HUT62030A

HUT62030A - Process for multiplication of macrophages and granulocytes with transforming beta-growth factor

Info

Publication number: HUT62030A
Application number: HU911376A
Authority: HU
Inventors: Isia Bursuker; Joseph A Carlino; Kim Neddermann; Bernice Schacter; Larry Ellingsworth; George Spitalny
Original assignee: Celtrix Pharma; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1990-04-25
Filing date: 1991-04-24
Publication date: 1993-03-29
Also published as: EP0454400A2; ZA913087B; US5147799A; EP0454400A3; JPH05252940A; IL97922A0; CA2040969C; HU911376D0; KR910018542A; CA2040969A1; KR0173967B1

Description

A jelen találmány a vérképzés kemoterápiájának és szabályozásának területeivel kapcsolatos. Részletesebben a jelen találmány a makrofág és granulocita populációk egyénben való növelésének módszereivel kapcsolatos, különösen kemoterápia után.

A rák egyik fő megkülönböztető jellemzője a rosszindulatúi sejtek abnormálisán gyors osztódása és burjánzása. Ezt használják ki a kemoterápia számos jelenleg alkalmazott formájában, melyekben a gyorsan osztódó sejtekre nagyobb a hatás, mint a nyugalomban levőkre, így a normális, lassan osztódó sejtekre gyakorolt hatás kisebb, mint a rosszindulatú sejtekre. Sajnos számos sejttípus normális körülmények között is gyorsan osztódik. Ezek közé tartoznak a szőrtüszőkkel, az intesztinális rendszer belsejét boritó réteggel és a vérképzéssel kapcsolatos sejtek. A kemoterápiát követő vérképzési depresszió a legsúlyosabb mellékhatás, ami számos esetben a beteget fogékonnyá teszi opportunista fertőzéssel szemben a limfociták, makrofágok és granulociták viszonylagos hiánya következtében.

Számos ismert növekedési faktor létezik, melyeket szükségesnek vélnek a csontvelő sejtek indukálásához és végső differenciálódásához. A granulocita makrofág telep stimuláló faktor /GM - CSF/ a mieloblasztok képződését serkenti, mely sejtek granuloci • · ······ · · • · · · *··· • · t ··· · · ··· ····· ·· · · • · · · ··· · · ·· tákká /neutrofilek és eozinofilek/ és makrofág/monocitákká képesek differenciálódni. A granulocita telep stimuláló faktor /G - CSF/ a granulocita/makrofág prekurzor sejtekből történő granulociták /túlnyomórészt neutrofilek/ képződését serkenti. A makrofág telep stimuláló faktor /M - CSF/ a monocita/makrofágok termelődését serkenti granulocita/makrofág prekurzor sejtekből. Bár természetes megoldásnak látszana, hogy a kemoterápiás kezelésnek alávetett betegnek GM - CSF-t, G - CSF-t és/vagy M - CSF-t adjunk ezek a sejtszaporodást és osztódást befolyásoló anyagok csupán toxikus mennyiségekben lennének hatásosak»

Seyedin az 1987 december lo.-én iktatott U.S· Patent No. 4,774,322 számú szabadalomban CIF - A és CIF - B-nek jelölt, két szarvasmarha csont-eredetű porc indukáló faktort /CIF-ek/ irt le. Mindkét faktor molekulasúlya megközelítően 26.ooo dalton /az SDS - PAGE. ’ technikával/ és mindkettő dimer. In vitro körülmények között magában mindkettő chondrogén aktivitást mutat, ahogy azt magzati patkány mezenhima sejteket használva agaróz gél tenyész modellben a porc specifikus proteoglükán /PG/ termeléssel mértük. Azonban in vivő körülmények között magában egyik sem aktív chondrogenikusan. A CIF - A aminosav szekvenálása kimutatta, hogy a CIF— A-nak van egy részleges /3o aminosav/ N-terminális szekvenciája, mely azonos a béta - tipusu transzfor• · · · ··· · ···· • ·· ··· · · ··· ····· ·· · · ··· · · · · ·· ·· máló növekedési faktornak /TGF~p/ nevezett humán placenta eredetű polipeptid esetében leirt szekvenciával· A CIF - B részleges N-terminális szekvenciája különbö- zik a TGF -β-étól. Mindkét CIF rendelkezett aktivitással a TGF -fi vizsgálatban /lágyagarban a normál patkány vese sejt telepek rögzítés-független, szaporodásának indukálására való képesség/. A CIF - A/TGF ~p jelenleg a TGF - pl néven ismert, míg a CIF - B-re általában mint TGF -p?2-re hivatkozunk.

