KR0173967B1

KR0173967B1 - 전환 성장인자-베타를 사용한 마크로파지 및 과립성 백혈구의 재증식법

Info

Publication number: KR0173967B1
Application number: KR1019910006677A
Authority: KR
Inventors: 버수커 이시아; 에이.카알리노 조셉; 네더만 김; 첵터 버니스; 엘링스워드 래리; 스피탤니 죠지
Original assignee: 래리 엘링즈워스; 셀트릭스 파마슈티컬 인코오퍼레이티드; 도미니크 엠. 메자프; 브리스톨-마이어즈 스퀴브 캄파니
Priority date: 1990-04-25
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR910018542A; ZA913087B; IL97922A0; HU911376D0; JPH05252940A; EP0454400A3; EP0454400A2; CA2040969C; CA2040969A1; HUT62030A; US5147799A

Abstract

형질전환 성장인자 -β를 단독으로 또는 콜로니 자극인자와 조합하여 치료적으로 처리하면 포유동물에 있어서 과립성 백혈구 및 단핵백혈구/마크로파지의 수가 증가한다.

Description

[발명의 명칭]

전환 성장인자-베타를 사용한 마크로파지 및 과립성 백혈구의 재증식법

제1도는 TGF-β₁의 생체내 투여후 M-CSF의 생체외 투여를 한 후의 마우스의 골수 전구체 세포에서 유래한 마크로파지의 수증가를 대조표준군의 백분율로 표시한 도(실험은 이하 실시예1에 기술됨).

제2도는 TGF-β₁의 생체내 투여후 GM-CSF의 생체외 투여를 한 후의 마우스의 골수 전구체 세포에서 유래한 마크로파지 및 과립성 백혈구의 수증가를 대조표준군의 백분율로 표시한 도(실험은 이하 실시예1에 기술됨).

제3도는 TGF-β₁의 생체내 투여후 GM-CSF의 생체외 투여를 한 후의 마우스의 골수 전구체 세포에서 유래한 마크로파지 및 과립성 백혈구 수의 투여량-의존 증가를 대조표준군의 백분율로 표시한 도(실험은 이하 실시예2(B)에 기술됨).

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 화학요법 및 조혈(hematopoiesis)의 조절에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 특별히 화학 요법후 환자내의 마크로파지(macrophage) 및 과립성 백혈구(granulocyte) 집단을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

암의 기본적으로 구분되는 특성중의 하나는 악성 세포의 불규칙적이고 빠른 분열 및 증식이다. 휴지세포보다 빠르게 분열하는 세포에 대해 보다 큰 영향을 미치는 많이 사용되는 화학요법의 형태에 이러한 성질이 이용되고 있다. 따라서 규칙적이고 천천히 분열되는 세포는 악성세포 보다 영향을 덜 받는다. 불행하게도 모낭, 장내막 및 조혈에 관계되는 세포를 포함하는 몇몇 세포타입이 통상적으로 빠르게 분열한다. 화학요법후에 따르는 조혈의 억제작용은 가장 심각한 부작용이고, 임파구, 마크로파지 및 과립성 백혈구의 상대적 결여로 인해 많은 경우 환자가 기회성 감염에 걸리기 쉽게 된다.

골수 세포의 유도 및 말단 분화작용에 필요하다고 믿어지는 성장인자가 여럿 알려져 있다. 과립성 백혈구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CFS)는 과립성 백혈구(호증구(neutrophil) 및 호산구(eosinophil)) 및 마크로파지/단핵 백혈구로의 분화작용능을 가진 혈액세포의 형성을 자극한다. 과립성 백혈구 콜로니 자극인자(G-CFS)는 과립성백혈구/마크로파지 전구체 세포로부터 과립성백혈구(주로 호중구)의 생성을 자극한다. 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CFS)는 과립성 백혈구/마크로파지 전구체세포로부터 단핵백혈구/마크로파지의 생성을 자극한다. 화학요법으로 환자에게 GM-CFS, G-CFS 및/또는 M-CFS를 투여하는 것이 자연적인 해결책이라도 이러한 시토킨은 중독적 용량시에만 유효할 수 있다.

