JP2002539172A

JP2002539172A - Ｔｇｆ−ベータを含む医薬組成物

Info

Publication number: JP2002539172A
Application number: JP2000604870A
Authority: JP
Inventors: テュードル・アルビンテ; ウベ・トーマス・ショーテ; ユルゲン・ジーク
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2002-11-19
Also published as: WO2000054797A3; WO2000054797A2; US20020064516A1; US6649168B2; AU3556400A; EP1161257A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、１態様において、ＴＧＦ−ベータおよび塩化カルシウム、リン酸カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムから選択された水溶性の塩を含む医薬組成物を提供する。もう１つの態様において、本発明は、ＴＧＦ−ベータおよび生物分解可能担体を含む医薬組成物も提供する。ここで、当該生物分解可能担体は、フィブリル化したカルシトニンである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＴＧＦ−βを含む医薬製剤に関する。トランスフォーミング増殖因子タイプβ(ＴＧＦ−β)は、分子量約２５０００
Ｄのホモ二量体タンパク質である。それは、細胞増殖および分化プロセス、骨お
よび結合組織における活性を調節する多機能サイトカインのファミリーである。
最高レベルのＴＧＦ−βが、血小板および骨に見出されている。ＴＧＦ−βの薬
理効果は当業界で知られており、それは、創傷治癒の促進および増進、骨、軟骨
、および組織の修復、癌の処置、骨髄保護剤、心保護のメディエーター、抗炎症
性もしくは免疫抑制剤、誘導組織相互作用のメディエーター、脈管形成の誘導、
口内粘膜炎、または哺乳動物の細胞培養における成長調節剤であってよい。

【０００２】本明細書で使用される「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βファミリーの構成員であ
る。任意のＴＧＦ−βアイソフォームおよび関連物質を本発明の医薬組成物に使
用し得る。本発明の好ましいＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および
ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ２およびＢＭＰ７等、特にＴＧＦ−β３である。ＴＧＦ
−β３は、それぞれ９個のシステインを含む１１２個のアミノ酸のポリペプチド
２個からなり、２５ｋＤのホモ二量体のジスルフィド結合されたタンパク質であ
る。このホモ二量体タンパク質のシステインは、４個の鎖内ジスルフィド結合お
よび１個の鎖間ジスルフィド結合を形成する。「ＴＧＦ−β」は、単一のまたは複数の変異、例えば、アミノ酸の置換、付加
または削除によるＴＧＦ−β変異体、例えば、類似の生物学的活性を示し、もと
のＴＧＦ−βタンパク質と異なるＴＧＦ−βタンパク質であるＴＧＦ−β変異体
を含む。

【０００３】我々は、ＴＧＦ−βを含む投与形態の開発時に、１つの問題を見出した。なぜ
なら、それは水溶液および粉末の形態において物理的および化学的安定性に乏し
いからである。ＴＧＦ−βをクロマトグラフィーの方法、例えば、ゲル電気泳動
およびＨＰＬＣによって分析するとき、ＴＧＦ−βの安定性は乏しいことを観察
し得る。

【０００４】我々は、ＴＧＦ−βが溶液中で容器の壁に付着するというさらなる問題をさら
に見出した。このような吸着現象は、安定な水性製剤、例えば、患者にとってよ
り扱いやすく使用され、製剤コストの低い予め満たしたゲルボトル品の開発にお
いて主要な障害となる。我々は、ＴＧＦ−βについて低治療用量(例えば、１０
μｇ／ｍｌ以下、例えば０．００１と１０μｇ／ｍｌの間、例えば、１と１０μ
ｇ／ｍｌの間)において、投与形態の製剤中、貯蔵中および患者によるＴＧＦ−
β製剤の使用前に表面への吸着が阻止されねばならないことを見出した。低濃度
で製剤において使用されることおよびＴＧＦ−βの表面への吸着のために、高感
度の分析方法の開発も必要である。

【０００５】我々は、今回驚くべきことに、ＴＧＦ−βが器壁に吸着されることを完全に阻
止するある種の物質を見出した。このような物質は、物理的および化学的安定性
が改善された様々なＴＧＦ−β投与形態に使用し得る。本発明は、１つの態様において、ＴＧＦ−βおよび塩化カルシウム、リン酸カ
ルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウムお
よび重炭酸アンモニウム、好ましくは塩化カルシウムおよびリン酸カルシウムか
ら選択される水溶性の塩を含む医薬組成物を提供する。本発明の水溶性の塩を含む医薬組成物において使用されるＴＧＦ−βは、それ
らの遊離形態またはそれらの塩の形態である。