A TGF - β , ha EGF-ral vagy TGF - alfával kombináljuk, /1/ elősegíti lágyagar tenyészet vizsgálatban a sejtszaporodást és /2/ elősegíti a sejtszaporodást és a fehérjeraktározást a patkány lágy szövet sebgyógyulási modellben. Az alkalmazások úgy jellemzik a TGF-kát, mint dimereket, melyeknek az SDS - PAGE módszer szerint megközelítően 26.ooo dalton /26 kDa/ a molekulasúlyuk. A TGF -β az aktivitások széles skáláját mutatja, mely úgy tűnik jórészt a hatásának kitett sejttípustól függ. Például a TGF -β a normál fibrobiasztok szaporodását stimulálja EGF vagy TGF -o< jelenlétében, de gátolja néhány tumorsejt szaporodását: A.B. Roberts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA /1985/ 82: 119 - 23· Bentz et al. az U.S. Pat. No. 4,8o6,523 számú szabadalomban /a CIF - A-nak és CIF - B-nek is ismert/ leírta a TGF -β gyulladásgátló hatását és kimutatta, hogy a TGF -β gátolta a T-sejtek szaporodását • · * · .

és az antitest termelést. S. Tsunawaki et.val., Natúré /1988/ 554:26o - 62 azt találták, hogy a TGF -^bl-gyel vagy a TGF -p 2-vel inkubált makrofágok reverzibilisen deaktiválódtak. H. Goey et al., J. Immunoi. /1989/ 145:877 - 80 arról számoltak be, hogy in vivő körülmények között az egér comb csontvelőbe közvetlenül bejuttatott TGF -fi 1 reverzibilisen gátolta a pluripotens őssejtek szaporodását.

Megnövekedett számú granulocotát és makrofágot igénylő emlősök kezelésére alkalmas módszert fejlesztettünk ki, melynek során TGF -β-t magában vagy CSF-ral kombinálva alkalmazunk. Ha a TGF - fi-t a CSF-t megelőzően vagy azzal egyidejűleg adjuk a betegnek, a CSFból szükséges hatásos dózis a szubtoxikus szintekre csökken.

A következőkben megadjuk a találmányban szereplő ábrák rövid leírását»

1. ábra: az egér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok számának növekedését ábrázolja a TGF -p> 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő M - CSF adagolás követett, a kontroll százalékában kifejezve. A kísérletet a későbbiekben leirt 1. Példa ismerteti.

• » · · ··· · · · · · • · · ·· · · · ··· ····· · · · · •·· · · ·« ·· ··

2. ábra: az eeér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok és granulociták számának növekedését szemlélteti a TGF - (¾ 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő GM - CSF^dagolás követett, a kontroll százalékába kifejezve. A kísérletet a későbbiekben leirt 1. Példa ismerteti.

p. ábra: az egér csontvelő prekurzor sejtjeiből származó makrofágok és granulociták számának dózis-függő növekedését szemlélteti a TGF - (b 1 in vivő adagolását követően, melyet ex vivő GM - CSF adagolás követett a kontroll százalékában kifejezve. A kísérlet leírása a későbbiekben ismertetett 2/B/ Példában található.

A következőkben megadjuk a találmány kivitelezésének módjait.