1987. 12. 10 출원 시예딘의 미합중국 특허 제4,774,322호는 CIF-A 및 CIF-B의 명칭으로 2가지의 소의 뼈 유래 연골 유도인자(CIFs)를 기술하고 있다. 양자는 SDS-PAGE에 의해 약 26,000 달톤의 분자량을 가지고 또한 이량체(dimer)이다. 그들은 각각 태아쥐 간엽세포를 사용한 한천겔 배양모델에서의 연골특정 프로테오글리칸(PG)생산에 의해 측정된 바와같이 시험관내에서 스스로 연골원 활성을 나타낸다. 그러나 생체내에서는 스스로 연골원적 활성을 나타내지 않는다. CIF-A의 아미노산 서열은 베타 타입 전환성장인자(transforming growth factor ; TGF-β)로 불리는 사람 태반 유래 포리펩타이드로 보고된 것과 동일한 부분적(30 아미노산) N-말단 서열을 가지고 있음을 나타냈다. CIF-B의 N-말단서열의 일부는 TGF-β의 그것과 다르다. 두가지 CIF는 TGF-β분석(부드러운 한천에서 정상적인 쥐 신장 세포 클로니의 앵커리지-독립성 성장을 유도하는 능력)에서 활성을 나타낸다. CIF-A/TGF-β는 지금은 TGF-β₁의 이름으로 알려져 있고 반면에 CIF-B는 일반적으로 TGF-β₂라고 한다.

TGF-β는 EGF 또는 TGF-알파와 조합될 때; (1) 부드러운 한천 배양분석에서 세포증식을 촉진시키고, (2)의 쥐의 부드러운 조직의 상처를 치료시키는 모델에 있어서 세포증식 및 단백질 침착을 촉진시킨다. 이 방법에선 TGF-β가 SDS-PAGE 법에 의해 분자량이 대략 26,000 달톤(26 kDa)인 이량체인 것이 특징이다. TGF-β는 노출되는 세포 타입에 따라 다양한 활성을 보인다. 예를들면 TGF-β는 EGF 또는 TGF-α의 존재하에 정상적인 섬유 아세포의 성장을 자극하나 몇몇 종양세포의 성장은 억제한다. 에이. 비. 로버트등 (Proc Nat Acad Sci USA (1985) 82 : 119-23) 및 벤츠등(미국 특허번호 제4,806,523호)은 TGF-β(CIF-A 및 CIF-B라고도 알려짐)을 항염증제로 사용하는 것을 설명하였고, TGF-β가 T-세포의 증식과 항체생성을 억제한다는 것을 증명하였다. 에스. 츠나와키등(Nature (1988) 334: 260-62)은 TGF-β₁또는 TGF-β₂로 배양한 마크로파지가 가역적으로 불활성화된다는 것을 발견하였다. 에이치. 고이등(J Immunol (1989) 143 : 877-80)은 마우스의 생체내에서 대퇴골수에 직접 TGF-β₁을 투여하면 다잠재성 선구세포의 증식을 가역적으로 억압한다고 보고하였다.

본 발명자들은 이제 TGF-β 단독 투여 또는 CSF와 함께 투여함에 의해 과립성 백혈구 및 마크로파지의 수증가가 필요한 포유동물을 치료하는 방법을 발명했다. TGF-β를 먼저 또는 CSF와 동시 투여했을 때 CSF의 요구 유효량은 독작용을 일으키지 않을 정도로 줄일수 있다.

[발명의 실시태양]

A. 정의

TGF-β 또는 전환성장인자β라는 용어는 단백질 TGF-β₁, TGF-β₂및 TGF-β 수용기와 결합할 수 있고 TGF-β타입 활성을 나타내는 관련 단백질을 말한다. 일반적으로 TGF-β활성은 시험관내에서는 섬유아세포에서 앵커리지-독립성 성장을 관찰함에 의해 분석될 수 있고 생체내에서는 상처 치료 모델에 있어서 단백질과 결합조직형성의 촉진으로 분석될수 있다. TGF-β는 TGF-β와 비슷한 모든 단백질을 포함하고 TGF-β₁과 TGF-β₂는 미국 특허 제4,774,322호에서 CIF-A 및 CIF-B라는 이름으로 기재된 특정 단백질만을 의미하며 상기 특허를 본 명세서에 참고로 병합한다.

CSF라는 용어는 콜로니자극인자를 말하며 과립성 백혈구 및 마크로파지/단핵 백혈구 세포 타입으로 분화되는 선구세포를 유도할 수 있는 단백질을 포함한다. 현재 바람직한 CSF는 M-CSF, GM-CSF 및 F-CSF이다.

