HUT62030A - Process for multiplication of macrophages and granulocytes with transforming beta-growth factor - Google Patents
Process for multiplication of macrophages and granulocytes with transforming beta-growth factor Download PDFInfo
- Publication number
- HUT62030A HUT62030A HU911376A HU137691A HUT62030A HU T62030 A HUT62030 A HU T62030A HU 911376 A HU911376 A HU 911376A HU 137691 A HU137691 A HU 137691A HU T62030 A HUT62030 A HU T62030A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- csf
- tgf
- cell
- granulocytes
- effective amount
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A jelen találmány a vérképzés kemoterápiájának és szabályozásának területeivel kapcsolatos. Részletesebben a jelen találmány a makrofág és granulocita populációk egyénben való növelésének módszereivel kapcsolatos, különösen kemoterápia után.
A rák egyik fő megkülönböztető jellemzője a rosszindulatúi sejtek abnormálisán gyors osztódása és burjánzása. Ezt használják ki a kemoterápia számos jelenleg alkalmazott formájában, melyekben a gyorsan osztódó sejtekre nagyobb a hatás, mint a nyugalomban levőkre, így a normális, lassan osztódó sejtekre gyakorolt hatás kisebb, mint a rosszindulatú sejtekre. Sajnos számos sejttípus normális körülmények között is gyorsan osztódik. Ezek közé tartoznak a szőrtüszőkkel, az intesztinális rendszer belsejét boritó réteggel és a vérképzéssel kapcsolatos sejtek. A kemoterápiát követő vérképzési depresszió a legsúlyosabb mellékhatás, ami számos esetben a beteget fogékonnyá teszi opportunista fertőzéssel szemben a limfociták, makrofágok és granulociták viszonylagos hiánya következtében.
Számos ismert növekedési faktor létezik, melyeket szükségesnek vélnek a csontvelő sejtek indukálásához és végső differenciálódásához. A granulocita makrofág telep stimuláló faktor /GM - CSF/ a mieloblasztok képződését serkenti, mely sejtek granuloci • · ······ · · • · · · *··· • · t ··· · · ··· ····· ·· · · • · · · ··· · · ·· tákká /neutrofilek és eozinofilek/ és makrofág/monocitákká képesek differenciálódni. A granulocita telep stimuláló faktor /G - CSF/ a granulocita/makrofág prekurzor sejtekből történő granulociták /túlnyomórészt neutrofilek/ képződését serkenti. A makrofág telep stimuláló faktor /M - CSF/ a monocita/makrofágok termelődését serkenti granulocita/makrofág prekurzor sejtekből. Bár természetes megoldásnak látszana, hogy a kemoterápiás kezelésnek alávetett betegnek GM - CSF-t, G - CSF-t és/vagy M - CSF-t adjunk ezek a sejtszaporodást és osztódást befolyásoló anyagok csupán toxikus mennyiségekben lennének hatásosak»
Seyedin az 1987 december lo.-én iktatott U.S· Patent No. 4,774,322 számú szabadalomban CIF - A és CIF - B-nek jelölt, két szarvasmarha csont-eredetű porc indukáló faktort /CIF-ek/ irt le. Mindkét faktor molekulasúlya megközelítően 26.ooo dalton /az SDS - PAGE. ’ technikával/ és mindkettő dimer. In vitro körülmények között magában mindkettő chondrogén aktivitást mutat, ahogy azt magzati patkány mezenhima sejteket használva agaróz gél tenyész modellben a porc specifikus proteoglükán /PG/ termeléssel mértük. Azonban in vivő körülmények között magában egyik sem aktív chondrogenikusan. A CIF - A aminosav szekvenálása kimutatta, hogy a CIF— A-nak van egy részleges /3o aminosav/ N-terminális szekvenciája, mely azonos a béta - tipusu transzfor• · · · ··· · ···· • ·· ··· · · ··· ····· ·· · · ··· · · · · ·· ·· máló növekedési faktornak /TGF~p/ nevezett humán placenta eredetű polipeptid esetében leirt szekvenciával· A CIF - B részleges N-terminális szekvenciája különbö- zik a TGF -β-étól. Mindkét CIF rendelkezett aktivitással a TGF -fi vizsgálatban /lágyagarban a normál patkány vese sejt telepek rögzítés-független, szaporodásának indukálására való képesség/. A CIF - A/TGF ~p jelenleg a TGF - pl néven ismert, míg a CIF - B-re általában mint TGF -p?2-re hivatkozunk.