【０００６】我々は、ＴＧＦ−β、特に、ＴＧＦ−β３の適当な濃度を決定するために適し
た分析方法も開発した。蛍光性の分子(タンパク質)のキュベット壁への吸着が生
じるとき、溶液中の分子の濃度は減少する。濃度のこの変化を、蛍光の強度の変
化(減少)によってモニターする。励起および発光モノクロメーターにおける最適
化されたスリットで、励起光線をキュベットの中心の小領域に集中させ、発光を
同じ領域から選択的に集光する。この局在化された励起および発光は、キュベッ
ト壁へ吸着した発光団の総発光強度に対する寄与が最小になることを示す。この
条件において、蛍光強度は水溶液中の分子の濃度に比例的する(キュベットの中
心においてモニターした)。結合が起これば、蛍光強度の減少が観察される。Ｔ
ＧＦ−βについてトリプトファン自体の蛍光を吸着試験に使用する。吸着プロセ
スを検討するために、ある時間間隔、例えば、２５分間隔でのキュベット中の器
壁に結合した総ＴＧＦ−βに基づくパーセンテージを測定する。蛍光測定を、２
５℃で、セル支持器に撹拌器を備えたSpex Fluorolog(商標)またはSpex Fluorom
ax(商標)スペクトロフォトメーターによって実施する。トリプトファン蛍光を２
８０ｎｍで励起させ、発光を３４０ｎｍでモニターする。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ
−β水溶液(１μｇ／ｍｌ)の場合、プラスチック、石英およびシリコン処理され
た石英キュベットに強く結合することが見出される。試験をDispolob(商標)、Ka
rtell(商標)P.N.1961によって供給されるディスポーザブルプラスチックキュベ
ット(ＰＭＭＡ)において実施するのが、殆どの蛍光吸光試験の再現性について特
に良好なシステムであった。

【０００７】タンパク質の様々な材料(キュベットが作られている材料以外)の表面への吸着
の試験方法も開発した。これらの実験において、ストック溶液からのＴＧＦ−β
を、水溶液(すなわち、水、最終ＴＧＦ−β濃度２μｇ／ｍｌ)を含むキュベット
に添加し、ＴＧＦ−βの壁への吸着を、吸着が平衡状態(一定の平衡強度)に到達
するまでの時間、モニターする。試験する必要がある材料２枚をキュベットに入
れ、ＴＧＦ−β３蛍光の変化をモニターする。ＴＧＦ−βがこの材料に吸着しな
いならば、時間中に蛍光強度の変化がない、すなわち表面への吸着が観察されな
い。ＴＧＦ−β３がその新しい材料に吸着するならば、蛍光強度の減少が観察さ
れる。

【０００８】本発明の好ましい組成物において、水溶性の塩イオンのＴＧＦ−β、例えば、
ＴＧＦ−β３に対するモル比は、１：１ないし２００：１、例えば、１０：１な
いし１００：１である。当業者は広範囲の賦形剤を使用し得ることがわかる。水溶性組成物にとって好
ましい構成成分は、例えば： a)液体溶媒、例えば、アルコール、例えばエタノールまたはイソプロパノール、 b)糖または糖アルコール、例えば、マンニトール、トレハロース、スクロース、
ソルビトール、フルクトース、マルトース、ラクトースまたはデキストラン、好
ましくはマンニトール、 c)他の賦形剤、例えば、ポリゲリン(polygeline)、ポリソルベート２０、PVC P
alinode(商標)Ｃ、および／またはメチルセルロース４０００ｃＰ d)等張性物質、例えば塩化ナトリウム、 e)酸、例えばクエン酸一水和物、酢酸、であり、使用する添加剤の量を意図する用途に応じて変えることができる。

【０００９】水溶性医薬組成物は、例えば、０．０５μg／ｍｌないし１００ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３、例えば０．１μｇ
／ｍｌないし４０ｍｇ／ｍｌ０．１ないし２００ｍｇ／ｍｌの塩、例えば塩化カルシウム、１ないし９０ｍｇ／ｍｌの液体溶媒、例えば、アルコール１ないし５０ｍｇ／ｍｌの糖または糖アルコール、０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌの酸を出す化合物、例えば、クエン酸一水和物また
は酢酸を含み得る。

【００１０】そのような溶液を標準的アンプル、バイアル、予め満たしたシリンジまたは複
数回投与システムで使用し得る。必要であれば、長期間、例えば、４０℃で６ヶ月間、冷蔵貯蔵不要で安定であ
る凍結乾燥製剤を、ＴＧＦ−β溶液から取得し得る。

