JPH01287039A - 正常細胞および癌細胞の増殖を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明の技術分野は、免疫細胞と増血細胞との増殖・
発生の調整および悪性細胞の増殖抑制に関する。さらに
詳しくは、この発明は、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧ
Ｆ−β）およびある種のサイトキンｌｉ　（ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅｓ　）からなるペプチド因子の組合せ物に関し、
これは、現在知られている治療法よりも、正常細胞や悪
性細胞の増殖を抑制するのに一層有効である。上記組合
せ物は２個々のサイドキン類よりも機能上および治療上
有効でありかつ副作用が少ない（例えば低毒性）。また
この発明は、　ＴＧＦ−βと腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　）
もしくはアルファーインターフェロン（ＩＦＮ−α）と
の治療上有効な量を投与することを含む。造血前駆細胞
の増殖を抑制する方法に関する。ＴＧＦ−βとＴＮＦも
しくはＩＦＮ−αとの治療上の有効量を投与することか
らなる免疫細胞の機能を抑制する方法も−この発明の一
つの態様である。またこの発明は、　ＴＧＦ−βとＴＮ
Ｆとの治療上の有効量を投与することからなる悪性細胞
の増殖を抑制する方法に関する。この発明の組成物は１
種々の治療用途に有用であり、限定はされないが、以下
のような用途がある。すなわち、放射線と細胞周期依存
性細胞毒性医薬との致死量からの、骨髄幹細胞の保護、
自己免疫疾患と過増殖性疾患の治療２組織移植拒絶反応
の防止。

ならびに各種癌の治療である。

（従来の技術） 疾病と癌に対する人体の主要な防御物は、免疫系と造血
系の細胞である。免疫細胞と造血細胞の増殖と機能は、
多くの異なる細胞間の複雑な相互作用によって調整され
ている。これらの相互作用は、サイトキン類として知ら
れている小分子量の蛋白質因子によって制御されている
。

サイトキン類には、一般に細胞の増殖を刺激もしくは抑
制する機能がある。マイトジェン因子または分化因子は
、細胞の増殖を刺激するサイトキン類である。細胞増殖
を阻止するサイドキン類は。

サプレッサー因子として知られている。自己分泌因子は
、これを表現する細胞に作用するサイドキン類である。

ある細胞系によって産生されて、別の細胞系に作用する
サイドキン類は、傍分泌因子として知られている。

免疫系や造血系の増殖と機能を阻止する作用をするサプ
レッサー因子には、慢性の炎症性疾患と過増殖性疾患の
転形１種々の自己免疫疾患の治療。

および同種移植と組織移植の拒絶反応の防止のような多
くの治療用途がある。さらに、サプレッサー因子は、細
胞増殖が制御されていない癌の治療にも有用である。後
者の用途には、限定はないが。

リンパ腫、骨髄腫、白血病、黒色腫および腺癌が含まれ
る。増殖阻止剤の例は、　ＴＧＦ−β、　ＴＮＦおよび
ＩＦＮである。

ＴＮＦには種々の形態がある。悪質液として知られてい
るＴＮＰ−ｃｒ（ブートラ−ら（Ｂｅｕｔｌｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、）（１９８５年）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１
６巻、５５３頁〕は、宿主の逆位を刺激する内毒素もし
くは他の刺激物に反応して大量に産生される単球／マク
ロファージサイトキンである。ＴＮＦ−αの悪質法活性
は、脂肪細胞中のりボタンバク質リパーゼ表現を特異的
に阻止することから生じるようである〔トーチイーら（
Ｔｏｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、　　（１９８５年）　
５ｃｉｅｎｃｅ　、　２２９巻。

８６７頁〕。腫瘍細胞系に対する細胞毒性効果に加えて
、　ＴＮＦ−αは、多くの正常細胞系に対してサイトキ
ン様活性を示す。これは、正常な内皮細胞上にタイプ１
の組織適合抗原などの表面マーカーの表現を誘発し、繊
維芽細胞の増殖を促進し、コラゲナーゼとプロスタグラ
ンジンＥ、の産生を刺激し。

また内皮細胞によるインターロイキン−１（ＩＬ−１）
の放出を刺激する。

インターフェロンは、その細胞系に基づいて経歴によっ
て分類された。大きな一層のタンパク質抗原で刺激され
たリンパ球もしくはマイトジェンで刺激されたリンパ球
由来である。これらの範祷のなかに２例えばＩＦＮ−β
１およびＩＦＮ−β２のようなサブグループがある。イ
ンターフェロンの第一に挙げられる特徴は、細胞内での
ウィルスの複製を阻止もしくは゛妨害°゛することがで
きることであり、またインターフェロンは現在、細胞障
害性のＴ細胞やマクロファージの細胞障害性を高めるこ
とが知られている。

種々の形態のＴＧＦ−βも発表されている。ＴＧＦ−β
は、増殖阻止剤（Ｇｌ）として知られているポリペプチ
ドに非常によく似ていることがわかっており。

Ｂ５Ｃ−１サルの腎臓細胞で調整された培地から精製さ
れ、同一物かもしれない〔タッカ−・アール・エフら（
Ｔｕｃｋｅｒ　Ｒ，Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　　（１
９８４年）　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２６巻、７０５頁〕。ＴＧＦ−βとＧｌはともに１種
々のＩＩＩ瘍細胞系の増殖を阻止することがわかってい
る〔アソイアン・アール・ケイら（Ａｓｓｏｉａｎ　、
　Ｒ，Ｋ。

ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　３
／Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄＴｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８５年６月、５９〜６４頁およびモーゼス・エイチ
・エルら（Ｍｏｓｅｓ　、　Ｈ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　
）　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ３／Ｇｒｏｈｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ、上記と同じ文献、６５〜７１頁〕。

ウシ腎臓、ヒト胎盤およびヒト血小板由来のＴＧＦ−β
は、　１９８４年３月２９日付で第一０８４１０１１０
６号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８３１
０１４６０号および１９８４年１２月１９日付で公開第
０１２８８４９号として公開されたＥＰＣ出願第８４４
５００１６．５号に記載されている。これらの出願は、
　ＴＧＦ−βをＥＧＦもしくはＴＧＦ−αと組合わせる
と、軟寒天培養検定法（正常細胞とラット腎臓細胞の軟
寒天内コロニーの足場依存性増殖を誘発する）において
細胞増殖を促進し、かつラットの軟組織の創傷治癒モデ
ルにおいて細胞増殖とタンパク質の堆積を促進すること
を示すデータを提供している。

ヒト胎盤由来のＴＧＦ−βの一部のＮ末端アミノ酸配列
が、ウシ由来の軟骨が誘発する因子Ａ　（（ｊＦ−Ａ）
と同一であると報告されている。ＣＩＦ−Ａは。

ＥＰＣ出願第８５３０４８４８．６号（１９８６年１月
２２日付で公開第０１６９０１６号として公開されてい
る）に記載されている。またこの出願には、　ＣＩＦ−
Ｂと命名された相同のポリペプチドが記載されている。

両方のポリペプチドはともに、　５Ｏ３−ＰＡＧＥ測定
法による約２６、０００ダルトン（２６Ｋｄ）の分子量
を有し二量体である。ＣＩＰ−Ｈの部分的なＮ末端配列
は、　ＣＩＦ−Ａのそれとは異なる（Ｎ末端における最
初の３０箇のアミノ酸の１１箇が異なる）。両ＣＩＦは
ともに上記ＴＣＰ−β軟寒天培養検定法で活性を示す。

その結果、　ＣＩＦ−ＡとＣＩＦ−８はそれぞれＴＧＦ
−β１とＴＧＦ−β２として月６日付出願）には２両方
のＴＧＦ−βが、抗炎症活性を有し、マイトジェンで刺
激されたＴ細胞の増殖とＢ細胞の活性化を阻止すると記
載されている。

またＴＧＦ〜βは、造血機能とリンパ球生成機能の中心
に局在し、それ故造血機能もしくはリンパ生成機能の不
全もしくは障害に伴う症状を治療するのに有用であると
報告されている。

同時係属出願中の米国特許願第９２８，７６０号（１９
８６年１１月７日付出願）には１両ＴＧＦ−βが静腫瘍
活性を示すので、限定されないが、癌、骨髄腫、黒色腫
、およびリンパ腫を含むいずれの種類の細胞新生物の治
療にも利用できると開示されている。

本願発明の発明者らは、正常細胞および悪性細胞の増殖
を抑制するのに有用で、特に有効な、　ＴＧＦ−β類と
サイトキン類の組合わせを見出したのである。

ＴＧＦ−βは、　ＴＮＦと組合わせると、　ＴＧＦ−β
もしくはＴＮＦ単独よりも、悪性細胞の増殖抑制に一層
有効である。ＴＧＦ−βおよびＩＦＮ−αもしくはＴＮ
Ｆの組合わせは、　ＴＧＦ−β、　ＴＮＦもしくはＩＦ
Ｎ−α−単独よりも、免疫細胞と造血前駆細胞との増殖
の抑制には一層有効である。

それ故に、　ＴＧＦ−βと特定のサイトキンとの組合わ
せには、細胞の増殖もしくは免疫機能を阻止する必要が
ある種々の疾患を治療する用途がある。

このような疾患には、特に限定はないが、癌（例えば、
リンパ腫、白血病、骨髄腫、腺癌など）。

自己免疫疾患と慢性炎症疾患（例えばリウマチ様関節炎
、変形性関節症１重症筋無力症、紅斑性狼癒、ブドウ膜
炎など）、過増殖性疾患（例えば尋常性転層）および器
官移植拒絶反応が含まれる。

（発明の要約） この発明の一つの態様は、　ＴＧＦ−βおよびＴＮＦも
しくはＩＦＮを有する。Ｉ’＃乳動物のリンパ球、骨髄
細胞もしくは悪性細胞の増殖を阻害する治療上有効な組
成物である。

この発明の他の態様は、　ＴＧＦ−βおよびＴＮＦもし
くはＩＦＮ−αの治療上の有効量を哺乳動物に投与する
ことを含む、造血前駆細胞および免疫細胞の増殖を抑制
する方法である。

この発明のさらに他の態様は、　ＴＧＦ−βとＴＮＦの
治療上の有効量を哺乳動物に投与することを含む。

悪性腫瘍の増殖を抑制する方法である。

この発明のその他の態様は、　ＴＮＰもしくはＩＦＮ−
αの投与量を減らしてＴＧＦ−βの治療上の有効量を一
緒に投与することを含む、哺乳動物のＴＮＦもしくはＩ
ＦＮ−αによる治療の副作用を減少させる方法である。

Ｃ以下余白） 以下に本発明を詳述する。

脱塩された骨由来の均一なＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β乙
の精製法と、これら精製ポリペプチドの特性は。