A TGF - β , ha EGF-ral vagy TGF - alfával kombináljuk, /1/ elősegíti lágyagar tenyészet vizsgálatban a sejtszaporodást és /2/ elősegíti a sejtszaporodást és a fehérjeraktározást a patkány lágy szövet sebgyógyulási modellben. Az alkalmazások úgy jellemzik a TGF-kát, mint dimereket, melyeknek az SDS - PAGE módszer szerint megközelítően 26.ooo dalton /26 kDa/ a molekulasúlyuk. A TGF -β az aktivitások széles skáláját mutatja, mely úgy tűnik jórészt a hatásának kitett sejttípustól függ. Például a TGF -β a normál fibrobiasztok szaporodását stimulálja EGF vagy TGF -o< jelenlétében, de gátolja néhány tumorsejt szaporodását: A.B. Roberts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA /1985/ 82: 119 - 23· Bentz et al. az U.S. Pat. No. 4,8o6,523 számú szabadalomban /a CIF - A-nak és CIF - B-nek is ismert/ leírta a TGF -β gyulladásgátló hatását és kimutatta, hogy a TGF -β gátolta a T-sejtek szaporodását • · * · .
és az antitest termelést. S. Tsunawaki et.val., Natúré /1988/ 554:26o - 62 azt találták, hogy a TGF -^bl-gyel vagy a TGF -p 2-vel inkubált makrofágok reverzibilisen deaktiválódtak. H. Goey et al., J. Immunoi. /1989/ 145:877 - 80 arról számoltak be, hogy in vivő körülmények között az egér comb csontvelőbe közvetlenül bejuttatott TGF -fi 1 reverzibilisen gátolta a pluripotens őssejtek szaporodását.
Megnövekedett számú granulocotát és makrofágot igénylő emlősök kezelésére alkalmas módszert fejlesztettünk ki, melynek során TGF -β-t magában vagy CSF-ral kombinálva alkalmazunk. Ha a TGF - fi-t a CSF-t megelőzően vagy azzal egyidejűleg adjuk a betegnek, a CSFból szükséges hatásos dózis a szubtoxikus szintekre csökken.
A következőkben megadjuk a találmányban szereplő ábrák rövid leírását»
1. ábra: az egér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok számának növekedését ábrázolja a TGF -p> 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő M - CSF adagolás követett, a kontroll százalékában kifejezve. A kísérletet a későbbiekben leirt 1. Példa ismerteti.
• » · · ··· · · · · · • · · ·· · · · ··· ····· · · · · •·· · · ·« ·· ··
2. ábra: az eeér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok és granulociták számának növekedését szemlélteti a TGF - (¾ 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő GM - CSF^dagolás követett, a kontroll százalékába kifejezve. A kísérletet a későbbiekben leirt 1. Példa ismerteti.
p. ábra: az egér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok és granulociták számának dózis-függő növekedését szemlélteti a TGF - (b 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő GM - CSF adagolás követett a kontroll százalékában kifejezve. A kísérlet leírása a későbbiekben ismertetett 2/B/ Példában található.
A következőkben megadjuk a találmány kivitelezésének módjait.
A. Az alábbiakban megadjuk a találmányban alkalmazott kifejezések ismertetését.
TGF - (b, vagy transzformáló növekedési faktor p> :
olyan TGF - pi, TGF - p 2 és ezekkel rokon proteinek, melyek a TGF ~p receptorokhoz képesek kötődni és a TGF —p> tipusu aktivitást képesek befolyásolni. Általában a TGF -p aktivitás az in vffcro körülmények közötti fibroblasztokban való rögzi• · · tés-független szaporodás megfigyeléséből, valamint az in vivő sebgyógyulási modellekben való protein és kötőszövet képződés előmozdításából állapítható meg. A TGF - “ az összes TGF -szerű proteint magába foglalja, míg a ”TGF -p>l” és ”TGF -^2” csupán azokat a specifikus fehérjéket jelölik, melyek az U.S. Pat. No. 4,774,5?-2 számú szabadalom bán /az irodalmi hivatkozás révén a találmányba épitettük/ a CIF - A és CIF - B nevek alatt kerültek leírásra.