【００１１】凍結乾燥製剤を、通常の方法で適当な溶液、例えば１ないし４．５、好ましく
は２．５ないし４のｐＨを有する例えば前記の溶液から取得し得る。好ましくは
、凍結乾燥前のこの溶液中のＴＧＦ−βの濃度は、０．１μｇ／ｍｌないし４０
ｍｇ／ｍｌ、例えば、１０μｇないし２ｍｇ／ｍｌである。凍結乾燥製剤を、例えばｐＨ５以下、例えばｐＨ２．５からｐＨ４で、長期間
、例えば１週間まで安定である溶液に再溶解し得る。そのような溶液において、
ＴＧＦ−βは、０．１μｇ／ｍｌないし４０ｍｇ／ｍｌ、例えば１０μｇないし
２ｍｇ／ｍｌの範囲である。溶液のｐＨは、２ないし１０、例えば２．５ないし４および６．８ないし１０
であってよい。本発明の乾燥粉末組成物、例えば、凍結乾燥製剤を、その溶液、ゲル、クリー
ム、スプレーの製造のために使用し得る。

【００１２】本発明のゲル製剤は、例えば、１０ないし５０μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β3 ０．１ないし１０ｍｇ／ｍｌの塩、例えば水和物形態の、例えば、塩化カルシウ
ム、１ないし２０ｍｇ／ｍｌの糖または糖アルコール、５ないし３０ｍｇ／ｍｌの増粘剤、例えば、メチルセルロース４０００ｃＰ。０．５ないし１０ｍｇ／ｍｌの酸を出す化合物、例えば、クエン酸一水和物また
は酢酸を含み得る。ゲルの最終ｐＨは、ｐＨ３ないしｐＨ４の間、例えば、ｐＨ３．４ないし３．
６の間である。

【００１３】本発明のスプレー製剤は、例えば、５０ないし５００μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３１ないし２０ｍｇ／ｍｌの塩、例えば水和物形態の、例えば、塩化カルシウム、１ないし５０ｍｇ／ｍｌの糖または糖アルコール、１ないし２０ｍｇ／ｍｌの酸、例えば、クエン酸一水和物または酢酸を含み得る。再構成されたスプレー溶液の最終ｐＨは、ｐＨ３およびｐＨ４の間、例えば、
ｐＨ３．２およびｐＨ３．６の間であってよい。

【００１４】安定なＴＧＦ−β投与形態を開発する必要がある一方で、効果的な送達システ
ムの必要性もまた存在する。１つの特に気懸りなことは、適用のすぐ後で、ＴＧ
Ｆ−βは、適用の部位から拡散することである。この効果は、ＴＧＦ−βが非常
に強力な化合物であるから、明らかに望ましくないことである。

【００１５】今回驚くべきことに、ＴＧＦ−βおよび生物分解可能な担体を含む組成物が、
前記の問題を解決することが見出された。ここで当該生物分解可能な担体は、フ
ィブリル化したカルシトニン、例えば、フィブリル化したカルシトニン誘導体で
ある。従って、本発明のさらなる態様において、ＴＧＦ−βおよび生物分解可能な担
体(ここで、当該生物分解可能な担体は、フィブリル化したカルシトニンである
）を含む医薬組成物を提供する。カルシトニンは、３２個のアミノ酸のポリペプチドホルモンであって、約３５
００の分子量である。それらは、哺乳動物の甲状腺の傍濾胞細胞によって、また
鳥および魚の後鰓腺(ultimobrachial gland)によって分泌される。

【００１６】生理食塩水溶液またはバッファー中で、特にヒトカルシトニンは安定ではない
。それは沈殿し、カルシトニンフィブリルからなるゲルを形成する。フィブリル
化したカルシトニンをＥＰ０５１０９１３(引用をもって本明細書の一部とする)
に記載された方法によって取得し得る。カルシトニンの濃度は、１ないし２００
ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５ないし１００ｍｇ／ｍｌであってよい。ヒトのカルシ
トニン(ｈＣＴ)フィブリルは、電子顕微鏡によって特徴付けられた[Bauer, H.H.
, Aebi, U., Haener, M., Hermann, R., Mueller, M., Arvinte, T., Merkle, H
.P.(1995)「Architecture and polymorphism of fibrillar supramolecular ass
enblies produced by in vivo aggregation of human calcitonin」,Journal of
Structural Biology 115, 1-15]。フィブリル化の時間は、例えば、５分ないし
１時間または２時間として非常に適切に定義される。より高濃度の溶液はより早
くフィブリル化し、より高温でより早くフィブリル化が起こる。

