ES2288766T3 - Efectos sinergicos de morfogenes op/bmp y factores neurotroficos gdnf/ngf. - Google Patents
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Abstract
Uso de (a) un morfogén que comprende una proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de homología con el esqueleto de siete cisteínas C-terminal de OP-1 humana y (b) un factor neutrotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, NT-5 y NT-6, para la fabricación de un medicamento para promover la supervivencia de, o inhibir la muerte o la degeneración de, células neurales mamíferas en un sujeto mamífero afectado por, o con riesgo inminente de, una enfermedad neuropática o neurodegenerativa.
Description
Efectos sinérgicos de morfogenes OP/BMP y
factores neutotróficos GDNF/NGF.
La presente invención se refiere generalmente a
preparaciones para el tratamiento de sujetos mamíferos afectados
por, o con riesgo inminente de, daño o lesión a tejidos,
particularmente tejidos neurales, que expresan receptores para
morfogenes OP/BMP y factores neurotróficos GDNF/NGF.
Durante el desarrollo del sistema nervioso
mamífero, neuronas que se diferencian procedentes de los sistemas
nerviosos central y periférico emiten axones que deben crecer y
tomar contacto con células diana específicas. En algunos casos, las
neuronas permanecen confinadas totalmente dentro del sistema
nervioso central. Sin embargo, en otros casos, los axones en
crecimiento deben cubrir enormes distancias, extendiéndose desde el
SNC hacia la periferia del cuerpo. En mamíferos, esta fase de
neurogénesis se completa durante la fase de vida embrionaria y se
cree que las células neuronales no se multiplican una vez que se han
diferenciado completamente.
El crecimiento dendrítico se produce en dos
fases: extensión inicial seguida por elongación y ramificación.
Purves y otros, Nature 336: 123-128 (1988).
Se ha observado que algunas moléculas, incluyendo neurotransmisores
y hormonas, regulan la expansión de un árbol dendrítico existente.
Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de los factores que
influyen en los episodios iniciales y hacen que una neurona forme
inicialmente dendritas. En ciertas clases de neuronas, el brote
dendrítico inicial se produce como parte de un programa de
desarrollo intrínseco que es relativamente independiente de
interacciones tróficas. Dotti y otros, J. Neurosci. 8:
1454-1468 (1988). Sin embargo, en otras clases de
neuronas, la regulación de las fases iniciales de crecimiento
dendrítico parece ser bastante diferente. Por ejemplo, las neuronas
simpáticas de rata no forman dendritas y extienden solo axones
cuando se cultivan en ausencia de células no neuronales. En
contraste, el cocultivo con células de Schwann o astrocitos hace
que estas neuronas formen apéndices dendríticos y generen finalmente
un árbol dendrítico que es comparable en tamaño al observado in
situ. Tropea y otros, Glia 1: 380-392
(1988). Así, parece que se requerirían interacciones tróficas
específicas para permitir que las neuronas simpáticas formen
dendritas.
Las observaciones precedentes se han tomado para
apoyar una teoría de que el ambiente in situ especifica la
formación de un árbol dendrítico. Se cree que el ambiente en la
vecindad de las células neurales o los apéndices neurales en
desarrollo incluye campos o gradientes electromagnéticos,
electroquímicos y/o bioquímicos que influyen positivamente y
negativamente en la extensión y la especificidad de la emergencia
dendrítica así como la formación de sinapsis entre dendritas y
cuerpos y axones de células nerviosas. Sin embargo, esta teoría
sufre de escasez de mediadores identificados que tengan la capacidad
de hacer que las neuronas hagan brotar dendritas.
Se ha identificado una multitud de neuropatías,
algunas de las cuales afectan solo a una subpoblación o un sistema
de neuronas en los sistemas nerviosos periférico o central. Las
neuropatías, que pueden afectar a las propias neuronas o las
células gliales asociadas, pueden resultar de disfunción metabólica
celular, infección, exposición a agentes tóxicos, disfunción por
autoinmunidad; malnutrición o isquemia. En algunos casos, se cree
que la disfunción celular induce a la muerte celular directamente
mediante apoptosis. Oppenheim, Ann Rev. Neurosci. 14:
37-43 (1991). En otros casos, la neuropatía puede
inducir necrosis tisular al estimular al sistema inmunitario del
cuerpo, dando como resultado una respuesta inflamatoria local y
lisis celular en la zona inicial de lesión
neural.
neural.
La capacidad de las neuronas dentro del sistema
nervioso periférico para regenerar una ruta neural dañada es
limitada. Específicamente, nuevos axones y dendritas se extienden
aleatoriamente y a menudo mal dirigidos, entrando en contacto con
dianas inapropiadas, lo que puede provocar una función anormal.
Además, cuando los apéndices nerviosos seccionados dan como
resultado un hueco de más de unos pocos milímetros, por ejemplo más
de 10 milímetros (mm), no se produce la regeneración nerviosa
apropiada, bien debido a que los apéndices no crecen la distancia
necesaria o bien debido a un crecimiento axonal mal dirigido. Los
esfuerzos para reparar el daño nervioso periférico por medios
quirúrgicos se han encontrado con resultados variados,
particularmente cuando el daño se extiende a lo largo de una
distancia significativa. En algunos casos, las etapas de sutura
usadas para obtener un alineamiento apropiado de extremos nerviosos
seccionados estimulan la formación de tejido cicatrizal que se cree
que inhibe la regeneración de axones. Incluso cuando se ha reducido
la formación de tejido cicatrizal, como con el uso de canales de
guía del nervio u otras prótesis tubulares, la regeneración
satisfactoria generalmente todavía está limitada a un daño nervioso
de menos de 10 milímetros de distancia.
Está ahora bien establecido que diversos
factores tróficos representan un papel crítico al regular la
supervivencia y la diferenciación de neuronas en desarrollo. Snider
y otros, Ann. Neurol. 26: 489-506 (1989). La
mayoría de las acciones caracterizadas de los factores tróficos
nerviosos se refiere a episodios de desarrollo y sugiere que la
regulación temporal y local de la expresión de estas proteínas
representa un papel durante la maduración del sistema nervioso. Los
factores tróficos nerviosos también son importantes en la función
del sistema nervioso del adulto para el mantenimiento de la
integridad estructural y la regulación de la plasticidad. Tales
procesos se alteran en enfermedades neurodegenerativas y episodios
neurodegenerativos que siguen a una lesión aguda en el sistema
nervioso. Esto ha disparado la especulación de que los factores
tróficos nerviosos están implicados en las alteraciones
estructurales que se producen en respuesta a la lesión y la
enfermedad.
Se ha observado que varios factores tróficos
bien caracterizados potencian la supervivencia y la diferenciación
de neuronas dopaminérgicas en cultivo tisular y/o después del
trasplante a la cámara anterior del ojo. Estos factores tróficos
incluyen factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de
crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante \alpha
(TGF-\alpha) y factor neurotrófico derivado de
células gliales (GDNF), así como varias neurotrofinas relacionadas
con factor de crecimiento nervioso
(NGF).
(NGF).
Los factores tróficos nerviosos se encuentran
entre varias superfamilias proteínicas de factores de crecimiento
polipeptídicos basándose en su homología de secuencia de aminoácidos
y/o su estructura tridimensional. MacDonald y otros, Cell
73: 421-424 (1993). Una familia de factores
neurotróficos es la familia de las neurotrofinas. Esta familia
consiste actualmente en factor de crecimiento nervioso (NGF), factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF),
neurotrofina-3 (NT-3),
neurotrofina-4/5 (NT-4/5) y
neurotrofina-6 (NT-6). Estos
factores neurotróficos afectan a poblaciones neuronales específicas
del sistema nervioso central. La pérdida de tales factores
neurotróficos específicos puede ser responsable de deterioros
relacionados con la edad en la supervivencia y/o la función de las
células. Aunque la fuente celular sigue sin estar clara, existe una
evidencia para sugerir que las neuronas y las células gliales son
ambas capaces de secretar factores neurotróficos.
Las proteínas proteína osteogénica/proteína
morfogénética ósea (OP/BMP) forman una familia, o subfamilia,
dentro de la superfamilia TGF-\beta mayor de
proteínas. Esto es, estas proteínas forman un subgrupo diferente,
denominado en la presente memoria "familia OP/BMP de
morfogenes" o "morfogenes OP/BMP", dentro del agrupamiento
evolutivo libre de proteínas relacionadas con la secuencia conocidas
como la superfamilia TGF-\beta. Miembros de esta
familia de proteínas comprenden polipéptidos secretados que
comparten características estructurales comunes y que se procesan
de forma similar a partir de una proproteína para dar una proteína
madura carboxiterminal. Los morfogenes OP/BMP se han identificado
en el tejido del cerebro y la médula espinal de ratas en desarrollo
y adultas, según se determina tanto mediante hibridación por
transferencia Northern de sondas específicas para el morfogén a
extractos de mRNA procedentes de tejido nervioso en desarrollo y
adulto como mediante estudios de inmunolocalización. Por ejemplo,
el análisis por transferencia Northern de tejido de rata en
desarrollo ha identificado expresión significativa del transcrito
de mRNA de OP-1 en el SNC. El mRNA de otro miembro
de la familia OP/BMP, GDF-1, parece expresarse
principalmente en tejido nervioso en desarrollo y adulto,
específicamente en el cerebro, incluyendo el cerebelo y el tallo
encefálico, la médula espinal y los nervios periféricos. También se
ha presentado que los transcritos de BMP4 (también denominada BMP2B)
y Vgr-1 se expresan en tejido nervioso.
Se encontró que el morfogén OP-1
estaba localizado predominantemente en la matriz extracelular de la
materia gris (cuerpos de células neuronales), presente claramente
en todas las áreas excepto los propios cuerpos celulares. En la
materia blanca, formada principalmente por fibras nerviosas
mielinizadas, la tinción parece estar confinada a los astrocitos
(células gliales). Un patrón de tinción similar también se observó
en secciones cerebrales de rata recién nacida (10 días de
edad).
