DE69837885T2 - Synergistische wirkung des ob/bmp morphogens und gdnf/ngf neurotropher faktoren - Google Patents

Synergistische wirkung des ob/bmp morphogens und gdnf/ngf neurotropher faktoren Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Präparate für die Behandlung von Säugetier-Probanden, welche durch die Beschädigung oder Verletzung von Geweben, insbesondere neuralen Geweben, welche Rezeptoren für OP/BMP-Morphogene und GDNF/NGF-neurotrophe Faktoren exprimieren, betroffen oder akut bedroht sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Während der Entwicklung des Säugetier-Nervensystems senden sich differenzierende Neuronen aus den zentralen und peripheren Nervensystemen Axone aus, welche wachsen und mit spezifischen Zielzellen in Kontakt treten müssen. In einigen Fällen bleiben die Neuronen gänzlich auf das zentrale Nervensystem beschränkt. Jedoch müssen in anderen Fällen wachsende Axone beim Ausbreiten aus dem ZNS in die Peripherie des Körpers enorme Distanzen abdecken. In Säugetieren wird dieses Stadium der Neurogenese während der embryonischen Lebensphase abgeschlossen und es wird angenommen, dass sich neuronale Zellen, sobald sie vollständig differenziert sind, nicht vermehren.
  • Dentritisches Wachstum erfolgt in zwei Phasen: Initiale Ausbreitung gefolgt von Elongation und Ramifikation. Purves et al., Nature 336: 123-128 (1981). Einige Moleküle, einschließlich Neurotransmittern und Hormonen, haben gezeigt, dass sie die Ausdehnung einer existierenden dendritischen Verästelung regulieren. Jedoch ist weit weniger über die Faktoren bekannt, welche die frühen Ereignisse beeinflussen und bei einem Neuron das initiale Ausbilden von Dendriten bewirken. In bestimmten Klassen von Neuronen erfolgt das initiale dendritische Wachsen als Teil eines intrinsischen Entwicklungsprogramms, welches von trophischen Wechselwirkungen relativ unabhängig ist. Dotti et al., J. Neurosci. 8:1454-1468_(1988). Jedoch scheint in anderen Klassen von Neuronen die Regulation der initialen Phasen des dendritischen Wachstums völlig verschieden zu sein. Beispielsweise versagen symphatische Rattenneuronen, Dendriten zu bilden und bauen lediglich Axone aus, wenn sie in der Abwesenheit nicht-neuronaler Zellen kultiviert werden. Im Gegensatz dazu veranlasst die Co-Kultur mit Schwann-Zellen oder Astrozyten diese Neuronen zur Bildung dendritischer Prozesse und schließlich zur Erzeugung einer dendritischen Verästelung, welche in ihrer Größe vergleichbar mit der in situ beobachteten ist. Tropea et al., Glia 1: 380-392 (1988). Es erscheint daher, dass spezifische trophische Wechselwirkungen benötigt werden, um symphatischen Neuronen die Bildung von Dentriten zu ermöglichen.
  • Die vorhergehenden Beobachtungen sind zur Unterstützung einer Theorie herangezogen worden, wonach die in situ-Umgebung die Ausbildung einer dendritischen Verästelung festlegt. Die Umgebung in der Nähe neuraler Zellen oder sich entwickelnder neuraler Prozesse schließt vermutlich magnetische, elektrochemische und/oder biochemische Felder oder Gradienten ein, welche positiv und negativ das Ausmaß und die Spezifität dendritischen Auswachsens ebenso wie die Bildung von Synapsen zwischen Dendriten und Nervenzell-Körpern und Axonen beeinflussen. Jedoch leidet diese Theorie an einem Mangel identifizierter Mediatoren, welche die Befähigung aufweisen, Neuronen zum Wachsen von Dendriten zu bewegen.
  • Eine Heerschaar von Neuropathien, von denen manche lediglich eine Subpopulation oder ein System von Neuronen in den peripheren oder zentralen Nervensystemen betreffen, sind identifiziert worden. Die Neuropathien, welche die Neuronen selbst oder die assoziierten Gliazellen betreffen, können aus zellulärer metabolischer Störung, Infektion, dem Ausgesetztsein toxischer Mittel, Autoimmunstörungen, Malnutrition oder Ischaemia resultieren. In manchen Fällen wird angenommen, dass die zelluläre Störung den Zelltod direkt durch Apoptose induziert. Oppenheim, Ann Rev. Neurosci. 14:37-43 (1991). In anderen Fällen kann die Neuropathie durch Stimulierung körpereigenen Immunsystems Gewebenekrose induzieren, welches zu einer lokalen entzündlichen Reaktion sowie Zelllysis an der initialen Stelle der neuralen Verletzung führt.
  • Die Fähgkeit von Neuronen, innerhalb des peripheren Nervensystems eine beschädigte neurale Bahn zu regenerieren, ist begrenzt. Insbesondere dehnen sich neue Axone und Dentrite zufällig aus und werden oft fehlgeleitet, nehmen Kontakt mit ungeeigneten Zielen auf, welche abnormale Funktionen verursachen können. Zusätzlich, wo abgetrennte Nervenprozesse zu einer Lücke größer als einige Millimeter, beispielsweise größer als 10 Millimeter (mm) führen, kann eine angemessene Nerv-Regeneration nicht erfolgen, entweder weil die Prozesse versagen, über die nötige Distanz zu wachsen oder wegen fehlgeleitetem axonalem Wachstum. Bemühungen, periphere Nervenschäden mit operativen Mitteln zu beheben, verblieben bei gemischten Ergebnissen, insbesondere wo Schaden sich über eine signifikante Distanz ausdehnt. In manchen Fällen stimulieren die Naht-Schritte, welche zur Erzielung genauer Ausrichtung abgetrennter Nervenenden verwendet werden, die Bildung von Narbengewebe, von dem angenommen wird, die Axon-Regeneration zu inhibieren. Selbst wo die Narbengewebsbildung reduziert worden ist, wie mit der Verwendung von Nervenführungskanälen oder anderen tubularen Prothesen, ist die erfolgreiche Regeneration im Allgemeinen immer noch auf Nervenbeschädigung von weniger als 10 mm im Abstand begrenzt.
  • Es ist nun wohlbekannt, dass verschiedene trophische Faktoren eine kritische Rolle in der Regulierung des Überlebens und der Differenzierung sich entwickelnder Neuronen spielen. Snider et al., Ann. Neurol. 26:489-506 (1989). Die meisten der beschriebenen Wirkungen von trophischen Nerv-Aktoren beziehen sich auf Entwicklungsereignisse und legen nahe, dass die temporäre und lokale Regulierung der Exprimierung dieser Proteine während der Reifung des Nervensystems eine Rolle spielt. Trophische Nervenfaktoren sind ebenfalls in der Funktion des adulten Nervensystems zur Erhaltung der strukturellen Integrität und Regulation der Plastizität von Bedeutung. Derartige Prozesse werden in neurodegenerativen Erkrankungen und neurodegenerativen Ereignissen nach akuter Verletzung des Nervensystems verändert. Dies veranlasste zur Spekulation, dass trophische Nervenfaktoren in den strukturellen Veränderungen, welche in Reaktion auf Verletzungen und Erkrankungen auftreten, involviert sind.
  • Einige wohl-charakterisierte trophische Faktoren haben eine Steigerung des Überlebens und der Differenzierung dopaminerger Neuronen in Gewebekulturen und/oder nach Transplantation zur vorderen Kammer des Auges gezeigt. Diese trophischen Faktoren beinhalten den Fibroblast-Wachstumsfaktor (FGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), den Transformationswachstumsfaktor-α (TGF-α) und den Gliazell-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) wie auch verschiedene Nervenwachstumsfaktor (NGF)-verwandte Neurotrophine.
  • Trophische Nervenfaktoren werden unter verschiedenen Protein-Überfamilien des Polypeptid-Wachstumsfaktors, basierend auf ihrer Aminosäure-Sequenzhomologie und/oder ihrer dreidimensionalen Struktur, gefunden. MacDonald et et., Cell 73:421-424 (1993). Eine Familie neurotropher Faktoren ist die Neurotrophin-Familie. Diese Familie besteht derzeit aus dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), dem Hirn-abgeleiteten neurotrophischen Faktor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) und Neurotrophin-6 (NT-6). Diese neurotrophen Faktoren beeinflussen spezifische neuronale Populationen im zentralen Nervensystem. Der Verlust solcher spezifischer neurotropher Faktoren kann für altersbezogene Verschlechterungen im Überleben und/oder Funktion der Zelle verantwortlich sein. Während die zelluläre Quelle unklar bleibt, legen Hinweise nahe, dass sowohl Neuronen als auch Gliazellen zur Absonderung neurotropher Faktoren geeignet sind.
  • Die osteogenen Protein/Knochen-morphogenetischen (OP/BMP) Proteine bilden eine Familie oder Sub-Familie innerhalb der größeren TGF-β-Überfamilie von Proteinen. D.h., diese Proteine bilden eine bestimmte Untergruppe, hierin als die „OP/BMP-Familie von Morphogenen" oder „OP/BMP Morphogene" bezeichnet, innerhalb des losen evolutionären Gruppierens Sequenz-bezogener Proteine, bekannt als die TGF-β Überfamilie. Mitglieder dieser Protein-Familie umfassen abgesonderte Polypeptide, welche gemeinsame strukturelle Merkmale teilen und welche in ähnlicher Weise aus einem Pro-Protein zur Erzielung eines Carboxyterminalen reifen Proteins aufgearbeitet werden. OP/BMP Morphogene sind für die Entwicklung und Reifung von Rattenhirn und Rückenmarksgewebe identifiziert worden, bestimmt sowohl durch Northern-Blot-Hybridisierung morphogen-spezifischer Sonden an mRNA-Extrakten aus entwickeltem und gereiftem Nervengewebe als auch durch Immunolokalisierungsstudien. Beispielsweise identifizierte die Northern-Blut-Analyse von entwickeltem Rattengewebe signifikante OP-1mRNA Transkriptionsexprimierung im ZNS. Die mRNA eines anderen OP/BMP-Familienmitgliedes, GDF-1, scheint überwiegend in entwickeltem oder gereiftem Nervengewebe exprimiert zu sein, insbesondere im Gehirn, einschließlich dem Zerebellum und dem Hirnstamm, Rückenmark und peripherer Nerven. Von BMP4 (auch als BMP2B bezeichnet) und Vgr-1 Transkriptionen ist ebenfalls berichtet worden, im Nervengewebe exprimiert zu werden.
