DE69821629T2

DE69821629T2 - Kombinationen von Cytokinen mit neurotroper Aktivität

Info

Publication number: DE69821629T2
Application number: DE1998621629
Authority: DE
Inventors: Klaus Unsicker; Jens Pohl; Michael Paulista; Rolf Bechtold
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: DE69821629D1; WO1999015191A2; US6790824B1; AU1024899A; EP1011712B1; JP2001517634A; EP1011712A2; ES2214743T3; CA2301693A1; WO1999015191A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung mit neurotropher Aktivität zur Behandlung von peripheren und/oder ZNS-Störungen in Säugern.
GDF-5 ist ein Knochen-morphogenetisches proteinähnliches Molekül, das ähnlich zu anderen Mitgliedern der transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β)-Überfamilie, mit neurotrophen Funktionen in Zusammenhang gebracht worden ist. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass TGF-β1, -β2 und -β3, wie auch Aktivin A, Knochen-morphogenetische Proteine (BMP) -2, -4, -6, -7, -12, von der Gliazelllinie abgeleitete neurotroph-ähnliche Faktoren (GDNF-ähnlich) und GDF-5 alle in vitro das Überleben von dopaminergen Mittelhirnneuronen durch verschiedene Mechanismen fördern. GDNF wirkt auch auf ein breites Spektrum von peripheren Neuronen.
Die Entdeckung von GDNF als ein neurotropher Faktor für dopaminergetische Mittelhirnneurone war ein Meilenstein bei der Suche nach neuartigen Molekülen, die bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. der Parkinson'schen Krankheit, von Bedeutung sein können. Die Bedeutung von GDNF wird weiter durch dessen Wirksamkeit in mehreren PD-Tiermodellen, einschließlich nicht-humaner Primaten, die allgegenwärtige Expression in Neuronen des ZNS und durch dessen erweiterndes Spektrum von darauf reagierenden Neuronenpopulationen unterstrichen. GDNF überträgt Signale über den Tyrosinkinase-Rezeptor c-ret in Zusammenwirken mit einem GPI-verbundenen α-Rezeptor, dem GDNFRα. GDNF ist ein Mitglied der TGF-β-Überfamilie, dessen engste Verwandte Neurturin sind. Zielgerichtete Mutationen der GDNF- oder c-Ret-Gene haben darauf hingewiesen, dass GDNF zur Entwicklung der Niere, der Hauptteile des Darm-Nervensystems und der sympathischen übergeordneten Zervikalganglien im wesentlichen erforderlich ist. Aber GDNF fördert nicht das Überleben der meisten peripheren Neuronen in mit geringer Dichte dissoziierten Kulturen und definierten Medien. Folgeexperimente, in denen gezeigt worden ist, dass GDNF das Überleben von angereicherten peripheren autonomen und sensorischen Neuronen fördert, wurden alle unter Verwendung von Serum während der gesamten Kulturdauer durchgeführt. Darüber hinaus wurde die dopaminotrophe Wirkung von GDNF in einem extrem komplexen Kultursystem begründet, wobei dessen auffallendste Wirkung bis zum Tag 7 in Kultur nicht offensichtlich wurde.
TGF-β sind weit verbreitete und kontextabhängig wirkende Zytokine mit bedeutenden Funktionen bei der Entwicklung und der Zellzykluskontrolle. TGF-β sind mit der Regulation des neuronalen Überlebens von z. B. Motoneuronen, sensorischen und dopaminergen Mittelhirn-Neuronen in Verbindung gebracht worden. Es sollte aber erwähnt werden, dass TGF-β keine oder geringe Wirkungen auf stark angereicherte, Serum-freie Neuronenkulturen, wie z. B. sensorische Neuronen zeigt.
Die WO-A-9711965 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Verletzung oder Degeneration von cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns durch Verabreichen von GDNF alleine oder in Kombination mit einem zweiten therapeutischen Mittel wie z. B. NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5, bFGF oder CNTF. Die WO-A-9719694 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Verletzung oder Degeneration von retinalen Neuronen durch Verabreichen von GDNF alleine oder in Kombination mit BDNF, NT-3, NT-4/5, NT-6, ILGF, FGF-5 oder TGF-β. Die EP-A-0454400 beschreibt, dass TGF-β alleine oder in Kombination mit CSF die Anzahl der Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in Säugern erhöht.