【００１７】フィブリル化は、また溶液中のイオン含量に依存し得る。フィブリル化段階が
完了するためには、２００ｍｇ／ｍｌのｈＣＴ水溶液の場合、１時間のインキュ
ベーション時間が必要である。ダブル・ヌクレエーション・メカニズムがヒトの
カルシトニンフィブリル化を説明するために提案された[Arvinite, T., Cudd, A
., Drake, A.F.(1993)「The structure and mechanism of formation of human
calcitonin fibrils」The Journal of Biological Chemistry 268, 6415-6422]
。本発明の医薬組成物において、フィブリル化したカルシトニンをゲル形態で使
用し得る。要すれば、カルシトニンフィブリルをフラグメント化し、そしてフラ
グメント化したフィブリルの分散物として使用し得る。フラグメント化したフィ
ブリルの分散物をＥＰ０５１０９１３(引用をもって本明細書の一部とする)に記
載された方法によって取得し得る。

【００１８】ゲルとして使用するとき、カルシトニンの濃度は１ないし２００ｍｇ／ｍｌ、
好ましくは、５ないし１００ｍｇ／ｍｌであってよい。フラグメント化したフィ
ブリルの分散物として使用するとき、カルシトニンの濃度は５０ｍｇ／ｍｌまで
であってよい。本発明のさらなる態様において、ＴＧＦ−βおよびカルシトニンフィブリルが
適用部位でインビボで形成されるフィブリル化したカルシトニンを含む医薬組成
物を提供する。

【００１９】カルシトニンは、好ましくはヒトカルシトニン(ｈＣＴ)であり、それは合成で
あってもよく、または組み換えＤＮＡ技術によっても製造され得る。「ヒトカル
シトニン」の語は、天然のヒトカルシトニンだけでなく、薬学的に許容できるそ
の誘導体およびその類似物、例えば、天然化合物中に存在する１個またはそれ以
上のアミノ酸残基が置換されているか、Ｎ−またはＣ−末端基が構造的に修飾さ
れたものも含む。サケ、ウナギもしくはブタのカルシトニンまたはそれらの誘導
体も使用し得る。

【００２０】特別な態様において、本発明はＴＧＦ−β３および生物分解可能な担体を含む
医薬組成物を提供する。ここで生物分解可能な担体は、フィブリル化したヒトの
カルシトニンである。ヒトカルシトニンは、遊離形態または薬学的に許容できる酸付加塩の形態で含
有され得る。そのような塩は、既知であり、それらの活性および適合性は遊離形
態のそれらに匹敵する。典型的な適当な酸付加塩は塩酸塩または酢酸塩である。

【００２１】本発明によれば、フィブリル化したカルシトニンを、任意の薬学的に活性のあ
る物質または、例えば、組織再成用の基質への細胞移植のための細胞の担体とし
て医薬組成物において使用し得ることが見出された。従って、さらなる態様にお
いて、本発明は、担体としてフィブリル化したカルシトニンを含む医薬組成物を
提供する。

【００２２】さらなる態様において、本発明は、医薬組成物における担体とのフィブリル化
したカルシトニンの使用を提供する。カルシトニンを含む医薬組成物を、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３と、溶
媒、例えば、モノアルカノール、例えば、メタノール若しくはエタノールとを、
例えば、酸を出す環境において、例えば、ｐＨ値約４以下で混合することによっ
て取得し得る。使用前に、それを、０．２μｍフィルター(Acrodisc(商標), Gel
man Science)を通して濾過し得る。ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の溶液を
、カルシトニンの、例えばクエン酸バッファー溶液とさらに混合し得る。ＴＧＦ
−β、例えば、ＴＧＦ−β３溶液および／またはカルシトニン溶液および／また
はＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３／カルシトニン混合物をそのまままたは凍
結乾燥物(lyophilisate)の形態で使用し得る。

【００２３】カルシトニンを含む医薬組成物は、薬学的に許容できる賦形剤を通常のように
さらに含み得る。例えば、 a)糖または糖アルコール、例えば、マンニトール、スクロース、フルクトース、
またはトレハロース； b)塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウム； c)バッファー、例えば、クエン酸塩(エステル)、マレイン酸塩(エステル)、リン
酸塩(エステル)； d)セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース； e)酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸; f)保存料、例えば、ベンズアルコニウムクロリド、またはベンゼントニウムクロ
リド。

【００２４】使用される添加物の量を、意図された使用によって変化させ得る。例えば、よ
り粘性のあるカルシトニンゲルを取得するために、例えば、組成物の総重量規準
で０．５重量％の量のメチルセルロースおよび通常、組成物の総重量規準で約０
．５ないし１重量％の量の糖または糖アルコールを使用し得る。