Además, OP-1 se ha localizado
específicamente en la sustancia negra, que está comprendida
principalmente por ganglios basales estriados, un sistema de
neuronas motrices accesorias cuya función está asociada con la
corteza cerebral y el sistema corticoespinal. Las disfunciones en
esta subpoblación o sistema de neuronas están asociadas con un
número de neuropatías, incluyendo corea de Huntington y enfermedad
de Parkinson. El efecto combinado de OP-1 y NGF
sobre la diferenciación morfológica de ciertas células neuronales se
describe en Neuron, 15, 597-605 (1998) y
Int. J. of Developmental Neuroscience, 14,
203-215 (1996).
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de que los morfogenes OP/BMP en combinación con
factores neurotróficos GDNF/NGF muestran un efecto sinérgico al
promover la supervivencia o el crecimiento, o inhibir la muerte o
degeneración, de células mamíferas, particularmente células
neurales, que expresan protectores de treonina quinasa activados
por OP/BMP y receptores de tirosina quinasa activados por GDNF/NGF.
Basándose en este descubrimiento, la presente invención proporciona
nuevas preparaciones farmacéuticas para el tratamiento in
vivo e in vitro de tales células, incluyendo tratamientos
in vivo para mamíferos afectados por, o con un riesgo
inminente de, daño o lesión a tales células.
Así, en un aspecto, la presente invención
proporciona el uso de (a) un morfogén que comprende una proteína
dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de
homología con el esqueleto de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana y (b) un
factor neurotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF,
NGF, BDNF, NT-3, NT-4,
NT-5 y NT-6, para la fabricación de
un medicamento para promover la supervivencia de, o inhibir la
muerte o la degeneración de, células neurales mamíferas en un sujeto
mamífero afectado por, o con riesgo inminente de, una neuropatía o
una enfermedad neurodegenerativa.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona el uso de (a) un morfogén que comprende una proteína
dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de
homología con el esqueleto de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana y (b) un
factor neurotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF,
NGF, BDNF, NT-3, NT-4,
NT-5 y NT-6, para la fabricación de
un medicamento para tratar a un sujeto mamífero afectado por daño o
lesión a células neurales.
En un tercer aspecto, la presente invención
proporciona el uso de (a) un factor neurotrófico seleccionado del
grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF, NT-3,
NT-4, NT-5 y NT-6 y
(b) un morfogén OP/BMP, para la fabricación de un medicamento para
tratar a un sujeto mamífero con riesgo inminente de daño o lesión a
células neurales.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona preparaciones para promover la supervivencia o el
crecimiento de células mamíferas, particularmente células neurales,
que comprende un factor neurotrófico GDNF/NGF y un morfogén OP/BMP.
De forma similar, la presente invención proporciona preparaciones
para inhibir la muerte o la degeneración de células mamíferas,
particularmente células neurales, que comprende un factor
neurotrófico GDNF/NGF y un morfogén OP/BMP. Tales preparaciones
pueden emplearse in vitro (por ejemplo, para cultivos
celulares mejorados) o in vivo (por ejemplo, para tratar
estados que afectan a tales células en un sujeto mamífero).
En otro aspecto, la presente invención
proporciona específicamente preparaciones para tratar a un sujeto
mamífero afectado por, o con riesgo inminente de, daño a lesión a
células, particularmente células neurales, que comprende un factor
neurotrófico GDNF/NGF y un morfogén OP/BMP. Estas preparaciones
pueden aplicarse bien a neuronas o bien a células neurogliales, y a
células del sistema nervioso bien central o bien periférico.
Las preparaciones de la presente invención son
particularmente adecuadas para el tratamiento de células que se han
dañado o lesionado, o tienen riesgo inminente de daño o lesión,
debido a traumas mecánicos tales como lesión cerebral traumática
por fuerza roma, lesión traumática de la médula espinal por fuerza
roma, concusión, presión intracraneal debida a edema cerebral o
hematoma subdural, vértebras rotas o aplastadas y nervios rasgados
o seccionados; traumas químicos tales como los que surgen de
exposición a neurotoxinas o los efectos secundarios de
quimioterapias; lesiones isquémicas tales como las que surgen de
apoplejía, ataque o fallo cardíaco; y daño o lesión neuropático o
neurodegenerativo tales como los que surgen de enfermedades
neuropáticas incluyendo enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer,
epilepsia, atrofia muscular progresiva, enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth, parálisis,
demencia, enfermedad de Shy-Drager, síndrome de
Wernicke-Korsakoff y enfermedad de
Hallervorden-Spatz.
En realizaciones preferidas, los morfogenes
OP/BMP de la presente invención comprenden polipéptidos que tienen
secuencias de aminoácidos con al menos 70% de homología, más
preferiblemente 80% de homología, con el dominio de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana. En
realizaciones particularmente preferidas, los morfogenes OP/BMP
comprenden polipéptidos que tienen al menos 60% de identidad de
aminoácidos, más preferiblemente al menos 70% de identidad, con el
dominio de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana. En las realizaciones más preferidas,
el morfogén OP/BMP comprende al menos el dominio de seis o siete
cisteínas C-terminal de una proteína
OP-1, OP-2, OP-3,
BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 o BMP9 mamífera, preferiblemente
humana. Preferiblemente, los morfogenes OP/BMP de la presente
invención son capaces de inducir osteogénesis en el ensayo del hueso
ectópico de Reddi-Sampath.
En realizaciones preferidas, los factores
neurotróficos GDNF/NGF de la presente invención comprenden al menos
la forma funcional madura de una proteína GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 o
NT-6 mamífera, preferiblemente humana.
En realizaciones preferidas, la concentración
eficaz de la preparación comprende entre 0,1 ng/ml y 10 \mug/ml
de un morfogén OP/BMP y entre 0,1 ng/ml y 10 \mug/ml de un factor
neurotrófico GDNF/NGF, más preferiblemente entre 1 ng/ml y 100
ng/ml bien de un morfogén OP/BMP o bien de un factor neurotrófico
GDNF/NGF y, lo más preferiblemente, entre 1 ng/ml y 100 ng/ml tanto
de un morfogén OP/BMP como de un factor neurotrófico GDNF/NGF.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones para promover la supervivencia o el
crecimiento, o inhibir la muerte o la degeneración, de células
mamíferas, incluyendo células no neurales, que expresan un receptor
de serina/treonina quinasa activado por OP/BMP y un receptor de
tirosina quinasa activado por GDNF/NGF. De forma similar, la
presente invención proporciona preparaciones para tratar a un sujeto
mamífero afectado por daño o lesión a células, o con riesgo
inminente de daño o lesión a células, incluyendo células no
neurales, que expresan un receptor de serina/treonina quinasa
activado por OP/BMP y un receptor de tirosina quinasa activado por
GDNF/NGF. Estas preparaciones también comprenden un factor
neurotrófico GDNF/NGF y un morfogén OP/BMP, según se describe
anteriormente.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones farmacéuticas para promover la
supervivencia o el crecimiento de células mamíferas, o inhibir la
muerte o la degeneración de células mamíferas, particularmente
células neurales, que comprenden un factor neurotrófico GDNF/NGF en
combinación con un morfogén OP/BMP.
La Fig. 1 es un gráfico de barras que muestra la
supervivencia de neuronas simpáticas disociadas que crecen en geles
de colágeno después de 2 ó 6 días de tratamiento con
NT-3 (2 ng/ml) o GDNF (50 ng/ml), en presencia o
ausencia de OP-1.
La presente invención proporciona nuevas
preparaciones para el tratamiento de sujetos mamíferos afectados
por, o con riesgo inminente de, daño o lesión a tejidos,
particularmente tejidos neurales, que comprenden un morfogén OP/BMP
y un factor neurotrófico GDNF/NGF. Sorprendentemente, se ha
demostrado que la administración de estos agentes en combinación
tiene un efecto sinérgico al promover la supervivencia y/o el
crecimiento de tejidos neurales y al inhibir la muerte o la
degeneración de tejidos neurales.
Sin querer limitarse a ninguna teoría particular
de la invención, se cree que los morfogenes OP/BPM y los factores
neurotróficos GDNF/NGF ejercen un efecto sinérgico al promover la
supervivencia y/o el crecimiento de tejidos neurales y al inhibir
la muerte o la degeneración de tejidos neurales, al actuar a través
de rutas de señalización basadas en receptores separadas. En
particular, se cree que las proteínas OP/BMP actúan a través de
receptores de serina/treonina quinasa y que los factores
neurotróficos GDNF/NGF de la invención actúan a través de
receptores de tirosina quinasa, tal que, cuando un morfogén OP/BMP y
un factor neurotrófico GDNF/NGF se administran en combinación, las
rutas de transducción de señal tanto de serina/treonina quinasa
como de tirosina quinasa se activan y se produce un efecto
sinérgico.
Así, se ha mostrado que los morfogenes OP/BMP
actúan a través de receptores de serina/treonina quinasa, y se ha
observado que estos receptores se expresan en tejidos de los
sistemas nerviosos tanto periférico como central. Por ejemplo, se
ha mostrado mediante hibridación in situ que varias clases de
neuronas periféricas expresan receptores de serina/treonina quinasa
de BMP tipo II que se sabe que se unen a la familia de morfogenes
OP/BMP (Liu y otros, Mol. Cell. Biol. 15:
3479-3486 (1995); Rosenzweig y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 92: 7632-7636 (1995)) y que
ambos receptores de serina/treonina de OP/BMP tipo I y tipo II se
expresan en el SNC. Söderström y otros, Cell Tiss. Res. 286:
269-279 (1996a); Nosrat y otros, Cell Tiss.
Res. 286: 191-207 (1996).
De forma similar, se ha mostrado que los
factores neurotróficos GDNF/NGF actúan a través de receptores de
tirosina quinasa específicos que se expresan en tejidos neurales.
Así, por ejemplo, se ha mostrado que la ruta de señalización de
GDNF implica la activación del receptor de tirosina quinasa Ret
(Trupp y otros, Nature 381: 785-789 (1996)),
que se expresa en tejidos neurales incluyendo ganglios simpáticos,
nodosos y ciliares. De forma similar, NT-3 actúa a
través del receptor TrkC y, en alguna extensión, a través del
receptor TrkA. Véase, por ejemplo, Ebendal, J. Neurosci.
Res. 32: 461-470 (1992). Estos receptores se
expresan en el cerebro y la médula espinal así como en neuronas
periféricas. Véase, por ejemplo, Vázquez y Ebendal, Neuro
Report 2: 593-596 (1991); Pei y Ebendal, Exp.