Demnach ist es das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, ein neues System, das die neurotrophe Aktivität verbessert hat, zur Behandlung von peripheren und/oder ZNS-Störungen in Säugern bereitzustellen.
Die Lösung des obigen technischen Problems wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung mit neurotropher Aktivität, umfassend eine biologisch aktive Menge von mindestens einer Kombination von TGF-β und NGF oder NT oder CNTF oder FGF oder EGF oder GDF oder eine Kombination von TGF-α und GDF-S oder funktionell wirksamer Derivate oder Teile davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel. Der Ausdruck „TGF-β" umfaßt TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3. Der Ausdruck „funktionell wirksames Derivat" und „funktionell wirksames Teil" bezieht sich auf eine proteinhaltige Verbindung, die mindestens einen Teil der biologischen Funktion des entsprechenden Zytokins aufweist.
Die Zytokine, die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wurden, können aus der Gruppe, die aus GDF wie z. B. GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8 und GDF-9, TGF, wie z. B. TGF-α oder TGF-β, z. B. TGF-β1, TGF-β2 oder TGF-β3, NGF, Neurotrophinen wie z. B. NT-3 oder NT-4, EGF, CNTF und FGF wie z. B. FGF-2 besteht, ausgewählt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfaßt die pharmazeutische Zusammensetzung die folgenden Kombinationen: TGF-β und FGF-2 oder CNTF oder NT-3 oder NGF.
Als eine überraschende Tatsache kann, wenn mindestens einer von TGF-β oder GDF-5 in der oben definierten pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden ist, ein synergistischer Effekt, der zu einer erhöhten neurotrophen Aktivität führt, beobachtet werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Behandlung von peripheren und/oder ZNS-Störungen in Säugern, vorzugsweise bei Menschen, wie z. B. Parkinson, Alzheimer, ALS oder andere Demenzien, andere neurodegenerative Störungen des Zentralennervensystems und periphere Neuropathien, einschließlich Diabetes, Cisplatin- oder andere genetische oder erworbene periphere Nervenerkrankungen, verwendet werden.
Die Figuren zeigen:
1: Das Überleben von E8 DRG-Neuronen, die 48 Stunden in Gegenwart von verschiedenen trophischen Faktoren in Sättigungskonzentrationen mit oder ohne Zugabe von GDF-5 bei einer konstanten Konzentration von 20 ng/ml kultiviert wurden. Die Werte stellen Mittelwerte + SEM von mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit Dreifachbestimmungen dar.
2: Wirkung von neutralisierendem endogenem TGF-β in mesenzephalen Neuronenkulturen. Die Anzahlen der überlebenden TH-immunoreaktiven Neuronen von mesenzephalen Kulturen (E14/DIV8) nach 8 Tagen in Kultur, behandelt mit FGF-2 (10 ng/ml), nur Medium (Kontrolle), in Anwesenheit oder Abwesen heit von neutralisierenden Antikörpern gegen TGF-β1/-β2/-β3 (10 μg/ml). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM (n = 3) angegeben, P-Werte sind ***P < 0,001 für gesteigertes Überleben verglichen mit Kontrollkulturen und +P < 0,05 oder +++P < 0,001 für vermindertes Überleben nach der Behandlung mit Antikörper.
3: Neutralisierendes endogenes TGF-β vermindert die überlebensfördernden Wirkungen von CNTF und FGF-2 auf Küken CG-Neurone. Die Kulturen wurden mit CNTF (A) oder FGF-2 (B) alleine (
) in den angegebenen Konzentrationen oder in Kombination mit neutralisierenden Antikörpern (
) gegen TGF-β1, -β2, -β3 (1 μg/ml) behandelt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM (n = 3) angegeben. P-Werte sind *P < 0,05; **P < 0,01 für vermindertes Überleben in der Kombination von Wachstumsfaktor plus anti-TGF-β verglichen mit der Behandlung mit Wachstumsfaktor alleine.