CSF:
telep stimuláló faktor, olyan fehérjéket foglal magába, melyek az őssejteket a granulocita és mákrofág/monocita sejttípusokká való differenciálódásra képesek indukálni. A jelenleg kedvelt CSFok az M - CSF, a GM - CSF és a G - CSF.
Makrofág telep stimuláló faktor, vagy M - CSF : körülbelül 45 kDa molekulasulyu, erősen glikolizált homodimer, mely a makrofág/monocita sejtek megfelelő prekurzor sejtekből való szaporodását stimulálja. Az M - CSF /CSF-l-ként is ismert/ természetes forrásokból való tisztítását E.R. v Stanley, Meth. Enzymol. /1985/ 116:564 -87, irta le, míg a klónozást E.S. Kawasaki et aló, Science /1985/ 23o:291 - 96; és Kawasaki et al., PCT WO • 4 ·*·· ··· · «444 • 4 4 4 *· * «4 ·· • · 4 · 4 44 44 ··· 4 ··« ····
86/o46o7 száma szabadalomban tették közzé.
Granulocita - makrofág telep stimuláló faktor, vagy
GM - CSF:
egy kb. 23 kDa molekulasulyu glükoprötéin, mely a megfelelő prekurzor sejtekből való granulocita /ide értve a neutrofileket és az eozinofileket/ és makrofág/monocita sejtekké differenciálódni képes sejtek szaporodását stimulálja.
Granulocita telep stimuláló faktor, vagy G - CSF: egy kb. 18 kDa molekulasulyu glükoprotein, mely a neutrofil telepek szaporodását stimulálja. A részleges N-terminális szekvencia: Thr - Pro - LeuGly - Pro - Alá - Ser - Ser - Leu - Pro - GinSer - Phe - Leu -Leu - Lys - Cys - Leu - Glu Gin. A G - CSF kondicionált táptalajokból való tisztítását Ono et al., az U-S. Patent No. 4,833, 127 számú szabadalomban írták le. A G - CSF klónozását és expresszióját Souza irta le az U.S. Pat. No. 4,81o,643 számú szabadalomban.
B. Az alábbiakban leírjuk a találmány általános módszerét.
A TGF - , GM - CSF,: G - <3SF és M - CSF mind beszerezhetők kereskedelmi forrásokból, vagy könnyen beszerezhető anyagokból előállíthatók olyan módszerek alkal mazásával, melyek a tudomány e területén jártas szakemberek számára ismertek és melyeket fent idéztünk.
A TGF -β-Ί és a szelektált CSF/oka/-t vagy in vivő vagy ex vivő alkalmazzák. A TGF -£>-t szívesebben alkalmazzák in vivő. Ha in vivő alkalmazzák, a fehérjéket általában parenterálisan juttatják be, pl. intravénás injekcióval, a csontvelőbe való injekciózással, implantálási módszerrel, intranazális aeroszollal és hasonló módokon. A jelenleg előnyben részesített in vivő alkalmazási mód az intravénás injekcióval való bejuttatás.
A találmány módszere hasznos bármely olyan esetben, amikor kívánatos a granulociták és/vagy makrofágok megnövekedett száma,, -pl. egy immunoszupressziv rendellenesség esetén, fertőzés vagy rosszindulatú daganat kezelésekor, vagy myeloszupressziv ágensekkel való kezelés után, akár szándékos, akár mellékhatásról van szó. A granulopoezis és a myelopoezis szupressziója gyakran fordul elő mellékhatásként a rosszindulatú daganat sugárkezeléses vagy kemoterapeutikumos kezelése során. Ennek hatására a beteg fertőzéssel szembeni ellenálló képessége meggyengül, lehetővé téve, hogy az opportunista szervezetek veszélyes mértékig szaporodjanak. A találmány gyakorlata szerint a TGF -a kezelés vagy a rendellenesség idejéhez közel vagy azt követően alkalmazzuk: előnyösen a TGF -[b alkalmazása ·« ·· • * 4 *· ··· 4 «4», ♦ · j·
V·· ····
- Ιο a kezelést követő o-5 napon belül történik. A CSF-t előnyösen csupán kemoterapeutikumos vagy radioterápiás kezelés után, és vagy a TGF -^>-val egyidejűleg vagy o-4 nappal azt követően alkalmazzuk. Előnyösen a CSF alkalmazása a TGF -β> alkalmazásai . 24-48 órával követi.