ＥＰＣ出願公開第０１６９０１６号に記載されており、
その開示事項を本願に援用する。

ＴＧＦ−βＩは、　５ＯＳ−ＰＡＧＥ法で測定して約２
６ｋｄの分子量を有するホモ二量体であることは明らか
である。それは下記のＮ−末端アミノ酸配列を存する。

人１ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−１１ｅ−八５ｐ−Ｐｈｅ−ＴＧＦ−
β？もまた５ＯＳ−ＰＡＧＥ法で測定して約２６ｋｄの
分子量を有するホモ二量体であることは明らかである。

そのＮ−末端アミノ酸配列は次のとおりである。

入１ａ−Ｌｅｕ−人ｓｐ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｈｅ−人ｒ９−人５ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｐ−Ａｓｎ−（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−）−Ｌｅｕ−人ｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−人印一両方のＴＧＦ
−βはともに、熱処理もしくはトリブタシンによる処理
に対して比較的非感受性（生物学的活性の低下の点から
）であるが、２−メルカプトエタノールもしくはジチオ
トレイトールのような試薬に還元作用で活性を失う。

本願で用いる“ＴＧＦ−β”という用語には、上記のウ
シのポリペプチド“”ＴＧＦ−β１”と°“ＴＧＦ−β
２”；ヒト、ブタ、ヒツジおよびウマのような他の哺乳
動物種由来の同等のポリペプチド；およびウシまたは他
の哺乳動物のポリペプチドの合成類似物〔ムティン（＋
ｕｔｅｉｎ）　）が含まれる。上記の類似物は、一般に
、特定の天然の種と、アミノ酸配列が実質的に同じであ
る（すなわち配列が少なくとも約９０％等しい）、これ
らのＴＧＦ−β類は、天然の起源から得るかまたは組換
えＤＮＡ技術によって製造することができる。組換え体
ポリペプチドは、当該技術分野で知られているように、
アミノ酸配列ではなくてその状態が、天然のポリペプチ
ドと異なる（例えばグリコジル化されていない）。

ヒトＴＮＦは、アガーワルらＣＡｇｇａｒｗａｌ　ｅｔ
　ａｌ、）　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８５）　、　２６０
巻、　２３４５頁に開示されているように、ヒト骨髄白
血病細胞系ＨＬ−６０の。

血清を含有していない組織培養物の上澄液がら単離する
ことができる。ヒトおよびマウスのＴＮＦ。

組換え体の形態のものも、ワンプら（ｔｊａｎｇ　ｅｔ
　ａｌ、）Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　　（１９８５年）　、
　２２８巻、１４９頁およびベニ力ら（Ｐｅｎｎｉｃａ
　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ
　５ｃｉＵＳＡ　　（１９８５年）、８２巻、　６０６
０頁に開示されているのと同様にして入手することがで
きる。

本願で用いる“ＴＮＦ”という用語は、その物質の起源
にかかわらず、　ＴＮＦ様の活性を有するすべての分子
が含まれる。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βはともに、有用な
レベルのＴＮＦ様活性を有する合成類似物とともに含ま
れる。ＴＮＦ−αは、この発明を実施するのに好ましい
形態である。

本願で用いる“’ＩＰＮ　”という用語は、　ＩＦＮ−
α様活性を示すすべての分子を意味する。インターフの
発明の範囲に含まれないものとする。インターフェロン
類の精製法と特性は、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ。

７８巻、シトニー・ペスト力（Ｓｉｄｎｅｙ　Ｐｅ５ｔ
ｋａ　）　ｗ１集、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　
Ｉｎｃ、米国、ニューヨーク州ニューヨーク、　１９８
１年に記載されている。

本願で用いる“造血前駆細胞°”という用語は。

リンパ球と骨髄細胞の系の種々の細胞形を生成する幹細
胞を意味する。

本願で用いる“免疫細胞°゛という用語は、Ｔ細胞もし
くはＢ細胞の表現型であるリンパ球を意味する。

本願で用いる“癌細胞°゛という用語は、良性新生物と
悪性新生物の両者、特に腫瘍塊を意味する。

本願で用いる“実質的に阻止するパという用語は、正常
細胞もしくは癌細胞の増殖の完全なもしくは部分的な（
少なくとも５０％）阻止を意味する。

本願で用いる“細胞の増殖（ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　
）という用語は、細胞の分裂と増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒ
ａｔｉｏｎ）が含まれる。

本願で用いる“治療上有効な”という用語は。

造血前駆細胞、免疫細胞および悪性細胞の増殖を実質的
に阻止するＴＧＦ−βおよびＴＮＦもしくはＩＦＮ−α
の量を意味する。上記の組合わせは、　ＴＧＦ−β、　
ＴＮＦもしくはＩＦＮ−αの単独での治療より、細胞の
増殖の阻止に一層有効である。“治療上有効な量によっ
て表される正確な量は、特定の細胞系および所望の効力
によって決まる。−射的な指針としては、　Ｃ３Ｈ胸腺
リンパ球の生体外での増殖を防止するＴＧＦ−β２の濃
度は、　０．５　Ｕ／ｄ　　ＩＦＮ−αの存在下　０．
００００１ｐＭという小濃度であり、Ｔ細胞の増殖をほ
ぼ６０％まで低下させる。０．０１ｐＭのＴＧＦ−βＺ
と５０Ｕ／ｄｌＦＮ−αを用いることによって、胸腺リ
ンパ球の増殖を９５％以上まで抑制することができる。