  • Das Morphogen OP-1 wurde überwiegend an der extrazellulären Matrix der grauen Masse (neuronaler Zellkörper) lokalisiert gefunden, merklich gegenwärtig in allen Gebieten mit Ausnahme der Zellkörper selbst. In weißer Masse, hauptsächlich aus myelinierten Nervenfasern gebildet, scheint Färbung auf die Astrozyten (Gliazellen) beschränkt zu sein. Ein ähnliches Färbungsmuster wurde ebenfalls in neugeborenen (10 Tage alt) Rattenhirn-Schnitten gefunden.
  • Zusätzlich ist OP-1 spezifisch in der Substantia Nigra lokalisiert worden, welche vorwiegend aus stratialer basaler Ganglia zusammengesetzt ist, einem System aus zusätzlichen Motorneuronen, deren Funktion mit der cerebralen Kortex und dem kortikospinalen System verbunden ist. Störungen in dieser Sub-Population oder in diesem System von Neuronen werden mit einer Anzahl von Neuropathien, einschließlich Huntington-Krankheit und Parkinson- Krankheit in Verbindung gebracht. Die kombinierte Wirkung von OP-1 und NGF auf die morphologische Differenzierung bestimmter neuronaler Zellen wird beschrieben in Neuron, 15, 597-605 (1998) und in Int. J. of Developmental Neuroscience, 14, 203-215 (1996).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Feststellung, dass OP/BMP Morphogene in Kombination mit GDNG/NGF neurotrophen Faktoren einen synergistischen Effekt zeigen im Befördern des Überlebens oder Wachstums oder Verhinderung des Todes oder der Degeneration von Säugerzellen, insbesondere neuralen Zellen, welche OP/BMP-aktivierte/Threoninkinase-Rezeptoren und GDNG/NGF-aktivierte Tyrosin-Kinase-Rezeptoren exprimieren. Basierend auf dieser Feststellung stellt die vorliegende Erfindung neue pharmazeutische Präparate für die in vivo- und in vitro-Behandlung solcher Zellen, einschließlich in vivo-Behandlungen für Säugetiere, welche von der Beschädigung oder Verletzung solcher Zellen betroffen oder akut bedroht sind, bereit.
  • Damit stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt die Verwendung eines a) Morphogens, umfassend ein dimeres Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70 % Homologie mit dem C-terminalen 7-Cystein-Skelett des humanen OP-1 aufweist und b) einen neurotrophen Faktor, der ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Überlebens oder zur Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen in einem Säugetier, welches von einer neuropathischen oder einer neurodegenerativen Krankheit betroffen oder akut bedroht ist, bereit.
  • Unter einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines a) Morphogens, umfassend ein dimeres Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie mit dem C-terminalen 7-Cystein-Skelett des humanen OP-1 aufweist und b) einem neurotrophen Faktor, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetieres, welches unter der Beschädigung oder Verletzung neuraler Zellen leidet, bereit.
  • Unter einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung a) eines neurotrophen Faktors, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) eines OP/BMP Morphogens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetieres in akutem Risiko der Beschädigung oder Verletzung neuraler Zellen, bereit.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Präparate zur Beförderung des Überlebens oder Wachstums von Säugerzellen, insbesondere neuraler Zellen, umfassend einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor und ein OP/BMP Morphogen, bereit. In ähnlicher Weise stellt die vorliegende Erfindung Präparate zur Verhinderung des Todes oder der Degeneration von Säugerzellen, insbesondere neuraler Zellen, umfassend einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor und ein OP/BMP Morphogen, bereit. Derartige Präparate können in vitro (z.B. für verbesserte Zellkulturen) oder in vivo (z.B. zur Behandlung von Zuständen, die derartige Zellen in einem Säugetier-Proband beeinflussen) angewendet werden.
  • Unter einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Präparate zur Behandlung eines Säugetieres in akutem Risiko der Beschädigung oder Verletzung an Zellen, insbesondere neuraler Zellen, umfassend einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor und ein OP/BMP Morphogen, bereit. Diese Präparate können entweder an Neuronen oder neuroglialen Zellen und auch an zentralen oder peripheren Nervensystemzellen angewendet werden.
  • Die Präparate der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere zur Behandlung von Zellen, welche beschädigt oder verletzt worden sind oder in akutem Risiko der Beschädigung oder Verletzung in Folge mechanischer Traumata steht, wie z.B. traumatischer Hirnverletzung durch stumpfe Krafteinwirkung, traumatischer Rückenmarksverletzung durch stumpfe Krafteinwirkung, Gehirnerschütterung, Hirndruck in Folge eines Gehirnödems oder subduralen Hämatoms, gebrochener oder gequetschter Vertebra und gerissener oder abgetrennter Nerven; chemische Traumata wie solche, die aus dem Ausgesetztsein gegenüber Neurotoxinen oder Nebenwirkungen von Chemotherapien entstehen; ischämische Verletzungen wie solche, die durch Apoplexie, Herzstillstand oder -Fehler und neuropathische oder neurodegenerative Beschädigung oder Verletzung wie solche, die durch neuropathische Krankheiten einschließlich Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, amytrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Epilepsie, progressive Muskelatrophie, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Lähmung, Demenz, Shy-Drager-Krankheit, Wernicke-Korsakoff-Syndrom und Hallervorden- Spatz-Krankheit entstehen. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die OP/BMP Morphogene der vorliegenden Erfindung Polypeptide, welche Aminosäuresequenzen mit mindestens 70% Homologie, eher bevorzugt 80% Homologie, mit der C-terminalen 7-Cystein Domäne von humanem OP-1 aufweisen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die OP/BMP Morphogene Polypeptide, welche mindestens 60% Aminosäureidentität, eher bevorzugt mindestens 70% Aminosäureidentität, mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP1 aufweisen. In den bevorzugtesten Ausführungsformen umfasst das OP/BMP Morphogen mindestens die C-terminale 6- oder 7-Cystein Domäne eines Säugetier-Proteins, bevorzugt humanes OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 oder BMP9 Protein. Bevorzugt sind die OP/BMP Morphogene der vorliegenden Erfindung zum Induzieren der Osteogenese in das Reddi-Sampath ektopische Knochenassay geeignet.
  • In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die GDNF/NGF neurotrophen Faktoren der vorliegenden Erfindung zumindest die reife, funktionale Form eines Säuger-, bevorzugt humanem GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6 Proteins.
  • In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die effektiven Konzentrationen des Präparates zwischen 0,1 ng/ml und 10 μg/ml eines OP/BMP Morphogens und zwischen 0,1 ng/ml und 10 μg/ml eines GDNF/NGF neurotrophen Faktors, der bevorzugt zwischen 1 ng/ml und 100 ng/ml entweder eines OP/BMP Morphogens oder eines GDNF/NGF neurotrophen Faktors und, am ehesten bevorzugt, zwischen 1 ng/ml und 100 ng/ml sowohl an OP/BMP Morphogen als auch an GDNF/NGF neurotrophem Faktor umfasst.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Präparate zur Förderung des Überlebens oder Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von Säugerzellen, einschließlich nicht-neuraler Zellen, welche einen OP/BMP-aktvierten Serin-Threonin Kinase-Rezeptor und einen GDNF/NGF-aktivierten Tyrosin Kinase Rezeptor exprimieren, bereit. In ähnlicher Weise stellt die vorliegende Erfindung Präparate zur Behandlung eines Säugetier-Probanden, welcher von der Beschädigung oder Verletzung an Zellen betroffen oder von der Beschädigung oder Verletzung von Zellen akut bedroht sind, einschließlich neuraler Zellen, welche einen OP/BMP aktivierten Serin-Threonin-Kinase-Rezeptor und einen GDNF/NGF-aktivierten Tyrosin Kinase Rezeptor exprimieren, bereit. Diese Präparate umfassen ebenfalls einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor und ein OP/BMP Morphogen, wie oben beschrieben.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Präparate zur Förderung des Überlebens oder Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von Säugerzellen, insbesondere neuralen Zellen, umfassend einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor in Kombination mit einem OP/BMP Morphogen, bereit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Säulendiagramm, welches das Überleben getrennter sympathischer Neuronen, gewachsen in Kollagengelen nach 2 oder 6 Tagen Behandlung mit NT-3 (2 ng/ml) oder GDNF (50 ng/ml) in Gegenwart oder Abwesenheit von OP-1, zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Präparate zur Behandlung von Säugetier-Probanden, welche von Beschädigung oder Verletzung an Geweben, insbesondere neuralen Geweben betroffen oder akut bedroht sind, umfassend ein OP/BMP Morphogen und einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor, bereit. Überraschenderweise ist gezeigt worden, dass die Verabreichung dieser Mittel in Kombination einen synergistischen Effekt zur Förderung des Überlebens und/oder Wachstums neuraler Gewebe und in der Verhinderung des Absterbens oder der Degeneration neuraler Gewebe aufweist.
  • Ohne an eine bestimmte Theorie zur Erfindung gebunden zu sein, wird angenommen, dass die OP/BMP Morphogene und GDNF/NGF neurotrophen Faktoren einen synergistischen Effekt zur Förderung des Überlebens und/oder Wachstums neuraler Gewebe und in der Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls neuralen Gewebes durch Wirkung in getrennten Rezeptor-basierten Signalwegen ausüben. Insbesondere wird angenommen, dass die OP/BMP Proteine durch Serin/Threonin-Kinaserezeptoren agieren und dass die GDNF/NGF neurotrophen Faktoren der Erfindung durch Tyrosinkinase-Rezeptoren agieren, so dass, wenn ein OP/BMP Morphogen und ein GDNF/NGF neurotropher Faktor in Kombination verabreicht werden, sowohl die Serin/Threonin-Kinase als auch die Tyrosinkinase-Signaltransduktionswege aktiviert werden und ein synergistischer Effekt erzeugt wird.
  • Damit konnte gezeigt werden, dass die OP/BMP Morphogene durch Serin/Threoninkinase-Rezeptoren agieren, und diese Rezeptoren zeigten, dass sie sowohl in peripheren als auch in zentralen Nervensystemgeweben exprimiert werden. Beispielsweise ist durch in situ-Hybridisierung gezeigt worden, dass verschiedene Klassen peripherer Neuronen BMP-Typ 2 Serin/Threoninkinaserezeptoren, welche bekanntermaßen Mitglieder der OP/BMP Morphogenfamilie binden, exprimieren (Liu et al., Mol. Cell. Biol. 15:3479-3486 (1995); Rosenzweig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:7632-7636 (1995), und dass sowohl OP/BMP Typ 1 und Typ 2 Serin/Threoninrezeptoren im ZNS exprimiert werden. (Söderström et al. Cell Tiss. Res. 286:269-279 (1996a); Nosrat et al., Cell Tiss. Res. 286:191-207 (1996)).