【００２５】さらなる態様において、本発明は、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３、およ
び生物分解可能な担体を含む医薬組成物の製造方法を提供する。ここで、生物分
解可能な担体はカルシトニン、例えば、フィブリル化したカルシトニンであり、
その方法は、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の溶液とカルシトニン、例えば
、フィブリル化したカルシトニンの溶液を混合することを含む。

【００２６】本発明のＴＧＦ−β製剤を、さらなる担体または支持体、例えば、機械的支持
体に含ませ得る。支持体として、任意の骨代用材料、例えば、顆粒またはブロッ
クの形態のセラミック材料、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウ
ム、サンゴ由来材料またはポリマー、例えば、ポリラクチド(polylactide, ＰＬ
Ａ)、例えば、ＰＬＡスポンジまたは例えば、コラーゲンスポンジ、ヒトの骨に
由来する整形外科用インプラント、金属のインプラント等を使用し得る。

【００２７】適当な支持体材料は、リン酸三カルシウム顆粒、例えば、ChronOS(商標)また
はCeros(商標)TCP、Mathys Ltd., Switzerland製造；Norian注入可能セメント、
Norian/Synthes,USAによって販売；多孔性移植用代用骨片、例えば、ProOsteon
Implant 500(商標)、Interpore Int., USAによって販売；微小ガラス顆粒、例え
ば、BiGran(商標)、Orthovita, USAによって販売；リン酸カルシウム、例えば、
Alpha BSM(商標)、ETEX Corp., USAによって販売；リン酸カルシウムに基づく骨
セメント、例えば、BoneSource(商標)、Orthofix Inc., USAによって販売；ゲル
、パテおよびフレックス形態、例えば、Grafton DMB(商標)、Osteotech Inc., U
SAによって販売；人工成形可能骨基質、Bioapatite AB, Swedenによって販売；c
ollagraft移植骨マトリックス、精製雌ウシコラーゲンおよびヒドロキシアパタ
イト−リン酸三カルシウム、Zimmer Inc., USAによって販売；ヒドロキシアパタ
イトでコートされたウシ皮膚コラーゲン繊維、例えば、Healos(商標)、Orquest
Inc., USAによって販売；コラーゲンスポンジ、例えば、Hemostagene(商標)、Co
letica SA, Franceによって販売、または例えばHelisat(商標)、Integra Life S
cience Inc., USAによって販売；生物溶解可能(Bioresorbable)ポリマーおよび
骨セメント、例えば、OrthoDyn、DynaGen Inc., USAによって販売；生物分解可
能ＰＯＢ／ＰＢＴコポリマー、IsoTris B.V., Netherlandsによって販売；生物
分解可能ポリマー、例えば、Prolease(商標)およびMedisorb(商標)、Alkermes,
USAによって販売、を含み得る。

【００２８】本発明の医薬組成物における使用のために適当なポリラクチドスポンジは、８
０ないし２０％の光学的活性Ｌ−形態の光学的不活性ＤＬ−形態に対する割合、
４００ないし８００マイクロメーターの孔サイズ、７０ないし８０％中空、およ
び分子量２０００００ダルトンを有し得る。それは非毒性で、生物に対して良好
な耐性があり、有害な反応を誘導せず、または免疫原性である。それは、さらに
代謝されることのできる乳酸に加水分解的に分解される。

【００２９】例えば、組成物が骨折の間の比較的大きい距離を橋渡ししなければならないよ
うな、組成物の機械的な力が望まれる場合、ＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β３、
フィブリル化したカルシトニンおよび支持体、例えば、機械的支持体、例えば、
生物分解可能なセラミックまたはポリマーを含む医薬組成物は、大きい骨欠損の
処置のために特に有用である。

【００３０】ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β／フィブリル化したカルシトニン混合物を支
持体、例えば、ＰＬＡスポンジに添加し得る。ＴＧＦ−β、例えばＴＧＦ−β３
／フィブリル化したカルシトニン混合物で負荷する前に、支持体を、例えば、エ
チレンオキシドで滅菌し、例えば２５μｌのエタノール１００％または２５μｌ
の緩衝エタノール２０％(Fluka)で予浸し得る。好ましくはエタノール１００％
を使用する。負荷する溶液を、支持体、例えば、ＰＬＡスポンジ上に置き得る。
そのとき、支持体、例えばＰＬＡ支持体は湿ったままである。負荷した後に、支
持体、例えば、ＰＬＡスポンジを、例えば、２５℃のＮ_２ガスで１分間、または
、２５℃のＮ_２ガスで１０分間、または、２５℃の真空デシケーターで２４時間
、または、３０℃の真空オーブンで２４時間乾燥し得る。好ましくは２５℃のＮ_２ガスで１０分間の条件を使用する。好ましくは、使用前にＮ_２ガスを０．２μ
ｍフィルターを通して濾過し得る。負荷した溶媒を支持体、例えば、ＰＬＡスポ
ンジから除去し、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３を支持体、例えばＰＬＡス
ポンジに吸収させる。