A. Az alábbiakban megadjuk a találmányban alkalmazott kifejezések ismertetését.

TGF - (b, vagy transzformáló növekedési faktor p> :

olyan TGF - pi, TGF - p 2 és ezekkel rokon proteinek, melyek a TGF ~p receptorokhoz képesek kötődni és a TGF —p> tipusu aktivitást képesek befolyásolni. Általában a TGF -p aktivitás az in vffcro körülmények közötti fibroblasztokban való rögzi• · · tés-független szaporodás megfigyeléséből, valamint az in vivő sebgyógyulási modellekben való protein és kötőszövet képződés előmozdításából állapítható meg. A TGF - “ az összes TGF -szerű proteint magába foglalja, míg a ”TGF -p>l” és ”TGF -^2” csupán azokat a specifikus fehérjéket jelölik, melyek az U.S. Pat. No. 4,774,5?-2 számú szabadalom bán /az irodalmi hivatkozás révén a találmányba épitettük/ a CIF - A és CIF - B nevek alatt kerültek leírásra.

CSF:

telep stimuláló faktor, olyan fehérjéket foglal magába, melyek az őssejteket a granulocita és mákrofág/monocita sejttípusokká való differenciálódásra képesek indukálni. A jelenleg kedvelt CSFok az M - CSF, a GM - CSF és a G - CSF.

Makrofág telep stimuláló faktor, vagy M - CSF : körülbelül 45 kDa molekulasulyu, erősen glikolizált homodimer, mely a makrofág/monocita sejtek megfelelő prekurzor sejtekből való szaporodását stimulálja. Az M - CSF /CSF-l-ként is ismert/ természetes forrásokból való tisztítását E.R. v Stanley, Meth. Enzymol. /1985/ 116:564 -87, irta le, míg a klónozást E.S. Kawasaki et aló, Science /1985/ 23o:291 - 96; és Kawasaki et al., PCT WO • 4 ·*·· ··· · «444 • 4 4 4 *· * «4 ·· • · 4 · 4 44 44 ··· 4 ··« ····

86/o46o7 száma szabadalomban tették közzé.

Granulocita - makrofág telep stimuláló faktor, vagy

GM - CSF:

egy kb. 23 kDa molekulasulyu glükoprötéin, mely a megfelelő prekurzor sejtekből való granulocita /ide értve a neutrofileket és az eozinofileket/ és makrofág/monocita sejtekké differenciálódni képes sejtek szaporodását stimulálja.

Granulocita telep stimuláló faktor, vagy G - CSF: egy kb. 18 kDa molekulasulyu glükoprotein, mely a neutrofil telepek szaporodását stimulálja. A részleges N-terminális szekvencia: Thr - Pro - LeuGly - Pro - Alá - Ser - Ser - Leu - Pro - GinSer - Phe - Leu -Leu - Lys - Cys - Leu - Glu Gin. A G - CSF kondicionált táptalajokból való tisztítását Ono et al., az U-S. Patent No. 4,833, 127 számú szabadalomban írták le. A G - CSF klónozását és expresszióját Souza irta le az U.S. Pat. No. 4,81o,643 számú szabadalomban.

B. Az alábbiakban leírjuk a találmány általános módszerét.

A TGF - , GM - CSF,: G - <3SF és M - CSF mind beszerezhetők kereskedelmi forrásokból, vagy könnyen beszerezhető anyagokból előállíthatók olyan módszerek alkal mazásával, melyek a tudomány e területén jártas szakemberek számára ismertek és melyeket fent idéztünk.

A TGF -β-Ί és a szelektált CSF/oka/-t vagy in vivő vagy ex vivő alkalmazzák. A TGF -£>-t szívesebben alkalmazzák in vivő. Ha in vivő alkalmazzák, a fehérjéket általában parenterálisan juttatják be, pl. intravénás injekcióval, a csontvelőbe való injekciózással, implantálási módszerrel, intranazális aeroszollal és hasonló módokon. A jelenleg előnyben részesített in vivő alkalmazási mód az intravénás injekcióval való bejuttatás.

