (para la tripanosomiasis),
pentamidona (para la tripanosomiasis) y agentes antimalaria (tales
como, por ejemplo, primaquina, cloroquina, quinina, mefloquina,
pirimetamina y cloroguanida).
Los antihipertensivos son sustancias
capaces de contrarrestar la presión sanguínea elevada. Ejemplos de
tales sustancias incluyen alfa-metildopa y el éster
pivaloiloxietílico de la alfa-metildopa.
Los analgésicos son sustancias capaces de
prevenir, reducir o mitigar el dolor y los antipiréticos son
sustancias capaces de mitigar o reducir la fiebre. Ejemplos de tales
sustancias incluyen aspirina, fenilbutazona, indometacina,
sulindac, tolmetic, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofeno,
fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina y
nalorfina.
Los anestésicos locales son sustancias
que tienen un efecto anestésico en una región localizada. Ejemplos
de tales anestésicos incluyen procaína, lidocaína, tetracaína y
dibucaína.
Los agentes oftálmicos incluyen agentes
de diagnóstico tales como fluoresceína de sodio, rosa de bengala,
metacolina, adrenalina, cocaína y atropina. Los aditivos quirúrgicos
oftálmicos incluyen alfa-quimotripsina e
hialuronidasa.
Las prostaglandinas son conocidas en la
técnica y son una clase de hidroxiácidos grasos de cadena larga
químicamente relacionados existentes en la naturaleza, que tienen
una variedad de efectos biológicos.
Los antidepresivos son sustancias capaces
de prevenir o aliviar la depresión. Ejemplos de antidepresivos
incluyen imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina,
desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tranilcipromina,
fenelzina e isocarboxazida.
Las sustancias antipsicóticas son
sustancias que modifican el comportamiento psicótico. Ejemplos de
tales agentes incluyen fenotiazinas, butirofenonas y
tioxantenos.
Los antieméticos son sustancias que
previenen o alivian las nauseas o los vómitos. Un ejemplo de tales
sustancias incluye la dramamina.
Los agentes para la creación de imágenes
son agentes capaces de crear una imagen de un lugar deseado, por
ejemplo un tumor, in vivo. Ejemplos de agentes para la
producción de imágenes incluyen sustancias que tienen una marca que
es detectable in vivo, por ejemplo anticuerpos unidos a
marcas fluorescentes. El término anticuerpo incluye anticuerpos
completos o fragmentos de los mismos.
Los agentes vectorizantes específicos
incluyen agentes capaces de administrar un agente terapéutico en un
lugar deseado, por un ejemplo un tumor, y proporcionar un efecto
terapéutico. Ejemplos de agentes vectorizantes incluyen agentes que
pueden llevar toxinas u otros agentes que proporcionen efectos
beneficiosos. El agente vectorizante puede ser un anticuerpo unido
a una toxina, por ejemplo ricina A, o un anticuerpo unido a un
fármaco.
Los neurotransmisores son sustancias que
son liberadas por las neuronas tras una excitación y se desplazan
para inhibir o excitar una célula diana. Ejemplos de
neurotransmisores incluyen dopamina, serotonina, ácido
\gamma-aminobutírico, norepinefrina, histamina,
acetilcolina y epinefrina.
Los factores tróficos, factores de
crecimiento y modificadores de la respuesta celular son
factores cuya presencia continuada mejora la viabilidad o la
longevidad de una célula. En algunos casos, producen efectos
quimiotácticos o tienen efectos protectores frente a toxinas o
neurotoxinas, o frente a la neurodegeneración. Tales factores
adecuados incluye, pero no se limitan a, el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), la proteína activadora de
neutrófilos, la proteína quimoatrayente de monocitos, la proteína
inflamatoria de macrófagos, el factor plaquetario, la proteína
básica de plaquetas y la actividad estimulante del crecimiento de
melanomas; el factor de crecimiento epidérmico, el factor de
crecimiento transformante (alfa), el factor de crecimiento de
fibroblastos, el factor de crecimiento de células endoteliales
derivado de plaquetas, el factor de crecimiento similar a insulina,
el factor neurotrófico de crecimiento derivado de la glía, el factor
neurotrófico ciliar, el factor de crecimiento nervioso y el factor
inductor del crecimiento del hueso/cartílago (alfa y beta) u otras
proteínas morfogenéticas óseas.
Otros modificadores de la respuesta celular son
las interleuquinas, inhibidores de interleuquinas o receptores de
interleuquinas, incluyendo desde la interleuquina 1 hasta la
interleuquina 10; interferones, incluyendo alfa, beta y gamma;
factores hematopoyéticos, incluyendo eritropoyetina, factor
estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de
colonias de macrófagos y factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos; factores de necrosis
tumoral, incluyendo alfa y beta; factores de crecimiento
transformantes (beta), incluyendo beta-1,
beta-2, beta-3, inhibina y activina;
y proteínas morfogenéticas óseas tales como OP-1,
BMP-2 y BMP-7.
Las hormonas incluyen estrógenos (tales
como, por ejemplo, estradiol, estrona, estriol, dietilestilbestrol,
quinestrol, clorotrianiseno, etinil estradiol, mestranol),
antiestrógenos (tales como, por ejemplo, clomifeno, tamoxifeno),
progestinas (tales como, por ejemplo, medroxiprogesterona,
noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), antiprogestina
(mifepristona), andrógenos (tales como, por ejemplo, cipionato de
testosterona, fluoximesterona, danazol, testolactona) y
antiandrógenos (tales como, por ejemplo, acetato de ciproterona,
flutamida). Las hormonas son utilizadas comúnmente para la terapia
de sustitución hormonal y/o con fines anticonceptivos. Las hormonas
esteroideas, tales como la prednisona, son también utilizadas como
inmunosupresores y antiinflamatorios. La administración de hormonas
esteroideas puede ser retardada mediante esterificación. Las
hormonas tiroideas incluyen triyodotironina, tiroxina,
propiltiouracilo, metimazol y yodixoda. Las hormonas hipofisarias
incluyen corticotropina, somatotropina, oxitocina y
vasopresina.
Los ácidos nucleicos son moléculas,
incluyendo moléculas de ADN o ARN, que contienen uno o más
nucleósidos y/o nucleótidos. Como se sabe que los compuestos de
calcio estimulan la transfección celular y la captación de ADN en
algunos sistemas, se anticipa que la reabsorción del presente
dispositivo de administración puede mejorar la eficacia de la
transfección. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser
administradas como vacunas o, por ejemplo, como agentes
antisentido. Alternativamente, pueden prepararse moléculas de ADN
para utilización en terapia génica, en la cual las moléculas pueden
corregir o compensar errores genéticos en las células en las cuales
se van a introducir las moléculas de ADN.
En la técnica se conocen protocolos y regímenes
estándar para la administración de los agentes anteriormente
enumerados. Típicamente, estos protocolos están basados en la
administración oral o intravenosa. Hasta el punto que la presente
invención proporciona modos alternativos de administración, puede
ser apropiada una modificación de estos protocolos.
Los agentes biológicamente activos son
introducidos en un vehículo de administración proporcionado por el
material de PCA de la presente invención durante o después de su
formación (ver los Ejemplos 20-21). Los agentes
pueden ser convenientemente mezclados en la pasta antes del
endurecimiento. Alternativamente, el vehículo puede ser modelado y
endurecido y expuesto posteriormente al agente terapéutico en
solución. Este procedimiento particular es particularmente muy
adecuado con proteínas, que se sabe que tienen afinidad por los
materiales apatíticos. Puede emplearse una solución tampón que
contenga el agente biológicamente activo, en lugar de agua, como
solución acuosa en la cual el fosfato de calcio amorfo es convertido
en el material apatítico sintético, débilmente cristalino, de la
presente invención. Pueden utilizarse tampones en cualquier rango de
pH, pero muy a menudo serán utilizados en el rango de 5,0 a 8,0. En
las realizaciones preferidas, el pH será compatible con la
estabilidad prolongada y la eficacia del agente terapéutico deseado
y, en las realizaciones más preferidas, estará en el rango de 5,5 a
7,4. Los tampones adecuados incluyen, pero no se limitan a,
carbonatos, fosfatos (por ejemplo, solución salina tamponada con
fosfato) y tampones orgánicos tales como Tris, HEPES y MOPS. Muy a
menudo, el tampón será seleccionado por su biocompatibilidad con los
tejidos del huésped y por su compatibilidad con el agente
terapéutico. Para la mayoría de las aplicaciones de ácidos
nucleicos, péptidos o antibióticos bastará una simple solución
salina tamponada con fosfato.
Los agentes biológicamente activos son
introducidos en el vehículo en cantidades que permiten la
administración de una dosis apropiada del agente al lugar del
implante. En la mayoría de los casos, las dosificaciones se
determinan utilizando directrices conocidas por los expertos y
aplicables al agente particular en cuestión. Para aquellos agentes
que se unen a un receptor, se prefiere generalmente conseguir
niveles locales 1-2 veces mayores aproximadamente
que la constante de disociación del complejo
receptor-agente. Los niveles de carga, el tamaño
del dispositivo y las propiedades de reabsorción pueden ser
determinadas empíricamente mediante la utilización de modelos
animales y de estudios de eficacia en humanos, como es común en la
industria farmacéutica.
Una de las ventajas del presente material para
administración, en comparación con los dispositivos cerámicos en
general, y con los materiales de fosfato de calcio en particular, es
que puede ser formado bajo condiciones de reacción suaves. Por
ejemplo, aunque las cerámicas basadas en fosfato de calcio (por
ejemplo hidroxiapatitas) han sido estudiadas extensamente como
materiales potenciales para la administración de fármacos debido a
su biocompatibilidad y a su afinidad conocida por los agentes
proteicos, tales materiales son preparados típicamente en procesos
que requieren tener efectos nocivos sobre muchos agentes
terapéuticos. Por ejemplo, algunos métodos requieren la
sinterización por encima de 500ºC, otros requieren la utilización de
condiciones ácidas y otros más requieren periodos prolongados de
tiempo para que se formen cristales conteniendo el agente
terapéutico. En contraste, el presente vehículo para la
administración de fármacos de PCA sintético puede ser preparado a
temperatura ambiente y a pHs fisiológicamente relevantes (ver el
Ejemplo 4). Por consiguiente, una amplia variedad de materiales
biológicamente activos que podrían ser destruidos durante la
preparación de los materiales de fosfato de calcio estándar puede
ser incorporada al material para la administración de fármacos de la
presente invención. Los agentes proteicos en particular son a
menudo sensibles al calor y a otras condiciones desfavorables. El
presente material de PCA sintético constituye por tanto un sistema
de administración de agentes proteicos particularmente
mejorado.
Una ventaja del material de PCA de la presente
invención es que la velocidad de reabsorción del material puede ser
modulada mediante modificaciones de los métodos preparativos.
Específicamente, los métodos que dan lugar a un producto endurecido
más denso tendrán generalmente como resultado un tiempo de
reabsorción más lento del fosfato de calcio PCA de la invención
puro in vivo. A este respecto, hay una variedad de formas
para alterar la densidad o la cinética de reabsorción del producto
endurecido. Éstas incluyen el ajuste del volumen de líquido
utilizado para crear la pasta, la alteración del tamaño de grano de
los materiales de partida y la compresión de la pasta durante el
endurecimiento. Pueden prepararse también compuestos
("composites"), en los cuales se incorporan a la pasta
partículas o materiales lixiviables o biodegradables, y finalmente
el material de PCA endurecido. Los materiales lixiviables o
biodegradables pueden ser posteriormente eliminados (por ejemplo
mediante lixiviación) del material endurecido in vivo, de tal
manera que se produzca un implante muy poroso. Adicionalmente, el
material de PCA de la invención puede ser preparado con una
distribución de densidades dentro del mismo implante. Una forma en
la que esto puede ser realizado es mediante la preparación de un
material de PCA endurecido in vitro de una densidad, la
pulverización del material endurecido hasta un tamaño de grano
deseado y la mezcla posterior del material pulverizado con una
segunda pasta de material de PCA diseñada para producir un material
de PCA de densidad diferente. Los materiales de PCA producidos de
esta forma se reabsorberán asincrónicamente.
La utilización de un material de tamaño de grano
total más pequeño para preparar el polvo precursor del material de
PCA tiene como resultado un tiempo mayor de reabsorción y/o
reosificación in vivo (ver los Ejemplos 5 y 19). Como el
precursor ACP es generalmente preparado con un tamaño de grano muy
pequeño, cuando se utilizan dos componentes para producir el
vehículo de la invención, el tamaño de grano del otro componente que
no es ACP es utilizado generalmente para ajustar el tiempo de
reabsorción. A este respecto, el tamaño de grano puede ser ajustado
mediante la utilización de un segundo componente triturado y
tamizado para seleccionar una distribución específica de tamaños de
grano para la adición a la mezcla final. En otra realización, el
segundo componente es triturado con el ACP durante cantidades
variables de tiempo para influir sobre la velocidad de
reabsorción.
Los materiales compuestos ("composites")
con una cinética de reabsorción alterada son producidos mediante la
incorporación al material de PCA de un "modificador de la
velocidad de erosión", que es un material cuya presencia altera
la velocidad de reabsorción del dispositivo en su totalidad. Los
modificadores de la velocidad de erosión que incrementan la
velocidad a la cual se reabsorbe el dispositivo para la
administración de fármacos, incluyen cualquier compuesto lixiviable
o biodegradable que afecte a la solubilidad (por ejemplo alterando
la porosidad) del dispositivo a lo largo del tiempo in vivo.
Los modificadores de la velocidad de erosión que disminuyen la
velocidad a la cual se reabsorbe el dispositivo para la
administración de fármacos, incluyen fosfatos de calcio
cristalinos, particularmente hidroxiapatita, y compuestos
difosfato.
Otra forma en la que puede ser modulada la
velocidad de reabsorción del material de PCA de la invención es
mediante la acción de células osteoclásticas y/o macrófagos. Los
osteoclastos, y posiblemente los macrófagos, digieren el hueso de
forma natural. De acuerdo con la presente invención, las células
osteoclásticas o los macrófagos, o factores que modulen su
desarrollo y/o actividad, pueden ser administrados junto con un
implante del material de PCA de la invención con el fin de acelerar
o retrasar la velocidad de reabsorción del material de PCA.
Por ejemplo, puede emplearse cualquier agente
que estimule directamente o indirectamente (por ejemplo, a través
de los osteoblastos) la actividad o el desarrollo osteoclástico con
el fin de incrementar la velocidad de reabsorción de un implante de
material de PCA. A la inversa, puede emplearse cualquier agente que
inhiba directamente o indirectamente la velocidad o el desarrollo
osteoclástico con el fin de reducir la velocidad de reabsorción de
un implante. Tales agentes estimulantes e inhibidores son bien
conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Athanasou, J. Bone Joing
Surg., 78-A:1096, 1996 y Roodman Endocrine Rev.
17:308, 1996, cada una de las cuales se incorpora a la presente por
referencia). Por ejemplo, se sabe que la
interleuquina-1 (IL-1), los factores
estimulantes de colonias (CSFs) tales como el CSF-(M) de
macrófagos, el factor de crecimiento transformante a (TGFa), el
factor de necrosis tumoral (TNF), la interleuquina-6
(IL-6), la interleuquina-11
(IL-11), la interleuquina-3
(IL-3), la hormona paratiroidea (PTH), metabolitos
de la vitamina D3 (por ejemplo, calcitriol), las prostaglandinas
(bajo ciertas condiciones conocidas) y los radicales libres de
oxígeno estimulan el desarrollo y/o la actividad osteoclástica.