またこの治療上有効な量は、リンパ球、骨髄細胞もしく
は悪性細胞の増殖の阻止に影響するＴＮＦもしくはＩＦ
Ｎ−αの投与量を減少させるのに必要なＴＧＦ−βの量
によって定義することができる。本願に開示された検定
法を用いて、当業者は、治療上有効な量を得るのに必要
な各成分の正確な量を決定することができるであろう。

この発明の一つの態様は、　ＴＧＦ−βおよびＴＮＦも
しくはＩＦＮ−αの治療上有効な量を有する。＃乳動物
の造血前駆細胞、免疫細胞および過増殖性細胞の増殖を
抑制する組成物である。好ましい態様は。

ＴＧＦ−βとＴＦＮ−αの治療上有効な量を有する組成
物であるが、　ＴＧＦ−βとＴＮＰ−αが１量部のＴＧ
Ｐ−β：１〜１０，０００量部のＴＮＦ−αの比率で投
与される組成物が一層好ましく、または１量部のＴＧＦ
−β：１〜１０．０００量部のＩＦＮ−αの比率で投与
される組成物も好ましいものである。

この発明の他の態様は、　ＴＧＦ−βとＴＮＦの治療上
有効な量を有する。哺乳動物の癌細胞増殖を阻止する組
成物である。好ましい実施例は、　ＴＧＦ−βとＴＮＦ
　、特にＴＧＰ−βとＴＮＦ−αの治療上有効な量を有
する組成物であるが、　ＴＧＦ−βとＴＮＦ−αが、ｌ
置部のＴＧＦ−β：１〜ｔｏ、ｏｏｏｔ部のＴＮＦ−α
の比率で投与される組成物がより好ましい。

この発明の他の態様は、　ＴＧＰ−βおよびＴＮＦもし
くはＩＦＮ−αの治療上有効な量を哺乳動物に投与する
ことを含む造血前駆細胞、免疫細胞および過増殖性細胞
の増殖を抑制する方法である。好ましい実施例は、　Ｔ
ＧＦ−βとＴＮＦ　、特にＴＧＦ−βとＴＮＦ−αの治
療上有効量を哺乳動物に投与することを含む方法である
が、　ＴＧＰ−βとＴＮＦ−αが、１量部のＴＧＦ−β
：１〜ｉｏ、ｏｏｏ量部のＴＮＦ−αの比率で投与され
る方法が好ましい。他の好ましい実施例は、↑ＧＦ−β
とＩＦＮ−αの治療上有効な量を哺乳動物に投与するこ
とを含む方法であるが、　ＴＧＦ−βとＩＦＮ−αが、
１量部のＴＧＦ−β：１〜１０，０００量部のＩＦＮ−
αの比率で投与される方法が好ましい。

この発明の他の態様は、　ＴＧＦ−βとＴＮＦの治療上
有効な量を哺乳動物に投与することを含む、悪性細胞の
増殖を阻止する方法である。好ましい実施例は、　ＴＧ
Ｆ−βとＴＮＦ　、特にＴＧＦ−βとＴＮＦ−αの治療
上有効な量を哺乳動物に投与することを含む方法である
が、　ＴＧＦ−βとＴＮＦ−αが、ｌ置部のＴＧＦ−β
：１〜１０，０００１部のＴＮＦ−αの比率で投与され
る方法が一層好ましい。

この発明のさらに他の態様は、投与されるＴＮＦもしく
はＩＦＮ−αの投与量を減らして治療上有効な量のＴＧ
Ｐ−βを一緒に投与することを含む哺乳動物のＴＮＦも
しくはＩＦＮ−αによる治療の副作用を減少させる方法
である。

この発明の組成物は、リンパ球系および骨髄細胞系の細
胞の増殖を阻止し、免疫系を抑制するのに有用である。

したがって、この発明の組成物は。

リンパ球および骨髄細胞の癌の治療および免疫の抑制を
要望する患者の治療に利用することができる。リンパ球
および骨髄の細胞の癌に伴う疾患には、限定はないが、
バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫
および種々の骨髄性白血病が含まれる。免疫系の疾患と
しては、限定はないが、乾廚、リウマチ様関節炎、変形
性関節症。

重症筋無力症、紅斑性狼疹およびブドウ膜炎のような自
己免疫疾患が挙げられる。その上、この発明の組成物は
、移植された器官に対する免疫応答を抑制するのに有用
である。

またこの発明の組成物は１例えばケラ千ノサイト（転層
症に罹患している哺乳動物の場合）を含む種々の過増殖
性細胞系の病的な増殖を阻止することができる。

この発明を実施する場合、この発明の組成物は同時に投
与する必要はない。個々のサイトキンを７２時間以内に
投与することが好ましい。ＴＮＦもしくはＩＦＮ−αは
、　ＴＧＦ−βと同時に投与することが好ましく、また
はＴＣＰ−βは、　ＴＮＦもしくはＩＦＮ−αの投与の
４８時間以内に投与してもよい。

この発明の組成物は２局所投与によって疾病を治療する
のに使用することができる。投与のルートは治療する疾
患によって決まる。ＴＧＦ−βとＴＮＦとからなる組成
物は、充実性腫瘍塊の局所治療に特に有効である。かよ
うな組成物は１表在性腫瘍塊に、皮下注射針によって直
接注射してもよい。表在性腫瘍塊には、黒色腫もしくは
基底細胞癌のような皮膚癌が含まれる。深部の腫瘍塊は
、カテーテル、例えば脈管カテーテルを通じてＴＧＦ−
βと丁ＮＦで治療することができる。この投与法は、肝
臓。