A találmány módszere hasznos bármely olyan esetben, amikor kívánatos a granulociták és/vagy makrofágok megnövekedett száma,, -pl. egy immunoszupressziv rendellenesség esetén, fertőzés vagy rosszindulatú daganat kezelésekor, vagy myeloszupressziv ágensekkel való kezelés után, akár szándékos, akár mellékhatásról van szó. A granulopoezis és a myelopoezis szupressziója gyakran fordul elő mellékhatásként a rosszindulatú daganat sugárkezeléses vagy kemoterapeutikumos kezelése során. Ennek hatására a beteg fertőzéssel szembeni ellenálló képessége meggyengül, lehetővé téve, hogy az opportunista szervezetek veszélyes mértékig szaporodjanak. A találmány gyakorlata szerint a TGF -a kezelés vagy a rendellenesség idejéhez közel vagy azt követően alkalmazzuk: előnyösen a TGF -[b alkalmazása ·« ·· • * 4 *· ··· 4 «4», ♦ · j·

V·· ····

- Ιο a kezelést követő o-5 napon belül történik. A CSF-t előnyösen csupán kemoterapeutikumos vagy radioterápiás kezelés után, és vagy a TGF -^>-val egyidejűleg vagy o-4 nappal azt követően alkalmazzuk. Előnyösen a CSF alkalmazása a TGF -β> alkalmazásai . 24-48 órával követi.

A találmány ex vivő módszereiben a csontvelőt /vagy más vérképző szövetet/ eltávolítják a betegből /előnyösen/ a TGF -β alkalmazását követően és a sejteket tenyészetben tartják fenn a CSF-ral való kezelésig.

Az alkalmazásra szánt TGF -β, CSF, vagy ezek kombinációinak összeállításai általában a TGF és/vagy CSF hatékony mennyiségeit fogják tartalmazni a gyógyszerészetileg elfogadható kötőanyag mellett. Az alkalmas kötőanyagok közé tartozik a legtöbb parenterális alkalmazáshoz jóváhagyott hordozó. Ezek közé tartozik a víz, sóoldat, a Einger oldat, a Hank oldat, valamint a glükóz, laktóz, dextróz, etanol, glicerin és a hasonlók oldatai. Ezek az összeállítások tetszés szerint tartalmazhatnak stabilizálókat, antioxidánsokat,antimikrobiális anyagokat, konzerválószereket, pufferoló ágenseket, felületaktív anyagokat és más járulékos adalék anyagokat. A jelenleg előnyben részesített hordozó kb 1 mg/mL szérumalbumint tartalmaz foszfát pufferes sóoldatban /PBS/. A parenterális alkalmazáshoz megfelelő hordozókról átfogó leírást E. W. Martin ”Re • ·

- 11 mington’s Pharmaceutical Sciences” /Mack Pub. Co., jelen kiadás/ cimü müvében található.

A szükséges pontos dózis a kortól, testmérettől, az alany állapotától, a kezelendő rendellenesség természetétől és súlyosságától és hasonlóktól függ: igy a pontos hatásos mennyiséget nem lehet előre specifikálni. Azonban a megfelelő mennyiségek az állati modellekkel végzett rutin kísérletezések alapján meghatározhatók, ahogy azt az alábbiakban leírjuk. Általában a TGF -(·) hatásos dózisa kb. lo |ag/kg - kb. 1 mg/kg határok közé esik. A jelenleg kedvelt TGF -β a TGF -^>1. Az M - CSF, GM - CSF és/vagy G - CSF hatásos dózisai kb lo jüg/kg - kb lmg/kg közé esnek. A jelenleg kedvelt CSF-ok az M - CSF és a GM - CSF.

Az alkalmas állati modellek közé tartozik az alábbi példákban illusztrált egér modell. Röviden, TGF -β-t alkalmazunk parenterálisan, ezt követi 1-9 nap elteltével a csontvelő eltávolítása. A velőt egy-sejt szuszpenzióvá hígítjuk és CSF-val kezeljük. A kezelt sejteket hagyjuk szaporodni és makrofágokká és/vagy granulocitákká differenciálódni, majd a szaporodás és differenciálódás mértékét standard technikákat /pl. peroxid fejlődés, H - timidin beépülés, fluoreszcensaktivált sejtosztályozás /FACS/ sejtfestés és hasonlók/ alkalmazva vizsgáljuk. A nyert granulociták és/vagy makrofág/monociták /a kontrollokhoz viszonyított/ meg- 12 -

növekedett száma az előbbi prekurzor sejtek CSF-val szemben megnövekedett érzékenységét jelzi, valamint jelezheti a prekurzor sejtek számának, TGF -φ-nak köszönhető, növekedését.