4: TGF-β induziert die Empfindlichkeit von Küken CG-Neuronen gegen CNTF, NGF und NT-3. Kulturen wurden mit (A) CNTF (5 oder 0,3 ng/ml), Oncostatin M, LIF, IL-6 (bei 10 ng/ml) oder (B) NGF, NT-3, NT-4 in der Abwesenheit oder Anwesenheit von TGF-β (2,5 ng/ml) behandelt. Die Daten sind als Prozent des CNTF-Plateau-Überlebens als Mittelwerte ± SEM (n = 3) angegeben. *P < 0,05, **P < 0,01 für gesteigertes Überleben in der Kombination mit TGF-β3 verglichen mit der entsprechenden Behandlung mit dem einzelnen Faktor alleine.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Die Wachstumsfaktoren TGF-β1 und -β3, transformierender Wachstumsfaktor-a, TGF-a zeigen auch synergistische oder additive Wirkungen, wenn sie zusammen mit GDF-5 in allen getesteten Konzentrationen (1) zugegeben werden.
Synergistische Wirkung von TGF-β mit anderen neurotrophen Faktoren und Neutrophinen
TGF-β vermittelt die neurotrophe Wirkung von FGF-2, CNTF und Neurotrophinen
Es ist bekannt, dass der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-2 als ein neurotropher Faktor auf dopaminerge Neurone im ventralen Mittelhirn wirkt. Frühere Untersuchungen wiesen darauf hin, dass die neurotrophe Wirkung, die von FGF-2 ausgeübt wird, hauptsächlich indirekt ist und durch mesenzephale Ganglien vermittelt wird (Engele und Bohn, J Neurosci, 11 (1991), 3070–3078). Da bekannt ist, dass TGF-β ein Produkt von Astrogliazellen ist, wurde untersucht, ob TGF-β-neutralisierende Antikörper die neurotrophe Wirkung von FGF-2 auf kultivierte Neurone, die aus dem embryonalen Mittelhirnboden stammen, aufheben können. 2 zeigt, dass die Behandlung der kultivierten Neuronen mit FGF-2 (10 ng/ml) zu einem 1,7 fachen Anstieg des Überlebens der Zellen im Vergleich zu der Negativkontrolle (Medium alleine) führte. Im Gegensatz dazu hob die Zugabe von Antikörpern, die spezifisch für TGF-β1/-β2/-β3 waren, die überlebensfördernde Wirkung von FGF-2 vollständig auf. Diese Daten zeigen, dass die neurotrophe Wirkung von FGF-2 auf dopaminerge Neurone im ventralen Mittelhirn durch TGF-β vermittelt wird.
TGF-β war in der Lage, synergistisch mit FGF-2 und CNTF in der Kontrolle des Neuronüberlebens von ziliaren (CG)-Küken-Ganglien zu wirken. Ein Antikörper, der die TGF-β-Isoformen -β1/-β2/-β3 erkennt, wurde eingesetzt, um TGF-β in Kulturen von CG-Neuronen, die jeweils mit CNTF oder FGF-2 behandelt waren, zu immunoneutralisieren (3). Die Neutralisierung von TGF-β verringerte das CNTF- oder FGF-2-vermittelte Neuronenüberleben um 40 bis 60%. Diese Daten weisen darauf hin, dass TGF-β, das von kultivierten CG-Neuronen freigesetzt wird, synergistisch mit exogenen neurotrophen Faktoren wirkt, um das Neuronenüberleben sicher zu stellen.
CNTF nutzt Rezeptor und Komponenten der Signaltransduktion gemeinsam mit Mitgliedern einer Familie von neuropoetischen Zytokinen, zu denen der Leukämieinhibierende Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und Interleukin-6 (IL-6) gehören (Stahl und Yancopoulos, J. Neurobiol. 25 (1994), 1454–1466). Wie in 4 dargestellt ist, erhöhte TGF-β eindeutig die Wirksamkeit einer nicht-sättigenden Konzentration von CNTF im Hinblick auf das Fördern des Überlebens von CG-Neuronen. OSM, LIF und IL-6 förderten CG-Neuronen nicht und eine weitere Zugabe von TGF-β steigerte die Wirkungen dieser Zytokine nicht über die Hintergrundwerte hinaus. Neu rotrophine sind keine etablierten trophischen Faktoren für CG-Neurone (Collins, Brain Res. 467 (1988), 111–116). Aber in Kombination mit TGF-β förderten sowohl NGF als auch NT-3 das Überleben bei 35 bis 40% des CNTF-Plateaus (4). Obwohl die Expression von trkA-Rezeptoren, die die Signalwirkung von NGF und NT-3 auf CG-Neurone zulassen, bis jetzt nicht nachgewiesen worden ist, deuten die vorgelegten Daten darauf hin, dass TGF-β mit der Neurotrophin Rezeptor-vermittelten Signalwirkung auf CG-Neurone zusammenwirken kann.