Neurol. 132: 105-115 (1995); Söderström y otros,
Dev. Brain Res. 85: 96-108 (1995); Hallböök
y otros, Int. J. Dev. Biol. 39:
855-868
(1995); Williams y Ebendal, Neuro Report 6: 2277-2282 (1995); Williams y otros, Eur. J. Neurosci. 7: 116-128 (1995).
(1995); Williams y Ebendal, Neuro Report 6: 2277-2282 (1995); Williams y otros, Eur. J. Neurosci. 7: 116-128 (1995).
Así, en un aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones para promover la supervivencia y/o el
crecimiento de tejidos neurales, o para inhibir la muerte o la
degeneración de tejidos neurales, que comprenden un morfogén OP/BMP
y un factor neurotrófico GDNF/NGF en combinación, activando de ese
modo tanto la ruta de serina/treonina quinasa activada por OP/BMP
como la ruta de tirosina quinasa activada por GDNF/NT.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de
tejidos no neurales. En particular, existe una variedad de tejidos
no neurales que expresan receptores de serina/treonina quinasa
activados por OP/BMP y receptores de tirosina quinasa activados por
GDNF, incluyendo tejido renal y muchos carcinomas papilares
tiroideos (véase, por ejemplo, Schuchardt y otros, Nature
367: 380-383 (1994); Pachnis y otros,
Development 119: 1005-1017 (1993)). Por lo
tanto, la presente invención también proporciona preparaciones para
promover la supervivencia y/o el crecimiento de tales tejidos no
neurales, o para inhibir la muerte o la degeneración de tales
tejidos no neurales, que comprende un morfogén OP/BMP y un factor
neurotrófico GDNF/NGF en combinación, activando de ese modo tanto
la ruta de serina/treonina quinasa activada por OP/BMP como la ruta
de tirosina quinasa activada por GDNF/NT.
Los morfogenes OP/BMP de la presente invención
son proteínas presentes en la naturaleza, o variantes funcionales
de proteínas presentes en la naturaleza, de la familia de proteína
osteogénica/proteína morfogénética ósea (OP/BMP) dentro de la
superfamilia TGF-\beta de proteínas. Esto es,
estas proteínas forman un subgrupo diferente, denominado en la
presente memoria los "morfogenes OP/BMP", dentro del
agrupamiento evolutivo libre de proteínas relacionadas con la
secuencia conocidas como la superfamilia
TGF-\beta. Miembros de esta familia de proteínas
comprenden polipéptidos secretados que comparten características
estructurales comunes y que se procesan de forma similar a partir
de una proproteína para dar una proteína madura carboxiterminal.
Dentro de la proteína madura, todos los miembros comparten un
patrón conservado de seis o siete residuos de cisteína que definen
un dominio de 97-106 aminoácidos, y la forma activa
de estas proteínas es bien un homodímero unido por disulfuro de un
solo miembro de la familia o bien un heterodímero de dos miembros
diferentes. Véanse, por ejemplo, Massague, Annu. Rev. Cell
Biol. 6:597 (1990); Sampath y otros, J. Biol. Chem.
265:13198 (1990). Por ejemplo, en su forma nativa madura, la
OP-1 humana de fuente natural es un dímero
glicosilado que tiene típicamente un peso molecular aparente de
aproximadamente 30-36 kDa, según se determina
mediante SDS-PAGE. Cuando se reduce, la proteína de
30 kDa da lugar a dos subunidades peptídicas glicosiladas que tienen
pesos moleculares aparentes de aproximadamente 16 kDa y 18 kDa. La
proteína no glicosilada tiene un peso molecular aparente de
aproximadamente 27 kDa. Cuando se reduce, la proteína de 27 kDa da
lugar a dos cadenas polipeptídicas no glicosiladas, que tienen pesos
moleculares de aproximadamente 14 kDa a 16 kDa.
Típicamente, las proteínas OP/BMP presentes en
la naturaleza se traducen como un precursor, que tiene una
secuencia de péptido de señal N-terminal, un dominio
"pro" y un dominio de proteína "madura". El péptido de
señal es típicamente de menos de 30 residuos y se segmenta
rápidamente durante la traducción en un sitio de segmentación que
puede predecirse usando el método de Von Heijne, Nucleic Acids
Research 14:4683-4691 (1986). El dominio
"pro" es variable tanto en secuencia como en longitud, variando
de aproximadamente 200 a más de 400 residuos. El dominio pro se
segmenta para dar el dominio C-terminal
"maduro" de aproximadamente 115-180 residuos,
que incluye el dominio C-terminal de seis o siete
cisteínas conservado de 97-106 residuos. Según se
usa en la presente memoria, la "forma pro" de un miembro de la
familia de OP/BMP incluye una proteína que comprende un par de
polipéptidos plegado, comprendiendo cada uno un dominio pro en
asociación bien covalente o bien no covalente con los dominios
maduros del polipéptido de OP/BMP. Típicamente, la forma pro de una
proteína es más soluble que la forma madura bajo condiciones
fisiológicas. La forma pro parece ser la forma primaria secretada a
partir de células mamíferas cultivadas. La "forma madura" de la
proteína incluye un dominio C-terminal maduro que
no está asociado, ni covalentemente ni no covalentemente, con el
dominio pro. Se considera que cualquier preparación de
OP-1 contiene forma madura cuando la cantidad de
dominio pro en la preparación no es mayor que 5% de la cantidad de
dominio C-terminal "maduro".
Miembros de la familia OP/BMP útiles en la
presente memoria incluyen cualquiera de las proteínas nativas
presentes en la naturaleza conocidas, incluyendo el homólogo
filogenético alélico y otras de sus variantes, ya sean de fuentes
naturales o se produzcan biosintéticamente (por ejemplo, incluyendo
"muteínas" o "proteínas mutantes"), así como nuevos
miembros activos de la familia OP/BMP de proteínas.
Secuencias particularmente útiles incluyen las
que comprenden los dominios de siete cisteínas
C-terminales de OP-1,
OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5,
BMP6, BMP8 y BMP9 mamíferas, preferiblemente humanas. Otras
proteínas útiles en la práctica de la invención incluyen formas
activas de GDF-5, GDF-6,
GDF-7, DPP, Vgl, Vgr-1, 60A,
GDF-1, GDF-3, GDF-5,
GDF-6, GDF-7, BMP10, BMP11, BMP13,
BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP o NURAL y sus variantes en la
secuencia de aminoácidos. En una realización actualmente preferida,
los morfogenes OP/BMP de la invención se seleccionan de uno
cualquiera de: OP-1, OP-2,
OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 y BMP9.
Publicaciones que describen estas secuencias,
así como sus propiedades químicas y físicas, incluyen:
OP-1 y OP-2: Patente de EE.UU. Nº
5.011.691, Patente de EE.UU. Nº 5,.66.683 y Ozkaynak y otros,
EMBO J. 9:2085-2093 (1990);
OP-3: WO94/10203; BMP2, BMP3 y BMP4: Patente de
EE.UU. Nº 5.013.649, WO91/18098, WO88/00205 y Wozney y otros,
Science 242:1528-1534 (1988); BMP5 y BMP6:
WO90/11366 y Celeste y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
87:9843-9847 (1991); Vgr-1: Lyons y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
86:4554-4558 (1989); DPP: Padgett y otros,
Nature 325:81-84 (1987); Vgl: Weeks,
Cell 51:861-867 (1987); BMP9: WO95/33830;
BMP10: WO94/26893; BMP-11: WO94/26892; BMP12:
WO95/16035; BMP-13: WO95/16035;
GDF-1: WO92/00382 y Lee y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 88:4250-4254 (1991);
GDF-8: WO94/21681; GDF-9:
WO94/15966; GDF-10: WO95/10539;
GDF-11: WO96/01845; BMP-15:
WO96/36710; MP121: WO96/01316; GDF-5
(CDMP-1, MP52): WO94/15949, WO96/14335, WO93/16099 y
Storm y otros, Nature 368:639-643 (1994);
GDF-6 (CDMP-2, BMP13): WO95/01801,
WO96/14335 y WO95/10635; GDF-7
(CDMP-3, BMP12): WO95/10802 y WO95/10635;
BMP-3b: Takao y otros, Biochem. Biophys. Res.
Comm. 219:656-662 (1996); GDF-3:
WO94/15965; 60A: Basler y otros, Cell
73:687-702 (1993) y Nº de Registro de GenBank
L12032. En otra realización, proteínas útiles incluyen constructos
biosintéticos biológicamente activos, incluyendo nuevas proteínas
biosintéticas y proteínas quiméricas diseñadas usando secuencias
procedentes de dos o más proteínas de la familia OP/BMP conocidas.
Véanse también los constructos biosintéticos descritos en la Patente
de EE.UU. Nº 5.011.691 (por ejemplo, COP-1,
COP-3, COP-4, COP-5,
COP-7 y COP-16).
En otras realizaciones preferidas, los
morfogenes OP/BMP útiles en la presente memoria incluyen proteínas
que comprenden una secuencia de aminoácidos que comparte al menos
70% de "homología" de la secuencia de aminoácidos y,
preferiblemente, 75% u 80% de homología con el domino de siete
cisteínas C-terminal presente en las formas activas
de OP-1 humana (es decir, residuos
330-431, según se muestra en el Nº ID SEC: 2 de la
Patente de EE.UU. Nº 5.266.683). En otras realizaciones preferidas,
los morfogenes OP/BMP útiles en la presente memoria incluyen
proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que comparte
al menos 60% de identidad de secuencia de aminoácidos y,
preferiblemente, 65% o 70% de identidad con el dominio de siete
cisteínas C-terminal presente en las formas activas
de OP-1 humana. Así, una posible secuencia de
aminoácidos puede alinearse con la secuencia de aminoácidos del
dominio de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana usando el método de Needleman y otros,
J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), ejecutado
convenientemente mediante programas informáticos tales como el
programa Align (DNAstar, Inc.). Como se entenderá por los expertos
en la técnica, secuencias homólogas o funcionalmente equivalentes
incluyen disposiciones funcionalmente equivalentes de los residuos
de cisteína dentro del esqueleto cisteínico conservado,
incluyendo inserciones o deleciones de aminoácidos que alteran la
disposición lineal de estas cisteínas, pero no deterioran
materialmente su relación en la estructura plegada de la proteína
dímera, incluyendo su capacidad para formar tales enlaces disulfuro
intra- o inter-catenarios que pueden ser necesarios
para la actividad biológica. Por lo tanto, los huecos internos y las
inserciones de aminoácidos en la posible secuencia se ignoran con
propósitos de calcular el nivel de homología o identidad de la
secuencia de aminoácidos entre las secuencias posible y de
referencia.