C. A következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt .

Az alábbiakban bemutatott példákat a tudomány e területén átlagosan képzett alkalmazó személy számára adtuk meg további útmutatásként, de ezek nem értelmezendőek a találmány bármilyen módon való korlátozásaként .

1. Példa

ZAz. aktivitás bemutatása/ /A/ Természetes szarvasmarha TGF -fsl-et oldottunk fel o,25 mL 4 mM-os HCl-ban, majd foszfát puffereit sóoldatban /PBS/ levő o,75 mL egér szérum albumint /MSA, 1 mg/mL/ adtunk hozzá, hogy 5oo jug/mL TGF -(^1 törzsoldatot kapjunk. Ebből az oldatból 3 vizsgálati oldatot készítettünk, a törzsoldat 25 /ug/mL és 125 /ug/ mL-es oldatokká való hígításával. Kontroll oldatot azonos módon készítettünk, de kihagytuk a TGF • «

- 13 /Β/ 6ο nőstény C57B1 egeret 5 kísérleti csoportba osztottunk /12 egér/csoport/ és szu.bku.tan módon TGF ^1-gyel /o,2 mL/ injekcióztuk a o. napon a következők szerint:

A: 5’p-g TGF - 1/egér;

B: lo fag TGF - 1/egér;

C: 25 /ig TGF - 1/egér;

D: kezeletlen;

E: oldószerrel kezelt.

Az 1. napon minden csoportból 3 egeret feláldoztunk és a csontvelő sejteket a comb- és a sipcsontból összegyűjtöttük. Ezt az eljárást megismételtük a 2., a 4. és a 9. napokon. Egy-sejt szuszpenziókat készitettünk DMEM + lo% lószérumban és a sejtszámot lo^ sejt/mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk l,o ml szuszpenzió/rekesz mennyiségben. Ezután minden rekeszhez M — CSF-t /o,l mL az 5°° U/mLes törzsoldatból/, GM -.CSF-t /o,l mL az 5οθ U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk. A lemezeket ezután 6 napig CO2-0S nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd PBS-tal mostuk és a sejteket formaldehiddel rögzítettük.A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és lo percig 1%-os metilénkékkel festettük. A festett lemezeket ismét borát pufferrel mostuk és levegőn hagytuk megszáradni· Ezután a festéket a lemezekről o,l N-os HCl-ot hasz• · · ·

- 14 nálva 2o percig mostuk 42°C hőmérsékleten, majd, az eluens abszorpcióját 6Jo nm hullámhosszon leolvastuk.

Az eredményeket az 1. és 2. ábrák szemléltetik. Az 1. ábra a TGF -p>l által indukált velősejtekből az M - CSF-val való kezelés erdményeként bekövetkező makrofág populáció növekedést mutatja. 25 ^ig/egér TGF -(11 alkalmazása a makrofágok számát az 1. napon a kontrolihoz viszonyítva 24o%—kai növelte. Ez azt jelzi, hogy a csontvelőben levő makrofág prekurzorsejtek száma megnőtt a TGF -^>1 in vivő alkalmazásának eredményeként. A 2. ábra a GM - CSF alkalmazás kövezkeztében megnövekedett makrofágok és granulociták számát illusztrálja. Ez azt mutatja, hogy a csontvelőben levő GM prekurzor sejtek CSF-val szembeni érzékenysége megnőtt a TGF -(61 in vivő alkalmazásának következtében. A kontroll csoportok esetében nem volt hatás.