마크로파지콜로니 자극인자 또는 M-CSF는 약 45 kDa의 대부분 글리코실화된 동질 이량체이며 적당한 전구체 세포에서 마크로파지/단핵백혈구 세포의 성장을 자극한다. 천연공급원에서 M-CSF(CSF-1이라고 알려짐)의 정제는 이. 알. 스탠리(Meth Enzymol (1985) 116 : 564-87)에 의해 기술되어 있고 클로닝은 이. 에스. 가와사끼 등에 의해 Science (1985) 230 : 291-96 및 PCT WO 86/04607에 개시되어 있다.

과립성 백혈구-마크로파지 콜로니 자극인자 또는 GM-CSF는 약 23 kDa의 당단백질로서, 적당한 전구체 세포로부터 과립성 백혈구(호중구 및 호산구를 포함) 및 마크로파지/단핵 백혈구 세포의 분화를 가능하게 하는 세포의 성장을 자극한다.

과립성 백혈구 콜로니 자극인자 또는 G-CSF는 약 18kDa의 분자량을 갖는 당단백질로서 호중구 콜로니의 증식을 자극한다. N-말단서열의 일부는 트레오닌-프롤린-루신-글리신-프롤린-알라닌-세린-세린-루신-프롤린-글루타민-세린-페닐알라닌-루신-루신-리신-시스테인-루신-글루탐산-글루타민이다. 조건배지로부터 G-CSF의 정제는 오노 등에 의해 미국 특허번호 제4,833,127호에 기재되어 있다. G-CSF의 클로닝과 발현은 소우자에 의해 미국 특허 제4,810,643호에 기재되어 있다.

B. 일반적 방법

TGF-β, GM-CSF, G-CSF 및 M-CSF는 모두 시판되는 것이 사용 가능하고 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람들은 공지방법으로 쉽게 제조할 수도 있다.

TGF-β 및 선택된 CSF(s)는 생체내에서 또는 생체외에서 사용되어진다. TGF-β는 생체내의 투여가 더 바람직하다. 생체내에 투여할때는 단백질은 비경구 경로, 예를들면 정맥주사, 골수주사, 이식장치, 비내 에어로솔 등에 의해 투여된다. 현재 생체내 투여의 바람직한 형태는 정맥주사에 의한 것이다.

본 발명의 방법은 과립성 백혈구 및/또는 마크로파지의 수 증가가 희망되는 어느 경우나, 예를들면 면역억제장해시, 감염 또는 악성종양의 치료시, 또는 의도된 것이나 부작용으로서 골수억제 효과를 갖는 약물로의 치료시에 유용하다. 과립성 백혈구형성 및 골수세포형성의 억제는 가끔 악성종양의 방사선치료 또는 화학요법제 치료시 부작용으로 일어난다. 이것은 감염에 저항하는 능력에 손상을 주어 자주 기회성 유기체가 위험한 정도로 증식되게 한다. 발명의 실행상 TGF-β를 치료 또는 장해이후 또는 그 근처에 투여하며; 바람직하게는 TGF-β를 치료후 0 내지 5일 사이에 투여한다. CFS를 화학요법 또는 방사선요법 치료후에만 투여하는 것이 바람직하고, TGF-β와 동시에 또는 4일이내에 투여한다. CSF투여는 TGF-β 투여후 약 24-48시간에 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 생체외 방법에 있어서, TGF-β 투여후 골수(또는 다른 조혈 조직)를 (바람직하게는) 환자로부터 제거하고 CSF로 치료할 때까지 세포를 배양한다.

투여용 TGF-β, CSF 또는 그것의 조합물의 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 이외에 TGF-β 및/또는 CSF 유효량을 포함할 것이다. 적절한 부형제로는 비경구 투여용으로 승인된 대부분의 담체, 즉 물, 식염수, 링거용액, 행크용액과 글루코스, 락토스, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤, 알부민 등의 용액을 포함한다. 이들 조성물에는 선택적으로 안정화제, 산화방지제, 항균제, 방부제, 완충제, 계면활성제와 다른 보조 첨가제가 포함될수 있다. 현재 바람직한 부형약은 인산염 완충식염수(PBS)중의 약 1㎎/㎖의 혈청알부민으로 구성된다. 비경구투여에 적절한 부형약에 대한 완전한 논의가 E.W.Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 최신판)에서 발견될 수 있다.