Cuando se utilizan CSFs, la administración posterior de
1,25-dihidroxivitamina D_{3} puede estimular
adicionalmente los osteoclastos; en contraste, la administración
concomitante de factores estimulantes de colonias y
1,25-dihidroxivitamina D_{3} inhibe los
osteoclastos.
osteoclastos.
\newpage
Otros factores que inhiben el desarrollo y/o la
actividad osteoclástica incluyen el factor de crecimiento
transformante \beta (TGF\beta), el
interferón-\gamma, la
interleuquina-4 (IL-4), el óxido
nítrico, anticuerpos contra, por ejemplo, el receptor de
vitronectina de los osteoclastos, la calcitonina y las
prostaglandinas (bajo ciertas condiciones conocidas).
Por supuesto, es también posible introducir los
propios osteoclastos (o células precursoras de osteoclastos,
preferiblemente en combinación con agentes que estimulen su
diferenciación en osteoclastos) en un implante de material de PCA
con el fin de estimular su reabsorción.
Los agentes que alteran la velocidad de
reabsorción del material de PCA pueden ser administrados
sistémicamente o localmente. La administración local se realiza
preferiblemente introduciendo el agente en, o asociando el agente
con, el propio material, preferiblemente de acuerdo con los
procedimientos aquí descritos. Cuando se emplea administración
local, es preferible que se minimice la difusión del agente lejos
del implante del material de PCA. Por ejemplo, se prefieren agentes
relativamente insolubles ya que menos probable que se difundan lejos
del implante y ejerzan efectos indeseables sobre otras células del
organismo.
Por ejemplo, el material puede ser utilizado
para administrar los agentes biológicamente activos a una variedad
de lugares de un organismo (preferiblemente un organismo humano,
aunque son también posibles aplicaciones veterinarias).
Alternativamente o adicionalmente, el material puede ser utilizado
en tejido óseo o en aplicaciones de reparación o en terapia
plástica de aumento in vivo. El material puede ser también
empleado como una membrana o matriz de encapsulación de células, o
en la construcción o reparación de un órgano artificial.
In vitro, el material puede ser utilizado
como una matriz para el cultivo de células tridimensional, y como
modelo para analizar cultivos de osteoclastos, osteoblastos,
condrocitos y/o macrófagos, la diferenciación de células
progenitoras y/o la reosificación y la reabsorción de fosfato de
calcio. El material es particularmente útil para estudios de
formación y/o degradación de tejidos, por ejemplo empleando células
tales como células progenitoras, células madre, osteocitos,
osteoclastos, osteoblastos, condrocitos, macrófagos, mioblastos y
fibroblastos. El material puede ser también empleado para realizar
la administración in vitro de un agente biológicamente
activo.
Ciertas aplicaciones preferidas se discuten con
más detalle posteriormente, pero la discusión está destinada
únicamente a servir como ejemplo y no tiene la intención de ser
limitante.
Cuando se utiliza como un vehículo de
administración in vivo o in vitro, el material de PCA
de la presente invención ofrece la ventaja de una administración
controlada, localizada. Como es bien conocido, se requieren
cantidades menores de agente biológicamente activo cuando el agente
es administrado en un lugar específico en lugar de ser administrado
sistémicamente. Además, los efectos tóxicos colaterales potenciales
del agente se minimizan cuando el agente es administrado a partir
del vehículo de administración de la presente invención. Además, la
actividad del agente es maximizada ya que el mismo está protegido
dentro del vehículo de administración hasta que es administrado a
su lugar.
El material de PCA de la presente invención
puede ser inyectado o implantado en cualquier tejido aceptable. Las
formulaciones orales están también consideradas dentro del ámbito de
la invención. Los lugares de administración preferidos incluyen
lugares en hueso, músculo, médula espinal, sistema nervioso central,
cavidad intraperitoneal, localizaciones subcutáneas y el humor
vítreo y acuoso del ojo. Cuando el material de PCA es administrado a
un sitio bajo circunstancias en las que la migración del implante
es una preocupación, pueden incorporarse al vehículo suturas o
ganchos de anclaje de tal manera que pueda ser fijado y mantenido en
posición. Cuando sea apropiado, el material de PCA puede ser
anclado mediante inserción en un lugar óseo (ver más adelante). Las
aplicaciones particulares y los lugares de administración preferidos
se discuten con más detalle a continuación:
El material de PCA de la presente invención
tiene ventajas particulares para administrar agentes biológicamente
activos a lugares de un hueso. La implantación de un vehículo de
administración formado a partir del material de PCA de la presente
invención en un sitio óseo puede ser utilizada alternativamente o
adicionalmente para anclar un vehículo de administración y llevar a
cabo la administración sistémica de un fármaco, o puede ser
utilizada para llevar a cabo la administración a un lugar adyacente
a, aunque no literalmente "en", el hueso. La Figura 9 describe
muchas aplicaciones útiles del material de PCA de la presente
invención en lugares óseos.
El mineral óseo existente en la naturaleza está
compuesto por fosfato de calcio débilmente cristalino, de un tamaño
de nanometros, con estructura apatítica. Sin embargo, a diferencia
de la hidroxiapatita cristalina estequiométrica ideal,
Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}, con
una proporción atómica de Ca/P de 1,67, la composición del mineral
óseo es significativamente diferente y puede ser representada por la
fórmula siguiente:
Ca_{8,3}(PO_{4})_{4,3}(HPO_{4}, \
CO_{3})_{1,7}(OH,
CO_{3})_{0,3}.
\newpage
El mineral óseo no estequiométrico es debido
principalmente a la presencia de iones divalentes, tales como
CO_{3}^{2-} y HPO_{4}^{2-}, que sustituyen a los iones
PO_{4}^{3-} trivalentes. La sustitución por los iones
HPO_{4}^{2-} y CO_{3}^{2-} produce un cambio en la
proporción Ca/P, teniendo como resultado una proporción Ca/P que
puede variar entre 1,50 y 1,70, dependiendo de la edad y del lugar
óseo. Generalmente, la proporción Ca/P aumenta durante el
envejecimiento del hueso, sugiriendo que la cantidad de la especie
carbonato aumenta típicamente en los huesos más viejos. Es la
proporción Ca/P junto con el tamaño nanocristalino y la naturaleza
débilmente cristalina, lo que produce la propiedad de solubilidad
específica de los minerales óseos. Y como los tejidos óseos
experimentan una reparación tisular constante regulada por las
células que reabsorben minerales (osteoclastos) y las células que
producen minerales (osteoblastos), el comportamiento de solubilidad
de los minerales es importante para mantener un equilibrio
metabólico delicado entre estas actividades celulares.
El material de PCA de la presente invención es
un sólido de nanotamaño, débilmente cristalino, con una proporción
Ca/P comparable a la de los minerales óseos naturales. El material
es biorreabsorbible, puede ser producido a bajas temperaturas y es
fácilmente modelable e inyectable. Por todas estas razones, el
material de la invención es particularmente muy adecuado para la
administración de fármacos en lugares óseos. Además, este material
de PCA sintético puede soportar el crecimiento óseo por lo que
finalmente es sustituido por el propio hueso del paciente. Debe
tenerse en cuenta, sin embargo, que el crecimiento óseo puede
afectar mucho a la velocidad de reabsorción del material para la
administración de fármacos de la presente invención. Por
consiguiente, puede ser deseable en ciertas circunstancias (por
ejemplo, cuando el agente biológicamente activo debe ser
administrado de acuerdo con una pauta de administración precisa,
predeterminada) reducir el crecimiento óseo en el vehículo para la
administración de fármacos, por ejemplo mediante el bloqueo de la
penetración de células osteocíticas o condrocíticas o de
precursores. En la mayoría de las circunstancias, la osificación
puede ser evitada colocando el dispositivo a cierta distancia del
hueso. En general, será suficiente 1 mm, aunque se prefieren
distancias mayores. Además, compuestos tales como el gen erizo indio
y sus productos génicos, la proteína relacionada con la hormona
paratiroidea (PTHRP) y agonistas del receptor de la PTHRP pueden ser
incluidos en, sobre o adyacentes al dispositivo para la
administración de fármacos con el fin de evitar el crecimiento
óseo.
En otras circunstancias, tal crecimiento del
hueso puede ser estimulado de forma deseable. Según se muestra en
los Ejemplos 14, 17 y 18, el material de fosfato de calcio PCA puede
colocarse en lugares óseos y dejar que se reabsorba de tal manera
que tenga como resultado su sustitución completa (100%) aparente por
hueso nuevo. Cuando se desea una osificación óptima, los
dispositivos y objetos pueden ser sembrados con células formadoras
de hueso (ver más adelante). Este objetivo se consigue muy
fácilmente colocando el dispositivo en contacto con una fuente de
las propias células formadoras de hueso del paciente. Tales células
pueden ser encontradas en el tejido óseo o en la sangre o fluidos
asociados con el hueso, incluyendo fluidos exógenos que hayan
estado en contacto con el hueso o con materiales o regiones óseas,
incluyendo el periostio, el hueso canceloso o la médula. En el caso
de dispositivos tales como tornillos y agujas, cuya introducción en
el hueso está acompañada por sangrado, no se requiere una siembra
adicional. Para placas, que implican solamente al hueso cortical,
se recomienda la inducción de una lesión en el periostio que
contactará con el dispositivo. En otras realizaciones más, será
útil preparar quirúrgicamente un alojamiento dentro del hueso
mediante la extracción de una porción del hueso cortical en el
lugar del implante. Pueden llevarse a cabo también otras etapas
para aumentar la osificación, incluyendo la introducción en el
injerto de células formadoras de hueso recogidas del paciente, o la
incorporación de factores tróficos o de proteínas inductoras del
crecimiento óseo en o sobre el dispositivo. Células óseas no
autólogas están también dentro del ámbito de la invención si la
cantidad deseada de regeneración ósea tiene lugar antes del rechazo
por el huésped de las células formadoras de hueso. A este respecto,
pueden administrarse inmunosupresores al receptor del dispositivo,
en algunos casos mediante incorporación al dispositivo. Por tanto,
células o tejidos obtenidos de fuentes primarias, líneas celulares
o bancos de células pueden ser todos útiles en ciertas
realizaciones.
Se espera que ciertas categorías de agentes
biológicamente activos sean particularmente adecuadas para la
administración a lugares óseos. Por ejemplo, cuando el vehículo para
la administración de fármacos es aplicado a un lugar óseo
lesionado, puede ser deseable incorporar al vehículo proteínas
regeneradoras óseas (BRPs). Se ha demostrado que las BRPs
incrementan la tasa de crecimiento óseo y aceleran la cicatrización
del hueso (ver, por ejemplo, Appel y col., Exp. Opin. Ther. Patents
4:1461, 1994). BRPs ejemplares incluyen, pero no están limitadas en
absoluto a, el Factor de Crecimiento Transformante Beta
(TGF-\beta), Factores de Fijación Celular (CAFs),
Factores de Crecimiento Endotelial (EGFs), OP-1 y
Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs). Tales BRPs están siendo
desarrolladas actualmente por el Genetics Institute, Cambridge, MA;
Genentech, Palo Alto, CA y Creative Biomolecules, Hopkinton, MA.
Pueden utilizarse también proteínas regeneradoras óseas y factores
tróficos para estimular la formación de huesos ectópicos, si se
desea. El material de PCA conteniendo BMP-7 puede
ser colocado subcutáneamente, y la formación de hueso tendrá lugar
en 1-2 meses.
Antibióticos y antisépticos son también
administrados deseablemente a lugares óseos. Por ejemplo, una de las
principales implicaciones clínicas que proceden de la cirugía de
injertos óseos, es la necesidad de controlar la inflamación o la
infección post-operatorias, particularmente la
infección asociada con osteomielitis. Una realización de un
dispositivo para la administración de fármacos, que incluya un
antibiótico, podría ser utilizada como (o conjuntamente con) un
injerto óseo mejorado para reducir las probabilidades de infección
local en el lugar de la cirugía, contribuyendo a un proceso de
cicatrización ósea libre de infección, y por tanto mas rápido. La
eficacia de los antibióticos es incrementada además mediante el
control de la reabsorción de la hidroxiapatita débilmente
cristalina, de tal manera que se disuelve a una velocidad que
administra los péptidos antibióticos o su componente activo al
lugar de reparación tisular, a la dosis más eficaz.
Ejemplos de antibióticos incluyen, pero no se
limitan en absoluto a, penicilina, tetraciclina, kanamicina,
gentamicina, clorhidrato de clortetraciclina (aureomicina),
minocilina, dosicilina, vancomicina, bacitracina, neomicina,
eritromicina, estreptomicina, cefalosporinas, cloranfenicol,
oxitetraciclina (terramicina) y derivados de los mismos. Los
antibióticos y las proteínas regeneradoras de hueso pueden ser
incorporados juntos en el material de PCA para administrar
localmente la mayor parte o todos los componentes necesarios para
facilitar las condiciones óptimas de reparación del tejido
óseo.
Otros agentes biológicamente activos que son
administrados deseablemente a lugares óseos incluyen agentes
anticancerosos, por ejemplo para el tratamiento de tumores óseos
(ver, por ejemplo, Otsuka y col., J. Pharm. Sci. 84:733, 1995). El
vehículo para administración de fármacos de la presente invención es
particularmente útil, por ejemplo, cuando se ha extraído a un
paciente quirúrgicamente un tumor óseo, ya que el material de PCA
sintético de la presente invención puede mejorar la integridad
mecánica del lugar óseo a la vez de tratar también las células
cancerosas remanentes con el fin de evitar la metástasis. Ejemplos
de agentes anticancerosos incluye, por ejemplo, metotrexato,
cisplatino, prednisona, hidroxiprogesterona, acetato de
medroxiprogesterona, acetato de megestrol, dietilestilbestrol,
propionato de testosterona, fluoximesterona, vinblastina,
vincristina, vindesina, daunorrubicina, doxorrubicina, hidroxiurea,
procarbazina, aminoglutetimida, mecloretamina, ciclofosfamida,
melfalán, mostaza de uracilo, clorambucilo, busulfán, carmustina,
lomuslina, dacarbazina (DTIC: dimetiltriazenomidazol carboxamida),
fluorouracilo, 5-fluorouracilo, citarabina,
arabinósido de citosina, mercaptopurina,
6-mercaptopurina, tioguanina.
Agentes biológicamente activos adicionales que
pueden ser incorporados deseablemente al sistema de administración
de fármacos de PCA sintético de la presente invención para
administración a lugares óseos, son agentes que mitigan la
osteoporosis. Por ejemplo, se ha demostrado que la calcitonina de
salmón amidada es eficaz contra la osteoporosis.
La Vitamina D y la Vitamina K son también
administradas deseablemente a lugares óseos, igual que factores
angiogénicos tales como veg-f, que pueden ser
utilizados cuando es deseable incrementar la vascularización.
Por supuesto, la aplicación del presente
dispositivo para la administración de fármacos no se limita a
lugares óseos. Se sabe que en lugares no óseos, el dispositivo se
reabsorbe sin osificación.
La colocación del presente dispositivo de
administración subcutáneamente es particularmente útil para la
administración sistémica de compuestos biológicamente activos. La
administración de estrógenos y/o progesteronas para ser utilizados
en el control de la fertilidad es un ejemplo de una aplicación
subcutánea. Adicionalmente, la administración de antígenos y/o
vacunas puede ser realizada mediante implantación subcutánea.