Se entiende en la presente memoria que
"homología de la secuencia de aminoácidos" incluye tanto
identidad como similitud de la secuencia de aminoácidos. Así, según
se usa en la presente memoria, un porcentaje de "homología"
entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de residuos
de aminoácido que son idénticos o similares entre las secuencias.
Residuos "similares" son "sustituciones conservativas" que
cumplen los criterios definidos para una "mutación puntual
aceptada" en Dayhoff y otros, Atlas of Protein Sequence and
Structure Vol. 5 (Supl. 3), pp. 354-352 (1978),
Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. Así, "sustituciones de
aminoácidos conservativas" son residuos que son físicamente o
funcionalmente similares a los correspondientes residuos de
referencia, teniendo similares tamaño, conformación, carga eléctrica
y/o propiedades químicas, tales como la capacidad para formar
enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Ejemplos de
sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un
aminoácido por otro con características similares, por ejemplo,
sustituciones dentro de los siguientes grupos: (a) valina, glicina;
(b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido
aspártico, ácido glutámico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina,
treonina; (g) lisina, arginina, metionina; y (h) fenilalanina,
tirosina. El término "sustitución conservativa" o "variación
conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido
en lugar de un aminoácido original no sustituido en una cadena
polipeptídica dada, con tal de que la cadena polipeptídica
sustituida resultante tenga una actividad biológica útil en la
presente invención.
Los morfogenes OP/BMP de la invención se
caracterizan por actividades biológicas que pueden ser determinadas
fácilmente por los expertos normales en la técnica. Específicamente,
un morfogén OP/BMP de la presente invención es capaz de inducir
osteogénesis en el ensayo del hueso ectópico de
Reddi-Sampath (Sampath y Reddi, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603 (1981)) o un
ensayo sustancialmente equivalente.
El ensayo del hueso ectópico de
Reddi-Sampath es bien conocido en la técnica como un
ensayo de actividad osteogénica. El ensayo, que puede realizarse
fácilmente, se describe y analiza en, por ejemplo, Sampath y Reddi,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:7599-7603
(1981); y Wozney, "Bone Morphogenetic Proteins", Progress in
Growth Factor Research 1:267-280 (1989). Muchos
ensayos equivalentes, que usan otros animales y zonas de tejido,
pueden emplearse o desarrollarse por los expertos en la técnica
para evaluar la actividad biológica de los morfogenes OP/BMP de la
presente invención. Véanse, por ejemplo, los bioensayos descritos en
la Patente de EE.UU. Nº 5.226.683.
Los morfogenes OP/BMP contemplados en la
presente memoria pueden expresarse a partir de DNA genómico o cDNA
intacto o truncado o a partir de DNAs sintéticos en células huésped
procarióticas o eucarióticas. Las proteínas dímeras pueden aislarse
del medio de cultivo y/o replegarse y dimerizarse in vitro
para formar preparaciones biológicamente activas. Los heterodímeros
pueden formarse in vitro al combinar cadenas polipeptídicas
diferentes separadas. Alternativamente, los heterodímeros pueden
formarse en una sola célula al coexpresar ácidos nucleicos que
codifican cadenas polipeptídicas diferentes separadas. Véanse, por
ejemplo, el documento WO93/09229 o la Patente de EE.UU. Nº
5.411.941, para varios protocolos ejemplares de producción de
proteínas heterodímeras recombinantes. Células huésped actualmente
preferidas incluyen, sin limitación, procariotas, incluyendo E.
coli, o ecuariotas, incluyendo una levadura tal como
Saccharomyces, células de insecto o células mamíferas, tales
como células CHO, COS o BSC. Un experto normal en la técnica
apreciará que pueden usarse ventajosamente otras células huésped.
Descripciones detalladas de las proteínas útiles en la práctica de
esta invención, incluyendo cómo elaborarlas, usarlas y probarlas
con respecto a la actividad osteogénica, se describen en numerosas
publicaciones, incluyendo las Patentes de EE.UU. Nº 5.266.683 y
5.011.691.
Los factores neurotróficos GDNF/NGF útiles en
las preparaciones de la presente invención incluyen polipéptidos,
así como variantes funcionales de polipéptidos, que comprenden al
menos la porción activa de una proteína mamífera madura
seleccionada del grupo que consiste en GDNF, BDNF, NGF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6. Cada uno de estos factores neurotróficos
GDNF/NGF preferidos se analizan separadamente a continuación.
1. GNDF. El factor neurotrófico derivado
de células gliales (GDNF) es un factor neurotrófico que pertenece
la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta
(TGF-\beta), pero no a la familia OP/BMP dentro
de la superfamilia TGF-\beta. El GDNF presenta
potentes efectos de supervivencia y promoción de la diferenciación
para neuronas dopaminérgicas en modelos animales tanto in
vitro (Lin y otros, Science 260:1130-1132
(1993)) como in vivo (Hudson y otros, Brain Res.
Bull. 36:425-432 (1995); Hoffer y otros,
Neurosci. Lett. 182:107-111 (1994). También
se ha mostrado que el GDNF tiene efectos neurotróficos para neuronas
motrices colinérgicas del tallo encefálico y la médula espinal.
Oppenheim y otros, Nature 373:344-346 (1995);
Yan y otros, Nature 373:341-344 (1995).
Descripciones de la porción activa de una proteína de GDNF mamífera
madura pueden encontrarse en, por ejemplo, Lin y otros, Science
260:1130-1132 (1993); Lin y otros, J.
Neurochem. 63:758-768 (1994) y en la
publicación PCT WO97/11965. En resumen, el GDNF se sintetiza como un
precursor y se secreta como una proteína madura que comprende 134
aminoácidos, incluyendo el dominio de siete cisteínas que
caracteriza a la superfamilia TGF-\beta de
proteínas. Una variante de 133 aminoácidos de GDNF en la que el
residuo de Met inicial se ha omitido ([Met^{-1}]GDNF) tiene
una actividad biológica sustancialmente equivalente. Véase, por
ejemplo, el documento WO97/11965. Según se usa en la presente
memoria, el término "GDNF" incluye un polipéptido que
comprende al menos la forma madura de 134 aminoácidos, así como una
variante funcional del polipéptido, tal como una variante de
sustitución de aminoácidos conservativa o la variante de 133
aminoácidos.
2. NGF. El factor de crecimiento nervioso
(NGF) es el miembro mejor caracterizado de la familia de proteínas
"neurotrofinas", otros miembros de la cual incluyen factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF),
neurotrofina-3 (NT-3),
neurotrofina-4 (NT-4),
neurotrofina-5 (NT-5) y
neurotrofina-6 (NT-6), analizadas
posteriormente. Se ha mostrado que el NGF representa un papel en la
regulación de las fases iniciales del crecimiento dendrítico, y
ayuda a promover la supervivencia, el crecimiento y/o la reparación
de neuronas colinérgicas y a mantener el fenotipo diferenciado de
neuronas colinérgicas. Por ejemplo, el NGF puede hacer que una
subpoblación de neuronas nodosas forme dendritas en cultivo (De
Koninck y otros, J. Neurosci. 13:577-585
(1993)) y puede potenciar el crecimiento de dendritas simpáticas
cuando se inyectan in situ (Snider, J. Neurosci.
8:2628-2634 (1988)). Sin embargo, el NGF solo no
apoya el crecimiento dendrítico en cultivos de neuronas simpáticas.
Bruckenstein y Higgins, Dev. Biol.
128:324-336 (1988). Además, se ha mostrado que el
NGF es eficaz al prevenir o incluso invertir la atrofia de neuronas
colinérgicas inducida en un modelo de axotomía de fimbria/fórnix
estándar de la enfermedad de Alzheimer. Véanse, por ejemplo,
Batchelor y otros, J. Comp. Neurol.
284:187-204 (1989); Hefti y otros, J.
Neurobiol. 25:1418-1435 (1994); Olson y otros,
Neurochem. J. 25:1-3 (1994). Según se usa en
la presente memoria, el término "NGF" incluye un polipéptido
que comprende al menos la forma madura, así como una variante
funcional del polipéptido, tal como una variante de sustitución de
aminoácidos conservativa.
3. BDNF. Se ha mostrado que el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), otro miembro de la familia
de proteínas neurotrofinas, potencia la captación de dopamina por
neuronas DA nigrales fetales en cultivo celular (Beck y otros,
Neurosci. 52:855-866 (1993); Knusel y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:961-969
(1991)) y protege parcialmente a las neuronas DA de los efectos
tóxicos de las neurotoxinas
N-metil-4-fenilpiridinio
y 6-hidroxidopamina (6-ODHA). Hyman
y otros, Nature 350:230-232 (1991). También
se ha mostrado que el BDNF tiene un fuerte efecto de apoyo sobre la
supervivencia de neuronas DA nigrales cultivadas. Beck y otros,
Neurosci. 52:855-866 (1993); Hyman y otros,
Nature 350:230-232 (1991); Knusel y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 88:961-965 (1991). Estos
hallazgos sugirieron que el BDNF podría tener un efecto promotor de
la supervivencia sobre neuronas DA injertadas in vivo. El
tratamiento con BDNF potencia el efecto de comportamiento de
neuronas DA nigrales injertadas hacia el cuerpo estriado agotado en
DA de ratas unilateralmente lesionadas con 6-ODHA
según se manifiesta por una reducción relativa en la renovación
inducida por anfetamina a las dos semanas después del injerto.