腎臓もしくは脳の腫瘍塊の治療に特に有効である。

ＴＧＦ−βとＩＦＮ−αの組合わせは、炎症性疾患を治
療するのに局所に塗布することができる。いくつかの例
として、適切な担体系の組成物を局所に塗布する方法が
ある。局所塗布方法は１例えばアトピー性皮膚炎や乾廚
症のような皮膚の過増殖性および炎症性の疾病の治療に
有用である。関節の慢性炎症疾患は、上記の組成物を、
炎症を起こした関節に直接注射することによって治療す
ることができる。この投与法は、リウマチ性関節炎およ
び変形性関節症の治療に有用である。

また、この発明の組成物は、全身投与によって疾患を治
療するのに利用することができる。ＴＧＦ−βとＴＮＦ
の組合わせは、癌の全身治療に有効である。

各成分の必要投与量は患者の年令や体格、治療する癌の
タイプおよび疾病の激しさによって変わる。

同様に、　ＴＧＦ−βとＴＮＦとからなる組成物は、自
己免疫疾患の全身治療および全身免疫抑制に有効である
。

ＴＧＦ−β、　ＴＮＦおよびＩＦＮ−αはすべて非経口
の注入による投与に適しているが、他の投与法も考えら
れ、これもこの発明に含まれる。例えば鼻腔内もしくは
気管支へのスプレーによる吸入で投与を行なうことがで
きる。代わりに、これらの化合物は、多数の、放出制御
もしくは徐放性の移植器具によって直接投与してもよい
。例えば、１種以上の成分を、移植に適したポリマー移
植物もしくは膜に混入させることができる。代わりに、
アルゼットミニポンプ（Ａｌｚｅｔ　ｍｉｎｉｐｕｍｐ
）　　（アルザ・コーポレーション（ＡＬＺＡ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）　、米国、カリフォルニア州、パロ
アルト〕を皮下に移植し。

１種以上の成分を、長期間にわたって放出することがで
きる。

この発明のほとんどの製剤は、非経口の注入に適切な生
理的に受容な賦形剤２例えばリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ　
）による、活性化合物の溶液もしくは懸濁液の形態であ
る。その外の受容な賦形剤としては１例えばデキストロ
ース・カルボキシメチルセルロース、ブチル化ヒドロキ
シアニソール（ＢＨ＾）。

ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＩＴ　）　、　　ヒト
血清アルブミン（ＩＳＡ　）　、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ　）　　などが挙げられる。適切な製剤技術
と原料についての完全な記述については、イー・ダブリ
ュ・マーチン著、　　（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、　
、米国、ペンシルヴエニア州、イーストン、第１５版、
　１９７５年）の”Ｒｅ−ｎ＋ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ”を参照
されたい。

（実施例） 下記の実施例は、当業者に対するこの発明の詳細な説明
として提供される。しかしこの発明は。

以下の具体的な実施例に限定されず、これらとの均等物
のすべてを含むものである。

（以下余白） スＩＬＬ （ＴＧＦ−βの製造） ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２を、　ＥＰＣ出願第３５３
０４８４８．６号に記載されているのと同様にして、脱
塩された骨粉から精製して得た。簡単に、ウシの中足骨
を。

０．５Ｍ　ＨＣＩ中４℃で１６時間かけて脱塩し次いで
４ＭＧｄｎ−１１ｃＩ／１ｓＭ　Ｎ−エチルマレイミド
／１０　ｓＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ６，８抽出法を用いてペプチドを可溶化した０次い
で両方のＴＧＦ・−βを次のようにして精製した。

まず４　Ｍ　Ｇｄｎ−ＩＣｌ１０．０２　　％アジ化ナ
トリウム／１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ６，８で平衡化し
たセファクリルＳ−２００カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ−２００ｃｏｌｕａ＋ｎ）を用いてゲル濾過し１次
いで６Ｍ尿素／１０ｍＭ　Ｎａｃｌ　７１ｍＭ　Ｎ＝エ
チルマレイミド１５０　ｍＭ　　酢酸ナトリウム、　ｐ
Ｈ４，５による１０〜４００　ｍＭ　Ｎａｃｌの直線勾
配液を用いるＣＭセルロースのカチオン交換クロマトグ
ラフィに付して精製した。最終的な精製と、　ＴＧＦ−
β１とＴＧＦ−β２からの分割は、０．１％のトリフル
オロ酢Ｈ，ｐ）１１．９による０、６０％アセトニトリ
ルの勾配液で溶離するＣ１１ｌカラムを用いる逆相高速
液体クロマトグラフィで行った。均一性は、銀染色５Ｏ
５−ＰＡＧＥ分析法およびＮ−末端アミノ酸配列分析法
によって証明した。

得られたＴＧＦ−β類は、少なくとも９５％純度であり
、さらに精製しなくても使用するのに適切なものである
。

他の種から得たＴＧＦ−β顆間には高度な相同性がある
ので、ヒトのＴＧＦ−βの代わりに他の哺乳類から得た
ＴＧＦ−βを用いることができることに留意すべきであ
る。例えば、ヒト起源の組織の安価な代替物として新鮮
な、ブタもしくはウシの血液を用いることができる。