  • In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass die GDNF/NGF neurotrophen Faktoren durch spezifische Tyrosinkinase-Rezeptoren, welche in neuralen Geweben exprimiert werden, agieren. So zeigte sich beispielsweise, dass der Signalweg von GDNF/NGF die Aktivierung des Tyrosinkinase-Rezeptors Ret (Trupp et al., Nature 381:785-789 (1996)) bedingt, welcher in neuralen Geweben einschließlich sympathischer, nodosa und ziliar-Ganglia exprimiert wird. In ähnlicher Weise agiert NT-3 über den TrkC Rezeptor und in gewissem Ausmaß über den TrkA Rezeptor. Siehe beispielsweise Ebendal, J. Neurosci. Res. 32:461-470 (1992). Diese Rezeptoren werden im Hirn und Rückenmark ebenso wie in peripheren Neuronen exprimiert. Siehe beispielsweise Vazquez und Ebendal, Neuro Report 1:593-596 (1991); Pei und Ebendas, Exp. Neurol. 132: 105-115 (1995); Söderström et al., Dev. Brain. Res. 85:96-108 (1995); Hallböök et al. Int. J. Dev. Biol. 39: 855-868 (1995); Williams und Ebendal, Neuro Report 6: 2277-2282 (1995); Williams et al., Eur. J. Neurosci. 7:116-128 (1995).
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt Präparate zur Förderung des Überlebens und/oder Wachstums neuralen Gewebes oder der Verhinderung des Absterbens oder der Degeneration neuralen Gewebes bereit, umfassend ein OP/BMP Morphogen und in Kombination einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor, um so sowohl den OP/BMP-aktivierten Serin/Threoninkinase-Weg als auch den GDNF/NT-aktivierten Tyrosinkinase-Weg zu aktivieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Erzeugnisse zur Behandlung von nicht-neuralen Geweben bereit. Insbesondere gibt es eine Vielzahl von nicht-neuralen Geweben, welche OP/BMP-aktivierte Serin/Threoninkinaserezeptoren und GDNF-aktivierte Tyrosinkinaserezeptoren, einschließlich renalem Gewebe und vielen thy roidpapillären Karzinomen, exprimieren (siehe beispielsweise Schuchardt et al., Nature 367: 380-383 (1994); Pachnis et al., Developement 119: 1005-1017 (1993)). Damit stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls Präparate zur Förderung des Überlebens und/oder Wachstums solcher nicht-neuraler Gewebe oder der Verhinderung des Absterbens oder Degeneration solcher nicht-neuraler Gewebe bereit, umfassend ein OP/BMP Morphogen und in Kombination einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor, um damit sowohl den OP/BMP-aktivierten Serin/Threoninkinase-Weg als auch den GDNF/NT-aktivierten Tyrosinkinase-Weg zu aktivieren.
  • A. OP/BMP Morphogene
  • Die OP/BMP Morphogene der vorliegenden Erfindung sind natürlich vorkommende Proteine oder funktionale Varianten natürlich vorkommender Proteine in der osteogenen protein/Knochen-morphogenetischen Protein (OP/BMP)-Familie innerhalb der TGF-β Überfamilie von Proteinen. Das heißt, diese Proteine bilden eine klare Untergruppe, hierin als die „OP/BMP Morphogene" bezeichnet, innerhalb der losen evolutionären Gruppierung Sequenz-verwandter Proteine, die als die TGF-β Überfamilie bekannt sind. Mitglieder dieser Proteinfamilie umfassen abgesonderte Polypeptide, welche gemeinsame strukturelle Merkmale teilen und welche in ähnlicher Weise aus einem Pro-Protein zur Erzielung eines Carboxy-terminalen reifen Proteins aufgearbeitet werden. Innerhalb des reifen Proteins teilen alle Glieder ein konserviertes Muster von sechs oder sieben Cysteinresten definierend eine 97-106 Aminosäuredomäne; und die aktive Form dieser Proteine ist entweder ein Disulfidgebundenes Homodimer eines einzelnen Familienmitgliedes oder ein Heterodimer zweier verschiedener Mitglieder. Siehe beispielsweise Massague, Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597(1990); Sampath et al., J. Biol. Chem. 265:13198 (1990). Beispielsweise ist humanes OP-1 aus natürlicher Quelle in seiner reifen, nativen Form ein glykosiliertes Dimer, welches typischerweise ein manifestes Molekulargewicht von ungefähr 30-36 kDa, wie durch SDS-PAGE bestimmt, aufweist. Nach Reduktion führt das 30 kDa Protein zu zwei glykosilierten Peptid-Untereinheiten, welche manifeste Molekulargewichte von ungefähr 16 kDa und 18 kDa aufweisen. Das unglykosilierte Protein weist ein manifestes Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Nach Reduktion führt das 27 kDa Protein zu zwei unglykosilierten Polypeptidketten, welche Molekulargewichte von ungefähr 14 kDa bis 16 kDa aufweisen.
  • Typischerweise werden die natürlich vorkommenden OP/BMP Proteine als ein Precursor übertragen, welcher eine N-terminale Signalpeptidsequenz, eine „Pro"-Domäne und eine „reife"-Proteindomäne aufweist. Das Signalpeptid hat typischerweise weniger als 30 Reste und wird nach Übertragung rasch an einer Spaltstelle, welche unter Verwendung der Methode nach von Heijne, Nucleic Acids Research 14:4683-4691 (1986) vorhergesagt werden kann, gespalten. Die „Pro"-Domäne ist sowohl in Sequenz als auch in Länge variabel, sich erstreckend von ungefähr 200 bis über 400 Reste. Die Pro-Domäne wird zur Erzielung der „reifen” C-terminalen Domäne von ungefähr 115 bis 180 Resten, welche die konservierten 6- oder 7-Cystein C-terminale Domäne von 97 bis 106 Resten einschließt, gespalten. Wie hierin verwendet, enthält die „Pro-Form" eines OP/BMP Familienmitgliedes ein Protein umfassend ein gefaltetes Paar von Polypeptiden, jedes umfassend eine Pro-Domäne in entweder kovalenter oder nicht-kovalenter Verbindung mit der reifen Domäne des OP/BMP Polypeptids. Typischerweise ist die Pro-Form des Proteins unter physiologischen Bedingungen löslicher als die reife Form. Abgesondert aus kultivierten Säugerzellen erscheint die Pro-Form als die primäre Form. Die „reife Form" des Proteins schließt eine reife C-terminale Domäne, welche mit der Pro-Domäne nicht, weder kovalent noch nicht-kovalent, verbunden ist, ein. Jedes OP-1 Präparat wird als die reife Form enthaltend erachtet, wenn die Menge an Pro-Domäne in dem Präparat nicht mehr als 5% der Menge an „reifer" C-terminaler Domäne beträgt.
  • Hierin nützliche OP/BMP-Familienmitglieder schließen jede der bekannten, natürlich vorkommenden nativen Proteine, einschließlich alleler, phylogenetischer Entsprechungen und anderer Varianten davon, ob natürlichen Ursprungs oder biosynthetisch hergestellt (z.B. einschließlich „Muteine" oder „Mutantenproteine") ebenso wie neue, aktive Mitglieder der OP/BMP Familie von Proteinen ein.
  • Besonders nützliche Sequenzen schließen solche umfassend die C-terminalen 7-Cysteindomänen von Säugetier-, bevorzugt humanem OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP8 und BMP9 ein. Andere in der Anwendung der Erfindung nützliche Proteine schließen aktive Formen von GDF-5, GDF-6, GDF-7, DPP, Vgl, Vgr-1, 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP oder NURAL und Aminosäuresequenz-Varianten davon ein. In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform sind die OP/BMP Morphogene der Erfindung beliebig ausgewählt aus: OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 und BMP9.
  • Veröffentlichungen, welche diese Sequenzen wie auch ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften offenbaren, schließen ein: OP-1 und OP-2: U.S. Pat. No. 5,011,691 , U.S. Pat. NO. 5,266,683 und Ozkaynak et al., EMBO J. 9: 2085-2093 (1990); OP-3: WO 94/10203 ; BMP2, BMP3 und BMP4: U.S. Pat. No. 5,013,649 , WO 91/18098 , WO 88/00205 und Wozney et al., Science 242:1528-1534 (1988); BMP5 und BMP6; WO 90/11366 und Celeste et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86: 4554-4558(1989); DPP: Padgett et al., Nature 325:81-84 (1987); Vgl: Weeks, Cell 51:861-867 (1987); BMP9: WO 95/33830 ; BMP10: WO 94/26893 ; BMP-11: WO 94/26892 ; BMP12: WO 95/16035 ; BMP-13: WO 95/16035 ; GDF-1: WO 92/00382 und Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 88:4250-4254 (1991); GDF-8: WO 94/21681 ; GDF-9: WO 94/15966 ; GDF-10: WO 95/10539 ; GDF-11: WO 96/01845 ; BMP-15: WO 96/36710 ; MP121: WO 96/01316 ; GDF-5 (CDMP-1, MP52): WO 94/15949 , WO 96/14335 , WO 93/16099 und Storm et al., Nature 368:639-643 (1994); GDF-6 (CDMP-2, BMP13): WO 95/01801 , WO 96/14335 und WO 95/10635 ; GDF-7 (CDMP-3, BMP12): WO 95/10802 und WO 95/10635 ; BMP-3b: Takao et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 219:656-662 (1996); GDF-3: WO 94/15965 ; 60A: Basler et al., Cell 73:687-702 (1993) und GenBank Accession No. 112032. In einer weiteren Ausführungsform schließen nützliche Proteine biologisch aktive, biosynthetische Produkte, einschließlich neuer biosynthetischer Proteine und chimerer Proteine, gestaltet unter Verwendung der Sequenzen aus einer oder mehrerer bekannter OP/BNP Familienproteine, ein. Siehe auch die biosynthetischen Produkte offenbart in US Pat. No. 5,011,691 (z.B. COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16).