La administración de sustancias terapéuticas al
sistema nervioso central puede ser llevada a cabo con los vehículos
para administración de la invención. Sustancias terapéuticas útiles
incluyen la administración de ácido
\gamma-aminobutírico a focos epilépticos, la
administración de L-dopa o de dopamina al estriado o
a la sustancia nigra para el tratamiento de la enfermedad de
Parkinson, la administración de factores de crecimiento para
prevenir la degeneración neural tal como GDNF en los ventrículos
laterales, el estriado o la sustancia nigra para el tratamiento de
la enfermedad de Parkinson, la administración de NGF a la región
cortical y a otras regiones para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer o la administración de CNTF a la médula espinal sacra o
lumbar para el tratamiento de la esclerosis amielolateral.
Otros lugares de administración potenciales
incluyen áreas intramusculares, intraperitoneales y oculares.
Este ejemplo describe la preparación etapa a
etapa y los métodos para convertir sólidos de fosfato de calcio
amorfo relativamente inerte en un fosfato de calcio amorfo altamente
reactivo de la presente invención.
La Solución A se preparó a temperatura ambiente
mediante la disolución rápida de 55 g de
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O (fosfato de sodio), 50 g de NaOH
(hidróxido de sodio), 30 g de NaHCO_{3} (bicarbonato de sodio) y 2
g de Na_{4}P_{2}O_{2}\cdot10H_{2}O en 1,3 l de agua
destilada. La Solución B fue preparada a temperatura ambiente
mediante la disolución rápida de 43 g de
Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O (nitrato de calcio
tetrahidrato) y 1 g de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O en 0,5 l de agua
destilada.
El fosfato de calcio amorfo carbonatado inerte
fue preparado posteriormente a temperatura ambiente mediante la
adición rápida de la Solución B a la Solución A agitada rápidamente.
El precipitado de fosfato de calcio amorfo similar a un gel así
formado fue filtrado inmediatamente utilizando papel de filtro (0,05
m cuadrados) con velocidad media de filtrado y una presión de vacío
de 10^{-2} torr aproximadamente. El material formaba una pasta
poco espesa y fue lavado con 4 litros aproximadamente de agua
destilada mediante la adición del agua al embudo de filtración. El
material lavado fue recogido posteriormente utilizando una espátula
y sumergido en nitrógeno líquido en un recipiente de 2,5 litros.
Después de la formación de fragmentos congelados duros, el
recipiente fue transferido a una cámara de vacío durante 24 horas
(10^{-1} - 10^{-2} torr), hasta que se obtuvo un polvo fino y
seco.
Aunque el procedimiento anteriormente descrito
puede ser realizado a temperatura ambiente, el proceso completo
tiene lugar preferiblemente por debajo de la temperatura ambiente
(4-5ºC) con el fin de impedir además que el estado
amorfo se convierta en una forma cristalina más estable. Además,
pueden añadirse a la solución en cantidades traza elementos tales o
iones que se sabe que actúan como inhibidores de la formación de
hidroxiapatita cristalina.
Un espectro infrarrojo del material amorfo
inerte en este punto del proceso contiene picos característicos de
los grupos P-O (600 y 1000 cm^{-1}), del grupo
CO_{3}^{2-} (1.420-1.450 cm^{-1}) con un pico
relativamente grande del grupo O-H (\sim3.550
cm^{-1}). El patrón de difracción de rayos X del mismo material
muestra la naturaleza amorfa del material según se demuestra por la
ausencia de picos pronunciados cuando se determina la medida de la
cristalinidad tomando la proporción de los picos coherentes respecto
al fondo.
El material amorfo inerte anteriormente descrito
fue convertido posteriormente en una forma reactiva mediante
calentamiento durante 60 minutos a 450ºC (\pm3ºC). El IR del
material calentado (no mostrado) muestra la reducción de grupos
O-H y CO_{3}^{2-} particulares, indicando la
reducción significativa de H_{2}O y CO_{3}^{2-} como CO_{2}
y H_{2}O. En muestras preparadas de forma similar se observó que
el contenido de carbono disminuía un 60% aproximadamente,
disminuyendo la proporción de carbonato total desde 1,56% a 0,5%.
Observar, sin embargo, que la naturaleza amorfa del material no se
perdió durante este proceso, según se demostró por el patrón de
difracción de rayos X mostrado en la Figura 4(a). Se
determinó que la medida de la proporción Ca/P de este material
después del tratamiento con calor era de 1,575, utilizando un método
de análisis cuantitativo con microsondas electrónicas (Figura 2).
Las propiedades morfológicas y ultraestructurales globales del
material amorfo están mostradas en la Figura 1, según se observan
bajo un microscopio electrónico de transmisión. Observar el aspecto
"amorfo" del material con ausencia de bordes definidos
separando cada gránulo con cierta porción del material para
presentar una forma amorfa (flechas). En este material se observó un
área superficial específica extremadamente elevada de 120
m^{2}/g, con un tamaño medio de poro de 130 \ring{A}
aproximadamente.
La preparación se llevó a cabo según está
descrito en el Ejemplo 1 anterior, con la excepción de que la
preparación de las Soluciones A y B fue sustituida por las
reacciones siguientes. La Solución A fue preparada a temperatura
ambiente mediante la disolución rápida de 90,68 g de
Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O en 1,2 litros de
H_{2}O destilada carbonatada. La Solución B fue preparada
disolviendo 40,57 g de K_{2}HPO_{4} en 1,53 litros de H_{2}O
destilada que contenía 24 ml de una solución de KOH al 45% en
volumen. Las propiedades químicas y físicas del producto fosfato de
calcio amorfo resultante de este procedimiento fueron similares a
las del material preparado según el Ejemplo 1.
La preparación se llevó a cabo según está
descrito en el Ejemplo 1 anterior, con la excepción de que la
preparación de las Soluciones A y B fue sustituida por las
reacciones siguientes. La Solución A fue preparada a temperatura
ambiente mediante la disolución rápida de 10,58 g de
Ca(NO_{3})_{2}\cdot6H_{2}O en 0,15 litros de
H_{2}O destilada carbonatada a un pH mayor de 9,0, ajustado con
NaOH. La Solución B fue preparada disolviendo 7,8 g de
(NH_{4})_{2}HPO_{4} en 0,35 litros de H_{2}O
destilada. Las propiedades químicas y físicas del producto fosfato
de calcio amorfo resultante de este procedimiento fueron similares a
las del material preparado de acuerdo con los Ejemplos 1 y 2.
Este ejemplo describe la preparación del
material de PCA de la invención.
El fosfato dicálcico dihidrato (DCPD) utilizado
en este ejemplo fue preparado de la manera siguiente. La Solución A
fue preparada a temperatura ambiente mediante la disolución rápida
de 10 g de H_{9}N_{2}O_{4}P (hidrógeno fosfato de diamonio)
en 500 ml de agua destilada a un pH de 4,6-4,8.
La Solución B fue preparada a temperatura
ambiente mediante la disolución rápida de 17,1 g de
Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O (nitrato de calcio
tetrahidrato) en 250 ml de agua destilada. El fosfato dicálcico
dihidrato fue preparado a temperatura ambiente mediante la adición
rápida de la Solución B a la Solución A en agitación. Inmediatamente
después, la muestra fue filtrada utilizando papel de filtro (0,05 m
cuadrados) con una velocidad media de filtración y una presión de
vacío de 10^{-2} torr aproximadamente. El material formaba una
pasta fina que fue lavada con 2 litros aproximadamente de agua
destilada y secada posteriormente a temperatura ambiente durante
24-72 horas.
El material de fosfato de calcio amorfo reactivo
preparado a partir del Ejemplo 1 fue mezclado en seco físicamente
con fosfato dicálcico dihidrato (CaHPO_{4}\cdot2H_{2}O) a
50:50% en peso utilizando un mortero y una mano de mortero durante
3-5 minutos. Posteriormente se añadió agua (1 ml/g
de material mezclado) a la mezcla de polvos para producir una
consistencia similar a una pasta. La cantidad de H_{2}O añadida
variaba dependiendo de si se deseaba una pasta espesa o fina. El
material pastoso fue posteriormente envuelto en papel de seda
húmedo y fue endurecido para dar lugar a una masa sólida mediante
calentamiento a 37ºC. El proceso de endurecimiento podía ser
retrasado durante varias horas envolviendo la muestra en parafilm y
manteniéndola a 4ºC. Además, puede dejarse que el endurecimiento
tenga lugar a temperatura ambiente, aunque los tiempos de
preparación pueden ser entonces prolongados.
El material endurecido estaba compuesto por
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino, de un tamaño de
nanometros, con una propiedad de solubilidad inherente que era
superior a las solubilidades descritas para un material de
hidroxiapatita sintético. Esto está demostrado en la Figura 3, en la
que la concentración de iones de calcio liberados en una solución
tampón de pH controlado durante 24 horas a 37ºC, era
significativamente más elevada para el material de PCA de la
presente invención (curva 50) que para el material de hidroxiapatita
cristalina estándar (curva 52).
Este ejemplo demuestra la preparación de
materiales de PCA sintéticos utilizando precursores con un tamaño
de partícula seleccionado.
El DCPD fue preparado según se describió en el
Ejemplo 4. El material seco fue triturado durante 5 minutos en un
molino de laboratorio SPEX 8510 con una cámara de trituración de
cerámica de alúmina SPEX 8505. Después de la trituración, el
material fue tamizado de manera seriada a través de un agitador con
un tamiz de ensayo Tyler para producir DCPD con 8 distribuciones de
tamaño de grano diferentes según está indicado en la Tabla 1.
Se ha encontrado que la trituración preliminar
del DCPD antes del tamizado puede ser sustituida por una breve
trituración a mano utilizando un mortero y una mano de mortero sin
cambiar sustancialmente los resultados.
El material de fosfato de calcio amorfo reactivo
preparado a partir de los Ejemplos 1, 2 ó 3 fue mezclado en seco
físicamente 1:1 (peso/peso) con DCPD durante 10 minutos utilizando
un molino de laboratorio SPEX 8510 con una cámara de trituración de
cerámica de alúmina SPEX 8505. Posteriormente se añadió agua
(1,0-0,8 ml/g de mezcla seca) a la mezcla de polvos
para dar lugar a una consistencia similar a una pasta. Cinco de las
ocho muestras indicadas en la Tabla 1 se endurecieron bien en 30
minutos a 37ºC. Las muestras 6, 7 y 8 no se endurecieron tan
rápidamente o tan firmemente como las demás muestras. Cada una de
estas muestras tenía porcentajes significativamente mayores de
partículas >100 \mum que las demás muestras. De estas
observaciones se concluyó que la utilización de DCPD de un tamaño
de grano menor da lugar a un endurecimiento más rápido y completo
que el obtenido con DCPD de tamaño de grano mayor.
El material de fosfato de calcio amorfo reactivo
según se preparó en el Ejemplo 1 fue mezclado en seco con otros
compuestos de fosfato de calcio, según el método descrito en el
Ejemplo 4. Estos compuestos incluían, pero sin limitarse a:
Ca(PO_{3})_{2} (metafosfatos de calcio),
Ca_{7}(P_{5}O_{16})_{2} (decafosfato de
heptacalcio), Ca_{2}P_{2}O_{7} (pirofosfato de calcio),
Ca_{3}(PO_{4})_{2} (fosfatos tricálcicos). Se
calculó apropiadamente que la proporción de la mezcla seca estaba
entre proporciones de Ca/P de 1,5-1,70, dependiendo
de la proporción molar de Ca/P del compuesto mezclado con el fosfato
de calcio amorfo reactivo. El material resultante era un sólido de
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino con las mismas
propiedades de solubilidad que las mostradas en la Figura 3.
Este ejemplo describe la preparación de una
pasta inyectable para la formación de un sólido de fosfato de
calcio apatítico débilmente cristalino.
Los materiales mezclados en seco preparados de
acuerdo con los Ejemplos 4 ó 6 fueron mezclados con H_{2}O
destilada (2,3 ml/g). Se formó una pasta que podía ser modelada
fácilmente a mano o inyectada a través de una boquilla tan pequeña
como de 0,5 mm de DI. La fluidez aumentaba después de refrigerar la
pasta a 4ºC durante 2-3 horas.
El material podía ser almacenado en forma de
pasta durante 12 horas aproximadamente a 4ºC en un recipiente
hermético sin endurecerse.
El contenido cristalino del material de PCA fue
determinado mediante difracción de rayos X y espectrometría IR.
Las Figs. 5a-d son los espectros
de difracción de rayos X del producto de reacción entre el DCPD y el
fosfato de calcio amorfo reactivo según se describió en el Ejemplo
4. La mezcla de reacción fue colocada en un entorno húmedo a 37ºC y
examinada mediante espectrometría de difracción de rayos X a
diferentes tiempos. Las condiciones del barrido de rayos X fueron
(a) ánodo de cobre, (b) \lambda = 1,4540598 \ring{A} y (c) rango
de barrido 20-35' en una etapa de 0,02' y un
intervalo entre etapas de 2 segundos. La Figura 6 muestra el
espectro infrarrojo del fosfato dicálcico dihidrato (a), del ACP
activado de la invención (b) y del material de PCA de la presente
invención (c).
Las muestras de las Figs. 5a-5d
fueron incubadas durante 0, 20 minutos, 75 minutos y 5 horas,
respectivamente. Las muestras fueron extraídas al tiempo indicado y
liofilizadas para conservar las características químicas. La Fig.
5a, tomada al comienzo de la reacción, representa una combinación de
picos atribuibles al ACP de partida y al difosfato dicálcico (ver
la Fig. 4 para los patrones de DRX de los componentes). Se observan
fácilmente picos pronunciados a 20,25º, 23,5º, 29,5º, 30,75º y
34,2º aproximadamente para el difosfato dicálcico cristalino. Al
incrementar el tiempo de reacción, los picos cristalinos
pronunciados tienden a desaparecer y aparecen picos anchos
(amorfos) centrados a 26', 28,5', 32,0' y 33,0'. Es interesante
observar que no hay un cambio significativo en el espectro después
de 75 minutos de reacción, indicando que la reacción de conversión
había finalizado esencialmente en poco más de una hora. El patrón
de difracción de rayos X del material de PCA de la invención (Fig.
5d) puede ser comparado con el del hueso existente en la naturaleza,
mostrado en la Fig. 7. Los dos espectros son casi idénticos,
indicando la estrecha biomimesis del fosfato de calcio apatítico de
la invención.
Ejemplos
9-12
Estos ejemplos demuestran el efecto del volumen
de fluido sobre la consistencia y la reactividad de la pasta
inyectable para ser utilizada en la formación de un material de
hidroxiapatita sintética débilmente cristalina. Cada una de las
pastas fue preparada según se describió en el Ejemplo 7 anterior, y
se determinaron la consistencia y la velocidad de reacción a
temperatura ambiente y a 37ºC. Las observaciones están descritas en
la Tabla 2.
Este ejemplo compara los espectros infrarrojos
de los precursores cristalinos y amorfos producidos de acuerdo con
los ejemplos y el material de PCA final producido mediante la
reacción de precursores similares. La Fig. 7a presenta el espectro
IR de la brusita (DCPD) preparada según se describió en el Ejemplo
4; la Fig. 7b presenta el espectro del ACP después del tratamiento
con calor, preparado según se describió en el Ejemplo 1 y la Fig.
