KR20140132010A - 신경보호 효과 화합물 - Google Patents

Abstract

본 출원은 a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) 슈퍼패밀리(superfamily) 또는 신경영양성 인자 단백질(neurotrophic factor protein)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 제조하는 단계; b) 상기 재조합 벡터를 배양된 세포의 군집에 형질감염시켜, 배양 세포의 군집을 형성시키는 단계; 및 c) 손상된 신경의 주변 영역에 상기 형질감염된 세포 군집을 이식하여, 상기 손상된 신경의 주변 영역에서 상기 DNA 서열이 발현함으로써, 신경 퇴화가 예방되는 단계를 포함하는 신경 퇴화 예방 방법을 개시한다.

Description

신경보호 효과 화합물{NEUROPROTECTIVE EFFECTIVE COMPOUND}

본 발명은 신경 퇴화(nerve degeneration) 예방에 관한 것이다.

당업계에는 신경계 및 신경 세포의 퇴화를 예방하기 위해 분자 치료 신경보호 화합물 및 상기 화합물을 이용한 방법이 필요하다.

본 발명은 이하의 상세한 기술 및 실례에 수반하는 도면에 의해 더욱 충분하게 이해되며, 이는 본 발명을 한정하지 않는다:
도 1은 3T3-hBMP 세포에서 메스암페타민(methamphetamine : MAP)-유도된 세포독성을 보여준다. 닫힌 박스는 MAP를 처리하지 않은 3T3 세포, 3T3-PMT-BMP3 또는 3T3-hBMP4 세포를 보여준다. 사선 박스는 1 mM MAP처리한 것이다.
도 2A 2F는 도 1의 관찰된 것과 대응되는 세포의 현미경 사진이다. 도 2A, 도 2B 및 2c는 MAP를 처리하지 않은 대조군 3T3 세포, 3T3-PMT-BMP3 및 3T3-hBMP4 세포와 대응된다. 도 2D, 2E 및 2F는 상기 도 1에서 나타낸 1 mM MAP가 처리된 대조군 3T3 세포, 3T3-PMT-BMP3 또는 3T3-hBMP4 세포 각각과 대응된다.
도 3은 마우스에서 카인산(kainite, I.C.V. 0.1 μg/head)으로 유도된 신경 손실에서 NIH3T3-BMP4의 효과를 보여준다. 각각의 값은 mean +/- S.E.M. of 4 animals 이다.
*pO.001 vs. con, #p<0.01 vs. Sal + KA or 3T3+KA (ANOVA with DMR test).
도 4A-4D는 카인산을 마우스에 처리한 결과인 신경 손실의 현미경 사진이다. 도 4A는 대조군 식염수를 처리한 동물의 해마 CA3 섹션 도 4B는 식염수 + 카이닛 용액을 처리한 동물의 CA3 섹션 도 4C는 카이닛으로 손상을 주기 전에 NIH3T3 세포를 처리한 동물의 CA3 섹션 및 도 4D 는 카이닛으로 손상을 쥐기 전 재조합 BMP4를 발현하는 NIH3T3 세포를 처리한 동물의 CA3 섹션이다.

한 측면에서, 본 발명은 신경보호 화합물을 가리킨다. 특히 본 발명의 예시에서 상기 화합물은 암페타민(amphetamine) 또는 카인산(kainic acid)의 세포 독성 효과에 반하여 신경을 보호할 수 있다.

실시예에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 신경의 퇴화 예방 방법을 가리킨다:

a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) 슈퍼패밀리(superfamily) 또는 신경영양성 인자 단백질(neurotrophic factor protein)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 제조하는 단계;

b) 상기 재조합 벡터를 배양된 세포의 군집에 형질감염시켜, 배양 세포의 군집을 형성시키는 단계; 및

c) 손상된 신경의 주변 영역에 상기 형질감염된 세포 군집을 이식하여, 상기 손상된 신경의 주변 영역에서 상기 DNA 서열이 발현함으로써, 신경 퇴화가 예방되는 단계.

상기 방법에 있어서, 형질전환 성장인자는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein: BMP)일 수 있다. 다른 실시예에서 상기 BMP는 BMP-2, BMP-3, BMP-4 및 BMP-9이고, 상기 방법에 있어서, 신경영양성 인자는 GDNF이다.

다른 측면에서, 세포는 섬유아세포(fibroblast cell)와 같은 결합 조직 세포일 수 있다. 세포는 또한 아교세포(glial cell) 또는 슈완 세포(Schwann cell)와 같은 신경세포일 수 있다. 세포는 방사선 조사할 수 있다. 더 나아가서 신경은 말초신경(peripheral nerve)이다. 상기에서 기술한 방법에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 벡터일 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 BMP 단백질을 포함하는 조성물을 손상된 신경 근처 부위에 투여하는 단계를 포함하는 신경 퇴화를 예방하는 방법을 가리킨다. 상기 방법에 있어서, BMP 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-4 또는 BMP-9일 수 있다.

그에 더하여, 세포 개체군은 이식 전에 10% DMSO로 액체 질소 하에 저장될 수 있다.

[실시예]

여기에서 사용되는 "결합 조직 세포(connective tissue cell)" 또는 "결합 조직의 세포(cell of a connective tissue)"는 섬유아세포, 연골세포(chondrocytes) 및 지방세포(adipocytes) 및 평활근 세포(smooth muscle cell)와 같이 콜라겐 세포외 기질(collagenous extracellular matrix)을 분비하는 골세포(골아세포: osteocytes , 골세포: osteocytes)와 같이 결합 조직에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직하게는 결합조직 세포는 섬유아세포, 연골세포 및 골세포이다. 보다 바람직하게는 결합조직세포는 섬유아세포이다. 또한 결합조직 세포는 미성숙한 섬유아세포로 알려진 간엽세포(mesenchymal cell)를 포함한다. 이는 본 발명이 단일 타입의 세포와 같은 결합조직 세포의 혼합 배양을 수행할 수 있음이 인지될 것이다.