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen schließen die hierin nützlichen OP/BMP Morphogene Proteine, welche eine Aminosäuresequenz umfassen, welche mindestens 70% Aminosäuresequenz-„Homologie” und, bevorzugt, 75% oder 80% Homologie mit der C-terminalen 7-Cysteindomäne vorhanden in den aktiven Formen von humanem OP-1 (d.h. Reste 330-431, wie gezeigt in SEQ ID NO: 2 aus U.S. Pat. No. 5,266,683 ) teilt, ein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen schließen die hierin nützlichen OP/BMP Morphogene Proteine, welche eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens 60% Aminosäuresequenzidentität und, bevorzugt, 60% oder 70% Identität mit der C-terminalen 7-Cysteindomäne, vorhanden in den aktiven Formen von humanem OP-1, teilt, ein. Damit kann ein Aminosäuresequenz-Kandidat mit der Aminosäuresequenz der C-terminalen 7-Cysteindomäne von humanem OP-1 unter Verwendung der Methode nach Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), zweckmäßig implementiert durch Computerprogramme wie das Align-Programm (DNAstar, Inc.), in Einklang gebracht werden. Wie vom Fachmann verstanden werden wird, schließen homologe oder funktional-äquivalente Sequenzen funktional-äquivalente Anordnungen der Cysteinreste innerhalb des konservierten Cysteinskelettes, einschließlich Aminosäureeinfügungen oder Löschungen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine verändern, mit ein, aber beeinträchtigen nicht wesentlich ihre Beziehung in der gefalteten Struktur des dimeren Proteins, einschließlich ihrer Fähigkeit, solche intra- oder interkettigen Disulfidbindungen zu bilden, wie sie für biologische Aktivität notwendig sein können. Daher werden interne Lücken und Aminosäureeinfügungen in die Kandidatensequenz zum Zwecke der Berechnung des Maßes an Aminosäuresequenzhomologie oder Identität zwischen dem Kandidaten und den Referenzsequenzen nicht berücksichtigt. „Aminosäuresequenzhomologie" wird hierin verstanden, sowohl die Aminosäuresequenzidentität als auch Ähnlichkeit zu beinhalten. Daher, wie hierin verwendet, zeigt eine prozentuale „Homologie" zwischen zwei Aminosäuresequenzen den Prozentanteil an Aminosäureresten, welcher zwischen den Sequenzen identisch oder ähnlich ist, an. „Ähnliche" Reste sind „konservative Substitutionen", welche die für eine „akzeptierte Punktmutation" definierten Kriterien in Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Stucture Vol. 5 (Suppl. 3), S. 354-352 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington D.C., erfüllen. Damit sind „konservative Aminosäuresubstitutionen" Reste, die physikalisch oder funktional den korrespondierenden Referenzresten ähnlich sind, eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung und/oder chemische Eigenschaften wie beispielsweise die Fähigkeit, kovalente oder Wasserstoff-Brückenbindungenn zu bilden oder ähnliches, aufweisen. Beispiele konservativer Substitutionen beinhalten die Substitution einer Aminosäure gegen eine andere mit ähnlichen Merkmalen, z.B. Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: (a) Valin, Glycin; (b) Glycin, Alanin; (c) Valin, Isoleucin, Leucin; (d) Asparaginsäure, Glutaminsäure; (e) Asparagin, Glutamin; (f) Serin, Threonin; (g) Lysin, Arginin, Methionin; und (h) Phenylalanin, Tyrosin. Der Begriff „konservative Substitution" oder „konservative Variation" beeinhaltet auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstatt einer nicht-substituierten Stamm-Aminosäure in einer gegebenen Polypeptidkette, vorausgesetzt, dass die entstehende substituierte Polypeptidkette eine in der vorliegenden Erfindung nützliche biologische Aktivität aufweist.
  • Die OP/BMP Morphogene der Erfindung werden durch biologische Aktivitäten charakterisiert, welche durch den Durchschnittsfachmann leicht ermittelt werden können. Insbesondere ist ein OP/BMP Morphogen der vorliegenden Erfindung geeignet, in dem Reddi-Sampath ekto pischen Knochenassay (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603 (1981)) oder einem im Wesentlichen äquivalenten Assay Osteogenese zu induzieren.
  • Das Reddi-Sampath ektopische Knochen-Assay ist im Stand der Technik als ein Assay für osteogene Aktivität wohlbekannt. Das Assay, welches leicht durchführbar ist, wird beispielsweise beschrieben und diskutiert in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603 (1981); und Wozney, „Bone Morphogenetic Proteins", Progress in Growth Factor Research 1: 267-280 (1989). Viele äquivalente Assays, welche andere Tiere oder Gewebestellen verwenden, können vom Fachmann zur Bestimmung der biologischen Aktivität der OP/BMP Morphogene der vorliegenden Erfindung durchgeführt oder entwickelt wurden. Siehe beispielsweise die Bioassays, beschrieben in US-Patent Nr. 5,226,683 .
  • Die hierin betrachteten OP/BMP Morphogene können aus intakter oder verkürzter genomischer oder cDNA oder aus synthetischen DNAs in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden. Die dimeren Proteine können aus den Kulturmedien isoliert werden und/oder in vitro-zurückgefaltet und dimerisiert werden, um biologisch aktive Präparate zu bilden. Heterodimere können in vitro durch Kombinieren separater, eindeutiger Polypeptidketten gebildet werden. Alternativ können Heterodimere in einer einzelnen Zelle durch Co-Exprimierung von Nukleinsäuren, welche separate, eindeutige Polypeptidketten codieren, gebildet werden, siehe beispielsweise WO 93/09229 oder US Patent Nr. 5,411,941 für einige beispielhafte Herstellungsprotokolle rekombinanter heterodimerer Proteine. Gegenwärtig bevorzugte Wirtszellen beinhalten, ohne Einschränkung, Prokaryoten einschließlich E.coli oder Eukaryoten einschließlich Hefen wie beispielsweise Saccharomyces, Insektenzellen oder Säugerzellen wie beispielsweise CHO-, COS- oder BSC- Zellen. Ein Durchschnittsfachmann wird abschätzen, dass weitere Wirtszellen mit Vorteil verwendet werden können. Detaillierte Beschreibungen der in der Anwendung dieser Erfindung nützlichen Proteine, einschließlich, wie sie für osteogene Aktivität präpariert, verwendet und getestet werden, sind in zahlreichen Publikationen offenbart, einschließlich US-Pat. No. 5,166,683 sowie 5,011,091 .
  • B. GDNF/NGF neurotrophe Faktoren
  • Die in den Präparaten der vorliegenden Erfindung nützlichen GDNF/NGF neurotrophen Faktoren beinhalten Poypeptide sowie funktionale Varianten von Polypeptiden, umfassend mindestens den aktiven Teil eines reifen Säugerproteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GDNF, GDNF, NGF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6. Jeder dieser bevorzugten GDNF/NGF neurotrophen Faktoren wird im Folgenden getrennt besprochen.
    • 1. GDNF. Der Gliazellen-abgeleitete neurotrophe Faktor (GDNF) ist ein neurotropher Faktor, welcher der transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Überfamilie angehört, aber nicht zu der OP/BMP-Familie innerhalb der TGF-β Überfamilie. GDNF zeigt potente Überlebens- und Differenzierungsfördernde Wirkungen für dopaminerge Neuronen, beide in vitro. Lin et al., Science 260:1130-1132 (1993) und in vivo in Tiermodellen (Hudson et al., Brain Res. Bull. 36:425-432 (1995); Hoffer et al., Neurosci. Lett. 182:107-111 (1994). Auch konnte gezeigt werden, dass GDNF neurotrophe Wirkungen auf cholinerge Motorneuronen des Hirnstammes und Rückenmarkes zeigt. Oppenheim et al., Nature 373:344-346 (1995); Yan et al., Nature 373:341-344 (1995). Beschreibungen des aktiven Teils eines reifen Säuger-GDNF-Proteins kann beispielsweise gefunden werden in Lin et al., Science 260: 1130-1132 (1993); Lin et al., J. Neurochem. 63: 758-768 (1994); und PCT Veröffentlichung WO 97/11965 . In Kürze, GDNF wird als Precursor synthetisiert und als ein reifes Protein, umfassend 134 Aminosäuren ausgesondert, einschließlich der 7-Cysteindomäne, welche die TGF-β Überfamilie von Proteinen charakterisiert. Eine 133 Aminosäuren-Variante von GDNF, in der der initiale Met-Rest weggelassen wurde ([Met–1]GDNF), weist eine im Wesentlichen äquivalente biologische Aktivität auf. Siehe z.B. WO 97/11965 . Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „GDNF" ein Polypeptid umfassend mindestens die 134 Aminosäuren reife Form wie auch eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante oder die 133 Aminosäuren-Variante.
    • 2. NGF. Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist das am besten charakterisierte Mitglied der „Neurotrophin"-Proteinfamilie, deren weitere Mitglieder Hirn-abgeleiteten neurotrophe Faktor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4), Neurotrophin-5 (NT-5) und Neurotrophin-6 (NT-6) beinhalten, wie im Folgenden bespro chen. Es zeigte sich, dass NGF eine Rolle in der Regulierung der initialen Schritte des dendritischen Wachstums spielt und die Förderung des Überlebens, Wachstums und/oder Wiederherstellung cholinerger Neuronen und Aufrechterhaltung des differenzierten Phänotyps cholinerger Neuronen unterstützt. Beispielsweise kann NGF eine Subpopulation von Nodosa-Neuronen veranlassen, in Kulturmedien Dendriten zu bilden (De Koninck et al., J.Neurosci. 13:577-585 (1993)) und kann das Wachstum sympathischer Dendriten, wenn in situ injiziert, verstärken. (Snider, J. Neurosci. 8:2628-2634 (1988)). Jedoch unterstützt NGF allein das dendritische Wachstum in Kulturen sympathischer Neuronen nicht. Bruckenstein und Higgins, Dev.Biol. 128:324-336 (1988). Zusätzlich zeigt sich NGF wirksam in der Vorbeugung oder gar Umkehr der Atrophie cholinerger Neuronen, welche in einem Standard-fimbria/fornix-Axotomiemodell der Alzheimerkrankheit eingeführt wurde. Siehe z.B. Batchelor et al., J. Corp. Neurol. 284:187-204 (1989); Hefti et al., J. Neurobiol. 25:1418-1435 (1994); Olson et al., Neurochem. J. 25:1-3 (1994). Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „NGF" ein Polypeptid umfassend mindestens die reife Form ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante.
    • 3. BDNF. Der Hirn-abgeleitete neurotrophe Faktor (BDNF), ein weiteres Mitglied der Neurotrophin-Familie von Proteinen, zeigte eine Verstärkung der Dopaminaufnahme von fetalen nigralen DA-Neuronen in Zeltkultur (Beck et al., Neurosci. 52:855-866 (1993); Knusel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:961-969 (1991)) sowie einen partiellen Schutz der DA-Neuronen vor den toxischen Wirkungen des Neurotoxins Nmethyl-4-phenylpyiridinium-Ion und 6-hydroxy-Dopamin (6-ODHA). Hyman et al., Nature 350:230-232 (1991). BDNF zeigte auch eine starke unterstützende Wirkung auf das Überleben kultivierter nigraler DA-Neuronen. Beck et al., Neurosci. 52:855-866 (1993); Hyman et al., Nature 350: 230-232 (1991); Knusel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:961-965 (1991). Diese Erkenntnisse legten nahe, dass BDNF eine überlebensfördernde Wirkung auf transplantierte DA-Neuronen in vivo haben könnte. BDNF-Behandlung verstärkt die Verhaltenswirkung transplantierter nigraler DA-Neuronen auf das DA-erschöpfte Striatum von unilateral 6-ODHA-läsionierten Ratten, wie es sich durch eine relative Reduktion in Amphetamin-induzierter Abkehr nach zweiwöchiger post-Transplantation offenbart. Sauer et al., Brain Research 626:37-44 (1993). Jedoch versagte diese Studie in der Festlegung irgendeines eindeutigen Un terschiedes zwischen behandelten und Kontroll-Tieren im Ausmaß an Neuritenauswuchs aus den transplantierten DA-Neuronen. Damit war sie, wenngleich die Infusion mit BDNF einige Wirkungen in Verhalten und Morphologie in Ratten, denen fetales, nigrales Gewebe transplantiert wurde, erzeugte, nicht in der Lage, die Überlebensraten der transplantierten Dopaminzellen zu erhöhen. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „BDNF" ein Polypeptid umfassend mindestens die reife Form ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids, beispielsweise eine konservative Aminosäure-Substitutionsvariante.