7c es el espectro IR del material de PCA preparado según se
describió en el Ejemplo 4.
La finalidad de este estudio fue analizar la
reabsorción y la osificación del fosfato de calcio PCA en un lugar
de implante óseo. El método es también útil para analizar las
propiedades de reabsorción y osificación de las formulaciones y
compuestos ("composites") del fosfato de calcio PCA de la
invención.
El artículo de ensayo utilizado fue una
formulación de fosfato de calcio PCA preparada según se describió
en el Ejemplo 4. El ACP y el DCPD fueron mezclados en las
proporciones especificadas y triturados durante 1 minuto, 30
segundos en el equipo de trituración SPEX.
Conejos NZW machos adultos (>5 meses de
edad), fueron mantenidos en cuarentena y aclimatados durante un
mínimo de 10 días antes del inicio del estudio. Los animales fueron
alojados individualmente en jaulas de acero inoxidable suspendidas.
Bajo las jaulas se utilizó viruta en bandejas para la recogida de
los excrementos. Antes del comienzo del estudio, los animales
fueron asignados aleatoriamente a los grupos o tratamientos y
fueron identificados mediante un tatuaje numerado en la oreja y por
la tarjeta correspondiente en la jaula. Todos los animales tenían
un único defecto localizado en una tibia. Los puntos de tiempo para
las evaluaciones fueron 2, 4 y 8 semanas (2 animales por cada punto
de tiempo). La cirugía se llevó a cabo bajo anestesia total y
condiciones quirúrgicas asépticas.
Después de obtener la anestesia adecuada (por
ejemplo, ketamina/xilacina), utilizando una técnica aséptica, se
realizó una incisión sobre la tibia proximal lateral. El tejido
blando fue retirado hacia un lado y se expuso el hueso. Utilizando
un trépano de 5 mm aproximadamente en un torno manual dental a baja
velocidad con irrigación (solución salina fisiológica al 0,9%)
según fuera necesario, se cortó un orificio de \sim5,5 mm de
diámetro a través de la porción cortical del hueso. El disco óseo
fue liberado de la corteza por disección y se preparó el lugar para
el implante. El material precursor hidratado en forma de pasta fue
colocado en el defecto. En los animales control los defectos se
dejaron sin tratar. Los tejidos blandos fueron posteriormente
cerrados en capas. Se preparó una muestra por animal utilizando este
método.
Observaciones clínicas de la salud y bienestar
general de los animales, con especial atención a sus capacidades
ambulatorias, fueron llevadas a cabo al menos semanalmente. Todos
los animales parecían tener buena salud. Al final del estudio los
animales fueron sometidos a eutanasia con una sobredosis de
anestésico y se recogió el lugar del implante. Se realizaron
radiografías de las tibias a intervalos programados incluyendo
después de la cirugía y en el momento de la necropsia.
Los lugares de implantación fueron fijados en
formalina y teñidos con hematoxilina y eosina, tricrómico de Masson
o con Von Kossa para muestras descalcificadas. Se prepararon también
muestras histológicas sin descalcificar y se tiñeron con fucsina
básica verde claro. Los cortes fueron evaluados microscópicamente
por un patólogo veterinario certificado por el consejo (ACVP) con
experiencia en patología de animales de laboratorio. Se realizaron
observaciones subjetivas de la morfología ósea y se observó la
presencia o ausencia de hueso organizado y de material de fosfato
de calcio PCA detectable.
Los resultados histológicos indicaban cierta
mineralización a las 2 semanas. Hacia las 4-6
semanas, los animales que habían recibido los implantes tenían un
hueso trabecular normal en el lugar del implante sin evidencia de
fosfato de calcio PCA restante. Los controles sin tratar no habían
cicatrizado totalmente en cuanto a que no tenían un crecimiento
completo y/o tenían un hueso de tipo no cortical. Las Figuras 10a y
10b son fotomicrografías de los defectos tibiales sin tratar y
tratados, respectivamente, 2 semanas después de la cirugía. Como
puede observarse, el hueso a la derecha del borde del defecto en la
muestra no tratada (Fig. 9a) es hueso trabecular fino; el hueso
nuevo a la derecha del borde del defecto en la muestra tratada es
hueso trabecular denso.
Este ejemplo demuestra la reabsorción del
fosfato de calcio PCA de la invención cuando es implantado
subcutáneamente en ratas. Demuestra también un procedimiento de
selección útil para analizar las características de reabsorción de
nuevas formulaciones de materiales y compuestos ("composites")
para implantes biocerámicos.
Ochenta ratas Sprague-Dawley
machos y ochenta hembras fueron implantadas cada una con 4 ml
(2-4 g) del PCA de la invención (preparado de
acuerdo con el Ejemplo 4) en el subcutis dorsal (>10 x la
cantidad considerada máxima en humanos por kg). Los animales
control fueron tratados con un volumen igual de solución salina. Los
procedimientos de la operación están descritos en el Ejemplo 16.
Las ratas fueron sacrificadas según el programa presentado a
continuación en la Tabla 3. El lugar del implante fue examinado
según se describe en el Ejemplo 16.
Se recogió sangre para los análisis de patología
clínica del seno retroorbital o mediante punción cardíaca (todos
por el mismo método) mientras los animales estaban bajo anestesia
con CO_{2}. Se recogieron muestras de sangre de cada grupo de
animales antes del sacrificio programado. Se llevaron a cabo
observaciones clínicas de los animales para determinar la salud y
el bienestar general al menos semanalmente hasta 3 meses, y
posteriormente una vez al mes.
En la semana 1, estaba presente material de PCA
en el lugar del implante y se encontró asociado con granulomas que
iban de moderados a manifiestos asociados presumiblemente con el
proceso de reabsorción. En la semana dos, una pequeña cantidad de
material de PCA estaba todavía presente en el lugar del implante y
los granulomas asociados eran de leves a moderados. Hacia la semana
cuatro, la mayor parte del tejido parecía normal, persistiendo unos
cuantos granulomas leves en el lugar del implante. En la semana
doce, no quedaba ninguna evidencia del implante.
Este ejemplo describe la preparación de
implantes de material de PCA que tienen tiempos variables de
reabsorción in vivo como resultado de una variedad de
tiempos de trituración. Los precursores secos individuales, ACP y
DCPD, fueron preparados según se describió en el Ejemplo 4.
Posteriormente se prepararon varias formulaciones diferentes de
DCPD y ACP mediante i) la trituración del DCPD durante 15 segundos,
30 segundos, 1 minuto, 2,5 minutos o 5 minutos en un triturador
SPEX; ii) la combinación del DCPD triturado con ACP 1:1; y iii) la
trituración de la mezcla durante 15 segundos, 30 segundos, 1
minuto, 2,5 minutos o 5 minutos adicionales, respectivamente. Los
tiempos de trituración totales para las diferentes preparaciones
fueron por tanto 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos y 10
minutos.
El fosfato de calcio PCA, esterilizado en forma
de polvo mediante 2,5 Mrad aproximadamente de irradiación gamma,
fue preparado según se describió en el Ejemplo 4 tomando el material
en forma de polvo y mezclándolo con agua o solución salina estéril
y moldeándolo en discos de 1 cm aproximadamente de 2 mm de espesor e
incubándolos durante un mínimo de 30 minutos a 37ºC. Los discos
fueron implantados en conejos New Zealand White adultos machos
inmediatamente después de la fabricación.
Los animales fueron asignados a grupos de dosis
que contenían 3 machos para un total de 15 animales. Los implantes
fueron asignados a los conejos aleatoriamente.
Diez-quince minutos antes de la cirugía, el animal
fue premedicado con xilacina (10 mg/kg, i.m.). Posteriormente se
administró al animal ketamina (50 mg/kg, i.m.). La superficie
dorsal del animal fue afeitada y lavada con una solución quirúrgica
de betadine y alcohol. Antes de la cirugía el animal fue
monitorizado para asegurarse de que estaba anestesiado
adecuadamente. Para hacer esto, se aplicó presión a la almohadilla
subplantar. Si no había respuesta, el animal estaba anestesiado
correctamente. A lo largo del procedimiento, el animal fue
monitorizado para observar si se producía contracción de los bigotes
y si tenía reflejo en los dedos de las patas cuando eran
pellizcados, lo cual indicaba que el animal no se estaba
despertando.
Utilizando una técnica aséptica y una hoja de
bisturí, se realizó una incisión de 1-2 cm de
longitud en la piel sobre el músculo longissimus lumborum
(que está a lo largo de ambos lados de la columna vertebral).
Cuando se realizó la incisión, la fascia subyacente y el músculo
fueron también cortados para permitir que la muestra pasara al
músculo. El disco de muestra fue colocado directamente en el
músculo, asegurándose de que el implante completo era incrustado en
el músculo. El músculo fue cerrado con una única sutura absorbible
y la piel se cerró subcutáneamente mediante puntos. Se utilizaron
agrafes para piel de metal para cerrar la incisión de la superficie
externa de la piel. De esta manera se colocaron en cada lado cinco
muestras. Cada muestra fue colocada en el extremo de la incisión y
estaban separadas 1 cm aproximadamente entre sí (ver el diagrama).
Las muestras estaban en forma de discos de 7 mm por 2 mm que pesaban
150 mg aproximadamente. Los animales fueron monitorizados y
recibieron buprenorfina (0,02-0,05 mg/kg, s.c.)
después de despertarse. El analgésico fue administrado 2 veces al
día durante 3 días después de la cirugía.
Los animales fueron radiografiados
inmediatamente después de la cirugía y posteriormente cada dos
semanas. Las radiografías fueron comparadas para seguir la
reabsorción de los materiales. Se utilizó un método estandarizado
para las radiografías con el fin de minimizar cualquier variación
entre los puntos de tiempo.
Después de la eutanasia, los lugares del
implante fueron evaluados primeramente mediante examen macroscópico.
En los sitios con implantes visibles, los implantes aparecían como
discos sólidos de color gris a amarillo. En los lugares en los que
se había reabsorbido el implante, se observaron áreas de
decoloración del músculo de color rojo a marrón.
El tejido muscular, con los implantes, fue
extraído, teniendo cuidado de no alterar los implantes. Los tejidos
y las marcas identificativas fueron colocados en recipientes
marcados llenos de formalina tamponada neutra al 10%. Todos los
lugares de implante fueron procesados y evaluados microscópicamente.
Las observaciones incluían fibrosis focal, inflamación
glanulomatosa focal y aspecto del implante (en algunos casos). La
fibrosis fue observada principalmente como fibrocitos y colágeno.
Los animales con reabsorción aparente tenían fibrosis e inflamación
focal granulomatosa de mínima a moderada. La inflamación
granulomatosa fue observada como agregados focales de macrófagos y
células gigantes, a menudo con cristales intracitoplásmicos, y
heterófilos y linfocitos ocasionales. La inflamación alrededor de
los implantes no reabsorbidos era principalmente fibrosis de mínima
a leve y/o inflamación granulomatosa, ambas de las cuales estaban
dentro del rango aceptable para los implantes intramusculares.
A las cuatro semanas, las pastillas de los
implantes de fosfato de calcio PCA que habían sido preparadas por
trituración durante 30 segundos, 1 minuto o 2 minutos se habían
reabsorbido totalmente. Las que habían sido preparadas triturando
durante 5 minutos o 10 minutos no se habían reabsorbido
totalmente.
La finalidad de este estudio era analizar la
reabsorción y la osificación del fosfato de calcio PCA de la
invención en un lugar óseo.
Para este estudio se emplearon perros beagle
maduros (>1 año) debido a su tamaño y al uso histórico como
modelo para estudios de hueso. La tibia del perro es suficientemente
grande para permitir la creación y el estudio de defectos grandes
(> 5 mm) sin comprometer la capacidad del animal para moverse y
sin inducir fracturas secundarias a la inducción de defectos en los
huesos.
Diez perros beagle adultos machos y hembras
(6,0-15,0 kg) recibieron el mismo tratamiento. Se
crearon defectos en la superficie lateral de la corteza de la
cresta de la tibia (8 mm o 10 mm) en cada tibia. El fosfato de
calcio PCA fue colocado en el defecto de una tibia y la otra tibia
sirvió como control.
Se realizó una incisión sobre la tibia proximal.
El tejido blando fue retirado hacia un lado y el hueso expuesto.
Utilizando un trépano de 8 mm en un torno manual dental a baja
velocidad con irrigación (solución salina fisiológica al 0,9%)
cuando era necesario, el disco óseo fue liberado por disección y se
preparó el lugar para el implante. El material de fosfato de calcio
de la invención (sólido o pasta) fue colocado en el defecto. Los
tejidos blandos fueron posteriormente cerrados en capas. Se
realizaron de una a tres muestras por animal utilizando este
método. Se dejó que los animales cicatrizaran durante periodos de
tiempo programados.
Los animales fueron evaluados mediante
observaciones clínicas, radiografías y microscoscopía de los lugares
con defecto a las 0, 2, 4 y 8 semanas. Específicamente, se
realizaron radiografías de la tibia cada 2 semanas a lo largo del
estudio. Las radiografías fueron utilizadas para determinar la
duración del estudio. Aproximadamente al final de cada 2 semanas,
se sacrificaron 2 animales y los lugares de ensayo fueron extraídos
para histología. Los lugares de implantación fueron preparados como
secciones descalcificadas y sin descalcificar.
Se utilizaron 2 perros como animales piloto y no
recibieron el material de PCA. En estos animales piloto, se observó
cierta cicatrización radiográficamente a las 2 semanas. Hacia las
6-8 semanas, el defecto había cicatrizado
completamente. Se determinó que el tamaño de los defectos de los
perros era óptimo a 1 cm. En los 8 perros restantes, los defectos
control cicatrizaron en 6 semanas; los defectos tratados
cicatrizaron en 2 a 4 semanas. La calidad del hueso en los defectos
control era hueso trabecular fino; en los defectos tratados, el
hueso era hueso de tipo trabecular denso a cortical. Por tanto, los
defectos tratados cicatrizaban 2 semanas aproximadamente más rápido
que los defectos sin tratar, y cicatrizaban con una mejor densidad
ósea.
La Figura 11 muestra una fotografía muy
aumentada (10x) del crecimiento de hueso trabecular canino en el
lugar de un defecto tratado con el material de PCA de la invención
8 semanas después de la cirugía. Las flechas pequeñas indican
células similares a osteoblastos que tapizan las espículas óseas y
son indicativas de una actividad celular incrementada.
La Figura 12 muestra una fotomicrografía de un
defecto óseo cortical canino tratado con el material de PCA de la
invención. Las flechas grandes indican un borde del defecto. El
crecimiento de hueso nuevo está a la derecha del defecto; 4 semanas
después de la cirugía, este crecimiento es hueso trabecular
denso.
La finalidad de este estudio era analizar la
reabsorción y la osificación del fosfato de calcio PCA de la
invención, y establecer parámetros para la selección de materiales
de fosfato de calcio PCA de ensayo.
En estos estudios se utilizaron 18 conejos NZW
machos adultos (>3 meses de edad). Después de obtener la
anestesia adecuada (por ejemplo, ketamina/xilacina para producirla),
utilizando una técnica aséptica, se realizó una incisión sobre la
tibia proximal. El tejido blando fue retirado hacia un lado y se
expuso el hueso. Utilizando un trépano de 5 mm aproximadamente en
un torno manual dental a baja velocidad con irrigación (solución
salina fisiológica al 0,9%) cuando era necesario, el disco óseo fue
liberado por disección y el lugar fue preparado para el implante.