災詣斑主 （製剤類） （Ａ）下記のものは、静脈注射による投与に適切な製剤
である。

全成分は、好ましくは凍結乾燥された粉末として、リン
酸緩衝塩水に添加され２次いでｐＨを約７．４に調節す
る。比活性の１単位（Ｕ）は、生体外で５０％の生物学
的応答を誘発するサイトキン（例えばＩＦＮ−α）の量
である。

全成分は、好ましくは凍結乾燥された粉末として、リン
酸緩衝塩水に添加され１次いでｐＨを約７．４に調節す
る。

（Ｃ）下記のものは、静脈注射による投与に適切なリポ
ソーム製剤である。

悲里Ｊ二人 全成分は、好ましくは凍結乾燥された粉末として、リン
酸緩衝塩水に添加され１次いでｐＨを約７．４に調節す
る。リポソーム製剤については、　ＰＢＳは。

Ｃａ″”、　Ｍｇ”＋などの二価のカチオンを含有しな
いものでなければならない。

ＤＡＰＣ（ジアラカドイルフォスファチジルコリン）。

ＤＡＰＳ（ジアラカドイルホスファチジルセリン）およ
びコレステロールは、丸底フラスコ中５　ｍｌのクロロ
ホルムに溶解する。次にクロロホルムを減圧下で除去し
、薄い脂質のフィルムをフラスコの面に残す。次に、前
記の活性成分の溶液を添加し。

フラスコを激しく振盪（例えば音波処理によって）静脈
注射もしくは筋肉注射に適切なリポソームの懸濁液を形
成させる。リポソーム製剤の他の適切な製造法は、当該
技術分野で知られている。

（Ｄ）以下に述べるものは１局所投与１例えば。

転層症の局所治療に適切な製剤である。

全成分（ＴＦＧ−β、　ＩＦＮ〜αおよび水以外）を合
せ。

攪拌しながら、６０”Ｃに加熱する。次に多量の水を。

激しく撹拌しながら添加して約９０ｇのクリームを作製
し１次に冷却する。次いで、　ＴＦＧ−β、　１ＦＮ−
αを約１０ｍ１の水に懸濁させ（任意にアルブミン、デ
キストロースなどのような安定剤を含有している）。

得られた懸濁液を上記のクリーム混合物に添加する。得
られた混合物を攪拌し、室温より低い温度で保管する。

（Ａ）ＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄細胞を、　　１　ｍｌ
ＲＰＭＩ−１６イ０（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、メリーラド州、シルバー
スプリング）、ｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および０
．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ）を含
有する０、３％シーブラックアガロース（ｓｅａｐｌａ
ｑｕｅａｇａｒｏｓｅ　）（ＲｏｃｋＬａｎｄ、米国メ
イン州）中に懸濁させ、　３５ａｎのル・ベトリ皿（ｌ
ｕｓ　ｐｅｔｒｉ　ｄｉｓｌ＋）（ＭｉｌｅｓＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ社、米国、イリノイ州、ネイバービル）中
にて５％ＣＯ２雰囲気下３７°Ｃで培養した。マウス顆
粒白血球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用
いてコロニー形成を誘発させた。培養物を、０．１ｎｇ
／ｍｌ　ＴＧＦ−βと、濃度を０．１〜１００Ｕ／ｄに
変化させたＴＮＦとで処理した。コロニーの数を７日目
に数えて、そのデータを、１ブレート当たりの骨髄細胞
のコロニーの数として示した。

（Ｂ）正常なマウス骨髄細胞からの顆粒白血球−マクロ
ファージコロニー形成単位（ＧＭ−ＣＦＶ）　（７）生
体外での発生に対する。　ＴＧＦ−βとＴＮＦの効果を
第１図に示す。ＩＮＦ単独（１０〜１００　Ｕ　／　ａ
ｌｌ　）によってＧＭ−ＣＦＵの発生は３５〜６２％抑
制された。　ＴＧＦ−βだけでは、　０．１ｎｇ／ｒｄ
でＧＭ−ＣＦＵの発生を５４％抑制された。ＴＮＦ　　
（１〜１００　Ｕ／ｄ）とＴＧＦ−β（０，１ｎｇ／絨
）の組合せで、　ＧＭ−ＣＦｔｌの発生が８０〜９３％
まで抑制された。これらの結果は、　ＴＧＦ−βとＴＮ
Ｐの組合わせによって、培養され正常骨髄細胞からのＧ
Ｍ−ＣＦＩＩの発生が有効に抑制されるということを示
している。

（Ａ）骨髄を、　ＢＡＬＢ／Ｃマウスの大腿骨から、　
Ｒ１’旧−１６４０を用いて吸い出し、１０％ＦＣＳ含
有のＲＰ旧−１６４０で２度洗い、同じ液に再懸濁させ
１次いでｏ、ｉ　＊中１×ｌＯＳの細胞数で、９６ウエ
ルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ社、米国
、マサチューセンツ州、ケンブリッジ）に接種した。細
胞の増殖を５ｎｇ／ＩＩｄｌのマウスＧＭ−Ｃ５Ｆを用
いて誘発させた。その実験培養物を、異なる量（０，０
１〜５００　Ｕ／ｍｆｆ１）のＴＮＦ単独で処理するか
、または、０．１ｎｇ／　ｍｌ　ＴＧＦ−βと異なる量
のＴＮＦ（０，０１〜５００　Ｕ　／　ｍｌ　）とで処
理した。増殖を、５％Ｃｏｔ雰囲気中３７°Ｃで７２時
間培養後に　Ｊ−チミジン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　
Ｎｕｃｌｅａｒ社、米国、マサチューセンッ州、ボスト
ン）の１ｍＣ１のオーバーナイトパルスによって測定し
た。細胞培養物を、多試料ハーベスタで、ガラス繊維フ
ィルター上に取出した。個々のフィルターを２ｄのＰＣ
Ｓシンチレーション流体（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ米国、イリノイ州、アーリントンハイツ
）中に入れ。