    • 4. NT-3. Wie hierin verwendet, bedeutet „NT-3" ein Humanprotein oder ein Säugerhomologes davon, aufweisend eine Proteinsequenz, wie sie im Wesentlichen publiziert ist in Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA 87:8060-8064 (1990); Maisonpierre et al., Genomics 10:558-568 (1991); Kaisho et al., FEBS Lett. 266:187-191 (1990); WO 91/03569 und erhältlich durch die Gen Bank Accession No. M37763. Die Isolierung und/oder Charakterisierung von humanem NT-3 ist beispielsweise beschrieben in Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 87:8060-806 (1990) und Maisonpierre et al., Science 247:1446-1451 (1990). Die Mäuse NT-3-Sequenz wird offenbart in Hohne et al., Nature 344:339-341 (1990); WO 91/03569 und GenBank Accession No. X53257. Die Ratten-NT-3 Sequenz wird offenbart in Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:5454-5458 (1990); WO 91/03569 ; sowie GenBank Accession No. M34643. Ein Vergleich des humanen NT3-Precursors mit den Ratten- und Mäuse-NT-3-Precursern zeigt, dass die reifen Formen identisch sind. Das Gen für humanes NT-3 codiert einen putativen 257 Aminosäureprecursor mit einem 18-Aminosäuresignalpeptid, welches in ein 119 Aminosäure reifes Peptid aufgearbeitet wird. NT-3 RNA ist im humanen ZNS-Gewebe detektiert worden, einschließlich dem Zerebellum, Nukleus basalis, basaler Ganglia, Hypocampus und visualem Kortex. Maisonpierre et al., Genomics 10:558-568 (1991). Humanes NT-3 teilt 56% Aminosäureidentität mit humanem NGF und humanem BDNF und teilt das konservierte 6-Cystein mit anderen Mitgliedern der Neurotrophin-Familie, wobei die Gebiete der größten Homologie zwischen den drei Proteinen um diese Cysteinreste angehäuft sind. Der Begriff „NT-3", wie hierin verwendet, beinhaltet ein Polypeptid umfassend mindestens die reife 119 Aminosäureform, wie offenbart in Jones et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:8060-806 (1990) ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante.
    • 5. NT-4. Wie hierin verwendet, bedeutet „NT-4" ein Humanprotein oder ein Säugerhomologes davon, aufweisend eine Proteinsequenz, im Wesentlichen wie publiziert in Ip et al., Proc. Nat. Acad. Sci (USA) 89:3060-3064 (1992); U.S. Pat. No. 5,364,769 und verfügbar durch GenBank Accession No. M86528. Die Isolierung und/oder Charakterisierung von NT-4 ist beispielsweise beschrieben in Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3060-3064 (1992); Hallböök et al., Neuron 6; 845-858 (1991); und Ibanez et al., Development 117:1345-1353 (1993). Die komplette NT-4 Gensequenz codiert eine 236 Aminosäure, 27 kD Precursorprotein umfassend ein putatives Signalpeptid, umfassend eine putative Signalpeptidsequenz und Pro-Region von ungefähr 60 Aminosäuren, von der angenommen wird, zu einem 130 Aminosäure reifen Human NT-4 Polypeptid aufgearbeitet zu sein. Die reife Form von NT4 teilt 46,5%, 55,4% und 52,2% Sequenzidentität mit NGF, BDNF bzw. NT-3. NT-4 enthält die konservierten 6-Cysteine der Neurotrophinfamilie, aber enthält eine 7-Aminosäureeinfügung, gelegen zwischen dem zweiten und dritten Cystein. NT-4 zeigt die Unterstützung des Überlebens von Neuronen des trigeminalen Ganglions in der Maus (Ibanez et al., Development 117:1345-1353 (1993)) und dorsale Wurzelganglia im Huhn. (Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3060-3064 (1992)). In der Ratte wurde NT-4 mRNA im Rückenmark und einigen Hirnregionen einschließlich Zerebellum und Kortex gefunden. Der Begriff „NT-4", wie hierin verwendet, beinhaltet ein Polypeptid umfassend mindestens die 130 Aminosäureform wie beschrieben in Ip et al., Proc. Natl. Sci. (USA) 89:3060-3064 (1992), ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante.
    • 6. NT-5. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „NT-5" ein Humanprotein oder ein Säugetier homologes davon, aufweisend eine Proteinsequenz wie sie im Wesentlichen in Berkemeier et al., Neuron 7:857-866 (1991) beschrieben ist. Die Isolierung und/oder Charaktierisierung von NT-5 wird beispielsweise beschrieben in Berkemeier et al., Neuron 7:857-866 (1991) und Berkemeier et al., Som. Cell Mol. Genet. 18:233-245 (1992). Das humane Gen für NT-5 codiert ein putatives 210 Aminosäure, 22,4 kD Precursorprotein. Das zugehörige Initiierungscodon ist gefolgt von einer putativen Signalsequenz-Spaltungsstelle bei Ser-24. Die putative Pre-Pro Sequenz von NT-5 ist ungefähr 50 Aminosäuren kürzer als jene der anderen Neurotrophine. Die Gesamt-Homologie des NT-5 Precursors mit Xenopus NT-4, humanem NT-3, humanem BDNF und humanem NGF ist 52%, 45%, 47% bzw. 41%. Das reife NT-5 ist 123 Aminosäuren lang und teilt die in der Neurotrophin-Familie konservierten 6-Cysteine. NT-5 teilt 50% Homologie mit NGF, 56% Homologie mit BDNF, 55% Homologie mit NT-3 und 66% Homologie mit Xenopus NT-4. Das Ratten-NT-5-Gen codiert ein 209 Aminosäurenprotein, welches zu 91% identisch mit seiner humanen Entsprechung ist. Berkemeier et al., Neuron 7:857-866 (1991). Das NT-5 Protein wurde in adulten Rattenhirnen identifiziert und fungiert als ein Überlebensfaktor für dorsale Wurzelganglionsensorzellen und fördert das Überleben und den Neuritenauswuchs aus sympathischen Ganglionneuronen. Berkemeiner et al., Neuron 7:857-866 (1991). Der Begriff „NT-5", wie hierin verwendet, beinhaltet ein Polypeptid umfassend die reife 123 Aminosäurenform ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante.
    • 7. NT-6. Wie hierin verwendet, bedeutet „NT-6" ein Humanprotein oder ein Säugetierhomologes davon, aufweisend eine Proteinsequenz, wie sie im Wesentlichen in Gotz et al., Nature 327:266-269; WO 95/26363 (1994) beschrieben ist und verfügbar durch GenBank Accession Nos. 136325 und 136942. Die Isolierung und Charakterisierung von NT-6 wird beispielsweise beschrieben in Gotz et al., Nature 327:266-269 (1994). Der NT-6 Precursor enthält 286 Aminosäuren, welche eine für ein Signalpeptid charakteristische hydrophobe Domäne am N-Terminus (Reste 1-10) aufweisen und eine putative Pro-Region an den Resten 20-142. Das putative reife Protein beginnt am Rest 143. NT-6 teilt die in allen Neurotrophinen gefundenen konservierten 6-Cysteine, enthält aber eine 22-Resteinfügung zwischen der zweiten und dritten konservierten Cystein enthaltenden Domäne. Der Begriff „NT-6", wie hierin verwendet, beinhaltet ein Polypeptid umfassend die reife 119 Aminosäurenform, offenbart in Gotz et al., Nature 327:266-269 (1994) ebenso wie eine funktionale Variante des Polypeptids wie beispielsweise eine konservative Aminosäuresubstitutionsvariante.
  • C. Probanden zur Behandlung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten Probanden zur Behandlung, ohne Beschränkung, (1) solche, welche beschädigte neurale Gewebe aufweisen oder in akutem Risiko der Beschädigung sind, infolge mechanischer Traumata, wie sie entstehen aus traumatischer Hirnverletzung durch stumpfe Krafteinwirkung, zerebraler Ödeme, subduraler Hämatome, gebrochener oder gequetschter Vertebra und gerissener oder abgetrennter Nerven (einschließlich solcher entstehend aus chirurgischen Eingriffen); (2) solche, welche leiden oder in akutem Risiko des Leidens stehen, durch chemische Traumata an Nervengewebe, wie sie entstehen können beispielsweise durch Ausgesetztsein gegen Neurotoxine, (z.B. Blei, Ethanol, Ammoniak, Formaldehyd, Quecksilber) oder dem Verabreichen von chemotherapeutischen Mitteln mit neurotoxischen Nebenwirkungen (z.B. cis-Platin); (3) solche, welche leiden oder in akutem Risiko des Leidens an ischämischer Verletzung neuraler Gewebe, z.B. Schlaganfall; und (4) solche, welche von einer neuropathischen oder neurodegenerativen Krankheit betroffen oder akut bedroht sind. Insbesondere wird die Behandlung für humane Probanden in Erwägung gezogen, welche diagnostiziert oder im Risiko der Diagnose einer Neuropathie oder neurodegenerativen Krankheit stehen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus amyotropher Lateralsklerose (ALS), Progressiver Muskelatrophie, ererbte motorische und sensorische Neuropathie (Charcot-Marie-Tooth-Krankheit), Alzheimer-Krankheit, Epilepsie, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Lähmung, Demenz, Shy-Drager-Krankheit, Korsakow-Syndrom und Hallervorden-Spatz-Krankheit.
  • Krankheiten wie ALS, progressive Muskelatrophie und ererbte motorische und sensorische Neuropathie (Charcot-Marie-Tooth-Krankheit) entstehen alle, zumindest in Teilen, aus der Degeneration von Motorneuronen, welche im ventralen Horn des Rückenmarks lokalisiert sind. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform Methoden und Präparate bereit, welche ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor zur Behandlung dieser und anderer Zustände, einschließlich Verlust oder Beschädigung an Motorneuronen, einsetzen.