정확한 투여량은 환자의 나이, 크기와 현상태, 치료되어야 할 장해의 성질 및 심한 정도 등에 따라 사실상 변경될 것이다. 따라서 정확한 유효량을 미리 특정화할 수 없다. 그러나, 하기의 동물 모델 실험에 따라 적절한 양을 결정할수 있다. 일반적으로 TGF-β의 유효량은 약 10㎍/㎏ 내지 약 1㎎/㎏의 범위일 것이다. 현재 바람직한 TGF-β는 TGF-β₁이다. M-CSF, GM-CSF 및/또는 G-CSF의 유효량은 약 10㎍/㎏ 내지 약 1㎎/㎏이다. 현재 바람직한 CFS는 M-CSF와 GM-CSF이다.

적절한 동물 모델은 하기 실시예에서 기술된 마우스 모델을 포함한다. 간단히, 골수제거 1-9일 후에 TGF-β를 비경구로 투여한다. 골수를 단일세포 현탁액으로 희석하고 CSF로 처리한다. 처리된 세포를 마크로파지 및/또는 과립성 백혈구로 증식 및 분화시키고 증식 및 분화의 정도는 표준기술(즉 과산화물 생성,³H-티미딘 혼입, 형광 활성세포분류(FACS), 세포오염등)에 의해 시험한다. 과립성 백혈구 및/또는 마크로파지/단핵백혈구의 수증가(대조표준군과 비교하여)의 결과는 그들의 전구체 세포에 의해 CSF에 대한 감도의 증가를 나타내며 TGF-β에 의한 전구체 세포의 수 증가를 나타낼수도 있다.

C. 실시예

하기 실시예들은 당해 분야에서의 통상 기술자에게 가이드로서 제공되며 어떤 방법으로도 발명을 한정하는 것으로서 해석되지 않는다.

[실시예1]

[활성의 입증]

(A) 순수 소 TGF-β₁을 0.25㎖의 4mM HC1에 용해하고, 인산염 완충식염수(PBS)중의 마우스 혈청알부민(MSA, 1㎎/㎖) 0.75㎖를 첨가하여 500㎍/㎖ TGF-β₁저장용액을 제조하였다.

이 용액을 25㎍/㎖, 50㎍/㎖와 125㎍/㎖로 희석하여 3개의 실험 용액을 제조하였다. 대조표준용액을 동일하게 그러나 TGF-β₁을 제외하고 제조하였다.

(B) 60마리 암컷 C57B1 마우스를 5개 실험군(군당 12마리 마우스)으로 나누어 0일째에 하기와 같이 TGF-β₁(0.2㎖)을 피하 주사하였다:

A: 마우스당 5㎍ TGF-β₁; B: 마우스당 10㎍ TGF-β₁; C: 마우스당 25㎍ TGF-β₁; D: 처리하지 않음; E: 희석제로 처리.

1일째에 각 군에서 3마리 마우스를 희생시켜 골수세포를 대퇴부와 경골에서 수집하였다. 이 과정을 2일째, 4일째와 9일째에 반복하였다. 단일 세포 현탁액을 DMEM + 10% 말 혈청에서 제조하고 10⁵세포/㎖로 조절하고 24-웰 플레이트에 웰당 1.0㎖ 현탁액으로 도말 하였다. 그후 각 웰어 M-CSF(0.1㎖의 500U/㎖ 스톡) 또는 0.1㎖ PBS를 첨가하였다. 플레이트를 CO₂습식 배양기에서 6일간 배양하고나서, PBS로 세척하고 세포를 포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 플레이트를 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.5)으로 세척하고 1% 메틸렌 블루로 10분간 착색하였다. 착색된 플레이트를 다시 붕산염 완충액으로 세척하고 공기 건조시켰다. 42℃에서 20분간 0.1N HC1을 사용하여 플레이트로부터 염료를 용리하고 용리액 흡수는 630nm에서 판독하였다.

결과는 제1도와 제2도에 나타나 있다. 제1도는 M-CSF를 TGF-β₁-유도 골수세포에 적용하여 기인하는 마크로파지 개체군의 증가를 나타낸다. 25㎍/마우스 TGF-β₁을 투여한 결과 1일째 대조표준의 약 240%로 마크로파지수가 증가되었다. 이것은 골수에서의 마크로파지 전구체 세포의 수가 TGF-β₁을 생체내 투여함으로써 증가되었음을 나타낸다. 제2도는 GM-CSF를 투여함으로써 얻어지는 마크로파지와 과립성 백혈구의 수증가를 나타내고, 이것은 TGF-β₁을 생체내 투여함으로써 CSF에 대한 골수에서의 GM 전구체 세포의 증가된 감도를 나타낸다. 대조표준군은 영향을 받지 않았다.