【００３１】さらなる態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法であって、
ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の溶液、例えば、ＴＧＦ−β３／カルシトニ
ン混合物、例えば、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３／フィブリル化したカル
シトニン混合物を、支持体、例えば、ポリラクチド(ＰＬＡ)スポンジに含ませる
ことを含む方法を提供する。

【００３２】本発明の組成物は、その組成物に含まれる特定の活性物質の既知の適応症にお
いて、動物、特に哺乳動物、より特にヒトの処置のために有用である。これらの
組成物は、創傷治癒の促進および増進、骨および組織修復(例えば、脊髄融合も
しくは腱修復)、発作、神経修復、口内粘膜炎、癌の処置において、骨髄保護剤
、心保護のメディエーター、抗−炎症性もしくは免疫抑制剤として、移植におい
て、脈管形成の誘導において、心臓外科手術もしくは梗塞心臓において、または
哺乳動物の細胞培養における成長調節剤として、より特に有用である。特に、本
発明の医薬組成物は、口内粘膜炎、骨欠損の処置のために、創傷治癒のメディエ
ートまたは脈管形成の誘導のために有用である。

【００３３】カルシトニンは、例えば、パジェット病(高カルシウム血症のある病徴)の処置
のため、および閉経後骨粗鬆症のための有効な薬物である。異なる起源、おもに
例えば、サケ、ブタ、ウナギ、およびヒトのカルシトニンを現在治療に使用する
。最近、カルシトニンフィブリルそれ自体が生物的に活性であり、カルシウム欠
乏症の処置に使用し得ることが発見された。したがって、フィブリル化したカル
シトニンの生理的効果によれば、本発明の医薬組成物が、例えば、骨修復のよう
なある疾患に使用された場合、よりさらに有利であると証明され得る。

【００３４】投与されるべき活性物質および製剤の正確な量は、多くの要因、例えば、欠損
のタイプ、ひどさおよび／または部位並びに処置されるべき患者の年齢および一
般的病状、処置の望ましい期間並びに活性物質の放出の速度等に依存する。ＴＧ
Ｆ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の濃度は、０．１μｇ／ｍｌないし約１００ｍｇ
／ｍｌ、好ましくは、１μｇ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌであってよい。約１μ
ｇないし１０ｍｇのＴＧＦ−β、例えば、０．１ｍｇないし５ｍｇ、例えば１ｍ
ｇのＴＧＦ−β３でも、有意な治療効果を有する。典型的には、ＴＧＦ−β、例
えば、ＴＧＦ−β３を単一の外科手術に一度に使用する。

【００３５】本発明の医薬組成物のインビトロの成績を、例えば、蛍光による測定、凝集お
よび化学的安定性によって調査し得る。本発明の医薬組成物のインビボ成績を、ウマ(創傷治癒)、ブタ(口内粘膜炎抑
制)、例えば、ウサギ頭骸異常モデル(骨欠損の修復の誘導)でのウサギ、および
メスのマウス(脈管形成の誘導)において試験し得る。

【００３６】実施例１：様々な水性条件におけるＴＧＦ−β３の凝集を、９０度光散乱を使用して試験
する。励起および発光について、同じ波長を使用し(例えば、励起および発光波
長が５６０ｎｍ)、分光蛍光計を使用して、９０度光散乱を測定することによっ
て凝集事象を検出する。この方法において、少量の等量のＴＧＦ−β３ストック
溶液を蛍光キュベット中で添加する。もし、凝集が起これば、９０度光散乱強度
の増加が観察される。ＴＧＦ−βを添加した溶液が凝集を誘導しないなら、光散
乱強度の増加が観察されない。１０ｍＭの塩化カルシウムまたは１０ｍＭのリン酸カルシウム、および２０％
のイソプロパノールまたはエタノールを含む組成物を調製する。６０μｇ／ｍｌ
までＴＧＦ−β３濃度を増加しても凝集は観察されない。

【００３７】実施例２: ＴＧＦ−β３、５．８８１ｍｇのＣａＣｌ_２および２５ｍｇのマンニトールを
含むバイアル中の凍結乾燥製剤の化学的安定性を試験した。バイアル(の内容物)
を溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．２５ｍｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３溶液を調
製する。ＴＧＦ−β３副産物(関連物質)をキャピラリーゾーン電気泳動によって
検出する。結果によれば、ＣａＣｌ_２製剤は非常に化学的に安定である。４０℃
で６ヶ月インキュベートした後も、ＴＧＦ−β３副産物の増加はみられない。こ
れに対して、ＣａＣｌ_２の不存在においては、化学的分解はかなりある。