2^ Példa /A/ 15 him CBeF-^ egeret 5 csoportra osztottunk /3 egér/csoport/ és TGF -^1-gyel /o,2 mL/ szubkután módon injekcióztuk a o. napon a következők szerint:

A:	kezeletlen;
B:	oldószeres	kontroll;
C:	25 pg TGF -	1/egér;
D;	lo (ug TGF -	1/egér;

··· · • ···· · · · · ··· · ·*· ·· ··

- 15 Ε: 5 pg TGF ~ 1/egér

A 2. napon az összes csoportban levő egeret feláldoztuk és a comb- és sipcsontból a csontvelő sejteket összegyűjtöttük. Egy-sejt szuszpenziót készítettünk DMEM + lo% loszérumban és a se jtsürüséget lo^y sejt/mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk, 1 mL szuszpenzió/rekesz mennyiségben. Ezután M CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/, GM - OSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk mindegyik rekeszhez. Ezután a lemezeket 6 napig C0₂-os nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd. PBS-tal mostuk és a sejteket f ormaid, ehidd. e(i rögzítettük. A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és 1%-oá metilénkékkel lo percig festettük. A festett lemezeket ismét borát pufferrej. mostuk és levegőn hagytuk megszáradni. A festéket ezután lemostuk a lemezekről 2o percig 42 °C hőmérséklezen o,l N-os HCl-at használva és az eluens abszorpcióját 63o nm-es hullámhosszon leolvastak.

Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az eredmények azt mutatják, hogy a TGF -£>1 alkalmazása megnöveli a csontvelőben levő makrofág és granulocita prekurzor sejtek CSF-val szembeni érzékenységét.

1· Táblázat

Csoport	% Kezeletlen Kontroll	% Oldószeres Kontroll
A: Kezeletlen	Ιοο,ο	-
B: Oldószeres	loo. 0	-
+ M - CSF	88,7	-
+ GM - CSP	114,6	-
C: 25 /ig TGF -f)l
+ M - CSF	161,3	181,9
+ GM - CSF	201.6	175,8
D: lo TGF -βΐ
+ M - CSF	166,4	187,6
+ GM - CSF	193	168,3
E: 5 /ig TGF -\|bl
+ M - CSF	177,5	2oo,2
+ GM - CSF	218,8	190,8

/Β/ A fenti /A/ kísérleti részt megismételtük a dózisokat l,o; 2,5 és 5,o /ig/egér TGF -β dózisokkal helyettesítve. Az eredményeket a 3· ábra mutatja, a kontroll százalékában kifejezve. Dózisfüggő válaszokat figyeltünk meg.

3» Példa

ZAz_alkalmazás_módja/ « ·

- 17 Ezt a vizsgálatot azért végeztük el, hogy megállapítsuk, hogy az alkalmazás befolyásolja-e a biológiai választ.

him CB6F-^ egeret 5 kísérleti csoportba osztottunk /3 egér/csoport/ és szubkután módon TGF -f>l-gyel /o,2 mL/ beinjekcióztuk a o. napon a következők szerint ϊ

A; Kezeletlen;

B: 25 pg TGF -^Sl/egér, szubkután;

C: 25 /ig TGF -p?l/egér, intravénás;

D: 25 ps TGF -βΙ/egér, intraperitoneális.

A 2. napon valamennyi csoportban levő egereket feláldoztuk, és a comb- és sipcsontból a csontvelő sejteket összegyűjtöttük. Egy-sejt szuszpenziót készítettünk DMEM + lo% lószérumban és a sejtsürüséget lo^ sejt/ mL értékre állítottuk be, és 24-rekeszü lemezekre adagoltuk l.o mL szuszpenzió/rekesz mennyiségben. M - CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/, GM - CSF-t /o,l mL az 5oo U/mL törzsoldatból/ vagy o,l mL PBS-ot adtunk mindegyik rekeszhez. A lemezeket ezután 6 napig CC^-os nedvesített légterű inkubátorban inkubáltuk, majd PBStal mostuk és a sejteket formaldehiddel rögzítettük. A rögzített lemezeket o,l M-os borát pufferrel /pH=8,5/ mostuk és 1%-os metilénkékkel lo percig festettük. A festett lemezeket ismét mostuk borát pufferrel és levegőn hagytuk megszáradni. A festéket ezután lemostuk « ·· ·

- 18 ··· · ·«·· • ·· «·· · · ··· ····· ·· · · ··· · ··· · · ·· a lemezekről 2o percig 42 °C hőmérsékleten o,l N-os HC1ot használva, és az eluens abszorpcióját 630 nm hullámhosszon leolvastuk. Az erdményeket a 2» Táblázat szemlélteti. Az eredmények azt mutatják, hogy a biológiai hatás független az alkalmazás módjától.