A találmány ex vivő módszereiben a csontvelőt /vagy más vérképző szövetet/ eltávolítják a betegből /előnyösen/ a TGF -β alkalmazását követően és a sejteket tenyészetben tartják fenn a CSF-ral való kezelésig.
Az alkalmazásra szánt TGF -β, CSF, vagy ezek kombinációinak összeállításai általában a TGF és/vagy CSF hatékony mennyiségeit fogják tartalmazni a gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyag mellett. Az alkalmas kötőanyagok közé tartozik a legtöbb parenterális alkalmazáshoz jóváhagyott hordozó. Ezek közé tartozik a víz, sóoldat, a Einger oldat, a Hank oldat, valamint a glükóz, laktóz, dextróz, etanol, glicerin és a hasonlók oldatai. Ezek az összeállítások tetszés szerint tartalmazhatnak stabilizálókat, antioxidánsokat,antimikrobiális anyagokat, konzerválószereket, pufferoló ágenseket, felületaktív anyagokat és más járulékos adalék anyagokat. A jelenleg előnyben részesített hordozó kb 1 mg/mL szérumalbumint tartalmaz foszfát pufferes sóoldatban /PBS/. A parenterális alkalmazáshoz megfelelő hordozókról átfogó leírást E. W. Martin ”Re • ·
- 11 mington’s Pharmaceutical Sciences” /Mack Pub. Co., jelen kiadás/ cimü müvében található.
A szükséges pontos dózis a kortól, testmérettől, az alany állapotától, a kezelendő rendellenesség természetétől és súlyosságától és hasonlóktól függ: igy a pontos hatásos mennyiséget nem lehet előre specifikálni. Azonban a megfelelő mennyiségek az állati modellekkel végzett rutin kísérletezések alapján meghatározhatók, ahogy azt az alábbiakban leírjuk. Általában a TGF -(·) hatásos dózisa kb. lo |ag/kg - kb. 1 mg/kg határok közé esik. A jelenleg kedvelt TGF -β a TGF -^>1. Az M - CSF, GM - CSF és/vagy G - CSF hatásos dózisai kb lo jüg/kg - kb lmg/kg közé esnek. A jelenleg kedvelt CSF-ok az M - CSF és a GM - CSF.
Az alkalmas állati modellek közé tartozik az alábbi példákban illusztrált egér modell. Röviden, TGF -β-t alkalmazunk parenterálisan, ezt követi 1-9 nap elteltével a csontvelő eltávolítása. A velőt egy-sejt szuszpenzióvá hígítjuk és CSF-val kezeljük. A kezelt sejteket hagyjuk szaporodni és makrofágokká és/vagy granulocitákká differenciálódni, majd a szaporodás és differenciálódás mértékét standard technikákat /pl. peroxid fejlődés, H - timidin beépülés, fluoreszcensaktivált sejtosztályozás /FACS/ sejtfestés és hasonlók/ alkalmazva vizsgáljuk. A nyert granulociták és/vagy makrofág/monociták /a kontrollokhoz viszonyított/ meg- 12 -
növekedett száma az előbbi prekurzor sejtek CSF-val szemben megnövekedett érzékenységét jelzi, valamint jelezheti a prekurzor sejtek számának, TGF -φ-nak köszönhető, növekedését.
C. A következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt .
Az alábbiakban bemutatott példákat a tudomány e területén átlagosan képzett alkalmazó személy számára adtuk meg további útmutatásként, de ezek nem értelmezendőek a találmány bármilyen módon való korlátozásaként .
1. Példa
ZAz. aktivitás bemutatása/ /A/ Természetes szarvasmarha TGF -fsl-et oldottunk fel o,25 mL 4 mM-os HCl-ban, majd foszfát puffereit sóoldatban /PBS/ levő o,75 mL egér szérum albumint /MSA, 1 mg/mL/ adtunk hozzá, hogy 5oo jug/mL TGF -(^1 törzsoldatot kapjunk. Ebből az oldatból 3 vizsgálati oldatot készítettünk, a törzsoldat 25 /ug/mL és 125 /ug/ mL-es oldatokká való hígításával. Kontroll oldatot azonos módon készítettünk, de kihagytuk a TGF • «
- 13 /Β/ 6ο nőstény C57B1 egeret 5 kísérleti csoportba osztottunk /12 egér/csoport/ és szu.bku.tan módon TGF ^1-gyel /o,2 mL/ injekcióztuk a o. napon a következők szerint:
A: 5’p-g TGF - 1/egér;
B: lo fag TGF - 1/egér;
C: 25 /ig TGF - 1/egér;
D: kezeletlen;
E: oldószerrel kezelt.