  • Der Hippocampus, eine wohldefinierte Struktur, die Teil des zerebralen Kortex des Hirns ist, ist bedeutend in der Bildung des Langzeitgedächtnisses. Degeneration pyramidaler CA1-Neuronen, welche in der CA1 Region des Hippocampus lokalisiert sind, ist ein Charakteristikum der Alzheimer-Krankheit. Die gleichen Neuronen sind selektiv verletzlich gegen ischämische oder anoxische Beschädigung, welche in Zuständen wie Schlaganfall oder Hirntrauma erfolgen. Zusätzlich werden die CA1 pyramidalen hippocampalen Neuronen ebenso wie die pyramidalen Neuronen in der CA3-Region des Hippocampus bei Epilepsie selektiv verletzt. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführung Methoden und Präparate bereit, welche ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor zur Behandlung dieser und anderer Zustände, einschließlich Verlust oder Beschädigung an hippocampalen Neuronen, einsetzen.
  • Die Mehrzahl der Neuronen im Striatum nutzen GABA (4-Aminobuttersäure) als ihren Neurotransmitter und können daher als „GABAnerge Neuronen" bezeichnet werden. Das Striatum ist auch das Hauptziel der progressiven Neurodegeneration, wie sie in der Huntington-Krankheit erfolgt, wo striatale GABA-nutzende Neuronen (z.B. stachelzellige Neuronen und Enkephalin-Neuronen) schrumpfen und/oder absterben. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführung Methoden und Präparate zur Verfügung, welche ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit einem GDNG/NGF neurotrophen Faktor zur Behandlung dieser und anderer Zustände, einschließlich Verlust oder Beschädigung an striatalem oder GA-BAnergen Neuronen, einsetzen.
  • Dopamin-erzeugende („dopaminerge” oder „DA") Neuronen" sind primär in der Substanzia Nigra und, in geringerem Maße, in dem benachbarten Striatum (umfassend den caudate Nukleus, das Putamen, Pallidum und Locus Coerulus) lokalisiert. Die Neuronen des Striatum exprimieren Rezeptoren für Dopamin und sind für die Kontrolle motorischer Aktivität verantwortlich. Daher führt die Degeneration von DA-Neuronen zu einer Abnahme des Dopaminspiegels und dem Verlust motorischer Aktivität. Insbesondere kann die progressive Degeneration dopaminerger Neuronen in der Substanzia Nigra zu einer Verlangsamung der Initiierung und Ausführung freiwilliger Muskelbewegung (Bradykinesis), der Muskelrigidität und Tremor führen, welche charakteristisch für Parkinsonkrankheit sind. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführung Methoden und Präparate bereit, welche ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor zur Behandlung dieser und anderer Zustände, einschließlich Verlust oder Beschädigung an dopaminergen Neuronen, einschließlich solcher der Substanzia Nigra einsetzen.
  • Weitere neuropathische Zustände, in welchen Populationen neuraler Zellen verloren gehen oder beschädigt werden, schließen Lähmung, Demenz, Shy-Drager-Krankheit, Korsakoff-Syndrom und Hallervorden-Spatz-Krankheit ein. Daher stellt die vorliegende Erfindung in anderen Ausführungen Methoden und Präparate bereit, welche ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor zur Behandlung dieser und anderer Zustände, einschließlich Verlust oder Beschädigung neuraler Gewebe, einsetzen.
  • D. Pharmazeutische Präparate
  • Die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung beinhalten mindestens ein OP/BMP Morphogen in Kombination mit mindestens einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor. Bevorzugt beinhalten solche Präparate eine Menge jeden Mittels, welche wirksam ist, wenn sie alleine verabreicht wird. Wegen der synergistischen Wirkung der Mittel in Kombination, können die pharmazeutischen Präparate eine Menge an jedem Mittel enthalten, welches, wenn in Abwesenheit des anderen verabreicht, alleine nicht wirksam wäre. Die Bestimmungen der geeigneten Verhältnisse der Mittel liegt in der Befähigung und dem Ermessen des Durchschnittsfachmanns für einen gegebenen Zustand, für eine gegebene Kombination aus OP/BMP Morphogen und GDNF/NGF neurotrophem Faktor und einem gegebenen Weg der Verabreichung. Im Allgemeinen können die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung, enthaltend mindestens ein OP/BMP Morphogen und mindestend ein GDNF/NGF neurotrophen Faktor, unter Verwendung von in vitro Assays, Tiermodellen und klinischen Studien getestet werden. Wirksame Konzentrationen der Präparate sind solche, welche hinreichend sind, um (1) ein verstärktes Neuritenauswachsen in einem in vitro Assay von neuralem Wachstum zu verursachen; (2) welche Verbesserungen motorischer Fähigkeiten in einem Standard-Tiermodell der Parkinsonkrankheit verursachen; oder (3) welche eine klinisch signifikante Verbesserung in neurologischer Funktion verursachen, wenn sie einem Säugetier-Probanden (z.B. einem menschlichen Patienten) verabreicht werden.
  • E. Methoden und Formulierungen zur Verabreichung
  • Die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung, enthaltend mindestens ein OP/BMP Morphogen und mindestens einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor, können einem Individuum in jeder geeigneten Form verabreicht werden, bevorzugt direkt (z.B. lokal, wie durch Injektion in einen Gewebeort) oder systemisch (z.B. parenteral oder oral). Ist das Präparat parenteral zu verabreichen, beispielsweise intravenös, subkutan, intraorbital, opthalmisch, intraventrikulär, intrakraniell, intrakapsulär, intraspinal, intrazisternal, intraperitoneal oder buccaler Verabreichung, umfasst das Präparat bevorzugt Teile einer wässrigen Lösung. Die Lösung wird als physiologisch akzeptabel gewählt, so dass zusätzlich zur Lieferung des gewünschten OP/BMP Morphogens und des GDNF/NGF neurotrophen Faktors zu dem Patienten die Lösung keine sonstigen nachteiligen Wirkungen auf den Elektrolyt- oder Volumenhaushalt des Patienten nimmt.
  • Nützliche Lösungen für die parenterale Verabreichung können durch eine Vielfalt von aus dem Stand der pharmazeutischen Technik bekannten Methoden angesetzt werden, siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A., ed., Mack Pub. (1990). Formulierungen können beispielsweise Polyalkylenglykole wie z.B. Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphtalene und dergleichen beinhalten. Formulierungen zur direkten Verabreichung können insbesondere Glycerin und andere Präparate hoher Viskosität beinhalten. Biokompatible, vorzugsweise bioresorbierbare Polymere, einschließlich z.B. Hyaluronsäure, Kollagen, Polybutyrat, Tricalziumphosphat, Laktid und Laktid/Glykolid-Copolymere können nützliche Hilfsstoffe sein, um die in vivo-Freisetzung des Präparates zu kontrollieren. Weitere potenziell nützliche parenterale Zuführsysteme für diese Präparate beinhalten Ethylen-Vinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen.
  • Wie vom Fachmann verstanden werden wird, werden die Mengen und/oder Konzentrationen der in einem pharmazeutischen Präparat vorliegenden Mittel in Abhängigkeit einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Dosierung des zu verabreichenden Arzneimittels, den chemische Eigenschaften (z.B. Hydrophobizität) der eingesetzten Mittel sowie dem Weg der Verabreichung variieren. Die bevorzugte Dosierung kann auch von Variablen wie beispielsweise der Art und dem Ausmaß der zu behandelnden Beschädigung oder Verletzung, dem allgemeinen Gesundheitszustand des Probanden, der relativen biologischen Effizienz der eingesetzten Mittel, dem Vorhandensein von Hilfsstoffen oder Verdünnungsmittel und dergleichen abhängen.
  • Im Allgemeinen werden die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung in hinreichenden Mengen verabreicht, um wirksame Konzentrationen des OP/BMP Morphogens und des GDNF neurotrophen Faktors an einer Stelle neuraler Gewebsbeschädigung oder Verletzung oder an einer Stelle in akutem Risiko einer solchen Verletzung zu erzielen. Bevorzugt enthalten die Präparate eine Menge an OP/BMP Morphogen, so dass bei Verabreichung durch einen gewählten Weg der Verabreichung dies zu einer Konzentration des OP/BMP Morphogens von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml, eher bevorzugt 1 ng/ml bis 100 ng/ml führt. In ähnlicher Weise enthalten die Präparate bevorzugt eine Menge an GDNF/NGF neurotrophen Faktor, so dass bei Verabreichung über einem gewählten Weg der Verabreichung dies zu einer Konzentration an GDNF/NGF neurotrophem Faktor von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml, eher bevorzugt 1 ng/ml bis 100 ng/ml führt. Wegen der synergistischen Wechselwirkungen der OP/BMP Morphogene und den GDNF/NGF neurotrophen Faktoren werden die optimalen Konzentrationen und Verhältnisse in Abhängigkeit der eingesetzten Mittel variieren.
  • Wo die Verletzung von Neuronen eines neuralen Signalweges beispielsweise als Teil eines chirurgischen Eingriffs beabsichtigt induziert wurde, werden das OP/BMP Morptogen und der GDNF/NGF neurotrophe Faktor vorzugsweise kurz vor oder begleitend zur Induktion des Traumas bereitgestellt. Vorzugsweise werden das Morphogen und der neurotrophe Faktor in einem chirurgischen Umfeld prophylaktisch verabreicht.
  • Wo das OP/BMP Morphogen und der neurotrophe Faktor an einer Stelle bereitgestellt werden sollen, um Axon-Regenerierung zu stimulieren, wird das pharmazeutische Präparat vorzugsweise an der Stelle in Verbindung mit einem biokompatiblen, bevorzugt bioresorbierbaren Träger, geeignet zur Erhaltung der Proteine an der in vivo-Stelle und durch den ein neuraler Vorgang sich regenerieren kann, bereitgestellt. Ein gegenwärtig bevorzugter Träger umfasst ebenfalls eine hinreichende Struktur, um die Richtung des axonalen Wachstums zu unterstützen. Gegenwärtig bevorzugte Träger beinhalten strukturelle Moleküle wie beispielsweise Kollagen, Hyaluronsäure oder Laminin und/oder synthetische Polymere oder Copolymere von beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder Polybuttersäure. Gegenwärtig am ehesten bevorzugt sind Träger, welche eine extrazelluläre Gewebematrix umfassen. Diese kann kommerziell erhalten werden. Zusätzlich kann eine Hirngewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix wie in PCT-Veröffentlichung WO 92/15323 beschrieben und/oder durch andere aus dem Stand der Technik bekannten Hilfsmittel hergestellt werden.