2. Táblázat

Csoport	% Kezeletlen Kontroll
A: Kezeletlen	Ιοο,ο
B: Szubkután /comb/
+ M - CSF	194,7
+ GM - CSF	195,2
C: Intravénás
+ M - CSF	217
+ GM - CSF	213,5
D: Intraperitoneális
+ M -CSF	218,1
+ GM - CSF	214,4

• ··

1· ábra

2. ábra pg TGF pig TGF pg TGF

GM - CSF

1—i <—i o £1 O

A = 5 pg TGF -^/egér

B = lo pg TGF -^/egér C = 25 yug TGF --p>/egér napok

TGF - BÉTA 1

M *· CSF

GM - CSF

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az emlős granulociták vagy monocita/ makrofágok szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy:

egy vérképző alapsejt kapcsolatba kerül a TGF egy hatásos mennyiségével; és az említett sejt a CSF egy hatásos mennyiségével kerül kapcsolatba az említett TGF ~p>-val való érintkezéstől számított o-5 napon belül.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G - CSF-t és GM· - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
3· Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett TGF -β-t a TGF -jSl-t és TGF p2-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a CSF-val a TGF -^>-val való érintkezés után kb 1-7 nappal kerül kapcsolatba.
5· Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a TGF -^-val in vivő kerül kapcsolatba, a vérképző alapsejttel rendelkező em•«·· ·· • · * · · · · · • * * ··· 4 * ·♦ · • ···» , * » · · •·· · ··· ·« ··

- 21 lőshek hatékony mennyiségű TGF -^-val való kezelése révén.
6. Az 5· igénypont szerinti eljárás a továbbiakban azzal jellemezve, hogy:

az említett vérképző sejtet eltávolítjuk az említett emlősből, miután az említett sejt kapcsolatba került a TGF -^-val, az említett sejt CSF-val való érintkezését megelőzően, ahol az említett sejt a CSF-val ex vivő kerül kapcsolatba.
7· A 6. igénypontban leirt eljárás a továbbiakban azzal jellemezve, hogy:

az említett sejtet olyan emlősbe juttatjuk az említett sejt CSF-val való kezelése után, melynek további monocita/makrof ágokra vagy granulocitákra van szüksége.
8. Az 5· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett sejt a CSF-val az említett emlősnek in vivő adott hatásos CSF mennyiség révén kerül kapcsolatba.
9. Egy összeállítás a monocita/makrofágok vagy granulociták szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy ···

- 22 egy hatásos mennyiségű TGF -S-t» és egy hatásos mennyiségű CSF-t tartalmaz.
10. A 9· igénypontban szereplő összeállítás azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G CSF-t és GM - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.
11. A 9· igénypontban szereplő összeállítás azzal jellemezve, hogy az említett TGF -fi, TGF -^>1.
12. Egy kit a monocita/makrofágok vagy granulociták szaporodásának és differenciálódásának indukálására, azzal jellemezve, hogy:

az első tároló hatásos mennyiségű TGF ~p>-t tartalmaz; és egy második tároló hatásos mennyiségű CSF-t tartalmaz.

igénypontban szereplő kit, azzal jellemezve, hogy az említett TGF -fi egy TGF 1.
14. A 12. igénypontban szereplő kit azzal jellemezve, hogy az említett CSF-t az M - CSF-t, G - CSF-t és GM - CSF-t tartalmazó csoportból szelektáltuk.

• · ···* ···· «ζ · ♦ * ·· · • · · ··· · ···· • ···· , · · ·^ · ··* 9 4«· ····

- 23 A következőkben megadjuk a találmány leírásának kivonatát.

vagy a Telep Stimuláló Faktorral kombinált kezelés terápiásán növeli a granulociták és monocita/makrofágok számát emlősökben.