Sauer y otros, Brain Research 626:37-44
(1993). Sin embargo, este estudio no establecía ninguna diferencia
de corte clara entre animales tratados y de control en la extensión
de la emergencia de neuritas desde las neuronas DA injertadas. Así,
aunque la infusión con BDNF producía varios efectos de
comportamiento y morfológicos en ratas injertadas con tejido nigral
fetal, era incapaz de incrementar las tasas de supervivencia de las
células dopaminérgicas trasplantadas. Según se usa en la presente
memoria, el término "BDNF" incluye un polipéptido que
comprende al menos la forma madura, así como una variante funcional
del polipéptido, tal como un variante de sustitución de
aminoácidos
conservativa.
conservativa.
4. NT-3. Según se usa en
la presente memoria, "NT-3" significa una
proteína humana, o sus homólogos mamíferos, que tiene una secuencia
proteínica esencialmente como la publicada en Jones y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:8060-8064
(1990); Maisonpierre y otros, Genomics
10:558-568 (1991); Kaisho y otros, FEBS Lett.
266:187-191 (1990); WO 91/03569; y disponible a
través del Nº de Registro de GenBank M37763. El aislamiento y/o la
caracterización de NT-3 humana se describe en, por
ejemplo, Jones y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
87:8060-806 (1990) y Maisonpierre y otros,
Science 247:1446-1451 (1990). La secuencia de
NT-3 de ratón se describe en Hohne y otros,
Nature 344:339-341 (1990); WO 91/03569 y el
Nº de Registro de GenBank X53257. La secuencia del gen de
NT-3 de rata se describe en Ernfors y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:5454-5458
(1990); WO 91/03569 y el Nº de Registro de GenBank M34643. La
comparación del precursor de NT-3 humana con los
precursores de NT-3 de rata y ratón revela que las
formas maduras son idénticas. El gen para NT-3
humana codifica un precursor de 257 aminoácidos putativo con un
péptido de señal de 18 aminoácidos que se procesa hasta un péptido
maduro de 119 aminoácidos. RNA de NT-3 se ha
detectado en tejidos del SNC humano, incluyendo el cerebelo, el
núcleo basal, los ganglios basales, el hipocampo y la corteza
visual. Maisonpierre y otros, Genomics
10:558-568 (1991). La NT-3 humana
comparte 56% de identidad de aminoácidos con NGF humano y BDNF
humano, y comparte las 6 cisteínas conservadas con otros miembros
de la familia de neurotrofinas, estando las regiones de mayor
homología entre las tres proteínas aglomeradas alrededor de estos
residuos de cisteína. El término "NT-3", según
se usa en la presente memoria, incluye un polipéptido que comprende
al menos la forma de 119 aminoácidos madura según se describe en
Jones y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
87:8060-806 (1990), así como una variante funcional
del polipéptido, tal como una variante de sustitución de aminoácidos
conservativa.
5. NT-4. Según se usa en
la presente memoria, "NT-4" significa una
proteína humana, o sus homólogos mamíferos, que tiene una secuencia
proteínica esencialmente como la publicada en Ip y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3060-3064 (1992);
Patente de EE.UU. Nº 5.364.769; y disponible a través del Nº de
Registro del GenBank M86528. El aislamiento y/o la caracterización
de NT-4 se describe en, por ejemplo, Ip y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3060-3064
(1992); Hallböök y otros, Neuron 6:845-858
(1991); e Ibañeez y otros, Development
117:1345-1353 (1993). La secuencia del gen de
NT-4 completa codifica una proteína precursora de 27
kD de 236 aminoácidos que comprende una secuencia de péptido de
señal putativa y la región pro de aproximadamente 60 aminoácidos,
que se cree que es procesada hasta un polipéptido de
NT-4 humano maduro de 130 aminoácidos. La forma
madura de NT-4 comparte 46,5%, 55,4% y 52,2% de
identidad de secuencia con NGF, BDNF y NT-3,
respectivamente. NT-4 contiene las 6 cisteínas
conservadas de la familia de neurotrofinas, pero contiene una
inserción de 7 aminoácidos situada entre las cisteínas segunda y
tercera. Se ha demostrado que NT-4 apoya la
supervivencia de neuronas del ganglión trigeminal en el ratón
(Ibañez y otros, Development 117:1345-1353
(1993)) y los ganglios radicales dorsales en el pollo (Ip y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3060-3064
(1992)). En la rata, Se ha encontrado mRNA de NT-4
en la médula espinal y varias regiones cerebrales incluyen el
cerebelo y la corteza. El término "NT-4",
según se usa en la presente memoria, incluye un polipéptido que
comprende al menos la forma de 130 aminoácidos madura que se
describe en Ip y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
89:3060-3064 (1992), así como una variante
funcional del polipéptido, tal como una variante de sustitución de
aminoácidos conservativa.
\newpage
6. NT-5. Según se usa en
la presente memoria, el término "NT-5"
significa una proteína humana, o sus homólogos mamíferos, que tiene
una secuencia proteínica esencialmente como la descrita en
Berkemeier y otros, Neuron 7:857-866 (1991).
El aislamiento y/o la caracterización de NT-5 se
describe en, por ejemplo, Berkemeier y otros, Neuron
7:857-866 (1991) y Berkemeier y otros, Som. Cell
Mol. Genet. 18:233-245 (1992). El gen humano
para NT-5 codifica una proteína precursora de 22,4
kD de 210 aminoácidos putativa. El codón de iniciación asignado es
seguido por un sitio de segmentación de la secuencia de señal
putativa en Ser-24. La secuencia
pre-pro putativa de NT-5 es
aproximadamente 50 aminoácidos más corta que las de las otras
neurotrofinas. La homología global del precursor de
NT-5 con NT-4 de Xenopus,
NT-3 humana, BDNF y NGF humano es 52%, 45%, 47% y
41%, respectivamente. La NT-5 madura tiene 123
aminoácidos de largo y comparte las 6 cisteínas conservadas en la
familia de las neurotrofinas. NT-5 comparte 50% de
homología con NGF, 56% de homología con BDNF, 55% de homología con
NT-3 y 66% de homología con NT-4 de
Xenopus. El gen de NT-5 de rata codifica una
proteína de 209 aminoácidos que es 91% idéntica a su homólogo
humano. Berkemeier y otros, Neuron 7:857-866
(1991). Proteína de NT-5 se ha identificado en
cerero de rata adulta y actúa como un factor de supervivencia para
células sensoras de gangliones radicales dorsales y promueve la
supervivencia y la emergencia de neuritas a partir de neuronas de
gangliones simpáticos. Berkemeier y otros, Neuron
7:857-866 (1991). El término
"NT-5", según se usa en la presente memoria,
incluye un polipéptido que comprende la forma de 123 aminoácidos
madura, así como una variante funcional del polipéptido, tal como
una variante de sustitución de aminoácidos conservativa.
7. NT-6. Según se usa en
la presente memoria, "NT-6" significa una
proteína humana, o su homólogo mamífero, que tiene una secuencia
proteínica esencialmente como la descrita en Gotz y otros,
Nature 327: 266-269; WO 95/26363 (1994); y
disponible a través del Nº de Registro de GenBank L36325 y L36942.
El aislamiento y la caracterización de NT-6 se
describe en, por ejemplo, Gotz y otros, Nature
327:266-269 (1994). El precursor de
NT-6 contiene 286 aminoácidos, que tienen un dominio
hidrófobo en el extremo N (residuos 1-19)
característico de un péptido de señal, y una región pro putativa en
los residuos 20-142. La proteína madura putativa
empieza en el residuo 143. NT-6 comparte las 6
cisteínas conservadas encontradas en todas las neurotropinas, pero
contiene una inserción de 22 residuos entre dominio que contiene la
segunda y tercera cisteína conservada. El término
"NT-6", según se usa aquí, incluye un
polipéptido que comprende la forma de 119 aminoácidos madura
descrita en Gotz y otros, Nature 327:266-269
(1994), así como una variante funcional del polipéptido, tal como
una variante de sustitución de aminoácidos conservativa.
Los sujetos para el tratamiento de acuerdo con
la presente invención incluyen, sin limitación, (1) los que tienen
tejidos neurales que se han dañado, o tienen riesgo inminente de
daño, debido a traumas mecánicos tales como los que surgen de
traumas por fuerzas romas en la cabeza, edema cerebral, hematoma
subdural, vértebras rotas o aplastadas o nervios rasgados o
seccionados (incluyendo las que surgen de procedimientos
quirúrgicos); (2) los que han sufrido, o tienen riesgo inminente de
sufrir, traumas químicos en tejido nervioso que pueden surgir, por
ejemplo, de exposición a neurotoxinas (por ejemplo, plomo, etanol,
amoniaco, formaldehído, mercurio) o la administración de agentes
quimioterapéuticos con efectos secundarios neurotóxicos (por
ejemplo, cisplatino); (3) los que han sufrido, o tienen riesgo
inminente de, una lesión isquémica en tejidos neurales (por ejemplo,
apoplejía cerebral) y (4) los afectados por, o con riesgo inminente
de, una enfermedad neuropática o neurodegenerativa. Se contempla
particularmente el tratamiento de sujetos humanos diagnosticados de,
o con riesgo inminente de, una enfermedad neuropática o
neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste en esclerosis
lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular progresiva, neuropatía
motriz y sensorial hereditaria (enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth), enfermedad de
Alzheimer, epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de
Parkinson, parálisis, demencia, enfermedad de
Shy-Drager, síndrome de
Wernicke-Korsakoff y enfermedad de
Hallervorden-Spatz.
Enfermedades tales como ALS, atrofia muscular
progresiva y neuropatía motriz y sensorial hereditaria (enfermedad
de Charcot-Marie-Tooth) resultan
todas, al menos en parte, de la degeneración de neuronas motrices
que están situadas en el cuerno ventral de la médula espinal. Así,
en una realización, la presente invención proporciona métodos y
preparaciones que emplean un morfogén OP/BMP en combinación con un
factor neurotrófico GDNF/NGF para el tratamiento de estos y otros
estados que implican la pérdida de o el daño a neuronas
motrices.
El hipocampo, una estructura bien definida que
es parte de la corteza cerebral del cerebro, es importante en la
formación de la memoria a largo plazo. La degeneración de neuronas
CA1 piramidales, que están situadas en la región CA1 del hipocampo,
es una característica de la enfermedad de Alzheimer. Estas mismas
neuronas son selectivamente vulnerables a daño isquémico y anóxico
que se produce en estados tales como apoplejía y trauma de cabeza.