【００３８】実施例３: バイアル中の凍結乾燥粉末は、ＴＧＦ−β３、マンニトール、ＣａＣｌ_２を含
む。これを、クエン酸、水酸化ナトリウム（ｐＨ３．４まで)および水を含む溶
媒で溶解する。溶解の後、メチルセルロース４０００ｃＰ、マンニトールおよび
水からなる担体を添加することによってゲルを形成する。最終的なゲル溶液にお
ける濃度は、２５μｇ／ｍｌＴＧＦ−β３、９．８５ｍｇ／ｍｌマンニトー
ル、１.４７０ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、２．１０３ｍｇ／ｍｌク
エン酸一水和物、１６．５ｍｇ／ｍｌメチルセルロース４０００ｃＰである。
ゲルの最終のｐＨはｐＨ３．５±０．１である。

【００３９】実施例４: バイアル中の凍結乾燥粉末は、ＴＧＦ−β３、マンニトールおよびＣａＣｌ_２を含む。これを、クエン酸バッファー、ｐＨ３．８(水酸化ナトリウムで調節)か
らなる溶媒で溶解する。最終のスプレー溶液中の濃度は、２５０μｇ／ｍｌＴ
ＧＦ−β３(スプレーから適用される体積はゲルで適用される体積より１０倍小
さいから、スプレーのためのＴＧＦ−β３濃度はゲルのためのものより１０倍高
い)、２５ｍｇ／ｍｌマンニトール、５．８８１ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ_２・２
Ｈ_２Ｏおよび８．４１ｍｇ／ｍｌクエン酸一水和物である。再構成されたスプ
レー溶液の最終のｐＨは、ｐＨ３．２からｐＨ３．６である。

【００４０】実施例５: それぞれ実施例３および４のＴＧＦ−β３／ＣａＣｌ_２ゲルおよびスプレー製
剤を、これらの試験のためにウマに適用する。結果を後記の表に示す(ｃｍ^２単位での平均傷面積)。ＣａゲルＣａスプレー第１日３６３５５４．０２ヶ月後２４０外科手術４ヶ月後の重度創傷の瘢痕形成の臨床評価は(瘢痕形成のスコア：０
＝最小、１＝中、２＝高)は次の通りである。ＣａゲルＣａスプレー０．５６２０．３７５

【００４１】実施例６: ＴＧＦ−β３／ＣａＣｌ_２製剤をブタの頬粘膜において試験する。使用した組
成物は、ＴＧＦ−β３、ＣａＣｌ_２およびマンニトールを含む凍結乾燥した製剤
から調製し、これをグリシンバッファーで溶解する。適用した溶液は、２５μｇ
／ｍｌのＴＧＦ−β３、２．５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、８０ｍＭのＣａＣｌ_２ (０．５８８ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ)、グリシンバッファーｐＨ
３．０(０．６ｍｇ／ｍｌグリシン、ｐＨをＨＣｌで調節した)および６．４ｍｇ
／ｍｌのメチルセルロース４０００ｃＰを含む。細胞増殖をＢｒｄＵ(５−ブロモ−２’−デオキシウリジン)検定によって測定
する。頬粘膜の穿孔生検材料（punch biopsies）を加工し、切片化し、ＢｒｄＵ
に対するモノクローナル抗体で染色して各細胞におけるＤＮＡ合成を同定する。結果によれば、インビボのブタモデルに適用したＴＧＦ−β３／ＣａＣｌ_２製
剤は、基本細胞増殖率を非常に減少させる。

【００４２】実施例７：表１：ＴＧＦ−β３(５０μｇ／スポンジ、０．３μｇ／ｍｍ^３に対応する)、フィブ
リル化したヒトのカルシトニン(ｈＣＴ)(５０μｌのヒトのカルシトニンゲル、
３０ｍｇ／ｍｌの濃度に対応、１．５ｍｇ／スポンジに対応)およびポリラクチ
ド(ＰＬＡ)スポンジ(直径８．３ｍｍのディスク)を含む医薬組成物のウサギ頭骸
欠損モデルにおける効果。効果（頭蓋骨孔あたりピクセル×１０^４として表した) コントロール(ＰＬＡスポンジ単独) ２．５ＰＬＡスポンジ＋ｈＣＴゲル２．０ＰＬＡスポンジ＋ｈＣＴゲル＋ＴＧＦ−β３１０．５