試料を標準の液体シンチレーション法で計数した。

（Ｂ）骨髄増殖検定法でのＧＭ−ＣＳＦ誘発増殖のＴＧ
Ｆ　−βとＴＮＦによる阻止の状態を第２図に示す。得
ろれた結果は、　ＴＧＦ−β（０，１Ｈｇ／　ｍｌ　）
が、　ＴＮＦの骨髄抑制作用を著しく促進することを示
している。

ＴＮＦの５０％有効作用投与量（ＥＤ、。）が、　ＴＧ
Ｆ−β（０，１Ｈｇ／ｍ　）の存在によって、２Ｕ／ｍ
ｌから０．６Ｕ　／　ｍｌに移行した。

（Ｃ）ＩＮＦＯ代わりにＩＦＮ−αを用いて上記（Ａ）
の手順を繰返した。第３図に示すように、ＴＧＦ−βと
ＩＮＦ−αの組合わせは、　ＴＮＦを組合わせた場合と
同程度ではないが、　ＧＭ−Ｃ３Ｆで誘発された骨髄増
殖の検定法におけるＩＦＮ−αの抑制効果を改善してい
ることはたしかである。得られた結果は、　ＴＧＦ−β
とＴＮＦの組合わせの方が、　ＴＧＦ−βとＩＮＦ−α
の組合わせより、骨髄前駆細胞の増殖を阻止するのに一
層有効であることを示している。

（Ａ）　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの胸腺リンパ球（１０６
）を、平底９６ウエルのマイクロタイタープレート〔コ
スタ−３５９６（Ｃｏｓｔａｒ　３５９６）、米国、メ
リーランド州、ケンブリッジ）に接種した。この細胞を
。

最適濃度のフィトヘマグルチニン［Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、米国、ミズーリ州、セント
ルイス］と。

インターロイキン−１（８Ｕ／ｄ　ＩＬ−１，ＣｉＣ１
５ｔｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏ、　　米国、ニュージャー
シイ州、パインブルーク）とで共同刺激させた（ｃｏｓ
ｔｉｍｕｌａｔｅ）。

種々の量のＩＦＮ−α（５〜５００　Ｕ／戚）、および
種々の量のＩＦＮ　−αｃ　５〜５００　Ｕ／Ｉｎ１）
と種々ノ量のＴＧＦ−β（０，００１〜０．１ｐＭ）と
を組合わせたものを培養物に添加した。細胞を、増湿し
たインキュベーター内で５％ＣＯ，雰囲気下３７゛ｃで
７２時間培養した。培養物は、取出す前に（２４時間後
）　、　０．５ｍＣ１の３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社、米国イリノイ州、シカゴ）でパルスした。これ
らの培養物を半自動細胞ハーベスタ−で取出して、取込
まれた３ｎ−チミジンの量を、標準液体シンチレーショ
ン法で測定した。データは、３個の培養物からの１分間
当たりの崩壊（ＤＰＭ）で示した。

（Ｂ）ＩＬ−１で誘発された胸腺リンパ球の増殖検定法
における。　ＩＦＮ−αと組合わせたＴＧＦ−β１の効
果と、ＩＦＮ−αと組合わせたＴＧＦ−β２の効果とを
それぞれ第４ａ図と第４ｂ図に示す。０．０１ｐＭのＴ
ＧＦ−βＩもしくはＴＧＦ−β２と５Ｕ／−のＩＦＮ−
αの組合わせによって、この検定法では、Ｔ細胞の増殖
が完全に（１９０％）抑制された。

（Ｃ）ＩＬ−１で誘発された胸腺リンパ球の増殖検定法
における。　ＩＦＮ−βと組合わせたＴＧＦ−β１の効
果と、もしくはＴＧＦ−β２の効果をそれぞれ第５ａ図
と第５ｂ図に示す。ＴＧＦ−β１もしくはＴＧＦ−β２
をＩＦＮ−βの組合わせた場合、胸腺リンパ球増殖検定
法における。ＩＬ−１で誘発されたＴ細胞の増殖応答を
抑制する効果は、　ＴＧＦ−β１とｒＦＮ−αもしくは
ＴＧＦ−β２とＩＦＮ−α組合わせよりもはるかに小さ
い。

（Ｄ）ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ｑ）を組合わせたＴＧＦ−
β１と、　ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ｑ）組合わせたＴＧＦ
−β２との効果をそれぞれ、第６ａ図と第６ｂ図に示す
。ＴＧＦ−β２もしくはＴＧＦ−β２とＩＦＮ−αとの
組合わせよりも、胸腺リンパ球増殖検定法における。　
ＩＬ−１で誘発されたＴ細胞の増殖応答層抑制する効果
がはるかに小さい。

（Ｅ）第４図、第５図および第６図に示した結果は、　
ＩＦＮ−αと組合わせたＴＧＦ−βｌもしくはＴＧＦ−
β２が最も効果が大で、Ｔ細胞増殖を抑制するのに望ま
しいＴＧＦ−βとｒＦＮの組合わせであることを示して
いる。