  • Die gegenwärtig bevorzugten Mittel zur Reparatur von Bruchstellen in neuralen Signalwegen des peripheren Nervensystems beeinhalten die Bereitstellung des OP/BMP Morphogens und des GDNF/NGF neurotrophen Faktors zu der Stelle als Teil einer Vorrichtung, welche eine biokompatible Membran oder Ummantelung in einer Größenordnung hinreichend, um sich über die Lücke zu erstrecken und welche Öffnungen aufweist, welche der Aufnahme abgetrennter Nervenenden angepasst sind. Das OP/BMP Morphogen und der GDNF/NGF neurotrophe Faktor werden innerhalb der Umhüllung verteilt, vorzugsweise überall in einem geeigneten Träger dispergiert, und sind den abgetrennten Nervenenden zugänglich. Alternativ können das OP/BMP Morphogen und der GDNF/NGF neurotrophe Faktor an die innere Oberfläche der Umhüllung adsorbiert oder in anderer Weise damit verbunden sein. Die Umhül lung fungiert als ein Nerven-Führungskanal unterstützend die Ausrichtung des axonalen Wachstums. Geeignete Kanal- oder Umhüllungsmaterialien beinhalten Silikon oder bioresorbierbare Materialien wie beispielsweise Kollagen, Hyaluronsäure, Laminin, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polybuttersäure und dergleichen.
  • Beispiele
  • OP/BMP Morphogen und GDNF/NGF neurotropher Faktor-Svnergie
  • Die hierin beschriebenen OP/BMP Morphogen- und GDNF/NGF neurotropher Faktor-Zusammensetzungen verstärken die Ausbildung von Wirkungsprozessen in neuralen Zellen. Eine Vielzahl peripherer Ganglia, abgeleitet aus embryonalen Hühnern, wurden als Modell für die Induktion von Nervenfaser-Auswuchs durch OP-1 (Creative Biomolecules, Hopkinton, MA) in Verbindung mit GDNF (PreproTech, Rocky Hill, New Jersey), NT-3 (Austral Biologicals, San Ramon, CA), Aktivin A (Austral Biologicals, San Ramon, CA) oder Mäuse β-NGF verwendet.
  • Periphere Ganglia wurden aus embryonalen Tag 9 (E9) Hühnern nach der Methode von Ebendal et al. (Ebendal, in IBRO Handbook series: Methods in the Neurosciences Vol. 12, pp. 81-93 (1989), John Wiley, Chichester) gewonnen. Symphatische Ganglia wurde aus der Lumbalregion erhalten. Ciliar-Ganglia wurde aus der Augenhöhle gewonnen. Remak-Ganglia wurde aus dem dorsalen Mesorektum erhalten. Dorsale Wurzelganglia wurde aus der lumbosakralen Region erhalten. Nodose-Ganglia wurde aus dem zum Herzen kranialen Vagusnerve erhalten. Für einige Experimente wurde trigeminale Ganglia gewonnen und die maxillomandibularen und ophthalmischen Lappen wurden vor der Explantation getrennt. Die Ganglia wurde intakt entfernt und bei 37°C mit 5% CO2 in einer Kollagenmatrix gehalten oder wurde in einzelne Neuronen getrennt und in einem dünnen Kollagengel verteilt (Ebendal (1989), supra). In beiden Fällen wurden die Gele durch gleiche Volumen an Eagle's Basal Medium mit 1% fetalem Kalbsserum ergänzt. Kontrollkulturen bestanden aus Eagle's Basal Medium mit 1% fetalem Kalbsserum, in manchen Fällen ergänzt durch den Puffer (25 mM Arginin, 150 mM NaCl, pH 9.0, 0.1% Tween 80) in Konzentrationen in Übereinstimmung mit den experimentellen Kulturverdünnungen. Die Kulturen wurden mit dem Kontrollmedium, OP-1, NT-3, GDNF oder NGF allein behandelt oder in verschiedenen Kombinationen und in einer Serie von Konzentrationen für 2, 4 und 6 Tage behandelt.
  • Die 6-Tage Kulturen wurden mit frischem Medium, enthaltend die Wachstumsfaktoren, am vierten Tag nach Inkubation versorgt. Ganze Ganglia wurden unter Dunkelfeld-Beleuchtung untersucht, während getrennte Neuronen unter Verwendung von Phasen-Kontrastoptiken untersucht wurden. Überlebende Zellen wurden auf einem schmalen Streifen über der Platte ausgezählt, um das Überleben relativ zum Überleben der Zellen, welche mit NGF bei 5 ng/ml für zwei Tage behandelt wurden, zu berechnen.
  • Vorherige Studien haben gezeigt, dass NT-3 Faserauswachsungen in explantierter Ciliarganglia hervorruft und ebenso eine schwache Reaktion in symphatischer Ganglia des Hühnerembryos auslöst. Ernfors et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 87:5454-5458 (1990). OP-1 verstärkte außerordentlich die Faserauswachsung induziert durch NT-3-Behandlung in E9 sympathischer Ganglia. Diese Wirkungen wurden nach zwei Tagen in Kultur manifest und blieben vier Tage nach Kultur bestehen. Optimale Konzentrationen an NT-3 und OP-1 waren 10 ng/ml bzw. 50 ng/ml. Die Behandlung von Ganglia-Kulturen mit OP-1 in Kombination mit GDNF ergaben ähnliche Ergebnisse. OP-1 simulierte keinen Faserauswuchs an irgendeiner der ganz explantierten E9-Ganglia in Dosen von 0,1 ng/ml bis 1000 ng/ml. Desweiteren verfehlte OP1 die Stimulation jüngerer Ganglia (z.B. vom embryonalen Tag 4,5). Der Puffer (pH 9) verfehlte irgendeinen potenzierenden Effekt auf die NT-3 Reaktionen in sympathischer, ciliarer oder Nodoseganglia auszuüben.
  • Behandlung von Ciliarganglia mit 10 ng/ml NT-3 und 50 ng/ml OP-1 resultierte in kräftigen Faser-Lichthöfen, bestehend aus dichten Bündeln von Neuriten, welche aus der Zelle strahlten. Behandlung von Ciliarganglia mit 50 ng/ml GDNF und 50 ng/ml OP-1 ergab einen Faser-Lichthof ciliarer Nervenbündel nach zwei Tagen Kultur. In Reaktion auf NT-3 (2 ng/ml und 10 ng/ml) und GDNF (50 ng/ml) breitete Ciliarganglia weniger oder weniger robuste Nervenfasern aus, aber breitete in Reaktion auf 50 ng/ml OP-1 allein keine Neuriten aus.
  • Damit liegt die Behandlung von Neuronen mit einer Kombination aus OP-1 und NT-3 oder OP-1 und GDNF einen synergistischen Effekt von OP-1 auf NT-3 oder GDNF-induziertem Neuritenauswuchs nahe. Eine statistische Analyse zeigt ebenfalls signifikante Unterschiede im Überleben (1) im Vergleich mit der Kontrollprobe (BME oder Basal Medium Eagle's). Sowohl OP-1 als auch NT-3 sind zu Beginn der Behandlungsperiode erforderlich, um die verstärkte Nervenauswuchsreaktion in der Ciliarganglia auszulösen.
  • Sensorische Neuronen der Nodoseganglia wurden ebenfalls mit OP-1 (50 ng/ml) allein und in Kombination mit NT-3 (2 ng/ml und 10 ng/ml) oder OP-1 (50 ng/ml) in Kombination mit GDNF (50 ng/ml) behandelt. Die Behandlung sensorischer Neuronen mit OP-1 allein löste keinen Faserauswuchs aus. Jedoch verstärkte OP-1 NT-3-induzierten Neuritenauswuchs nach zwei und vier Tagen Behandlung.
  • Activin A (20 ng/ml) imitierte nicht die Wirkungen von OP-1, wenn es allein oder in Kombination mit NT-3 (10 ng/ml), GDNF (50 ng/ml) oder NGF (5 ng/ml) in der Behandlung sympathischer Ganglia getestet wurde.
  • OP-1 ist damit befähigt, NT-3- und GDNF- induzierte Bildung von Nervenwirkungsprozessen in verschiedenen Klassen peripherer Neuronen zu fördern.
  • Behandlungen für Alzheimerkrankheit
  • Die Alzheimerkrankheit ist eine neurodegenerative Krankheit, mit signifikantem neuronalen Verlust der großen pyramidalen Zellen der parietalen und frontalen Verbindungsgebiete Hippocampus und Amagdyla. Cholinerge Neuronen des basalen Vorderhirns und noradrenerge Neuronen des Locus Coeruleus sind ebenfalls stark betroffen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein OP/BMP Morphogen, bevorzugt humanes OP-1, in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor, bevorzugt GDNF oder NT-3, einem Alzheimerpatienten zu verabreichen, um das Wachstum und Überleben von Zellen in dieser Region zu fördern, ebenso wie den progressiven Verlust zusätzlicher neuronaler Zellen zu verhindern.
  • Ein wässriges pharmazeutisches Präparat, umfassend ein OP/BMP Morphogen und einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor ist dem Patienten parenteral zu verabreichen. Vorzugsweise wird das Präparat intracerebral durch beispielsweise intracerebroventrikuläre oder intrathekale Injektion oder Infusion verabreicht. In einer Ausführungsform wird die Schädelkapsel des Probanden in einer Stereotaxievorrichtung immobilisiert, eine kleine Öffnung in den Schädel geschnitten und das Präparat in die betroffenen Regionen des Hirns direkt injiziert oder infundiert. Es lassen sich Dosierungen berechnen, um Konzentrationen des OP/BMP Morphogens und des GDNF/NGF neurotrophen Faktors von ungefähr 0,1 bis 10 μg/ml, bevorzugt ungefähr 1-100 ng/ml an der Stelle der Injektion, zu erzielen. Alternativ können Dosierungen berechnet werden, um ungefähr 10-100 μg/kg des Morphogens oder des neurotrophen Faktors, bevorzugt 1-25 μg/kg zu liefern. Die Dosierungen werden täglich oder weniger häufig über eine Dauer von einigen Wochen bis Monaten oder, wenn nötig, auf einer regelmäßigen lebenslangen Basis des Probanden wiederholt. Alternativ ist eine fortwährende Freisetzungs-Vorrichtung innerhalb des Hirns des Probanden zu implantieren, um eine fortgesetzte Freisetzung des Präparates über eine ausgedehnte Zeitdauer zu verursachen.