El material de fosfato de calcio PCA de la invención (sólido,
gránulos o pasta) fue colocado en el defecto. Los tejidos blandos
fueron posteriormente cerrados en capas.
Observaciones clínicas de la salud general y del
bienestar de los animales, con especial atención al movimiento, se
llevaron a cabo semanalmente y con más detalle en el momento de las
radiografías bisemanales. Se realizaron radiografías de las tibias
a intervalos programados, incluyendo después de la cirugía y en el
momento de la necropsia.
Los lugares de implantación fueron preparados
como muestras descalcificadas teñidas con hematoxilina y eosina y
tricrómico de Masson y como cortes sin descalcificar.
Los hallazgos y las observaciones clínicas
estaban asociados con la cirugía y no estaban asociados con los
implantes de fosfato de calcio PCA. Las observaciones clínicas
posteriores a la cirugía estaban dentro del rango de los hallazgos
previstos para el trauma relacionado con la cirugía. Se realizaron
radiografías inmediatamente después de la cirugía y a cada punto de
tiempo de sacrificio programado.
Inmediatamente después de la cirugía, todos los
lugares de los defectos óseos eran claros; los implantes parecían
tener la misma radiodensidad que el hueso. Dos semanas después de la
cirugía, los defectos del control tenían lugares claros y los
lugares del implante eran menos claros y se iban fundiendo con el
hueso circundante; se observaron hallazgos similares a las 4
semanas. A las 7 semanas, todos los lugares parecían similares, con
una radiodensidad incrementada. Macroscópicamente, los lugares del
defecto a las 2 semanas eran claramente visibles en los animales
control y en los animales tratados. A las 4 semanas y después, los
lugares del implante o los lugares control no podían ser
determinados macroscópicamente.
Los hallazgos radiográficos indicaban poco
cambio en los animales control hasta la semana 7; los animales
tratados con el material de PCA de la invención tenían una
radiodensidad creciente en el defecto a lo largo del tiempo. Los
defectos de los animales control presentaban cierto crecimiento de
hueso nuevo, predominantemente del tipo trabecular fino, en
4-7 semanas. Los defectos de los animales tratados
presentaban crecimiento óseo tan pronto como a las 2 semanas, y
hacia las 7 semanas estaban rellenos de hueso nuevo. Los hallazgos
microscópicos son consistentes con una sustitución ósea
incrementada por los implantes de fosfato de calcio PCA. Tomado en
conjunto, este estudio muestra que defectos de 5 mm en la tibia del
conejo cicatrizan o tienen crecimiento de hueso nuevo en los
animales control hacia las 7 semanas y en los animales tratados con
el material de PCA de la invención hacia las 4 semanas. Además,
este modelo del defecto de tamaño crítico de 5 mm unicortical en
conejo es útil para analizar productos de ensayo con el fin de
determinar sus propiedades de reabsorción y osificación.
La Figura 13 muestra fotomicrografías de
defectos tibiales de conejo sin tratar (Fig. 13a) y tratados (13b)
4 semanas después de la cirugía. La flecha grande indica el borde
del defecto. En la Fig. 13a, las fechas pequeñas 100 indican la
abundancia de tejido conectivo fibroso en el lugar del defecto. La
cabeza de flecha grande 102 señala hueso trabecular nuevo en el
defecto. En la Fig. 13b, las dos flechas pequeñas 104 demarcan el
crecimiento de hueso trabecular denso en el lugar del defecto.
El material precursor del PCA es preparado según
el Ejemplo 5. Se preparan dos mezclas de precursores, la muestra A
que corresponde a la muestra 6 y la muestra B se corresponde a una
mezcla 2:4:3:1 de las muestras 1, 2, 3 y 4. Pastas de precursores
hidratados de las dos muestras son analizadas en roedores en el
ensayo subcutáneo del Ejemplo 15. La reabsorción es monitorizada a
varios puntos de tiempo.
Este ejemplo demuestra la incorporación de una
proteína a un vehículo de administración de la presente invención
de una forma que se conserva la estabilidad in vitro de la
proteína.
Se prepara tripsina pancreática bovina en
solución salina tamponada con fosfato a una concentración de 100
mg/ml. Se añaden 0,8 ml de esta solución a 1 g de una mezcla 1:1 de
ACP activado y DCPD según se describió en el Ejemplo 17, muestra B.
La mezcla se modela en forma de una bola y se endurece en un entorno
húmedo a 37ºC durante 30 minutos. La bola endurecida es
posteriormente liofilizada durante una noche y posteriormente es
triturada mediante y con un mortero y una mano de mortero. El polvo
formado de esta forma es mezclado con 1 ml de agua y aplicado a los
pocillos de una placa de ensayo con caseína. El aclaramiento de la
caseína turbia en un anillo alrededor del pocillo es comparada con
el aclaramiento observado en un pocillo cargado de manera similar
con una muestra de PCA liofilizado conteniendo tripsina inactivada
por calor.
Este ejemplo demuestra la incorporación de una
proteína a un vehículo de administración de la presente invención
de una forma que se conserva la actividad in vivo de la
proteína.
Se preparan 200 mg/ml de
beta-galactosidasa (Worthington LS004093) en
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,0. Se añaden 0,8 ml de
esta solución a 1 g de una mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD
(preparada según se describió en el Ejemplo 17, muestra B) y se
mezcla para dar lugar a una masilla. El PCA modelable es
posteriormente preparado en forma de bola e implantado
subcutáneamente en una rata. Dos semanas después se extrae la bola
de PCA, se liofiliza y se tritura con un mortero y una mano de
mortero. El polvo es posteriormente analizado para determinar la
actividad beta-galactosidasa, utilizando por ejemplo
un ensayo líquido tal como el descrito por Miller (Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1972).
Este ejemplo demuestra la utilización del
vehículo de administración para administrar un antibiótico en una
aplicación dental.
Se preparan 100 mg/ml de gentamicina en solución
salina tamponada con fosfato, pH 7,0. Se añaden 0,8 ml de esta
solución a 1 g de una mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD (preparada
según se describió en el Ejemplo 17, muestra B) y se mezcla para
dar lugar a una masilla. El PCA modelable es preparado
posteriormente en forma de bola e implantado subcutáneamente en una
rata. Dos semanas después la bola de PCA es extraída, liofilizada y
triturada con un mortero y una mano de mortero. El polvo es
posteriormente analizado para determinar la actividad bactericida
utilizando un ensayo de zonas de inhibición
bactericidas/bacteriostáticas de la USP.
Este ejemplo demuestra la utilización del
vehículo de administración de la presente invención para administrar
una vacuna.
Se prepara hemocianina de la lapa ojo de
cerradura a una concentración de 0,5 mg/ml en solución salina
tamponada con fosfato, pH 7,0. Se añaden 0,8 ml de esta solución a
1 g de una mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD (preparada según se
describió en el Ejemplo 17, muestra B) y se mezcla para dar lugar a
una masilla. El PCA modelable es preparado posteriormente en forma
de bola e implantado subcutáneamente en una rata. El proceso es
repetido una vez al mes durante 4 meses. Se extraen muestras de
sangre regularmente y se determinan los títulos de anticuerpo
anti-hemocianina de la lapa ojo de cerradura
mediante ELISA.
Este ejemplo demuestra la utilización del
vehículo de administración de la presente invención para la
administración intramuscular de un ácido nucleico con la finalidad
de transfección celular. Este método puede ser también utilizado
para incorporar ADN a tejidos distintos del músculo.
Se prepara ADN del plásmido pUC 19 en EDTA TRIS
pH 7,4 a 2 mg/ml. Se añaden 0,8 ml de esta solución a 1 g de una
mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD (preparada según se describió en
el Ejemplo 17, muestra B) y se mezcla para dar lugar a una masilla.
El PCA modelable es posteriormente preparado en forma de bola e
implantado intramuscularmente en una rata. Después de 4 semanas, el
músculo del lugar del implante es disecado y teñido histológicamente
para determinar la presencia del producto del gen de la B
galactosidasa.
Este ejemplo demuestra la utilización del
vehículo de administración de la presente invención con el fin de
administrar un fármaco para el tratamiento de la enfermedad de
Parkinson.
Se convirtieron primates en hemiparkinsonianos
con MPTP y se evaluaron comportamentalmente según está descrito en
Kordower y col., Cell Transplantation 14:155-171,
1995.
Se preparan 200 mg/ml de GDNF en solución salina
tamponada con fosfato, pH 7,0. Se añaden 0,8 ml de esta solución a
1 g de una mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD (preparada según se
describió en el Ejemplo 17, muestra B) y se mezcla para dar lugar a
una masilla. El precursor de PCA hidrato es posteriormente modelado
en 3 cilindros de 1 mm x 1 cm aproximadamente cada uno y endurecido
en un entorno húmedo a 37ºC.
Los cilindros son posteriormente colocados en
los ventrículos laterales del lado lesionado de los animales
experimentales y se continúa la evaluación comportamental de los
primates. Después de dos meses, los animales son sacrificados y se
analizan las neuronas de la sustancia negra y del estriado para
determinar la actividad tirosina hidroxilasa.
El fin de este estudio era evaluar la
reabsorción, la osificación y la biocompatibilidad de dos
formulaciones del fosfato de calcio PCA de la invención en lugares
mandibulares caninos. El fosfato de calcio PCA
pre-endurecido fue implantado en un modelo de
inserción mandibular canino que puede ser utilizado adicionalmente
como modelo de aumento.
El producto de ensayo era fosfato de calcio PCA
en dos formulaciones, correspondientes a los Tipos 2 y 10 descritos
en el Ejemplo 16. El fosfato de calcio PCA fue
pre-endurecido en un entorno húmedo a 40ºC
aproximadamente inmediatamente antes del implante. Los implantes
control eran cilindros de 3 mm x 4 mm de silicona e hidroxiapatita
porosa, respectivamente.
Dos perros adultos de tipo sabueso hembras (20 a
25 kg) fueron utilizados en el estudio. Ambos perros recibieron dos
implantes control (uno de cada) en el lado derecho de la mandíbula y
una de cada una de las formulaciones de fosfato de calcio PCA de
Tipo 2 y de Tipo 10 en el lado izquierdo (opuesto).
La implantación se llevó a cabo bajo anestesia
total y condiciones quirúrgicas asépticas. Los animales fueron
premedicados con tranquilizantes y con agentes del tipo atropina e
inducidos con barbitúricos. Los signos vitales de los animales
(temperatura, ritmo cardíaco, ritmo respiratorio) fueron
monitorizados antes y a lo largo de todo el procedimiento. Los
animales fueron analizados para determinar la profundidad anestésica
apropiada mediante pellizcamiento de los dedos de las patas y
mediante estimulación corneal. Después de obtener la anestesia
adecuada, utilizando una técnica aséptica, se realizó una incisión
en la piel sobre la superficie ventral lateral media de la
mandíbula y el cuello proximal (sobre el borde inferior de la
mandíbula). El tejido blando fue retirado hacia un lado y se expuso
el hueso. Se elevó el periostio sobre la superficie mandibular
externa y la superficie del hueso fue desbastada con una fresa o un
torno hasta que se convirtió en rugosa y sangrienta con una forma
adecuada para aceptar los implantes cilíndricos. Los artículos
control y el fosfato de calcio PCA pre-endurecido
fueron colocados en los defectos. Dos muestras por animal por lado
fueron colocadas en cada superficie mandibular externa utilizando
este método (dos muestras de fosfato de calcio PCA experimentales y
dos controles). Las muestras fueron colocadas a 1 cm aproximadamente
para asegurar que no hubiera yuxtaposición entre ellas. El
periostio fue cerrado en primer lugar utilizando vicrilo
3-0. Los tejidos blandos fueron posteriormente
cerrados en capas con sutura absorbible de vicrilo
3-0. La piel fue cerrada con suturas interrumpidas
simples de nailon 5-0. Se dejó cicatrizar a los
animales durante periodos de tiempo programados. Un perro fue
sacrificado a las 3 semanas y el otro a los 3 meses y los lugares
de ensayo se extrajeron para histología. Todos los animales fueron
sacrificados y se recogieron las marcas identificativas.
Los sitios de implantación fueron preparados
como secciones sin descalcificar. Las secciones fueron evaluadas
para determinar la biointegración, la biodegradación y la
biocompatibilidad.
Los resultados fueron según sigue: Se observó
una biocompatibilidad excelente en todos los puntos de tiempo. No
se observaron células gigantes y se observó un número mínimo de
macrófagos. Hubo únicamente una capa de reacción mínima de sólo
unas cuantas células de espesor en la base de los implantes de
fosfato de calcio PCA. Esto es significativamente mejor que lo
observado en los controles.
A las tres semanas, la mayor parte del material
de Tipo 2 se había reabsorbido. A las doce semanas, el Tipo 2 se
había reabsorbido completamente en la superficie del hueso original.
Adicionalmente, el hueso del receptáculo no estaba totalmente
diferenciado.
Las muestras de Tipo 10 demostraron integración
ósea con el crecimiento de hueso nuevo y migración celular al
implante. El propio implante se había reabsorbido un 10% después de
doce semanas.
El implante control de silicona, que no es
reabsorbible, mostraba una reacción de cuerpo extraño de leve a
moderada. Los huecos no se habían rellenado a las tres semanas, pero
hacia las doce semanas estaban llenos de tejido fibroso. El
implante control de hidroxiapatita no mostró signos de reabsorción
ni de integración ósea en las primeras doce semanas.
Este experimento confirma la excelente
biocompatilidad del fosfato de calcio PCA de la invención.
Adicionalmente, se observó una diferencia en el tiempo de
reabsorción entre las dos formulaciones de PCA, con un curso
temporal de reabsorción prolongado para la muestra en la cual los
precursores fueron mezclados/triturados durante un periodo de
tiempo mayor (Tipo B).
Los resultados señalan también las propiedades
de reabsorción y osificación más lentas observadas en el lugar del
implante mandibular sin carga en comparación con las aplicaciones
que llevaban carga y que osificaban rápidamente de los Ejemplos 14,
17 y 18.
Este ejemplo demuestra la utilización de un
material de PCA que se reabsorbe de manera relativamente lenta en
un "composite" de PCA/HA para producir un aumento esquelético
de larga duración, que conserva la forma.
Los "composites" de PCA/HA son preparados
mezclando HA particulada (tamaño de grano <200 \mum) con la
masilla precursora hidratada de la invención descrita en el Ejemplo
5, Muestra 5, en una proporción que varía del 0,05 al 30%
peso/volumen. La masilla granular producida por esta mezcla es
modelada en una forma adecuada para el implante. La masilla
granular es posteriormente endurecida a 37ºC.
El lugar del implante es preparado eliminando
por disección unos cuantos milímetros del hueso cortical, incluyendo
el periostio. Si es posible, el periostio es desprendido de la
superficie ósea cortical en el lugar del implante, pero se deja
unido. El material y la sangre del hueso disecado son retenidos y
mezclados con la pasta de material de PCA fresca (esto es, el
precursor hidratado) en una proporción 1:3 volumen/volumen
aproximadamente, y se deja aparte. Se utiliza pasta del material de
PCA fresca como cemento para fijar el implante a la superficie ósea
cortical expuesta. Se aplica pasta del material de PCA adicional
según sea necesario para asegurar la adhesión del implante. La
mezcla de PCA/material tisular retenida es utilizada posteriormente
como fuente de siembra para el implante y es aplicada a tanta
superficie del implante como sea posible. El periostio es
posteriormente colocado de nuevo sobre el implante tanto como sea
posible.