（Ａ）ヒト組織白血球細胞糸Ｕ９３７を、ファルコン組
織培養フラスコ内の、１０％ＦＣ５，ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍ１）　、　ストレプト？　イシ７　（１００ｍ
ｇ　／　ｍｌ　）オヨび３　ｍｇ　／　ｔｒｒ！グルタ
ミンを追加したＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。細胞
を、　ＴＮＦ単独（０，１〜１，０００　Ｕ／ｄ）、ま
たはＯ，ｌｎｇ／ｒｄのＴＧＦ−βと組合わせたＴＮＦ
　（０，１〜１，０００　Ｕ／ｄ）で処理した。いくつ
かの実験で、細胞を、　ＩＦＮ　−α単独（０，１〜１
，０００　Ｕ／ｄ）、または０．１Ｈｇ／ｍ　ＴＧＦ−
β組合わせたＩＦＮ−α（１〜１，０００　Ｕ／ｍ）で
処理した。処理された試料は、３個づつ１０’細胞／ウ
エルで、７２時間培養した。次いで細胞を１ｍｃｉの３
Ｈ−チミジンでパルスしてから６時間後に取り出して液
体シンチレーシコン法で計数した。データはカウント７
分（ＣＰＭ）で示す。

（Ｂ）白血球細胞増殖検定法における。　ＴＧＦ−βと
ＴＮＦの組合わせの結果を第７図に示す。ＴＮＦの腫瘍
細胞に対する増殖阻止効果は、　０．１ｎｇ／ｄのＴＧ
Ｉβを添加すると著しく改善される。

（以下余白） 木石団１ト列１助 この発明は、全米健康協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅｓｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　）によって一部資
金の援助を受けた研究においてなされたものである。し
たがって、米国政府が一定の権利を有する。

４　　゛　　の　　　な晋　■ 第１図は、実施例３（Ｂ）で述べる。骨髄の軟寒天検定
法によるＴＧＦ−βとＴＮＦｉの試験結果を示すグラフ
である。

第２図は、実施例４（Ｂ）で述べる。骨髄増殖検定法に
よるＴＧＦ−βとＴＮＦの試験結果を示すグラフである
。

第３図は、実施例４（Ｃ）で述べる。骨髄増殖検定法に
よるＴＧＦ−βとＩＦＮ−αの試験結果を示すグラフで
ある。

第４ａ図は、実施例５（Ｂ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＦ−β１とＩＦＮ−αの試験結果を
示すグラフである。

第４ｂ図は、実施例５（Ｂ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＦ−β２とＩＦＮ−αの試験結果を
示すグラフである。

第５ａ図は、実施例５（Ｃ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＰ−β１とＩＦＮ−βの試験結果を
示すグラフである。

第５ｂ図は、実施例５（Ｃ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＦ〜β２とＩＦＮ−βの試験結果を
示すグラフである。

第６ａ図は、実施例５（Ｄ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＦ〜β１とＩＦＮ−Ｔの試験結果を
示すグラフである。

第６ｂ図は、実施例５（Ｄ）で述べる。胸腺リンパ球増
殖検定法によるＴＧＦ〜β２とＩＦＮ−７の試験結果を
示すグラフである。

第７図は、実施例６（Ｂ）で述べる。白血球増殖検定法
によるＴＧＦ−βとＴＮＦの試験結果を示すグラフであ
る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＴＧＦ−βとＴＮＦもしくはＩＦＮ−αとの治療上
   有効量を有する、哺乳動物中の免疫細胞、造血前駆細胞
   、過増殖性細胞および癌細胞の増殖を実質的に阻止する
   組成物。 ２、前記の治療上有効量が、造血前駆細胞を治療するの
   に有効な量である請求項１記載の組成物。 ３、ＴＧＦ−βとＴＮＦの治療上有効量を有する請求項
   ２記載の組成物。 ４、前記ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求項３記載の組成
   物。 ５、前記ＴＧＦ−βとＴＮＦ−αが、１：１〜１０，０
   ００の比率で存在する請求項４記載の組成物。 ６、前記の治療上有効量が免疫細胞を治療するのに有効
   な量である請求項１記載の組成物。 ７、ＴＧＦ−βとＴＮＦとを有する請求項６記載の組成
   物。 ８、前記ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求項７記載の組成
   物。 ９、前記ＴＧＦ−βとＴＮＦ−αが、１：１から１０，
   ０００の比率で存在する請求項８記載の組成物。 １０、造血前駆細胞の増殖を実質的に阻止するＴＧＦ−
   βとＩＦＮ−αの治療上有効量を有する請求項２記載の
   組成物。 １１、前記ＴＧＦ−βとＩＦＮ−αが、１：１〜１０，
   ０００の比率で存在する請求項１０記載の組成物。 １２、免疫細胞の増殖を実質的に阻止するＴＧＦ−βと
   ＩＦＮ−αの治療上有効量を有する請求項６記載の組成
   物。 １３、前記ＴＧＦ−βとＩＦＮ−αが、１：１〜１０，
   ０００の比率で存在する請求項１２記載の組成物。 １４、癌細胞の増殖を実質的に阻止するＴＧＦ−βとＴ
   ＮＦの治療上有効量を有する請求項１記載の組成物。 １５、前記癌細胞が悪性細胞である請求項１４記載の組
   成物。 １６、前記ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求項１４記載の
   組成物。 １７、前記ＴＧＦ−βとＴＮＦ−αが、１：１〜１０，
   ０００の比率で存在する請求項１６記載の組成物。