Az 1. napon minden csoportból 3 egeret feláldoztunk és a csontvelő sejteket a comb- és a sipcsontból összegyűjtöttük. Ezt az eljárást megismételtük a 2., a 4. és a 9. napokon. Egy-sejt szuszpenziókat készitettünk DMEM + lo% lószérumban és a sejtszámot lo^ sejt/mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk l,o ml szuszpenzió/rekesz mennyiségben. Ezután minden rekeszhez M — CSF-t /o,l mL az 5°° U/mLes törzsoldatból/, GM -.CSF-t /o,l mL az 5οθ U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk. A lemezeket ezután 6 napig CO2-0S nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd PBS-tal mostuk és a sejteket formaldehiddel rögzítettük.A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és lo percig 1%-os metilénkékkel festettük. A festett lemezeket ismét borát pufferrel mostuk és levegőn hagytuk megszáradni· Ezután a festéket a lemezekről o,l N-os HCl-ot hasz• · · ·
- 14 nálva 2o percig mostuk 42°C hőmérsékleten, majd, az eluens abszorpcióját 6Jo nm hullámhosszon leolvastuk.
Az eredményeket az 1. és 2. ábrák szemléltetik. Az 1. ábra a TGF -p>l által indukált velősejtekből az M - CSF-val való kezelés erdményeként bekövetkező makrofág populáció növekedést mutatja. 25 ^ig/egér TGF -(11 alkalmazása a makrofágok számát az 1. napon a kontrolihoz viszonyítva 24o%—kai növelte. Ez azt jelzi, hogy a csontvelőben levő makrofág prekurzorsejtek száma megnőtt a TGF -^>1 in vivő alkalmazásának eredményeként. A 2. ábra a GM - CSF alkalmazás kövezkeztében megnövekedett makrofágok és granulociták számát illusztrálja. Ez azt mutatja, hogy a csontvelőben levő GM prekurzor sejtek CSF-val szembeni érzékenysége megnőtt a TGF -(61 in vivő alkalmazásának következtében. A kontroll csoportok esetében nem volt hatás.
2^ Példa /A/ 15 him CBeF-^ egeret 5 csoportra osztottunk /3 egér/csoport/ és TGF -^1-gyel /o,2 mL/ szubkután módon injekcióztuk a o. napon a következők szerint:
A: | kezeletlen; | |
B: | oldószeres | kontroll; |
C: | 25 pg TGF - | 1/egér; |
D; | lo (ug TGF - | 1/egér; |
··· · • ···· · · · · ··· · ·*· ·· ··
- 15 Ε: 5 pg TGF ~ 1/egér
A 2. napon az összes csoportban levő egeret feláldoztuk és a comb- és sipcsontból a csontvelő sejteket összegyűjtöttük. Egy-sejt szuszpenziót készítettünk DMEM + lo% loszérumban és a se jtsürüséget loy sejt/mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk, 1 mL szuszpenzió/rekesz mennyiségben. Ezután M CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/, GM - OSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk mindegyik rekeszhez. Ezután a lemezeket 6 napig C02-os nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd. PBS-tal mostuk és a sejteket f ormaid, ehidd. e(i rögzítettük. A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és 1%-oá metilénkékkel lo percig festettük. A festett lemezeket ismét borát pufferrej. mostuk és levegőn hagytuk megszáradni. A festéket ezután lemostuk a lemezekről 2o percig 42 °C hőmérséklezen o,l N-os HCl-at használva és az eluens abszorpcióját 63o nm-es hullámhosszon leolvastak.
Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az eredmények azt mutatják, hogy a TGF -£>1 alkalmazása megnöveli a csontvelőben levő makrofág és granulocita prekurzor sejtek CSF-val szembeni érzékenységét.