Además, las neuronas hipocampales piramidales CA1 así como las
neuronas piramidales situadas en la región CA3 del hipocampo son
lesionadas selectivamente en la epilepsia. Así, en una realización,
la presente invención proporciona métodos y preparaciones que
emplean un morfogén OP/BMP en combinación con un factor
neurotrófico GDNF/NGF para el tratamiento de estos y otros estados
que implican la pérdida o el daño a neuronas hipocampales.
La mayoría de las neuronas del cuerpo estriado
utilizan GABA (ácido 4-aminobutírico) como su
neurotransmisor, y pueden denominarse neuronas "GABAnérgicas".
El cuerpo estriado también es el objetivo principal de la
neurodegeneración progresiva que se produce en la enfermedad de
Huntington, en la que neuronas que utilizan GABA del cuerpo
estriado (por ejemplo, neuronas de célula espinosa y neuronas
encefalinérgicas) se atrofian y/o mueren. Así, en una realización,
la presente invención proporciona métodos y preparaciones que
emplean un morfogén OP/BMP en combinación con un factor
neurotrófico GDNF/NGF para el tratamiento de estos y otros estados
que implican la pérdida de o el daño a neuronas del cuerpo estriado
o GABAnérgicas.
Las neuronas productoras de dopamina
("dopaminérgicas" o "DA") están situadas principalmente en
la sustancia negra y, en una extensión menor, en el cuerpo estriado
adyacente (que comprende el núcleo caudado, el putamen, el globo
pálido y el locus cerúleo). Las neuronas del cuerpo estriado
expresan receptores para dopamina y son responsables del control de
la actividad motriz. Así, la degeneración de neuronas DA da como
resultado una disminución de los niveles de dopamina y una pérdida
de la actividad motriz. En particular, la degeneración progresiva
de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra puede conducir a la
ralentización de la iniciación y la ejecución del movimiento
muscular voluntario (bradiquinesia), la rigidez muscular y el
temblor que son característicos de la enfermedad de Parkinson. Así,
en una realización, la presente invención proporciona métodos y
preparaciones que emplean un morfogén OP/BMP en combinación con un
factor neurotrófico GDNF/NGF para el tratamiento de estos y otros
estados que implican la pérdida de o el daño a neuronas
dopaminérgicas, incluyendo las de la sustancia negra.
Otros estados neuropáticos en los que
poblaciones de células neurales se pierden o dañan incluyen
parálisis, demencia, enfermedad de Shy-Drager,
síndrome de Wernicke-Korsakoff y enfermedad de
Hallervorden-Spatz. Así, en otras realizaciones, la
presente invención proporciona métodos y preparaciones que emplean
un morfogén OP/BMP en combinación con un factor neurotrófico
GDNF/NGF para el tratamiento de estos y otros estados que implican
pérdida de o daño a tejidos neurales.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención incluyen al menos un morfogén OP/BMP en combinación con
al menos un factor neurotrófico GDNF/NGF. Preferiblemente, tales
preparaciones incluyen una cantidad de cada gen que es eficaz
cuando se administra por sí misma. Sin embargo, debido al efecto
sinérgico de los agentes en combinación, las preparaciones
farmacéuticas pueden contener una cantidad de cada agente que,
cuando se administrara en ausencia del otro, no sería eficaz sola.
Las determinaciones de relaciones apropiadas de los agentes está
dentro de la capacidad y la competencia de un experto normal en la
técnica para el tratamiento de un estado dado, para una combinación
dada de morfogén OP/BMP y factor neurotrófico GDNF/NGF, y una ruta
de administración dada.
Como una cuestión general, las preparaciones
farmacéuticas de la presente invención, que incluyen al menos un
morfogén OP/BMP y al menos un factor neurotrófico GDNF/NGF, pueden
probarse usando ensayos in vitro, modelos animales y
estudios clínicos. Concentraciones eficaces de las preparaciones son
aquellas suficientes para (1) provocar una emergencia de neuritas
potenciada en un ensayo in vitro de crecimiento neuronal; (2)
provocar mejora en la aptitud motriz en un modelo animal estándar
de la enfermedad de Parkinson; o (3) provocar una mejora
clínicamente significativa en la función neurológica cuando se
administran a un sujeto mamífero (por ejemplo, un paciente
humano).
Las preparaciones farmacéuticas de la presente
invención, que incluyen al menos un morfogén OP/BMP y al menos un
factor neurotrófico GDNF/NGF, pueden administrarse a un individuo
mediante cualquier medio adecuado, preferiblemente directamente
(por ejemplo, localmente, tal como mediante inyección a un
emplazamiento tisular) o sistémicamente (por ejemplo,
parenteralmente u oralmente). Cuando la preparación ha de
administrarse parenteralmente, tal como mediante administración
intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica,
intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal,
intracisternal, intraperitoneal o bucal, la preparación comprende
preferiblemente parte de una solución acuosa. La solución se elige
para que sea fisiológicamente aceptable, tal que, además del aporte
del morfogén OP/BMP y el factor neurotrófico GDNF/NGF deseados al
paciente, la solución no afecte adversamente de otro modo al
equilibrio electrolítico y volumétrico del paciente.
Soluciones útiles para administración parenteral
pueden prepararse mediante una variedad de métodos bien conocidos
en las técnicas farmacéuticas. Véase, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences. Gennaro, A., ed., Mack Pub., (1990).
Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles
tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos
hidrogenados y similares. Las formulaciones para administración
directa, en particular, pueden incluir glicerol y otras
preparaciones de alta viscosidad. Polímeros biocompatibles,
preferiblemente biorreabsorbibles, incluyendo, por ejemplo, ácido
hialurónico, colágeno, polibutirato, fosfato tricálcico, láctico y
copolímeros de láctido/glicólido, pueden ser excipientes útiles para
controlar la liberación de la preparación in vivo. Otros
sistemas de aporte parenteral potencialmente útiles para estas
preparaciones incluyen partículas de copolímero de
etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas,
sistemas de infusión implantables y liposomas.
Como se apreciará por los expertos en la
técnica, las cantidades y/o las concentraciones de los agentes
presentes en una preparación farmacéutica variarán dependiendo de
un número de factores, incluyendo la dosificación del fármaco que
ha de administrarse, las características químicas (por ejemplo,
hidrofobia) de los agentes empleados y la ruta de administración.
La dosificación preferida también puede depender de variables tales
como el tipo y la extensión del daño o la lesión que ha de tratarse,
el estado de salud global del sujeto, la eficacia biológica
relativa de los agentes empleados, la presencia de excipientes o
diluyentes, y similares.
Como una cuestión general, las preparaciones
farmacéuticas de la presente invención se administran en cantidades
suficientes para alcanzar concentraciones eficaces del morfogén
OP/BMP y el factor neurotrófico GDNF en una zona de daño o lesión
tisular neural, o en una zona de riesgo inminente de tal lesión.
Preferiblemente, las preparaciones contienen una cantidad de un
morfogén OP/BMP tal que, cuando se administra mediante la ruta de
administración elegida, da como resultado una concentración del
morfogén OP/BMP de 0,1 ng/ml a 10 \mug/ml, más preferiblemente 1
ng/ml a 100 ng/ml. De forma similar, las preparaciones contienen
preferiblemente una cantidad de un factor neurotrófico GDNF/NGF tal
que, cuando se administra mediante la ruta de administración
elegida, da como resultado una concentración del factor neurotrófico
GDNF/NGF de 0,1 ng/ml a 10 \mug/ml, más preferiblemente 1 ng/ml a
100 ng/ml. Debido a las interacciones sinérgicas de los morfogenes
OP/BMP y los factores neurotróficos GDNF/NGF, las concentraciones y
las relaciones óptimas variarán dependiendo de los agentes
particulares empleados.
Cuando la lesión a neuronas de una ruta neural
está inducida deliberadamente como parte de, por ejemplo, un
procedimiento quirúrgico, el morfogén OP/BMP y el factor
neurotrófico GDNF/NGF preferiblemente se proporcionan justo antes
de o concomitantemente con la inducción del trauma. Preferiblemente,
el morfogén y el factor neurotrófico se administran
profilácticamente en un entorno quirúrgico.
Cuando el morfogén OP/BMP y el factor
neurotrófico han de proporcionarse a una zona para estimular la
regeneración de axones, la preparación farmacéutica se proporciona
preferiblemente a la zona en asociación con un portador
biocompatible, preferiblemente biorreabsorbible, adecuado para
mantener las proteínas en la zona in vivo, y a través del
cual puede regenerarse un apéndice neural. Un portador preferido
actualmente también comprende una estructura suficiente para ayudar
a la dirección del crecimiento axonal. Portadores actualmente
preferidos incluyen moléculas estructurales tales como colágeno,
ácido hialurónico o laminina, y/o polímeros o copolímeros
sintéticos de, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido
glicólico) o poli(ácido butírico). Actualmente, los más preferidos
son portadores que comprenden matriz extracelular tisular. Estos
pueden obtenerse comercialmente. Además, una matriz extracelular
derivada de tejido cerebral puede prepararse como se describe en la
Publicación PCT WO92/15323 y/o mediante otros medios conocidos en
la técnica.
Los medios actualmente preferidos para reparar
roturas en rutas neurales, particularmente rutas del sistema
nervioso periférico, incluyen proporcionar el morfogén OP/BMP y el
factor neurotrófico GDNF/NGF a la zona como parte de un dispositivo
que induce una membrana o envuelta biocompatible de una dimensión
suficiente para cubrir la rotura y que tiene aberturas adaptadas
para recibir extremos nerviosos seccionados. El morfogén OP/BMP y
el factor neurotrófico GDNF/NGF se disponen dentro de la envuelta,
preferiblemente dispersados a través de un portador adecuado, y son
accesibles a los extremos del nervio seccionados. Alternativamente,
el morfogén OP/BMP y el factor neurotrófico GDNF/NGF pueden
adsorberse sobre la superficie interior de la envuelta, o asociarse
de otro modo con ella. La envuelta actúa como un canal de guía del
nervio, ayudando a dirigir el crecimiento axonal. Materiales de
canal o envuelta adecuados incluyen silicona o materiales
biorreabsorbibles tales como colágeno, ácido hialurónico, laminina,
poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido butírico) y
similares.