Este ejemplo demuestra las propiedades de
endurecimiento y la formación de fosfato de calcio PCA a partir de
ACP utilizando varios promotores participantes diferentes. Se
preparó ACP altamente reactivo de acuerdo con el Ejemplo 1.
La hidroxiapatita nanocristalina de las muestras
1-1, 1-2 y 1-3 fue
preparada sin inhibidores de la cristalización según sigue: 218 g
de ortofosfato hidrógeno disódico
(Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O) fueron disueltos en 1200 ml de
solución de agua destilada. Para el fosfato de calcio PCA
carbonatado de las muestras 1-1 y
1-2, se añadieron también a esta solución 80 g de
NaHCO_{3}. Se disolvieron 70 g de nitrato de calcio
[Ca(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O] en 500 ml de
agua destilada. La solución de calcio fue vertida rápidamente en la
solución de fosfato a temperatura ambiente con agitación constante.
La precipitación fue inmediata y sustancialmente completa. El pH del
precipitado fue ajustado a 7,4 por la adición de una solución de
hidróxido de sodio con el fin de evitar la formación de fosfatos de
calcio ácidos. El precipitado fue separado inmediatamente de la
solución por filtración a través de un filtro Buchner (con una
superficie total de 0,1 m cuadrados aproximadamente) y fue lavado
con 3 litros aproximadamente de agua destilada. Sobre el papel de
filtro se obtuvo una masa de gel de fosfato de calcio de baja
cristalinidad. Una porción de la masa de gel fue liofilizada
inmediatamente para las muestras 1-2 y
1-3.
Para la muestra 1-1, la masa de
gel fue tratada según sigue: Después de la filtración y el lavado,
se añadió al gel precipitado una cantidad apropiada de agua
destilada (del 5 al 80% en peso). El gel fue homogeneizado
batiéndolo enérgicamente durante unos cuantos minutos.
Posteriormente fue colocado en moldes de politetrafluoroetileno
(PTFE) (60 mm de diámetro; 2 mm de altura) y sonicado durante unos
minutos con el fin de liberar las burbujas de aire atrapadas en el
gel.
Los moldes fueron secados en una cámara a
temperatura (5 a 37ºC) y humedad (del 10 al 95% HR) controladas.
Las muestras se contraían lentamente a medida que se iban secando y
liberaron la mayor parte de su agua. El nivel de secado y de
reducción de las muestras dependía del contenido inicial de agua. El
material se endureció al secarse y se convirtió en vítreo. Contenía
un 10% aproximadamente de agua residual.
Las restantes hidroxiapatitas y fuentes de
calcio fueron utilizadas como tales a partir de fuentes
comerciales.
El ACP fue mezclado con el promotor específico
en una proporción (peso/peso) de 50:50 aproximadamente (ver la
Tabla 1) durante 5 minutos en un molino de laboratorio SPEX. Se
añadieron 0,8 ml aproximadamente de H_{2}O/g de polvos secos a la
mezcla del precursor seco y se mezcló para formar una pasta. La
mezcla fue posteriormente moldeada en forma de bola, envuelta en
papel de seda húmedo y calentada a 37ºC durante al menos 30 minutos.
Después de 30 minutos y a varios puntos de tiempo posteriormente,
la pasta fue monitorizada para determinar su dureza. Las Figuras 15
y 16 son DRX representativos de las reacciones 1-2 y
1-4. La utilización de dos hidroxiapatitas con
tamaño de grano diferente como promotores participantes dio lugar a
resultados similares a los obtenidos con DCPDs de tamaño de grano
diferente (ver Ejemplo 5). Esto es, la hidroxiapatita de tamaño de
grano mayor endurecía más lentamente y menos completamente que la
hidroxiapatita de grano más pequeño.
Este ejemplo demuestra la utilización de fosfato
de calcio apatítico neutro como promotor de la conversión de ACP en
el fosfato de calcio PCA de la invención con el fin de estimular el
crecimiento óseo in vivo. Hidroxiapatita estequiométrica es
mezclada con ACP reactivo según se describió en el Ejemplo
34-37. La pasta del precursor hidratado es aplicada
a sujetos animales según se describió en los Ejemplos 14, 15 ó 16.
La cicatrización del hueso y la biocompatibilidad fueron
monitorizadas según se describió en los puntos de tiempo
indicados.
Este ejemplo demuestra la producción de fosfato
de calcio PCA a partir de ACP utilizando varios promotores pasivos
diferentes.
Se preparó ACP altamente reactivo de acuerdo con
el Ejemplo 5. El ACP fue mezclado con el promotor específico en una
proporción (peso/peso) de 5:1 ó 1:1 aproximadamente (ver la Tabla 2)
durante 5 minutos en un molino de laboratorio SPEX. Se añadió agua
(0,75-0,85 ml) y se mezcló hasta formar una masilla.
La mezcla fue posteriormente moldeada en forma de bola, envuelta en
papel de seda húmedo y calentada a 37ºC durante al menos 30 minutos.
Después de 30 minutos y a varios puntos de tiempo posteriores la
pasta fue monitorizada para determinar su dureza. La Figura 17 es
un DRX representativo de la muestra 2-4 empleando un
promotor de alúmina. En esta figura pueden verse los picos de la
alúmina superpuestos al perfil del fosfato de calcio PCA
estándar.
Este ejemplo demuestra la utilización de un
calorímetro diferencial de barrido (DSC) para monitorizar la
sensibilidad a la temperatura y la naturaleza endotérmica neta de
la reacción de una realización preferida que emplea los precursores
ACP activado y DCPD.
La mezcla de los precursores secos que contenía
pesos iguales de ACP y DCPD fue preparada mezclando en un molino de
laboratorio SPEX 850 con una cámara de trituración de cerámica de
alúmina SPEX 8505, los precursores ACP y DCPD según se describió en
el Ejemplo 4; el mezclado se llevó a cabo durante 2 minutos. La
preparación del precursor hidratado fue realizada añadiendo de 0,7
a 1,5 ml de agua por gramo de precursores secos mezclados. Se
añadió agua (0,05 ml), preenfriada a 4ºC aproximadamente, a 47,27 mg
de la mezcla de precursores secos y se colocó inmediatamente en el
calorímetro. El DSC (sistema de análisis térmico, serie 7 de Perkin
Elmer) fue fijado a una temperatura inicial de 0ºC con una
velocidad de barrido de 5ºC/minuto. Los resultados están mostrados
en la Figura 16. La gráfica representa la monitorización de los 7
primeros minutos de reactividad y muestra que esencialmente no
había flujo de calor entre 0,0ºC y 20ºC aproximadamente, punto en el
cual tenía lugar la aparición de un flujo de calor endotérmico. Las
propiedades del flujo de calor indican que a 37ºC la reacción es
esencialmente endotérmica y, bajo las condiciones utilizadas, la
reacción transcurre sólo muy lentamente, si es que tiene lugar, a
temperaturas por debajo de 20ºC aproximadamente. Por tanto, la
reactividad neta en el sistema, esto es, la suma del flujo de calor
endotérmico y exotérmico del sistema, es endotérmica.
Este ejemplo describe la conversión del ACP en
fosfato de calcio PCA en ausencia de un promotor y demuestra la
incapacidad de endurecimiento del fosfato de calcio PCA recién
formado. De igual modo, el promotor DCPD no se endurece ni se
convierte por sí mismo.
El DCPD y una variedad de ACPs y otros fosfatos
de calcio fueron mezclados con agua y analizados para determinar su
capacidad de endurecimiento a 37ºC. La Tabla 6 resume estos
resultados, además de identificar los productos de reacción, si es
que hay alguno, después del periodo de ensayo. No se observó
endurecimiento bajo ninguna circunstancia hasta 3 días. Se concluyó
que aunque puede tener lugar la conversión del ACP en fosfato de
calcio PCA, es deseable la presencia de un promotor para conseguir
el fraguado y el endurecimiento.
Se preparó un precursor hidratado (ACP y DCPD)
según se describió en los Ejemplos 4, 5 ó 37 ó 10, con la excepción
de que se utilizaron una variedad de medios de hidratación. Las
muestras fueron analizadas posteriormente para determinar la dureza
y la finalización de la reacción a varios puntos de tiempo. En todos
los casos, 1 g de los precursores mezclados fue hidratado con
0,75-1,0 ml de medio de hidratación para producir
una pasta. La Tabla 7 resume los resultados y demuestra que puede
utilizarse una variedad de líquidos acuosos y, en particular, de
medios fisiológicamente aceptables, en la preparación del fosfato de
calcio PCA.
Se determinó la porosidad de una muestra
endurecida de fosfato de calcio PCA preparada según el Ejemplo
5.
Una muestra endurecida de fosfato de calcio PCA
(1 g) fue pesada inmediatamente después de ser retirada del
incubador húmedo y secada posteriormente al aire a temperatura
ambiente durante 12 horas. La muestra seca fue pesada
cuidadosamente y a continuación se calculó su volumen. La muestra
fue colocada en una muestra de agua de 20 ml. Después de 1 minuto,
se observó el desplazamiento aproximado del volumen. Se encontró que
la muestra seca absorbía hasta un 50-60% de su peso
seco en H_{2}O. Se interpreta que estos resultados indican que la
muestra es hasta un 50-60% porosa. La densidad era
aproximadamente 1,65 g/cm^{3}.
Este ejemplo demuestra la utilización de un
polímero reabsorbible para estimular la conversión del ACP en
fosfato de calcio PCA.
Se prepara PLLA granulado y se tamiza hasta un
tamaño de 100 \mum. El polvo así obtenido es mezclado con el ACP
del Ejemplo 37 (ACP:PLLA 5:1) y triturado durante 5 minutos en un
molino de laboratorio SPEX. Se añade agua a 1 g de la mezcla para
formar una pasta moldeable. A la pasta se le da la forma de una bola
y se calienta a 37ºC en un entorno húmedo durante 1 hora. La
muestra endurecida es analizada utilizando FTIR y DRX.
Este ejemplo investiga las características del
endurecimiento del precursor hidratado a temperaturas
sub-ambiente.
El precursor hidratado fue preparado con agua
según se describió en el Ejemplo 37 y posteriormente cerrado
herméticamente para evitar la pérdida por evaporación en un tubo con
parafilm o con aluminio. Las muestras fueron posteriormente
mantenidas hasta 1 hora, 24 horas y 6 días. A los puntos de tiempo
indicados, la muestra hidratada fue retirada de la refrigeración y
colocada en un entorno húmedo a 37ºC. En todos los casos las
muestras se endurecían en 30 minutos.
Este ejemplo demuestra el efecto de mantener el
precursor hidratado a temperatura ambiente sin tapar.
El precursor seco fue preparado según se
describió en el Ejemplo 6, excepto C. El precursor seco fue mezclado
con la cantidad indicada de agua y analizado para determinar el
endurecimiento y la inyectabilidad a través de una aguja de calibre
16 después de permanecer a temperatura ambiente sin tapar durante
varios periodos de tiempo. Los resultados están descritos en la
Tabla 8.
Estos resultados demuestran que una muestra de
un gramo puede ser estable como una pasta inyectable en condiciones
de temperatura ambiente durante un tiempo de hasta 45 minutos, y que
una muestra de 5 gramos puede ser estable como una pasta inyectable
hasta 30 minutos en condiciones ambiente (al aire, 25ºC).
Este ejemplo ilustra el método para preparar una
pastilla con una prensa hidráulica.
Se utiliza una Prensa de Laboratorio Carver. Se
mide en peso una cantidad específica de polvo. El polvo es
posteriormente colocado en el molde del portamatriz. La altura o el
espesor están determinados en parte por la cantidad de material
utilizada en el molde. Una vez que el material está en el
portamatriz, el molde es colocado en la prensa hidráulica. Se fija
una carga deseada en la prensa. El material es comprimido
posteriormente durante una cantidad de tiempo específica. Una vez
que ha transcurrido el tiempo, la pastilla resultante es expulsada
del portamatriz a un recipiente de conservación.
Una muestra de 0,5 g, ID=AB com1, del lote
AB971002 fue comprimida a 500 psi (libras por pulgada cuadrada)
durante 5 minutos en la Prensa de Laboratorio Carver. Los aspectos
físicos de la pastilla resultante fueron: diámetro = 13 mm, altura
= 3 mm y la densidad era de 1,27 g/cm^{3}. La resistencia mecánica
fue descrita como dura y capaz de ser partida a mano. Después del
análisis mediante FTIR, la pastilla tenía un 70% de PCA en tejido
húmedo, un 90% de PCA en 20 ml de agua destilada y un 100% de PCA en
solución tamponada carbonatada (0,2 moles de CO_{3}^{2-}). Una
segunda muestra de 0,5 g, ID=AB com2, del lote AB971002 fue
comprimida a 4700 psi durante 5 minutos en la Prensa de Laboratorio
Carver. La pastilla tenía los resultados siguientes: diámetro = 13
mm, altura = 2 mm y la densidad era de 1,99 g/cm^{3}. La
resistencia mecánica fue descrita como muy dura y capaz de ser
partida con la mano. Cuando la pastilla fue incubada a 37ºC durante
60 horas y analizada mediante análisis FTIR, se encontraron los
resultados siguientes: un 60% de PCA en tejido húmedo, un 60% de
PCA en 20 ml de agua destilada y un 60% de PCA en solución tamponada
carbonatada (0,2 moles de CO_{3}^{2-}).
Este ejemplo demuestra el método para preparar
una pastilla con una prensa manual.
Se utiliza una Prensa Perkin Elmer Quick. Se
producen pastillas de 7 mm de diámetro utilizando los portamatrices
seleccionados junto con la Prensa Quick. Pueden utilizarse también
otros portamatrices de diferentes diámetros dependiendo de las
medidas deseadas. La superficie de la pastilla puede ser plana o
redondeada, dependiendo de la forma del molde. La muestra es
cargada en el molde de la matriz seleccionada. A medida que aumenta
la cantidad de muestra, aumenta también el grosor de la pastilla. A
continuación, se selecciona una posición de referencia de las
diferentes posiciones manuales dispuestas en la parte superior de la
Prensa Quick. El portamatriz es colocado en posición en la Prensa
Quick. Se aplica una presión constante al mango de la Prensa Quick
durante un tiempo seleccionado. Una vez que ha transcurrido el
tiempo, la pastilla es extraída del molde retirando la tapa
inferior del portamatriz y aplicando presión a la parte superior de
la matriz con el fin de expulsar la pastilla del portamatriz.
Una muestra de 0,08 g, ID=AB com3, de AB del
lote AB971002 fue medida en el portamatriz de 7 mm de diámetro. La
posición manual de la Prensa Quick fue fijada a 20 y se realizó la
compresión durante 1 minuto. La pastilla resultante tenía un
diámetro de 7 mm y una altura de 1,5 mm; la densidad era de 1,39
g/cm^{3}. Una segunda muestra, ID=AB com4, de 0,1 g de AB del
lote AB971002 fue medida en el portamatriz de 7 mm de diámetro. La
posición manual fue fijada a 20 y se comprimió durante 30 segundos
en la Prensa Quick. Se formó una pastilla resultante con un
diámetro de 7,0 mm y una altura de 2,0 mm; la densidad era de 1,23
g/cm^{3}.