1· Táblázat
Csoport | % Kezeletlen Kontroll | % Oldószeres Kontroll |
A: Kezeletlen | Ιοο,ο | - |
B: Oldószeres | loo. 0 | - |
+ M - CSF | 88,7 | - |
+ GM - CSP | 114,6 | - |
C: 25 /ig TGF -f)l | ||
+ M - CSF | 161,3 | 181,9 |
+ GM - CSF | 201.6 | 175,8 |
D: lo TGF -βΐ | ||
+ M - CSF | 166,4 | 187,6 |
+ GM - CSF | 193 | 168,3 |
E: 5 /ig TGF -|bl | ||
+ M - CSF | 177,5 | 2oo,2 |
+ GM - CSF | 218,8 | 190,8 |
/Β/ A fenti /A/ kísérleti részt megismételtük a dózisokat l,o; 2,5 és 5,o /ig/egér TGF -β dózisokkal helyettesítve. Az eredményeket a 3· ábra mutatja, a kontroll százalékában kifejezve. Dózisfüggő válaszokat figyeltünk meg.
3» Példa
ZAz_alkalmazás_módja/ « ·
- 17 Ezt a vizsgálatot azért végeztük el, hogy megállapítsuk, hogy az alkalmazás befolyásolja-e a biológiai választ.
him CB6F-^ egeret 5 kísérleti csoportba osztottunk /3 egér/csoport/ és szubkután módon TGF -f>l-gyel /o,2 mL/ beinjekcióztuk a o. napon a következők szerint ϊ
A; Kezeletlen;
B: 25 pg TGF -^Sl/egér, szubkután;
C: 25 /ig TGF -p?l/egér, intravénás;
D: 25 ps TGF -βΙ/egér, intraperitoneális.
A 2. napon valamennyi csoportban levő egereket feláldoztuk, és a comb- és sipcsontból a csontvelő sejteket összegyűjtöttük. Egy-sejt szuszpenziót készítettünk DMEM + lo% lószérumban és a sejtsürüséget lo^ sejt/ mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk l.o mL szuszpenzió/rekesz mennyiségben. M - CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/, GM - CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk mindegyik rekeszhez. A lemezeket ezután 6 napig CC^-os nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd PBStal mostuk és a sejteket formaldehiddel rögzítettük. A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és 1%-os metilénkékkel lo percig festettük. A festett lemezeket ismét mostuk borát pufferrel és levegőn hagytuk megszáradni. A festéket ezután lemostuk « ·· ·
- 18 ··· · ·«·· • ·· «·· · · ··· ····· ·· · · ··· · ··· · · ·· a lemezekről 2o percig 42 °C hőmérsékleten o,l N-os HC1ot használva, és az eluens abszorpcióját 630 nm hullámhosszon leolvastuk. Az erdményeket a 2» Táblázat szemlélteti. Az eredmények azt mutatják, hogy a biológiai hatás független az alkalmazás módjától.
2. Táblázat
Csoport | % Kezeletlen Kontroll |
A: Kezeletlen | Ιοο,ο |
B: Szubkután /comb/ | |
+ M - CSF | 194,7 |
+ GM - CSF | 195,2 |
C: Intravénás | |
+ M - CSF | 217 |
+ GM - CSF | 213,5 |
D: Intraperitoneális | |
+ M -CSF | 218,1 |
+ GM - CSF | 214,4 |
• ··
1· ábra
2. ábra pg TGF pig TGF pg TGF
GM - CSF
1—i <—i o £1 O
A = 5 pg TGF -^/egér
B = lo pg TGF -^/egér C = 25 yug TGF --p>/egér napok
TGF - BÉTA 1
M *· CSF
GM - CSF
Claims (13)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az emlős granulociták vagy monocita/ makrofágok szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy:egy vérképző alapsejt kapcsolatba kerül a TGF egy hatásos mennyiségével; és az említett sejt a CSF egy hatásos mennyiségével kerül kapcsolatba az említett TGF ~p>-val való érintkezéstől számított o-5 napon belül.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G - CSF-t és GM· - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
- 3· Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett TGF -β-t a TGF -jSl-t és TGF p2-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a CSF-val a TGF -^>-val való érintkezés után kb 1-7 nappal kerül kapcsolatba.
- 5· Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a TGF -^-val in vivő kerül kapcsolatba, a vérképző alapsejttel rendelkező em•«·· ·· • · * · · · · · • * * ··· 4 * ·♦ · • ···» , * » · · •·· · ··· ·« ··- 21 lőshek hatékony mennyiségű TGF -^-val való kezelése révén.