Experimentelle Verfahren
Materialien
CMF: Ca²⁺/Mg²⁺-freie Hanks balancierte Salzlösung, DMEM: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium und PSN wurden von Gibco bezogen. Poly-L-Ornithiun, Laminin, A23187, Carbachol und Verapamil wurden von Sigma bezogen, bovines Serumalbumin (BSA) war von Serva (Heidelberg, Deutschland) und PIPLC von Boehringer Mannheim (Deutschland).
Pferdeserum (HS) wurde von Gibco bezogen, fetales Kalbserum (FCS) Chargen 1 und 2 waren von PAA, FCS Chargen 3 und 4 waren von Euro und FCS Chargen 5 und 6 waren von PAN.
Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren wurden von Boehringer Mannheim (NGF, 2,5 S NGF und rekombinanter humaner (rh) LIF) und IC-Chemikalien (rekombinantes Ratten (rr) CNTF, rh GDNF, rh Oncostatin M (OSM), rh IL-6, rh NT-3 und NT-4) bezogen. GDF-5 wurde wie beschrieben hergestellt (Kriegelstein et al., J. Neurosci. Res., 42 (5) (1995) 724–732). Rh FGF-2 wurde für die Experimente entsprechend der 2 von Progen und für alle anderen Experimente von IC Chemikalien bezogen. Gefriergetrocknete Faktoren wurden in Kulturmedium resuspendiert (siehe unten), um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu erhalten und in Aliquoten von 50–100 μl bei –70°C bis zur Verwendung gelagert.
Antikörper
Der neutralisierende Antikörper gegen TGF-β1, 2, 3 wurde von Genzyme und der gegen GDNF von Santa Cruz Biotechnology bezogen.
Agarose-konjugierte Antikörper gegen TGF-β1 und GDNF waren von Santa Cruz Biotechnology. Der Peroxidase-konjugierte α-Kaninchen Antikörper wurde von Sigma bezogen.
Tiere für die Experimente entsprechend 1
Befruchtete weiße Leghorn-Küken-Eier wurden von einem lokalen Vogelhaus erhalten und in einer befeuchteten Eierkammer bei 37,8°C inkubiert.
Tiere für die Experimente entsprechend den 2–4
Befruchtete weiße Leghorn-Küken-Eier wurden von einem lokalen Vogelhaus erhalten und in einer befeuchteten Eierkammer bei 38°C bis E8 inkubiert.
Zellkulturen für die Experimente entsprechend 1
Assays der neurotrophen Aktivität
Embryonale ziliare (CG), dorsale Wurzel-(DRG) und sympathische (SG) Ganglien aus Küken am embryonalen Tagen) (E) 8, 10 und 12 wurden präpariert, von Nervenwurzeln und Bindegewebe befreit und in CMF gesammelt. Die Ganglien wurden in Trypsin (ICN) inkubiert, gewaschen und durch Zerreiben unter Verwendung von abgeflammten Pasteur Pipetten getrennt. Die Kulturen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die mit Poly-L-Ornithin und Laminin vorbeschichtet waren (Costar, A/2), in einer Dichte von 1.200–1.500 Zellen/Vertiefung in DMEM, ergänzt mit N1 Zusatzstoffen, 0,25% BSA und 0,1% PSN (DME/N1), angesetzt und bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert.
Zu geeigneten Zeitpunkten (CG: 24 h, DRG: 48 h, SG: 72 h) wurden die Kulturen durch Zugabe von 2,5% Glutardialdehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) fixiert. Die Anzahlen der überlebenden Neurone wurden durch direktes Zählen von 30% des Oberflächenbereichs unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie bestimmt.
Zelllinien
Die Zelllinien B49, 3T3 und COS waren in 10% FCS/DMEM mit 1% PSN gewachsen und die Zelllinie BHK wurde in DMEM/F 12 mit 5% FCS und 1% PSN in Plastik-Kulturkolben eingesetzt.