Este ejemplo describe el comportamiento de las
pastillas de fosfato de calcio PCA en diferentes medios.
Los cuatro tipos de medio elegidos fueron:
\alpha-MEM (Medio Esencial Mínimo); TBS (Suero
Bovino Tris: 50 mM de Tris + 150 mM de NaCl);
\alpha-MEM + FBS (Suero Bovino Fetal al 10%); y
Medio Completo (inmersión durante 2 horas en TBS a 37ºC e inmersión
posterior en el \alpha-MEM + FBS).
Una muestra de 0,3 g de los precursores ACP y
DCPD mezclados fue comprimida durante un minuto a 7 toneladas
utilizando la Prensa de Laboratorio Carver. La pastilla resultante
(a) tenía un diámetro de 12 mm y una altura de 1 mm. La pastilla
fue colocada en 10 ml de agua destilada a 37ºC durante 30 minutos.
Después de la incubación, la pastilla fue colocada en 6 ml de
diferentes medios a 37ºC durante 24 y 48 horas.
Una segunda muestra de 1 g de los precursores
ACP y DCPD mezclados fue combinada con 0,8 ml de agua destilada. La
mezcla fue arrollada para formar una bola y vertida en 10 ml de agua
destilada a 37ºC durante 30 minutos. La bola fue posteriormente
triturada utilizando un mortero y una mano de mortero para obtener
un polvo fino. El polvo fue presionado durante un minuto a 7
toneladas utilizando una Prensa de Laboratorio Carver. La pastilla
resultante (b) tenía un diámetro de 12 mm y una altura de 1 mm. Las
pastilla fue colocada posteriormente en los diferentes medios a
37ºC durante 24 y 48 horas.
El pH de la solución de los medios fue medido (a
25ºC) a diferentes tiempos: 0, 24 y 48 horas después de la
incubación a 37ºC. Los resultados de este estudio están mostrados en
la Tabla 9.
Este ejemplo ilustra cómo se forma una pastilla
a partir de la pasta de fosfato de calcio PCA.
Se produce PCA utilizando ACP y DCPD como
promotor. Se utiliza solución salina como medio acuoso
biológicamente adecuado. La pasta de PCA preparada es
posteriormente endurecida in vitro a 37ºC y liofilizada a
continuación. El material de PCA es troceado posteriormente a mano.
Una vez troceado, el material de PCA es moldeado para formar una
pastilla mediante los métodos descritos en los Ejemplos 34 y 35.
Este ejemplo muestra cómo se forma una pastilla
a partir de la pasta de fosfato de calcio PCA.
Se seleccionaron como precursores ACP y DCPD. Se
utiliza una cantidad apropiada de solución salina para producir una
pasta de PCA. La pasta de PCA es moldeada en la forma deseada.
Posteriormente es incubada a 37ºC in vitro durante 30
minutos. El objeto endurecido es posteriormente liofilizado.
Este ejemplo compara los métodos de producción
de las pastillas mediante experimentación in vivo.
Las pastillas son producidas según el Ejemplo
32. Se implantan dos pastillas en el fémur de un perro. Loa
animales son sacrificados y los lugares de implantación son
analizados para determinar el material residual remanente a los
puntos de tiempo de 3, 4 y 6 semanas. A cada punto de tiempo, se
preparan y se tiñen cortes descalcificados y sin descalcificar del
lugar del implante. Estos cortes son analizados
histomorfométricamente para determinar la similitud de las
pastillas preparadas con la pasta de fosfato de calcio PCA.
Este ejemplo demuestra la utilización de un
agente de carga para estudiar el flujo plástico, con un interés
particular en el efecto sobre la resistencia a la tracción de la
pastilla.
Se utiliza un azúcar comprimible como agente de
carga junto con la producción de la pastilla. El azúcar es mezclado
con los precursores ACP y DCPD en una proporción de 1:1:1 antes de
la compresión. La pastilla es producida de acuerdo con el Ejemplo 1
con modificaciones en la duración del ciclo total de compresión y en
la duración de la fuerza de compresión máxima. La eficacia del
azúcar agente de carga es medida comparando la resistencia a la
tracción de las pastillas. La ecuación utilizada para calcular la
resistencia a la tracción es:
\sigma_{0}
=
2F/IIdt,
en la que \sigma_{0} es la
resistencia a la tracción, F es la fuerza necesaria para cortar la
tableta, d es el diámetro de la pastilla y t es el espesor o altura
de la
tableta.
Este ejemplo explica cómo se utiliza la pastilla
como vehículo para la administración de una vacuna.
Se prepara hemocianina de la lapa ojo de
cerradura a una concentración de 0,5 mg/ml en solución salina
tamponada con fosfato, pH 7,0. Se añaden 0,8 ml de esta solución a
1 g de una mezcla 1:1 de ACP activado y DCPD y se mezcla para dar
lugar a una masilla. La masilla de PCA preparada es posteriormente
liofilizada. El material seco es triturado durante 10 minutos para
dar un polvo utilizando un molino de laboratorio SPEX 8510 con una
cámara de trituración de cerámica de alúmina SPEX 8505. El PCA en
polvo es posteriormente preparado como una pastilla según se
describió en el Ejemplo 32. La pastilla formada según el Ejemplo 32
es implantada subcutáneamente en una rata. El proceso es repetido
mensualmente durante cuatro meses. Se extraen muestras de sangre
regularmente y se determina el título de anticuerpos
anti-hemocianina de la lapa ojo de cerradura
mediante ELISA.
Este ejemplo describe la utilización del fosfato
de calcio PCA en la fusión de vértebras espinales caninas.
Los animales fueron anestesiados según se
describió en el Ejemplo 26, colocados en posición de decúbito
lateral derecho, afeitados desde la línea media anterior a la
posterior, extendiéndose desde el tórax medio hacia la pelvis.
Después de una preparación estéril y de cubrir al animal con un paño
estéril, se llevó a cabo un abordaje retroperitoneal izquierdo
estándar a la columna vertebral lumbar anterior, con exposición de
las vértebras L3-L6. Los vasos segmentados que
cubrían L4 y L5 fueron ligados y divididos, permitiendo la
exposición anterolateral de los discos L3-4,
L4-5 y L5-6. Se realizaron
discotomías anteriores a cada nivel con la placa terminal preparada
paralela y para hacer sangrar el hueso subcondral utilizando una
sierra oscilante de dos hojas paralelas (Aesculap). Después de la
discotomía, una caja de titanio cilíndrica conteniendo fosfato de
calcio PCA o hueso autólogo, o una caja vacía fue insertada en cada
espacio discal. Se recogió un injerto óseo autólogo de la cresta
ilíaca anterior izquierda mediante una incisión preparada justo
antes de su inclusión en la caja y de la inserción en el espacio
discal. Una vez que fueron insertadas las tres cajas, se aplicó una
fijación interna utilizado tornillos para los cuerpos vertebrales de
4,5 mm y una varilla longitudinal de 6 mm de diámetro desde la L3 a
la L6. Posteriormente se realizó el cierre en capas de la herida
abdominal y del lugar del injerto de la cresta ilíaca utilizando
suturas absorbibles y agrafes cutáneos.
Los perros fueron sacrificados a las dos y a las
doce semanas y se examinó la histología de las secciones sin
descalcificar para determinar la evidencia de crecimiento de hueso
nuevo y de la fusión vertebral. Tras la inspección visual del
explante, las vértebras de la columna parecían fusionadas utilizando
el fosfato de calcio PCA de la invención.
La finalidad de este estudio era examinar la
cicatrización ósea en presencia del material de PCA inventado.
Para este estudio, se utilizaron 30 conejos NZW
adultos. A lo largo del curso del estudio estaban disponibles ad
libitum agua corriente y pastillas de pienso certificado de
conejo. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia
total y condiciones asépticas. Se administró posteriormente
cefazolina (22 mg/ml) 30 minutos antes de la cirugía. La anestesia
constaba de 10 ml de ketamina (100 mg/ml), 1 ml de xilacina (100
mg/ml) y 5 ml de solución salina fisiológica al 0,9% (87,5 mg/kg de
ketamina, 8,75 mg/kg de xilacina). El cóctel anestésico fue
administrado a un nivel de dosis de 1,4 ml/kg i.m. El miembro
trasero de los animales fue posteriormente afeitado y lavado con la
solución quirúrgica Betadine y alcohol. Antes de la cirugía el
animal fue monitorizado para asegurarse de que estaba anestesiado
apropiadamente. Para realizar esto, se aplicó presión en la
almohadilla subplantar. Cuando el animal dejó de responder, se
interrumpió la anestesia. A lo largo de todo el procedimiento el
animal fue monitorizado para determinar la contracción de los
bigotes, lo cual indicaría la reanimación del animal. Utilizando
una técnica aséptica, se realizó una incisión sobre la tibia
proximal. El tejido blando fue retirado hacia un lado y se expuso el
hueso. Se utilizó un torno manual dental con un trépano de 8 mm a
baja velocidad con irrigación (solución salina fisiológica al 0,9%)
cuando era necesario. El disco óseo fue liberado mediante disección
y luego el lugar fue preparado para el implante. El material de PCA
fue posteriormente colocado en el defecto. Los tejidos blandos
fueron cerrados en capas con el material de sutura Dexon^{TM}
3-0. Se realizó una muestra por animal utilizando
este método. Los animales fueron monitorizados y se les administró
buprenorfina (0,02-0,05 mg/kg, s.c.) y un
antibiótico de amplio espectro cuando despertaron. El analgésico y
el antibiótico fueron administrados 2 veces al día durante tres
días después de la cirugía. Se extrajo sangre de cada animal antes
de la eutanasia. El método utilizado para extraer sangre fue según
sigue: Se administró a cada animal acepromazina (1 mg/kg, s.c.) para
relajar al animal y dilatar los vasos, 15-20
minutos aproximadamente antes de la extracción de sangre. A
continuación, se colocó en la arteria central de la oreja una
palomilla de 23 G.
Se utilizó un vacutainer que tenía acoplado un
tubo de vidrio de 2 cc para extraer no más de 2 ml de sangre del
animal. Una vez que se había extraído la sangres se retiró la aguja
y se aplicó presión sobre el vaso para permitir una coagulación
apropiada. Además, se administraron inyecciones intramusculares
durante el procedimiento quirúrgico mientras el animal estaba bajo
anestesia total. El lugar del tejido blando fue posteriormente
afeitado y preparado para inyecciones del material de PCA de Tipo
10.0. Se realizaron 3-5 inyecciones en el músculo
lumbar utilizando una aguja hipodérmica de calibre 16. Se aplicaron
a los conejos 4 ó 5 inyecciones a los puntos de tiempo de 4, 7 y 14
días con el fin de permitir la recuperación del material de PCA para
análisis químico. Los puntos de tiempo restantes tenían únicamente
3 inyecciones. Cada inyección contenía 0,2 gramos aproximadamente
del material de PCA. En el lado contralateral se aplicaron 3
inyecciones de material de sutura reabsorbible que actuaron como
control positivo. Los animales fueron sacrificados por anestesia
intravenosa con pentobarbital sódico seguido por exsanguinación por
incisión de las arterias axilares. Para el análisis mediante FTIR y
DRX, el material de PCA fue extraído de los lugares de los implantes
en el tejido blando, congelado instantáneamente en isopentano y
almacenado en un congelador a -70ºC antes de su envío a ETEX
Corporation en hielo seco. Se extrajeron lugares de ensayo de
tejido blando y duro y se prepararon para histología.
Después de la eutanasia y la exsanguinación, los
tejidos fueron extraídos de los animales, incluidos en parafina,
seccionados y teñidos con hematoxilina y eosina para preparar
secciones histopatológicas. A continuación, 300 mg del material de
PCA recuperado fueron analizados en un difractómetro de rayos X de
ánodo rotatorio Rigaku RU300 en las dependencias del Center for
Materials Science and Engineering del Massachusetts Institute of
Technology de Cambridge, MA el 22 de Enero de 1997. Una mezcla
homogénea de 300 mg de KBr y 1,5 mg del material de PCA recuperado
fue analizada mediante FTIR en un Spectrum 1000 de Perkin Elmer.
Además, las secciones de tejido fueron puntuadas por la formación
de hueso endosteal en un escala de 0 a +3. La áreas con infiltrados
neutrofílicos tenían generalmente poco osteoprogenitor o formación
de hueso nuevo. En un escala de 0 a +3, siendo 0 la no formación de
hueso endosteal nuevo y siendo +3 una extensa formación de hueso
endosteal nuevo, los animales tenían en el día 4 de 0 a +1, en el
día 7 tenían +1 y en el día 14 tenían +2.
En el día 4 y en el día 7 era visible una ligera
inflamación sobre el lugar del defecto. Los hallazgos macroscópicos
en el día 14 mostraban el desarrollo de un callo óseo con forma
abovedada sobre el lugar taladrado. Había una madurez incrementada
del callo óseo en el lugar del defecto en todos los grupos de ensayo
cuando se evaluaron el día 21, y una falta de reacción
significativa en el periostio sobre la corteza restante.
Microscópicamente, el lugar del defecto había sido rellenado con
hueso trabecular y cortical. Había una cantidad moderada de
formación de hueso trabecular endosteal alrededor de, y
extendiéndose hacia, el material de PCA. En el día 21 no había
indicios de reacción adversa hacia el material de PCA implantado. Se
recuperaron muestras a los días 4, 7 y 14 y se analizaron
utilizando DRX. Ver la Figura _____. Estos espectros confirmaron lo
siguiente: La estructura cristalina del material de PCA es estable
durante al menos 14 días in vivo y es sustancialmente la
misma que la del material de PCA preparado in vitro.
Adicionalmente, se recuperaron muestras de los animales los días 4,
7 y 14 y se analizaron mediante FTIR. Ver la Figura _____. El
material de ensayo era químicamente estable y la reacción se había
completado in vivo. El material de PCA no causó ninguna
respuesta inflamatoria inaceptable cuando se implantó
intramuscularmente o en el lugar de un defecto óseo. Mediante el
análisis de DRX y FTIR, se determinó que el material de PCA era
químicamente estable in vivo hasta 21 días después del
implante.
El objetivo de este estudio era cuantificar la
cicatrización ósea en presencia del PCA de la invención y
monitorizar la reabsorción de material de PCA implantado.
El protocolo fue firmado el 14 de Febrero de
1996 y el estudio se llevó a cabo en Bio-Research
Laboratories Ltd., 87 Senneville Rd., Senneville, Quebec, Canadá,
H9X 3R3 de acuerdo con las Regulaciones de Buenas Prácticas de
Laboratorio de la FDA de Estados Unidos (21 CFR Parte 58). Las
cirugías se llevaron a cabo el 15, 16, 22, 23 y 29 de Febrero y en
Marzo de 1996 (para el estudio de 6 meses) y el 11 y 12 de Abril de
1996 (para el estudio de 1 año).
Los perros beagle (canis familiaris)
fueron obtenidos de HRP Inc., 6321 South 6th Street, Kalamazoo, MI
49009, EE.UU. Los perros fueron alojados individualmente en jaulas
de acero inoxidable equipadas cada una de ellas con un suelo de
tipo barras y una válvula para bebida automática en 4 salas
separadas. Los animales tenían acceso a un pienso para perros
comercial en pastillas certificado estándar (400 g - PMI Certified
DogChow 5007: PMI Feeds Inc.) una vez al día y los cuencos
permanecían en las jaulas durante 24 horas aproximadamente (excepto
durante los procedimientos indicados). Además, algunos animales
recibieron ocasionalmente un suplemento dietético de alimento
enlatado, Mixit o Canine ID (Hill's Science Diet). Agua corriente
municipal fue suministrada ad libitum.