- 6. Az 5· igénypont szerinti eljárás a továbbiakban azzal jellemezve, hogy:az említett vérképző sejtet eltávolítjuk az említett emlősből, miután az említett sejt kapcsolatba került a TGF -^-val, az említett sejt CSF-val való érintkezését megelőzően, ahol az említett sejt a CSF-val ex vivő kerül kapcsolatba.
- 7· A 6. igénypontban leirt eljárás a továbbiakban azzal jellemezve, hogy:az említett sejtet olyan emlősbe juttatjuk az említett sejt CSF-val való kezelése után, melynek további monocita/makrof ágokra vagy granulocitákra van szüksége.
- 8. Az 5· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a CSF-val az említett emlősnek in vivő adott hatásos CSF mennyiség révén kerül kapcsolatba.
- 9. Egy összeállítás a monocita/makrofágok vagy granulociták szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy ···- 22 egy hatásos mennyiségű TGF -S-t» és egy hatásos mennyiségű CSF-t tartalmaz.
- 10. A 9· igénypontban szereplő összeállítás azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G CSF-t és GM - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
- 11. A 9· igénypontban szereplő összeállítás azzal jellemezve, hogy az említett TGF -fi, TGF -^>1.
- 12. Egy kit a monocita/makrofágok vagy granulociták szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy:az első tároló hatásos mennyiségű TGF ~p>-t tartalmaz; és egy második tároló hatásos mennyiségű CSF-t tartalmaz.igénypontban szereplő kit, azzal jellemezve, hogy az említett TGF -fi egy TGF 1.
- 14. A 12. igénypontban szereplő kit azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G - CSF-t és GM - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.• · ···* ···· «ζ · ♦ * ·· · • · · ··· · ···· • ···· , · · ·^ · ··* 9 4«· ····- 23 A következőkben megadjuk a találmány leírásának kivonatát.vagy a Telep Stimuláló Faktorral kombinált kezelés terápiásán növeli a granulociták és monocita/makrofágok számát emlősökben.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/513,999 US5147799A (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Repopulation of macrophages and granulocytes using transforming growth factor-beta |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU911376D0 HU911376D0 (en) | 1991-10-28 |
HUT62030A true HUT62030A (en) | 1993-03-29 |
Family
ID=24045403
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU911376A HUT62030A (en) | 1990-04-25 | 1991-04-24 | Process for multiplication of macrophages and granulocytes with transforming beta-growth factor |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5147799A (hu) |
EP (1) | EP0454400A3 (hu) |
JP (1) | JPH05252940A (hu) |
KR (1) | KR0173967B1 (hu) |
CA (1) | CA2040969C (hu) |
HU (1) | HUT62030A (hu) |
IL (1) | IL97922A0 (hu) |
ZA (1) | ZA913087B (hu) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2130493C1 (ru) * | 1984-07-06 | 1999-05-20 | Новартис Аг | Способ получения белка с активностью gm-csf приматов |
US5795568A (en) * | 1984-09-19 | 1998-08-18 | Novartis Corporation | Method of treating infectious disease with GM-CSF |
US5529982A (en) * | 1985-08-06 | 1996-06-25 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Inducing granulocyte production or B cell production in peripheral blood by TGF-β |
CA2067498C (en) * | 1990-09-21 | 1996-10-15 | Joseph Carlino | Composition for inducing granulocyte production or b cell production in peripheral blood |
WO1993014782A1 (en) * | 1992-01-29 | 1993-08-05 | La Jolla Cancer Research Foundation | Methods of controlling the proliferation of macrophages |
DE69821629T2 (de) | 1997-09-19 | 2005-01-13 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Kombinationen von Cytokinen mit neurotroper Aktivität |
US8338373B2 (en) * | 2003-10-24 | 2012-12-25 | Nora Therapeutics, Inc. | Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject |
EP2140875A1 (en) * | 2003-10-24 | 2010-01-06 | Nora, LLC | Compositions and methods for healthy pregnancy |
US20090226397A1 (en) * | 2003-10-24 | 2009-09-10 | Nora Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0169016B2 (en) * | 1984-07-16 | 2004-04-28 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
US4843063A (en) * | 1984-07-16 | 1989-06-27 | Collagen Corporation | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
US4806523A (en) * | 1985-08-06 | 1989-02-21 | Collagen Corporation | Method of treating inflammation |
US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