Las composiciones de morfogén OP/BMP y factor
neurotrófico GDNF/NGF descritas en la presente memoria potencian la
formación de apéndices en células neurales. Se usó una variedad de
ganglios periféricos derivados de pollos embrionarios como un
modelo para la inducción de la emergencia de fibras nerviosas
mediante OP-1 (Creative Biomolecules, Hopkinton,
MA) en combinación con GDNF (PeproTech, Rocky Hill, New Jersey),
NT-3 (Austral Biologicals, San Ramon, CA), activina
A (Austral Biologicals, San Ramon, CA) o \beta-NGF
de ratón.
Se obtuvieron ganglios periféricos de pollos
embrionarios de 9 días (E9) de acuerdo con el método de Ebendal y
otros (Ebendal, en IBRO Handbook series: Methods in the
Neurosciences Vol. 12, pp. 81-93 (1989), John
Wiley, Chichester). Se obtuvieron ganglios simpáticos de la región
lumbar. Se obtuvieron ganglios ciliares de la órbita. Se obtuvieron
ganglios de Remak del mesorrecto dorsal. Se obtuvieron ganglios
radicales dorsales de la región lumbosacra. Se obtuvieron ganglios
nodosos del nervio vago craneal hacia el corazón. Para algunos
experimentos, se obtuvieron ganglios trigeminales y los lóbulos
maxilomandibular y oftálmico se separaron antes del explante. Los
ganglios se extirparon intactos y se mantuvieron a 37ºC con CO_{2}
al 5% en una matriz de colágeno o se disociaron en neuronas simples
y se extendieron en un gel de colágeno delgado (Ebendal (1989),
anteriormente). En ambos casos, los geles se complementaron con
volúmenes iguales de medio basal de Eagle con suero de ternero
fetal al 1%. Los cultivos de control consistían en medio basal de
Eagle con suero de ternero fetal al 1%, en algunos casos
complementado con el tampón (arginina 25 mM, NaCl 150 mM, pH 9,0,
Tween 80 al 0,1%) a concentraciones para ajustarse a las condiciones
de cultivo experimentales. Los cultivos se trataron con medio de
control, OP-1, NT-3, GDNF o NGF
solos, o en diversas combinaciones y en una serie de
concentraciones durante 2, 4 y 6 días.
Los cultivos de 6 días se alimentaron con medio
reciente que contenía los factores de crecimiento el día 4 después
de la incubación. Los ganglios enteros se examinaron bajo
iluminación de campo oscuro mientras que las neuronas disociadas se
examinaron usando óptica de contraste de fases. Las células
supervivientes se contaron en una tira a través de la placa para
calcular la supervivencia relativa a la supervivencia de células
tratadas con NGF en 5 ng/ml durante 2 días.
Estudios previos han mostrado que
NT-3 provoca emergencia de fibras en ganglios
ciliares explantados y también provoca una respuesta débil en
ganglios simpáticos del embrión de pollo. Ernfors y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 87:5454-5458 (1990).
OP-1 potencia mucho la emergencia de fibras inducida
por tratamiento con NT-3 en ganglios simpáticos E9.
Los efectos eran evidentes después de 2 días en cultivo y persistían
después de 4 días de cultivo. Las concentraciones óptimas de
NT-3 y OP-1 eran 10 ng/ml y 50
ng/ml, respectivamente. El tratamiento de cultivos de ganglios con
OP-1 en combinación con GDNF daba resultados
similares. OP-1 no estimulaba la emergencia de
fibras de ninguno de los ganglios E9 explantados totales a dosis de
0,1 ng/ml a 1000 ng/ml. Además, OP-1 tampoco
estimulaba ganglios más jóvenes (por ejemplo, procedentes del día
embrionario 4, 5). El tampón (pH 9) no ejercía ningún efecto
potenciador sobre las respuestas de NT-3 en ganglios
simpáticos, ciliares o nodosos.
El tratamiento de ganglios ciliares con 10 ng/ml
de NT-3 y 50 ng/ml de OP-1 daba como
resultado halos fibrosos robustos que consistían en manojos gruesos
de neuritas que radiaban desde la célula. El tratamiento de ganglios
ciliares con 50 ng/ml de GDNF y 50 ng/ml de OP-1
daba un halo fibroso de manojos de nervios ciliares después de 2
días de cultivo. Los ganglios ciliares extendían menos fibras
nerviosas o fibras nerviosas menos robustas en respuesta a
NT-3 (2 ng/ml y 10 ng/ml) y GDNF (50 ng/ml) pero no
extendían neuritas en respuesta a 50 ng/ml de OP-1
sola.
Así, el tratamiento de neuronas con una
combinación de OP-1 y NT-3, u
OP-1 y GDNF, sugería un efecto sinérgico de
OP-1 sobre la emergencia de neuritas inducida por
NT-3 o GDNF. Un análisis estadístico también muestra
que las diferencias en la supervivencia son significativas (Figura
1) en comparación con el control (BME o medio basal, Eagle). Tanto
OP-1 como NT-3 se requieren desde el
principio del período de tratamiento para provocar la respuesta de
emergencia nerviosa potenciada en los ganglios ciliares.
Neuronas sensoras de los ganglios nodosos
también se trataron con OP-1 (50 ng/ml) sola y en
combinación con NT-3 (2 ng/ml y 10 ng/ml) u
OP-1 (50 ng/ml) en combinación con GDNF (50 ng/ml).
El tratamiento de las neuronas sensoras con OP-1
sola no provocaba emergencia de fibras. Sin embargo,
OP-1 potenciaba la emergencia de neuritas inducida
por NT-3 después de 2 y 4 días de tratamiento.
La activina A (20 ng/ml) no imitaba los efectos
de OP-1 cuando se probaba sola o en combinación con
NT-3 (10 ng/ml), GDNF (50 ng/ml) o NGF (5 ng/ml) en
el tratamiento de los ganglios simpáticos.
Por lo tanto, OP-1 es capaz de
promover la formación de apéndices nerviosos inducida por
NT-3 y GDNF en varias clases de neuronas
periféricas.
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad
neurodegenerativa en la que existe pérdida neuronal significativa
de las células piramidales grandes de las áreas de asociación
parietal y frontal, el hipocampo y la amígdala. Las neuronas
colinérgicas del cerebro anterior basal y las neuronas
noradrenérgicas del locus cerúleo también se ven gravemente
afectadas.
De acuerdo con la presente invención, un
morfogén OP/BMP, preferiblemente OP-1 humana, ha de
administrarse a un paciente con enfermedad de Alzheimer en
combinación con un factor neurotrófico GDNF/NGF, preferiblemente
GDNF o NT-3, para promover el crecimiento y la
supervivencia de células en esta región, así como para inhibir la
pérdida progresiva de células neuronales adicionales.
Una preparación farmacéutica acuosa que
comprende un morfogén OP/BMP y factor neurotrófico GDNF/NGF ha de
administrarse al paciente parenteralmente. Preferiblemente, la
preparación se administra intracerebralmente mediante, por ejemplo,
inyección o infusión intracerebroventricular o intratecal. En una
realización, el cráneo del sujeto se inmoviliza en un dispositivo
estereotáxico, se realiza un pequeño agujero en el cráneo y la
preparación se inyecta o infunde directamente en las regiones
afectadas del cerebro. Las dosificaciones pueden calcularse para
alcanzar concentraciones del morfogén OP/BMP y el factor
neurotrófico GDNF/NGF de aproximadamente 0,1-10
\mug/ml, preferiblemente aproximadamente 1-100
ng/ml, en la zona de inyección. Alternativamente, las
dosificaciones pueden calcularse para aportar aproximadamente
10-100 \mug/kg del morfogén y el factor
neurotrófico, preferiblemente 1-25 \mug/kg. Las
dosificaciones se repiten diariamente o menos frecuentemente
durante un período de varias semanas a meses o, si es necesario, en
base regular a lo largo de la vida del sujeto. Alternativamente, un
dispositivo de liberación sostenida ha de implantarse dentro del
cerebro del sujeto para provocar una liberación continua de la
preparación a lo largo de un período prolongado.
Debido a la capacidad limitada de las células
nerviosas mamíferas para crecer o regenerarse, las fibras nerviosas
seccionadas conducen frecuentemente a pérdida permanente de la
función sensorial o motriz asociada con el nervio. Las fibras
nerviosas pueden rasgarse o seccionarse en accidentes (por ejemplo,
accidentes automovilísticos) o como un efecto secundario inevitable
de la cirugía.
De acuerdo con la presente invención, un
morfogén OP/BMP, preferiblemente OP-1 humana, ha de
administrarse en combinación con un factor neurotrófico GDNF/NGF,
preferiblemente GDNF o NT-3, a un sujeto que tiene
fibras nerviosas seccionadas para promover el crecimiento reparador
y la supervivencia de células dañadas.
Una preparación farmacéutica acuosa que
comprende un morfogén OP/BMP y factor neurotrófico GDNF/NGF ha de
administrarse al paciente parenteralmente. En el caso de fibras
nerviosas periféricas dañadas (por ejemplo, en el nervio ciático),
la preparación se administra preferiblemente junto con el uso de
canales de guía del nervio que encierran los extremos de las fibras
seccionadas y guían su crecimiento conjuntamente. En el caso de
fibras seccionadas en la médula espinal, la preparación se inyecta o
infunde preferiblemente en el fluido cerebroespinal en la región de
la lesión. Las dosificaciones pueden calcularse para alcanzar
concentraciones del morfogén OP/BMP y el factor neurotrófico
GDNF/NGF de aproximadamente 0,1-10 \mug/ml,
preferiblemente aproximadamente 1-100 ng/ml, en la
zona de inyección o infusión. Alternativamente, las dosificaciones
pueden calcularse para aportar aproximadamente
10-100 \mug/kg del morfogén y el factor
neurotrófico, preferiblemente 1-25 \mug/kg. En el
caso de una lesión espinal, las dosificaciones se repiten
diariamente o menos frecuentemente durante un período de varias
semanas a meses. Alternativamente, en el caso de nervios periféricos
seccionados encerrados en canales de guía del nervio, ha de
emplearse una formulación de liberación sostenida en la que la
preparación se mezcla con un material de matriz dentro del canal de
guía del nervio.