[실시예 2]

(A) 15마리의 CB6F₁수컷마우스를 5개의 실험군(군당 3마리의 마우스)으로 나누고 다음과 같이 0일째 TGF-β₁(0.2㎖)를 피하주사하였다;

A: 처리하지 않음; B: 희석제 대조표준; C: 마우스당 25㎍ TGF-β₁; D: 마우스당 10㎍ TGF-β₁; E: 마우스당 5㎍ TGF-β₁.

2일째 각 군으로부터 마우스를 희생시키고 대퇴골과 경골로부터 골수세포를 수집하였다. 단일 세포 현탁액을 DMEM + 10% 말 혈청에 제조하고 10⁵개 세포/㎖로 조절한 후 1.0㎖ 현탁액/웰로 24개의 웰이 있는 플레이트에 도말하였다. 그런 다음 M-CSF(500U/㎖ 스톡의 0.1㎖), GM-CSF(500U/㎖ 스톡의 0.1㎖) 또는 0.1㎖ PBS를 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 CO₂습식배양기내에서 6일 동안 배양하고 PBS로 세척한 후 세포를 포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 플레이트를 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.5)으로 세척하고 1% 메틸렌블루로 10분동안 착색시켰다. 착색된 플레이트를 다시 붕산염 완충액으로 세척하고 공기 건조시켰다. 그런 후 42℃에서 20분동안 0.1N HC1을 사용하여 플레이트로부터 염료를 용리하고 용리액의 흡광도는 630nm에서 판독하였다.

결과는 아래 표1에 나타낸다. 이 결과는 TGF-β₁을 투여하면 골수에서의 마크로파지와 과립성 백혈구 전구체 세포의 CFS에 대한 감도가 증가됨을 나타낸다.

(B) 투여량을 1.0, 2.5 및 5.0㎍/마우스 TGF-β로 치환하여 상기 (A)의 실험을 반복하였다. 결과는 대조표준의 백분율로 제3도에 나타내었다.

투여량에 좌우되는 반응이 관찰되었다.

[실시예 3]

[투여방식]

이 실험은 투여방식이 생물학적 반응에 영향을 미치는지의 여부를 측정하기 위해 행하였다.

12마리의 CB6F수컷마우스를 5개의 실험군(군당 3마리의 마우스)으로 나누고 0일째에 다음과 같이 TGF-β(0.2㎖)를 피하 주사하였다:

A: 처리하지 않음; B: 마우스당 25㎍ TGF-β, 피하; C: 마우스당 25㎍ TGF-β, 정맥내; D: 마우스당 25㎍ TGF-β, 복막내.

2일째 각 군으로부터 마우스를 희생시키고 대퇴골과 경골로부터 골수세포를 수집하였다. 단일 세포 현탁액을 DMEM +10% 말 혈청에 제조하고 10개 세포/㎖로 조절한후 1.0㎖ 현탁액/웰로 24개의 웰이 있는 플레이트에 도말하였다. 그런 다음 M-CSF(500U/㎖ 스톡의 0.1㎖), GM-CSF(500U/㎖ 스톡의 0.1㎖) 또는 0.1㎖ PBS를 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 CO습식배양기내에서 6일동안 배양하고 PBS로 세척한 후 세포를 포름알데히드로 고정시켰다. 고정된 플레이트를 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.5)으로 세척하고 1% 메틸렌블루로 10분 동안 착색시켰다. 착색된 플레이트를 다시 붕산염 완충액으로 세척하고 공기 건조시켰다. 그런 후 42℃에서 20분동안 0.1N HC1을 사용하여 플레이트로부터 염료를 용리하고 용리액의 흡광도를 630nm에서 판독하였다.

결과는 아래 표2에 나타낸다. 이 결과는 생물학적효과가 투여경로와는 무관함을 나타낸다.

Claims

TGF-β의 유효량; 및 CSF의 유효량으로 되어 있는 것을 특징으로 하는 단핵백혈구/마크로파지 또는 과립성 백혈구의 증식 및 분화를 유도하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CSF가 M-CSF, G-CSF 및 GM-CSF로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β₁인 것을 특징으로 하는 조성물.
TGF-β의 유효량을 갖고 있는 제1 용기; 및 CSF의 유효량을 갖고 있는 제2용기로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 단핵백혈구/마크로파지 또는 과립성 백혈구의 증식 및 분화를 유도하는 위한 키트.
제4항에 있어서, 상기 TGF-β가 TGF-β₁인 것을 특징으로 하는 키트.
제4항에 있어서, 상기 CSF가 M-CSF, G-CSF 및 GM-CSF로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.