Von diesen verschiedenen Zelllinien wurde konditioniertes Medium gesammelt und Aliquoten wurden bei –80°C gelagert und dann zur Bestimmung der TGF-β-Aktivität für den MLEC-Bioassay präpariert.
Agarosekonjugat/Westernblots
Zu 1 ml Stimulationspuffer mit oder ohne Zusatzstoffe von chromaffinen Zellen wurden 10 μl des Antikörper-Agarose-Konjugats zugegeben und bei 4°C über Nacht unter Mischen inkubiert. Das Pellet wurde mit PBS gewaschen und dann in 50 μl Elektrophorese-Probenpuffer resuspendiert und 2 Minuten lang gekocht. Die Proben wurden durch Elektrophorese in einem 12,5% SDS-PAA-Gel getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (Hybond, Amersham) übertragen. Die Nitrocellulosemembran wurde mit 3% fettarmem Milchpulver/0,1% BSA in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, pH 7,3) blockiert, mit primärem Antikörper (1 : 200 in 0,1% BSA/TBS) über Nacht bei 4°C, gefolgt von einem sekundären Peroxidase-konjugierten Antikörper (1 : 2000 in 0,1% BSA/TBS), inkubiert. Schließlich wurde die Membran unter Verwendung des erweiterten Amersham Chemolumineszens (ECL) Detektions-Systems entwickelt.
Assay für TGF-β
Die Bestimmung der TGF-β-Aktivität wurde durch Verwenden des Nerz-Lungenepithelzell-(MLEC) (freundlicherweise von Dr. Rifkin, New York Universität, New York, USA zur Verfügung gestellt) Bioassays (Abe et al., Anal. Biochem. 216 (1994) 276–284) durchgeführt. Transfizierte MLEC-Kulturen wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) in einer Dichte von 1,6 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in DMEM (Glukosereich) mit 10% FCS und Geneticin (250 μg/ml) eingebracht und das Anheften 3 Stunden lang bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator zugelassen. Das Medium wurde dann durch 100 μl der Testprobe in DME/N1 (aktiviert mit HCl) ersetzt und über Nacht bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und durch Verwendung von 100 μl Lysepuffer (Promega) 2–3 h lang bei RT lysiert. Zur Bestimmung der TGF-β-Aktivität wurden 80 μl des Lysats in ein Teströhrchen überführt und durch Verwenden eines Luminometers (Lumat, Berthold/Deutschland) durch 100 μl-Injektionen von Luciferase-Reagens (Promega) analysiert. Die Luciferase-Aktivität wurde als relative Licht-Einheiten (RLU) angezeigt und alle Assays wurden dreifach durchgeführt.
Statistiken
Statistische Vergleiche wurden mit Einweg-ANOVA, enthalten in der MicroCalOrigin-Software, durchgeführt. Die Unterschiede wurden bei *P < 0,05, **P < 0,005 und ***P < 0,0005 als statistisch signifikant erachtet.
Zellkultur für die Experimente entsprechend den 2–4
Getrennte Kulturen von embryonalen dorsalen Wurzelganglien (DRGs) aus Huhn wurden wie im Detail von Krieglstein und Unsicker beschrieben erzeugt (Dev. Brain. Rees. 93 (1996) 10–17). Kurz dargestellt, DRGs wurden in Ca²⁺-Mg²⁺-freier Hanks balancierter Salzlösung (CMF) präpariert. Nach 15 minütiger Inkubation in 0,08 Trypsin (BioWhittaker) wurden die Ganglien durch vorsichtiges Zerreiben unter Verwendung von abgeflammten Pasteur Pipetten getrennt. Die Zellen in Suspension (Neuron/Nicht-Neuron-Verhältnis 1 : 2) wurden in Polyornithin-Laminin beschichtete Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (A/2 Costar) mit einer Dichte von 1.200 Zellen/Vertiefung geimpft. Die Wachstumsfaktoren wurden zum Zeitpunkt der Plattenkultur in einem Endvolumen von 50 μl Dulbecco's modifiziertem Eagles Medium, ergänzt mit 0,25% Rinderserumalbumin, N1-Zusatzstoffen (Bottenstein et al., Exp. Cell Res. 125 (1980) 183–190) und 100 U/ml Penicillin aufgebracht. Als eine Positivkon trolle wurde Nervenwachstumsfaktor (NGF) in der sättigenden Konzentration von 10 ng/ml verwendet. Nach 48 h langer Inkubation bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, wurden die Kulturen mit 2,5% Glutaraldehyd in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) fixiert. Neuronale Zellen wurden anhand ihrer Hellphasen- und ihrer Neurit-tragenden Morphologien identifiziert und innerhalb von 30 des gesamten Oberflächenbereichs unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie ausgezählt. Alle Experimente wurden mindestens in Dreifachbestimmungen in zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mit Student's Doppel t-Test, ANOVA und MicrocalOrigin Software durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001 als statistisch signifikant angesehen.