【００４３】表１は、ｈＣＴフィブリルを有するＰＬＡスポンジと比較し、ｈＣＴフィブリ
ルおよびＴＧＦ−β３を有するＰＬＡスポンジと比較した、ＰＬＡスポンジ単独
の、ウサギ頭骸欠損モデルにおける効果を示している。骨の再生度のコントロー
ルとして使用する欠損の形成のために、骨をディスク状に切除する。８週間の修
復期間の後、欠損の骨の充填を定量的ラジオグラフィーによって検定する。総欠
損面積は、１１３３２０．２ピクセルであり、これをさらなる計算における１０
０％として扱う。したがって、完全な再生は、１１．３×１０^４ピクセルの値に
対応する。結果によれば、ＴＧＦ−β３での処置は、骨形成を強く誘導する。ＴＧＦ−β
３を用いない動物群において起こる修復は有意ではない。フィブリル化したカルシトニンを含む本発明の医薬組成物は、急速な骨傷修復
を誘導する。さらにＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の拡散および／または全
身性の影響を防止する。

【００４４】実施例８：表２は、皮下のマウスモデルにおいて、ｈＣＴフィブリルおよびＴＧＦ−β３
と比較したｈＣＴフィブリルの効果を示す。表２：マウス皮下モデルにおけるＴＧＦ−β３(２．５μｇ／ｍｌ)およびフィブリル化
したカルシトニン(５０ｍｇ／ｍｌ)を含む医薬組成物の効果。血管新生面積(１７日後のｍｍ^２として表した) コントロール(無処置) １３．９ヒトカルシトニンゲル１３．９ヒトカルシトニンゲル＋ＴＧＦ−β３３１．１結果によれば、ＴＧＦ−β３での処置は、ＴＧＦ−β３で処置された動物群に
強く血管新生を誘導する。フィブリル化したカルシトニンを含む本発明の医薬組成物は、急速な骨傷修復
または血管新生を誘導する。さらに、ＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β３の拡散
および／または全身性の影響を防止する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月３日（２００１．５．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 17/00 17/00 19/00 19/00 29/00 29/00 35/00 35/00 37/06 37/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C076 AA12 AA29 AA95 BB32 CC01 CC03 CC04 CC07 CC11 CC18 CC27 DD03Q DD23Q DD25Q DD26Q EE24 EE41 FF07 FF18 FF36 FF63 4C084 AA02 AA03 BA44 DA01 MA05 MA17 MA43 MA44 NA03 ZA022 ZA202 ZA362 ZA892 ZA962 ZB082 ZB112 ZB261 4C097 BB01 DD01 DD06 DD09 DD14 DD15 EE08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】塩化カルシウム、リン酸カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸
カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムから選択
された水溶性の塩およびＴＧＦ−βを含む医薬乾燥粉末組成物。
【請求項２】請求項１の医薬組成物を投与する方法であって、組成物が液
体形態で適用される方法。
【請求項３】ＴＧＦ−βおよび生物分解可能な担体を含む医薬組成物であ
って、生物分解可能な担体が、フィブリル化したカルシトニンである組成物。
【請求項４】請求項３の医薬組成物であって、カルシトニンフィブリルが
適用部位でインビボにおいて形成されるように適合された組成物。
【請求項５】請求項１ないし４のいずれかの医薬組成物であって、該組成
物を支持体にさらに含ませた組成物。
【請求項６】請求項５の医薬組成物であって、支持体がセラミック、ポリ
マー、ヒトの骨に由来する整形外科用インプラント、または金属のインプラント
である組成物。
【請求項７】請求項６の医薬組成物であって、ポリマーがポリラクチドス
ポンジである組成物。
【請求項８】請求項１ないし７のいずれかの医薬組成物の使用であって、
創傷治癒の促進および増進において、骨、組織、発作、もしくは神経の修復にお
いて、癌の処置において、骨髄保護剤として、心保護のメディエーターとして、
抗−炎症性もしくは免疫抑制剤として、もしくは哺乳動物細胞培養における成長
調節剤としてまたは脈管形成の誘導において使用する送達システムの生産のため
の使用。
【請求項９】請求項１の医薬組成物の製造方法であって、ＴＧＦ−βおよ
び塩化カルシウム、リン酸カルシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リ
チウム、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含む群から選択される塩
を混合することを含む方法。
【請求項１０】請求項３の医薬組成物の製造方法であって、ＴＧＦ−βの
溶液およびカルシトニンの溶液を混合することを含む方法。
【請求項１１】請求項９もしくは１０の医薬組成物の製造方法であって組
成物を支持体にさらに含ませることを含む方法。
【請求項１２】医薬組成物中での担体としてのフィブリル化したカルシト
ニンの使用。
【請求項１３】担体としてフィブリル化したカルシトニンを含む医薬組成
物。