-
1990
- 1990-04-25 US US07/513,999 patent/US5147799A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-04-22 EP EP19910303603 patent/EP0454400A3/en not_active Withdrawn
- 1991-04-23 IL IL97922A patent/IL97922A0/xx unknown
- 1991-04-23 CA CA002040969A patent/CA2040969C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-24 ZA ZA913087A patent/ZA913087B/xx unknown
- 1991-04-24 HU HU911376A patent/HUT62030A/hu unknown
- 1991-04-25 KR KR1019910006677A patent/KR0173967B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-04-25 JP JP3095842A patent/JPH05252940A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0454400A2 (en) | 1991-10-30 |
ZA913087B (en) | 1992-02-26 |
US5147799A (en) | 1992-09-15 |
EP0454400A3 (en) | 1992-10-21 |
JPH05252940A (ja) | 1993-10-05 |
IL97922A0 (en) | 1992-06-21 |
CA2040969C (en) | 1996-10-15 |
HU911376D0 (en) | 1991-10-28 |
KR910018542A (ko) | 1991-11-30 |
CA2040969A1 (en) | 1991-10-26 |
KR0173967B1 (ko) | 1999-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5817773A (en) | Stimulation, production, culturing and transplantation of stem cells by fibroblast growth factors | |
Lopez et al. | Murine eosinophil differentiation factor. An eosinophil-specific colony-stimulating factor with activity for human cells. | |
Molineux et al. | Transplantation potential of peripheral blood stem cells induced by granulocyte colony-stimulating factor | |
Landreth et al. | Pre-B cell generation potentiated by soluble factors from a bone marrow stromal cell line. | |
Rennick et al. | Control of hemopoiesis by a bone marrow stromal cell clone: lipopolysaccharide-and interleukin-1-inducible production of colony-stimulating factors | |
Mould et al. | Relationship between interleukin-5 and eotaxin in regulating blood and tissue eosinophilia in mice. | |
Dexter et al. | The regulation of haemopoiesis in long‐term bone marrow cultures: I. Role of L‐cell CSF | |
US5674843A (en) | Increase in hematopoietic progenitor cells in peripheral blood by transforming growth factor β | |
HUT62030A (en) | Process for multiplication of macrophages and granulocytes with transforming beta-growth factor | |
Li et al. | Spontaneous megakaryocyte colony formation in myeloproliferative disorders is not neutralizable by antibodies against IL3, IL6 and GM‐CSF | |
US20070298015A1 (en) | Treatment of Muscular Dystrophy with Mobilized Peripheral Blood Pluripotent Cells | |
Migliaccio et al. | Comparative analysis of hematopoietic growth factors released by stromal cells from normal donors or transplanted patients [see comments] | |
Falkenburg et al. | Gene-expression and release of macrophage-colony stimulating factor in quiescent and proliferating fibroblasts. Effects of serum, fibroblast growth-promoting factors, and IL-1. | |
Kratz et al. | Conditioned medium from cultured human keratinocytes has growth stimulatory properties on different human cell types | |
Hangoc et al. | Influence of IL-1 alpha and-1 beta on the survival of human bone marrow cells responding to hematopoietic colony-stimulating factors. | |
EP0684828A1 (en) | EXPANSION OF STEM CELLS IN LONG TERM BONE MARROW CULTURES BY NEUTRALIZATION OF TGF-$g(b) | |
JPH04506818A (ja) | 造血細胞の成熟 | |
Ridgway et al. | Granulocyte macrophage colony-stimulating activity production by cultured human thymic nonlymphoid cells is regulated by endogenous interleukin-1 | |
Krizanac-Bengez et al. | Suppressive effect of met-enkephalin on bone marrow cell proliferation in vitro shows circadian pattern and depends on the presence of adherent accessory cells | |
WO1993014782A1 (en) | Methods of controlling the proliferation of macrophages | |
Rameshwar et al. | Neural Regulation of Hematopoiesis by the Tachykinins: Implications for a “Fine Tuned” Hematopoietic Regulation | |
Wu et al. | Effect of stem cell factor (c‐kit ligand) on clonogenic leukemic precursor cells: Synergy with other hematopoietic growth factors | |
PT97197A (pt) | Factor de supressao do colapso respiratorio | |
Dorshkind et al. | Isolation and characterization of a stromal cell line | |
Suzuki et al. | Enhanced effect of mutant granulocyte-colony-stimulating factor (KW-2228) on the growth of normal and leukemic hemopoietic progenitor cells in comparison with recombinant human granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFC9 | Refusal of application |