Assay für präganglionären Neuronschutz in vivo
Bei erwachsenen Männchen von Hanover-Wistar-Ratten wurde eine Adrenomedullektomie durchgeführt. Präganglionäre Neurone im Rückenmark, die adrenale medulläre chromaffine Zellen innervierten, wurden durch retrograden Nachweis mit Fast Blue oder Fluoro-Gold (FG) identifiziert. Die Faktoren (je 1 μg) wurden vor der Implantation in einseitig medullektomisierte adrenale Drüsen in Gelschaum (Spongostan, Ferrosan, Soeburg, Dänemark) eingeweicht. Die Anzahlen der FG-markierten präganglionären Neurone wurde durch Zellzählungen von vollständigen Serien von längslaufenden Schnitten durch die Rückenmark-Segmente T7–T10 vier Wochen nach der Operation bestimmt. Nur hell fluoreszierende Neurone, die einen deutlich sichtbaren Zellkern enthielten wurden gezählt. Die Gesamtanzahlen wurden wegen möglichen Doppelzählungen von geteilten Zellkernen entsprechend der Abercombies Formel korrigiert. Die Anzahlen von präganglionären Neuronen an der adrenalen Medulla, die in Schein-operierten Tieren und an der unverletzten Seite überlebten wurden als 100% gesetzt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben und die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mit Hilfe des Students t-Tests bestimmt.
In situ-Hybridisierung
In situ-Hybridisierungen wurden auf Paraffin-Schnitten des Thorax-Rückenmarks, im Wesentlichen wie in Arumäe et al. beschrieben (J. Cell Biol. 122 (1993) 1053–1065), durchgeführt. Proben wurden von Ratten-GFRα-1, Nukleotide 294–1039 und Maus-cRet, Nukleotide 2534–3217 erhalten. Nach der Hybridisierung wurden alle Schnitte eingetaucht und 2–3 Wochen lang belichtet, mit Haematoxylin gegen gefärbt, an der Luft getrocknet und in DPX eingebettet. Kein Hybridisierungs-Signal wurde mit den Proben in Richtungslagebestimmung nachgewiesen.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung mit neurotropher Aktivität, umfassend eine biologisch aktive Menge von mindestens einer Kombination aus TGF-β und NGF oder NT oder CNTF oder FGF oder EGF oder GDF oder funktionell wirksamer Derivate oder Teile davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglicher Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend TGF-β und FGF-2.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend TGF-β und CNTF.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend TGF-β und NT-3.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend TGF-β und NGF.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend TGF-β und GDF-5.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit neurotropher Aktivität, umfassend eine biologisch aktive Menge mindestens einer Kombination aus TGF-α und GDF-5.
Verwendung von biologisch aktiven Mengen mindestens zweier Cytokine oder funktionell wirksamer Derivate oder Teile davon und gegebenenfalls eines pharmazeutisch verträglichen Trägers und/oder Verdünnungsmittels für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung peripherer und/oder ZNS-Störungen in Säugern, wobei die zwei Cytokine mindestens eine Kombination aus TGF-β und GDNF oder NGF oder NT oder CNTF oder FGF oder EGF oder GDF oder eine Kombination aus TGF-α und GDF-5 umfassen.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung GDNF und TGF-β umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung TGF-β und FGF-2 umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung TGF-β und CNTF umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung TGF-β und NT-3 umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung TGF-β und NGF umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung TGF-β und GDF-5 umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei die ZNS-Störung Parkinson, Alzheimer, ALS oder andere Demenzien, andere neurodegenerative Störungen des Zentralennervensystems und periphere Neuropathien, einschließlich Diabetes, Cisplatin- oder andere genetische oder erworbene periphere Nervenerkrankungen sind.