El material de PCA fue suministrado como un
polvo estéril en paquetes prepesados. El material fue preparado el
día de la cirugía para el implante. El material fue hidratado con
las cantidades apropiadas de agua estéril y almacenado tapado a
temperatura ambiente antes del implante. Cada perro recibió una
dosis de Penlong-XL (Benzatina penicilina G y
Procaína penicilina G) (1 ml) intramuscularmente al menos 1 hora
antes de la cirugía y de nuevo 2 días después de la cirugía. Cada
animal fue preanestesiado con una inyección intramuscular de
AC-Promazina (0,05 mg/kg), Butorfanol (0,2 mg/kg) y
Glicopirrolato (0,01 mg/kg) al menos 10 minutos antes de la
preparación prequirúrgica. Los animales fueron posteriormente
preparados para la cirugía afeitando uno (Grupos 1 y 2) o ambos
(Grupos 3 y 4) miembros posteriores, desde la pelvis hasta la parte
inferior de la pata. El área afeitada fue lavada con
Hibitane^{TM} (gluconato de clorhexidina al 4%) seguido por una
aplicación abundante de isopropanol al 70% y Betadine^{TM}
(povidona yodada al 10%). Los animales fueron anestesiados con una
inyección intravenosa de tiopentona sódica al 2,5% y el lugar de la
inyección subcutánea (región torácica dorsal media) del Grupo 2 fue
preparado de la misma manera. Antes de la cirugía, se administró a
cada ojo un ungüento Duratears^{TM}. Todos los animales fueron
intubados y mantenidos bajo anestesia con isofluorano para el
procedimiento quirúrgico. Ringer lactado (a una velocidad de 10
ml/kg/hora) fue administrado perioperativamente.
Se realizó una incisión cutánea longitudinal a
lo largo de la superficie lateral del miembro posterior para
exponer 8-10 cm aproximadamente del fémur. El
periostio que cubría el fémur fue retirado hacia un lado del hueso.
Se aplicó un plantilla (que medía 6 cm) para identificar los lugares
de los orificios que iban a ser taladrados en cada extremo de la
caña del hueso. Utilizando un taladro del tamaño apropiado, se
retiró un fragmento de hueso de 3-5 mm de
profundidad aproximadamente de cada extremo de la caña y utilizando
una sierra oscilante este orificio fue alargado distalmente
4-5 cm aproximadamente. Se extrajo la médula y
cualquier sangrado significativo fue controlado apropiadamente. En
los animales del Grupo 1, después de crear el lugar del defecto, el
hueso extraído fue cortado en pequeños fragmentos, lavado con
solución salina y introducido en el lugar del defecto como
aplicación ósea autóloga. En los animales del Grupo 2, después de la
creación del lugar del defecto, el material sustituto del hueso fue
colocado en el lugar del defecto, asegurándose de no dejar una
cantidad en exceso del material en los tejidos circundantes. Después
de este procedimiento, se inyectó subcutáneamente en la región
torácica dorsal media una cantidad de - - de BSMTM (hasta
constituir una dosis total de 25 g). En el caso de los animales de
los Grupos 3 y 4, después de la creación del lugar del defecto en
el primer miembro posterior, el material sustituto del hueso fue
colocado en el lugar del defecto, asegurándose de no dejar una
cantidad en exceso del material en los tejidos circundantes. El
hueso extraído fue cortado en pequeños fragmentos y lavado con
solución salina. Se creó un lugar de defecto en el miembro opuesto
y el hueso preparado fue colocado en ese lugar. Cada lugar de
defecto fue marcado colocando una pieza de 1 mm de un hilo metálico
K en cada extremo de la hendidura. Posteriormente la fascia fue
suturada con sutura reabsorbible para asegurar que el material
permanecía en su lugar. El lugar quirúrgico fue cerrado con agrafes
quirúrgicos y los agrafes fueron retirados 10 días después de la
cirugía aproximadamente.
Se realizó una radiografía de ambos miembros
posteriores de cada animal del Grupo 3 el día de la necropsia para
la Semana 0, y en todos los animales supervivientes del Grupo 3 en
las Semanas 3, 12 y 26. Los animales fueron sedados para el
procedimiento. Los animales fueron sacrificados mediante anestesia
intravenosa con pentobarbital sódico seguido por exsanguinación por
incisión de las arterias axilares. Los tejidos indicados
anteriormente fueron preparados mediante inclusión en parafina,
corte y tinción con hematoxilina y eosina. La mitad de cada lugar
de implante femoral (Grupos 1, 2 y 4) fue preparada como una sección
descalcificada y preparada como cortes teñidos con hematoxilina y
eosina y tricómico de Masson. La mitad restante de cada sitio de
implante fue conservada en alcohol al 70% y preparada como una
sección sin descalcificar (en un medio de inclusión apropiado) y
teñida con von Kossa y tricrómico de Goldner mientras que se fijó en
fluido de Zenker.
Después del análisis histopatológico, se llevó a
cabo un análisis histomorfométrico. Los límites del defecto fueron
determinados subjetivamente y el área total del hueso y del material
de PCA presente fue tabulada para la región del defecto. La
histomorfometría confirmaba y ampliaba la histopatología. Los datos
histomorfométricos de todas las secciones sin descalcificar teñidas
con von Kossa de todos los grupos experimentales disponibles fueron
agrupados en cada punto de tiempo de acuerdo con el tipo de
implante, independientemente de si los animales eran del grupo 1, 2
ó 4. Los resultados de la formación de hueso nuevo en los defectos
tratados con el material de PCA y en los defectos tratados con el
autoinjerto, así como de la reabsorción del material de PCA, están
presentados en la Figura _____. La formación de hueso nuevo en los
receptores del autoinjerto parecía tener lugar ligeramente antes
que la formación de hueso nuevo en los receptores del material de
PCA. A las cuatro semanas, el hueso nuevo en los receptores del
autoinjerto alcanzó un valor casi máximo del 74,7% +/- 20 (SEM;
n=8). Hacia la semana 26 los valores del autoinjerto habían
disminuido hasta el 56,78% +/- 20,9 (SEM; n=4), sugiriendo que la
remodelación incrementada estaba teniendo lugar debido quizá al
fracaso de algunas regiones de injerto. Aunque el hueso nuevo no
alcanzó su valor máximo (77,18% +/- 11,2, SEM; n=8) hasta la semana
12 en los receptores del material de PCA, la remodelación aparente
observada en los autoinjertos a las 26 semanas no fue observada en
los receptores del material de PCA. Los valores del material de PCA
en la semana 26 (78% +/- 21,5, SEM; n=4) eran comparables a los
valores de la semana 12. El material de PCA residual observable
representaba menos del 95% del área superficial total del defecto
hacia la semana 4 y menos de un 0,3% hacia la semana 26. Como el
defecto fue rellenado originalmente un 100% con el material de PCA,
la reabsorción era mayor del 99% hacia la semana 26.
Claims (16)
1. Un vehículo para la administración de un
agente biológicamente activo, que comprende
- (A)
- un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de polipéptidos, polinucleótidos, nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas, sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas, antisépticos, inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos, antiácidos, inmunosupresores o factores inmunomoduladores, sustancias antivirales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes musculares, sustancias antiPakinsonianas, antiespasmódicos, contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes, diuréticos, mióticos, anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios, compuestos antiprotozoos, antihipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo, medicaciones antinertígicas, medicaciones contra el mareo por movimiento, anestésicos locales, oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicóticas, agentes para la producción de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos, factores de crecimiento, neurotransmisores, modificadores de la respuesta celular y vacunas, y
- (B)
- un fosfato de calcio apatítico sintético débilmente cristalino (PCA) obtenible a partir de un proceso que comprende:
- \quad
- la exposición de un fosfato de calcio amorfo (ACP) a un promotor seleccionado de fosfatos de calcio ácidos en presencia de una cantidad limitada de una solución acuosa,
- \quad
- de tal manera que se forme un precursor hidratado con consistencia de pasta o masilla.
2. Un vehículo para la administración de un
agente biológicamente activo, que comprende
- (A)
- un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de polipéptidos, polinucleótidos, nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas, sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas, antisépticos, inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos, antiácidos, inmunosupresores o factores inmunomoduladores, sustancias antivirales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes musculares, sustancias antiPakinsonianas, antiespasmódicos, contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes, diuréticos, mióticos, anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios, compuestos antiprotozoos, antihipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo, medicaciones antinertígicas, medicaciones contra el mareo por movimiento, anestésicos locales, oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicóticas, agentes para la producción de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos, factores de crecimiento, neurotransmisores, modificadores de la respuesta celular y vacunas, y
- (B)
- un fosfato de calcio apatítico sintético débilmente cristalino (PCA) endurecido obtenible a partir de un proceso que comprende:
- \quad
- la exposición de un fosfato de calcio amorfo (ACP) a un promotor seleccionado de fosfatos de calcio ácidos en presencia de una cantidad limitada de una solución acuosa,
- \quad
- de tal manera que se forme un precursor hidratado con consistencia de pasta o masilla,
- \quad
- y permitiendo que el precursor hidratado se endurezca.
3. El vehículo de la reivindicación, en el que
el fosfato de calcio PCA es formado a partir de un precursor
hidratado que se endurece a 22ºC después de un tiempo mayor de una
hora o que se endurece a 37ºC después de un tiempo menor de una
hora, preferiblemente después de 10 a 30 minutos.
4. El vehículo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor fosfato de calcio
ácido es seleccionado de tal manera que, en combinación con el ACP,
se obtenga un fosfato de calcio PCA con una proporción Ca/P en el
rango de 1,1 a 1,9 aproximadamente.
5. El vehículo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el promotor fosfato de calcio
ácido es seleccionado del grupo que consta de fosfato dicálcico
dihidrato, metafosfato de calcio, decafosfato de heptacalcio,
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino, pirofosfato de
calcio, fosfato octacálcico y fosfatos tricálcicos.
6. El vehículo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un material adicional
seleccionado para cambiar un parámetro físico del vehículo, donde
el parámetro físico es seleccionado del grupo que consta de
resistencia, tiempo de reabsorción, adherencia, inyectabilidad,
características de fricción y cinética de liberación.
\newpage
7. El vehículo de la reivindicación 4, en el que
el fosfato de calcio PCA tiene una proporción Ca/P menor de
1,5.
8. Un método para producir un vehículo para la
administración de un vehículo biológicamente activo, que comprende
las etapas de:
- -
- la mezcla, en cualquier orden, de un fosfato de calcio amorfo (ACP) y una solución acuosa, la adición de un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de polipéptidos, polinucleótidos, nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas, sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas, antisépticos, inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos, antiácidos, inmunosupresores o factores inmunomoduladores, sustancias antivirales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes musculares, sustancias antiPakinsonianas, antiespasmódicos, contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes, diuréticos, mióticos, anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios, compuestos antiprotozoos, antihipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo, medicaciones antinertígicas, medicaciones contra el mareo por movimiento, anestésicos locales, oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicóticas, agentes para la producción de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos, factores de crecimiento, neurotransmisores, modificadores de la respuesta celular y vacunas, y
la exposición del ACP reactivo a un promotor
seleccionado de fosfatos de calcio ácidos antes, durante o después
de las etapas de mezclado y adición,
de tal manera que se forme un precursor
hidratado con consistencia de pasta o masilla.
9. Un método para la producción de un vehículo
para la administración de un agente biológicamente activo, que
comprende las etapas de:
- -
- la mezcla, en cualquier orden, de un fosfato de calcio amorfo (ACP) y una solución acuosa, la adición de un agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de polipéptidos, polinucleótidos, nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas, sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas, antisépticos, inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos, antiácidos, inmunosupresores o factores inmunomoduladores, sustancias antivirales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes musculares, sustancias antiPakinsonianas, antiespasmódicos, contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes, diuréticos, mióticos, anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios, compuestos antiprotozoos, antihipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo, medicaciones antinertígicas, medicaciones contra el mareo por movimiento, anestésicos locales, oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicóticas, agentes para la producción de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos, factores de crecimiento, neurotransmisores, modificadores de la respuesta celular y vacunas, la exposición del ACP reactivo a un promotor seleccionado de fosfatos de calcio ácidos antes, durante o después de las etapas de mezclado y adición, de tal manera que se forme un precursor hidratado con consistencia de pasta o masilla, y
- -
- el permitir que la mezcla se endurezca, mediante lo cual se forma un fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino sintético (PCA).
10. Un método para la producción de un vehículo
para la administración de un agente biológicamente activo, que
comprende las etapas de:
- -
- la mezcla, en cualquier orden, de un fosfato de calcio amorfo (ACP) y una solución acuosa, y la exposición del ACP a un promotor seleccionado de fosfatos de calcio ácidos antes, durante o después de las etapas de mezclado y adición, de tal manera que se forme un precursor hidratado con consistencia de pasta o masilla,
- -
- el permitir que la mezcla se endurezca, mediante lo cual se forma un fosfato de calcio apatítico sintético débilmente cristalino (PCA), y
- -
- la adición del agente biológicamente activo seleccionado del grupo que consta de polipéptidos, polinucleótidos, nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas, sustancias anti-SIDA, sustancias anticancerosas, antisépticos, inhibidores del ECA, antígenos, antagonistas adrenérgicos, antiácidos, inmunosupresores o factores inmunomoduladores, sustancias antivirales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, opioides, hipnóticos, antihistamínicos, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivantes, relajantes musculares, sustancias antiPakinsonianas, antiespasmódicos, contracturantes musculares, antidiarreicos, antieméticos, laxantes, diuréticos, mióticos, anticolinérgicos, compuestos antiglaucoma, compuestos antiparasitarios, compuestos antiprotozoos, antihipertensivos, analgésicos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios, agentes antitusivos, medicaciones antivértigo, medicaciones antinertígicas, medicaciones contra el mareo por movimiento, anestésicos locales, oftálmicos, prostaglandinas, antidepresivos, sustancias antipsicóticas, agentes para la producción de imágenes, agentes vectorizantes específicos, factores tróficos, factores de crecimiento, neurotransmisores, modificadores de la respuesta celular y vacunas.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que el promotor de fosfato de calcio
ácido es seleccionado de tal manera que, en combinación con el ACP,
se obtenga un fosfato de calcio PCA con una proporción Ca/P en el
rango de 1,1 a 1,9 aproximadamente.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que el promotor de fosfato de calcio
ácido es seleccionado del grupo que consta de fosfato dicálcico
dihidrato, metafosfato de calcio, decafosfato de heptacalcio,
fosfato de calcio apatítico débilmente cristalino, pirofosfato de
calcio, fosfato octacálcico y fosfatos tricálcicos.
13. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que la solución acuosa es una
solución tamponada seleccionada por su compatibilidad con el agente
biológicamente activo.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en el que el endurecimiento está asociado
con una reacción endotérmica.
15. Un método de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, que incluye además una etapa de modelado
del fosfato de calcio PCA para darle una forma predeterminada.
16. El método de la reivindicación 11, en el que
el fosfato de calcio PCA tiene una proporción Ca/P menor de
1,5.
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