Los episodios isquémicos, o apoplejías, en el
cerebro pueden provocar lesiones neurales que dan como resultado
pérdida permanente de función cognitiva, sensorial o motriz.
Inmediatamente después del comienzo de una apoplejía, la inhibición
de la muerte o degeneración de las células en el área isquémica, así
como la promoción del crecimiento y la supervivencia de estas
células, es importante para minimizar el daño permanente.
De acuerdo con la presente invención, un
morfogén OP/BMP, preferiblemente OP-1 humana, ha de
administrarse en combinación con un factor neurotrófico GDNF/NGF,
preferiblemente GDNF o NT-3, a un sujeto que sufre
una apoplejía.
Una preparación farmacéutica acuosa que
comprende un morfogén OP/BMP y factor neurotrófico GDNF/NGF ha de
administrarse al paciente parenteralmente. Preferiblemente, la
preparación se administra intracerebralmente mediante, por ejemplo,
inyección o infusión intracerebroventricular o intratecal. Las
dosificaciones pueden calcularse para alcanzar concentraciones del
morfogén OP/BMP y el factor neurotrófico GDNF/NGF de aproximadamente
0,1-10 \mug/ml, preferiblemente aproximadamente
1-100 ng/ml, en la zona de inyección.
Alternativamente, las dosificaciones pueden calcularse para aportar
aproximadamente 10-100 \mug/kg del morfogén y el
factor neurotrófico, preferiblemente 1-25
\mug/kg. Las dosificaciones pueden ser continuas o frecuentes
durante un período de varios días a semanas. Las primeras
dosificaciones se administran preferiblemente dentro de las
primeras pocas horas desde el comienzo de la apoplejía.
Claims (46)
1. Uso de (a) un morfogén que comprende una
proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos
70% de homología con el esqueleto de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana y (b) un
factor neutrotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF,
NGF, BDNF, NT-3, NT-4,
NT-5 y NT-6, para la fabricación de
un medicamento para promover la supervivencia de, o inhibir la
muerte o la degeneración de, células neurales mamíferas en un
sujeto mamífero afectado por, o con riesgo inminente de, una
enfermedad neuropática o neurodegenerativa.
2. Uso de (a) un morfogén que comprende una
proteína dímera que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos
70% de homología con el esqueleto de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana y (b) un
factor neutrotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF,
NGF, BDNF, NT-3, NT-4,
NT-5 y NT-6, para la fabricación de
un medicamento para tratar a un sujeto mamífero afectado de daño o
lesión a células neurales.
3. Uso de (a) un factor neutrotrófico
seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6 y (b) un morfogén OP/BMP, para la fabricación
de un medicamento para tratar a un sujeto mamífero con riesgo
inminente de daño o lesión a células neurales.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, en el que dicho daño o lesión comprende un trauma mecánico a un
tejido que comprende dichas células.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que dicho trauma mecánico se selecciona del grupo que consiste
en lesión cerebral traumática por fuerza roma, lesión traumática de
la médula espinal por fuerza roma, concusión, presión intracraneal
debida a edema cerebral o hematoma subdural, vértebras rotas o
aplastadas y nervios rasgados o seccionados.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, en el que dicho daño o lesión comprende un trauma químico a un
tejido que comprende dichas células.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, en el que dicho daño o lesión comprende isquemia de un tejido que
comprende dichas células.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó
3, en el que dicho daño o lesión resulta de una enfermedad
neuropática.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 u
8, en el que dicha enfermedad neuropática se selecciona del grupo
que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington,
esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, epilepsia,
atrofia muscular progresiva, enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth, parálisis,
demencia, enfermedad de Shy-Drager, síndrome de
Wernicke-Korsakoff y enfermedad de
Hallervorden-Spatz.
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células neurales
comprenden neuronas o células neurogliales.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células neurales
comprenden células neurales del sistema nervioso central.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas células neurales
comprenden células del sistema nervioso periférico.
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho morfogén comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con el
dominio de siete cisteínas C-terminal de
OP-1 humana.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfogén
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de
homología con el dominio de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfogén
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de
identidad de aminoácidos con el dominio de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfogén
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de
identidad de aminoácidos con el dominio de siete cisteínas
C-terminal de OP-1 humana.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho morfogén
comprende al menos el dominio de seis o siete cisteínas
C-terminal de una proteína mamífera seleccionada del
grupo que consiste en OP-1, OP-2,
OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 o BMP9.
18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho morfogén está presente en
una concentración de 0,1 ng/ml a 10 \mug/ml, y dicho factor
neurotrófico está presente en una concentración de 0,1 ng/ml a 10
\mug/ml.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho morfogén está presente en una concentración de 1
ng/ml a 100 ng/ml.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho factor neurotrófico está presente en una
concentración de 1 ng/ml a 100 ng/ml.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho morfogén está presente en una concentración de 1
ng/ml a 100 ng/ml y dicho factor neurotrófico está presente en una
concentración de 1 ng/ml a 100 ng/ml.
22. Uso de (a) un factor neurotrófico
seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6 y (b) un morfogén OP/BMP, para la fabricación
de un medicamento para promover la supervivencia de, o inhibir la
muerte o la degeneración de, células neurales mamíferas en un sujeto
mamífero afectado por, o con riesgo inminente de, una neuropatía o
una enfermedad neurodegenerativa, en el que dichas células expresan
un receptor de serina/treonina quinasa activado por OP/BMP y un
receptor de tirosina quinasa activado por dicho factor
neurotrófico.
23. Uso de (a) un factor neurotrófico
seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6 y (b) un morfogén OP/BMP, para la fabricación
de un medicamento para tratar a un sujeto mamífero afectado por
daño o lesión a células neurales mamíferas, en el que dichas células
expresan un receptor de serina/treonina quinasa activado por OP/BMP
y un receptor de tirosina quinasa activado por dicho factor
neurotrófico.
24. Uso de (a) un factor neurotrófico
seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6 y (b) un morfogén OP/BMP, para la fabricación
de un medicamento para tratar a un sujeto mamífero con riesgo
inminente de daño o lesión a células neurales mamíferas, en el que
dichas células expresan un receptor de serina/treonina quinasa
activado por OP/BMP y un receptor de tirosina quinasa activado por
dicho factor neuro-
trófico.
trófico.
25. El uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que dicho factor neurotrófico es
GDNF.
26. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 24, en el que dicho factor neurotrófico
es
NT-3.
NT-3.
27. Un método in vitro para promover la
supervivencia de, o inhibir la muerte o la degeneración de, células
neurales mamíferas, que comprende: poner en contacto las células
neurales con una preparación sinérgica que comprende (a) un
morfogén que comprende una proteína dímera que tiene una secuencia
de aminoácidos con al menos 70% de homología con el esqueleto de
siete cisteínas C-terminal de OP-1
humana y (b) un factor neutrotrófico seleccionado del grupo que
consiste en GDNF, NGF, BDNF, NT-3,
NT-4, NT-5 y
NT-6.
28. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dichas células neurales comprenden neuronas o células
neurogliales.
29. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dichas células neurales comprenden células neurales
del sistema nervioso central.
30. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dichas células neurales comprenden células del
sistema nervioso periférico.
31. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dicho morfogén comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos 70% de homología con el dominio de siete
cisteínas C-terminal de OP-1
humana.
32. El método de acuerdo con la reivindicación
31, en el que dicho morfogén comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos 80% de homología con el dominio de siete
cisteínas C-terminal de OP-1
humana.
33. El método de acuerdo con la reivindicación
31, en el que dicho morfogén comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos 60% de identidad de aminoácidos con el dominio de
siete cisteínas C-terminal de OP-1
humana.
34. El método de acuerdo con la reivindicación
31, en el que dicho morfogén comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene al menos 70% de identidad de aminoácidos con el dominio de
siete cisteínas C-terminal de OP-1
humana.
35. El método de acuerdo con la reivindicación
31, en el que dicho morfogén comprende al menos el dominio de seis
o siete cisteínas C-terminal de una proteína
mamífera seleccionada del grupo que consiste en
OP-1, OP-2, OP-3,
BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 o BMP9.
36. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dicho morfogén está presente en una concentración de
0,1 ng/ml a 10 \mug/ml y dicho factor neurotrófico está presente
en una concentración de 0,1 ng/ml a 10 \mug/ml.
37. El método de acuerdo con la reivindicación
36, en el que dicho morfogén está presente en una concentración de
1 ng/ml a 100 ng/ml.
38. El método de acuerdo con la reivindicación
36, en el que dicho factor neurotrófico está presente en una
concentración de 1 ng/ml a 100 ng/ml.
39. El método de acuerdo con la reivindicación
36, en el que dicho morfogén está presente en una concentración de
1 ng/ml a 100 ng/ml y dicho factor neurotrófico está presente en una
concentración de 1 ng/ml a 100 ng/ml.
40. Un método in vitro para promover la
supervivencia de, o inhibir la muerte o la degeneración de, células
neurales mamíferas, en el que dichas células expresan un receptor de
serina/treonina quinasa activado por OP/BMP y un receptor de
tirosina quinasa activado por GDNF o neurotrofina, comprendiendo
dicho método poner en contacto dichas células con una concentración
eficaz de una preparación sinérgica que comprende: (a) un factor
neurotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF, BDNF,
NT-3, NT-4, NT-5 y
NT-6 y (b) un morfogén OP/BMP.
41. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 27 a 40, en el que dicho factor neurotrófico es
GDNF.
42. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 27 a 40, en el que dicho factor neurotrófico
es NT-3.
43. Una preparación farmacéutica para promover
la supervivencia de, o inhibir la muerte o la degeneración de,
células neurales mamíferas, que comprende: (a) un factor
neutrotrófico seleccionado del grupo que consiste en GDNF, NGF,
BDNF, NT-3, NT-4,
NT-5 y NT-6 y (b) un morfogén
OP/BMP.
44. Una preparación farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 43, en la que dicho factor neurotrófico es
GDNF.
45. Una preparación farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 43, en la que dicho factor neurotrófico es
NT-3.
NT-3.
46. Una preparación farmacéutica de acuerdo una
cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, en donde dicha
preparación comprende además un portador biocompatible.
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