  • Behandlungen für abgetrennte Nervenfasern
  • Durch die begrenzte Fähigkeit von Säugern, Nervenzellen zu wachsen oder zu regenerieren, führten abgetrennte Nervenfasern häufig zu permanentem Verlust der sensorischen oder der motorischen Funktion in Verbindung mit dem Nerv. Nervenfasern können durch Unfälle getrennt oder zerrissen sein (z.B. Fahrzeugunfälle) oder als unvermeidbare Nebeneffekte einer Operation.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein OP/BMP Morphogen, bevorzugt humanes OP-1, zu verabreichen in Kombination mit einem GDNF/NGF neurotrophem Faktor, bevorzugt GDNF oder NT-3 an einen getrennte Nervenfasern aufweisenden Probanden, um reparatives Wachstum und Überleben der beschädigten Zellen zu fördern.
  • Ein wässriges pharmazeutisches Präparat, umfassend ein OP/BMP Morphogen und einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor ist dem Patienten parenteral zu verabreichen. Im Falle beschädigter peripherer Nervenfasern (z.B. im Ischiasnerv), wird das Präparat vorzugsweise unter Verwendung von Nervenführungskanälen, welche die Enden der abgetrennten Fasern umschließen und ihr Zusammenwachsen führen, verabreicht. Im Falle abgetrennter Fasern im Rückenmark wird das Präparat vorzugsweise in die CSF in der Region der Verletzung injiziert oder infundiert. Es können Dosierungen berechnet werden, um Konzentrationen des OP/BMP Morphogens und GDNF/NGF neurotrophen Faktors von ungefähr 0,1-10 μg/ml, bevorzugt ungefähr 1-100 ng/ml an der Stelle der Injektion oder Infusion zu erzielen. Alternativ können Dosierungen berechnet werden, um ungefähr 10-100 μg/kg des Morphogens und neurotrophen Faktors, bevorzugt 1-25 μg/kg, zu liefern. Im Falle einer Rückenmarksverletzung werden die Dosierungen täglich oder weniger häufig über eine Dauer von Wochen bis Monaten wiederholt. Alternativ ist im Falle abgetrennter peripherer Nerven, eingeschlossen in Nervenführungskanälen eine fortwährende Freisetzungsformulierung einzusetzen, in der das Präparat einem Matrixmaterial innerhalb des Nervenführungskanals beigemischt ist.
  • Behandlungen für Schlaganfall
  • Ischämische Vorfälle oder Schlaganfälle im Gehirn können neurale Läsionen verursachen, welche in permanentem Verlust kognitiver, sensorischer oder motorischer Funktion resultieren. Unmittelbar nach Beginn eines Schlaganfalls ist das Verhindern des Todes oder der Degeneration von Zellen in der ischämischen Region ebenso wie das Fördern des Wachstums und des Überlebens dieser Zelle von Wichtigkeit zur Minimierung permanenter Beschädigung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein OP/BMP Morphogen, bevorzugt humanes OP-1, in Verbindung mit einem GDNF/NGF neurotrophen Faktor, bevorzugt GDNF oder NT-3, einem an Schlaganfall leidenden Probanden zu verabreichen.
  • Ein wässriges pharmazeutisches Präparat umfassend ein OP/BMP Morphogen und einen GDNF/NGF neurotrophen Faktor ist dem Patienten parenteral zu verabreichen. Vorzugsweise ist das Präparat intracerebral durch beispielsweise intracerebroventikuläre oder intrathekale Injektion oder Infusion zu verabreichen. Es können Dosierungen berechnet werden, um Konzentrationen des OP/BMP Morphogens und des GDNF/NGF neurotrophen Faktors von ungefähr 0,1-10 μg/ml, bevorzugt ungefähr 1-100 ng/ml an der Stelle der Injektion zu erzielen. Alternativ können Dosierungen berechnet werden, um ungefähr 10-100 μg/kg des Morphogens und neurotrophen Faktors, vorzugsweise 1-25 μg/kg, zu liefern. Die Dosierungen können kontinuierlich oder häufig über eine Dauer von einigen Tagen bis Wochen sein. Die ersten Dosierungen werden bevorzugt innerhalb der ersten Stunden des Beginns des Schlaganfalls verabreicht.

Claims (46)

  1. Verwendung a) eines Morphogens, umfassend ein dimeres Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie mit dem C-terminalen 7-Cystein-Skelett des humanen OP-1 aufweist, und b) einen neurotrophen Faktor, der ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Überlebens oder zur Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen in einem Säugetier, welches von einer neuropathischen oder einer neurodegenerativen Krankheit betroffen oder akut bedroht ist.
  2. Verwendung a) eines Morphogens, umfassend ein dimeres Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie mit dem C-terminalen 7-Cystein-Skelett des humanen OP-1 aufweist, und b) einem neurotrophen Faktor, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetieres, welches unter der Beschädigung oder Verletzung neuraler Zellen leidet.
  3. Verwendung a) eines neurotrophen Faktors, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) eines OP/BMP Morphogens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetieres in akutem Risiko der Beschädigung oder Verletzung neuraler Zellen.
  4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Beschädigung oder Verletzung ein mechanisches Trauma eines die Zellen umfassenden Gewebes umfasst.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das mechanische Trauma ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus traumatischer Hirnverletzung durch stumpfe Krafteinwirkung, traumatischer Rückenmarksverletzung durch stumpfe Krafteinwirkung, Gehirnerschütterung, Hirndruck in Folge eines Gehirnödems oder subduralen Hämatoms, gebrochener oder gequetschter Vertebra, und gerissener oder abgetrennter Nerven.
  6. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Beschädigung oder Verletzung ein chemisches Trauma eines die besagten Zellen umfassenden Gewebes umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Beschädigung oder Verletzung eine Ischämie eines die Zellen umfassenden Gewebes umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Beschädigung oder Verletzung aus einer neuropathischen Krankheit resultiert.
  9. Verwendung nach Anspruch 1 oder 8, wobei die neuropathische Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Epilepsie, progressive Muskelatrophie, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, Lähmung, Demenz, Shy-Drager-Krankheit, Wernicke-Korsakoff-Syndrom und Hallervorden-Spatz-Krankheit.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die neuralen Zellen Neuronen oder Neuroglia-Zellen umfassen.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die neuralen Zellen Nervenzellen des zentralen Nervensystems umfassen.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die neuralen Zellen Zellen des peripheren Nervensystems umfassen.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 70% Homologie mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% Homologie mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  15. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% Aminosäureidentität mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  16. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 70% Aminosäureidentität mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  17. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen mindestens die C-terminale 6- oder 7-Cystein-Domäne eines Säugetierproteins, das aus der Gruppe bestehend aus OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 und BMP9 ausgewählt ist, umfasst.
  18. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml vorliegt und der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml vorliegt.
  19. Die Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt.
  20. Die Verwendung nach Anspruch 18, wobei der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt.
  21. Die Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt und der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 1 ng/ml-100 ng/ml vorliegt.
  22. Verwendung eines a) neurotrophen Faktors, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) eines OP/BMP Morphogens zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Überlebens oder Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen in einem Säugetier, welches unter der Beschädigung oder Verletzung neuraler Säugetierzellen leidet, wobei die Zellen einen OP-BMP aktivierten Serin/Threonin-Kinase Rezeptor exprimieren und einen durch den neurotrophen Faktor aktivierten Tyrosin-Kinase Rezeptor exprimieren.
  23. Verwendung eines a) neurotrophen Faktors, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) eines OP/BMP Morphogens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, welches unter der Beschädigung oder Verletzung neuraler Säugerzellen leidet, wobei die Zellen einen OP/BMP aktivierten Serin/Threonin-Kinase Rezeptor und einen durch den neurotrophen Faktor aktivierten Tyrosin-Kinase Rezeptor exprimieren.
  24. Verwendung eines a) neurotrophen Faktors, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) eines OP/BMP Morphogens zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, welches dem akuten Risiko der Schädigung oder Verletzung neuraler Säugerzellen ausgesetzt ist, wobei die Zellen einen OP/BMP aktivierten Serin/Threonin-Kinase Rezeptor sowie einen durch den neurotrophen Faktor aktivierten Tyrosin-Kinase Rezeptor exprimieren.
  25. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der neurotrophe Faktor GDNF ist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-24, wobei der neurotrophe Faktor NT-3 ist.
  27. Ein in-vitro-Verfahren zur Förderung des Überlebens oder zur Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen, umfassend: Kontaktieren der neuralen Zellen mit einem synergistischen Präparat, umfassend: a) ein Morphogen umfassend ein dimeres Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit mindestens 70% Homologie mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, sowie b) einen neutrophen Faktor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die neuralen Zellen Neuronen oder Neuroglia-Zellen umfassen.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die neuralen Zellen neurale Zellen des zentralen Nervensystems umfassen.
  30. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die neuralen Zellen Zellen des peripheren Nervensystems umfassen.
  31. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 70% Homologie mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% Homologie mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 60% Aminosäureidentität mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Morphogen eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 70% Aminosäureidentität mit der C-terminalen 7-Cystein-Domäne von humanem OP-1 aufweist, umfasst.
  35. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Morphogen mindestens die C-terminale 6- oder 7-Cystein-Domäne eines Säugetierproteins, das aus der Gruppe bestehend aus OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 und BMP9 ausgewählt ist, umfasst.
  36. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml vorliegt und der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 0,1 ng/ml bis 10 μg/ml vorliegt.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt.
  39. Das Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Morphogen in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt und der neurotrophe Faktor in einer Konzentration von 1 ng/ml bis 100 ng/ml vorliegt.
  40. Ein in-vitro-Verfahren zur Förderung des Überlebens oder Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen, wobei die Zellen einen OP-BMP aktivierten Serin/Threonin-Kinase Rezeptor und einen GDNF- oder Neurotrophinaktivierten Tyrosin-Kinase Rezeptor exprimieren, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zellen mit einer effektiven Konzentration eines synergistischen Präparates umfasst, welches: a) einen neurotrophen Faktor, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) ein OP/BMP Morphogen umfasst.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 27-40, wobei der neurotrophe Faktor GDNF ist.
  42. Verfahren nach einem der Ansprüche 27-40, wobei der neurotrophe Faktor NT-3 ist.
  43. Ein pharmazeutisches Erzeugnis zur Förderung des Überlebens oder Verhinderung des Absterbens oder Zerfalls von neuralen Säugerzellen, umfassend: a) einen neurotrophen Faktor, der aus der Gruppe bestehend aus GDNF, NGF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5 und NT-6 ausgewählt ist, und b) ein OP/BMP Morphogen.
  44. Pharmazeutisches Erzeugnis nach Anspruch 43, wobei der neurotrophe Faktor GDNF ist.
  45. Pharmazeutisches Erzeugnis nach Anspruch 43, wobei der neurotrophe Faktor NT-3 ist.
  46. Pharmazeutisches Erzeugnis nach einem der Ansprüche 43-45, wobei das Erzeugnis weiterhin einen biokompatiblen Träger umfasst.
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