여기에서 사용되는 세포 주입되는 손상된 신경 또는 신경계 "주변(near)"은 손상 자리에서 손상된 신경 세포의 퇴화를 예방하는 효과적인 결과를 이루기 위해 주입 자리 및 손상 영역 사이가 충분히 가까운 영역을 의미한다. 그러므로 세포 주입되는 손상 신경 근처는 손상 자리 또는 유효한 폴리펩티드 및 신경 퇴화 예방 효과를 직접 또는 간접적인 효과가 허용된 폴리펩티드를 발현하는 주입된 세포가 충분히 가까운 어떤 자리던지 포함한다. 말초 신경을 대상으로, 특이적으로 척추 손상(spinal cord injury)에서 세포는 소상 자리에서부터 세는 경향이 있으므로, 주입은 손상 자리의 "상류(upstream)"에서 할 수 있다.

여기에서 사용되는 "프로모터(promoter)"는 활성화되는 어느 DNA 서열도 될 수 있고, 진핵세포(eukaryotic cell)에서 전사를 조절한다. 프로모터는 진핵세포(eukaryotic cell) 또는 원핵세포(prokaryotic cell) 모두 또는 어느 하나를 활성화할 수 있다. 바람직하게는 프로모터는 포유류 세포(mammalian cell)에서 활성화한다. 프로모터는 구성적으로 발현되거나 유도될 수 있다. 바람직하게 프로모터는 유도된다. 더욱 바람직하게 프로모터는 호르몬 또는 금속에 의해 유도된다. 한층 더욱 바람직하게는, 프로모터는 중금속에 의해 유도된다. 가장 바람직하게 프로모터는 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자 프로모터이다. 또한 전사를 조절하는 "증강자 요소(enhancer elements)"도 DNA 벡터 컨스트럭트(construct)에 삽입될 수 있으며, 본 발명의 컨스트럭트는 대상 유전자의 발현을 증강하기 위하여 이용되었다.

여기에서 사용되는 "선별 마커(selectable marker)는 도입된 DNA를 안정하게 유지하는 세포에 의한 유전자 생산물을 포함하며, 세포가 형태학상 형질변환(morphological transformation)과 같은 변형된 표현형(phenotype)을 발현하거나 또는 효소적 활성을 초래한다. 형질도입된 유전자를 발현하는 세포의 분리는 같은 세포에 항생제 또는 다른 약물에 내성을 부여하는 효소적 활성을 가진 것과 같은 선별 마커를 암호화하는 두번째 유전자의 도입을 통해 성취된다. 실시예의 선별 마커는 이에 한정되는 것은 아니나 티미딘 키나아제(thymidine kinase), 디하이드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase), 아미노글리코사이드 포스포트렌스퍼라아제(aminoglycoside phosphotransferase , 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin) 및 제네티신(geneticin) 같은 아미노글리코사이드 항생물질에 내성을 부여하는 것, 하이그로마이신 B 포스포트렌스퍼라아제(hygromycin B phosphotransferase), 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(xanthine-phosphoribosyl transferase), CAD[새로운 우리딘(uridine) 생합성의 처음 효소적 활성을 소유하는 3개의 단일 단백질-카바밀 포스페이트 신테타아제(carbamyl phosphate synthetase), 아스파테이트 트랜스카바밀라아제(aspartate transcarbamylase) 및 디하이드로오로타아제(dihydroorotase)], 아데노신 디아미나아제(adenosine deaminase) 및 아스파라진 신테타아제( asparagine synthetase)를 포함하고(Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989), 상기 전체는 참고문헌에 의해 통합된다.

여기에서 사용된 "전환 성장인자-베타(transforming growth factor-β: TGF-β 슈퍼패밀리(superfamily)"는 배 발달(embryonic development) 동안 분화 과정의 광범위한 범위에 영향을 주는 구조적으로 연관된 단백질 그룹을 포함한다. 패밀리(family)는 정상적인 남자 성 발달에 요구되는 뮐러 억제 물질(Mullerian inhibiting substance : MIS) (Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), 등-배 축 형성(dorsal- ventral axis formation) 및 성충판(imaginal disks)의 형태 발생에 요구되는 DPP(Drosophila decapentaplegic) 유전자 산물(Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), 난소의 식물극(vegetal pole of eggs)에 위치한 Xenopus Vg-I 유전자 산물(Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), Xenopus 배(embryo)에서 중배엽 및 앞쪽 구조의 형성을 유도할 수 있는 액티빈(Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986) 및 디 노보(de novo) 연골 및 골 형성을 유도할 수 있는 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein)(BMP-2,3,4,5,6 및 7과 같은 BMP들, 오스테오제닌(osteogenin), OP-I)을 포함한다. TGF-β 유전자 산물은 지방세포 형성(adipogenesis), 골격근세포 형성(myogenesis), 연골 형성(chondrogenesis), 혈구 형성(hematopoiesis) 및 상피세포 분화(epithelial cell differentiation)를 포함하는 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있고(for a review, see Massague, Cell 49:437, 1987), 상기 전체는 참고문헌에 의해 통합된다.

TGF-β 패밀리(family) 단백질은 C-터미널에서 대략 110-140 아미노산 정도의 염기 잔기의 클러스터(cluster)가 단백질 절단을 당한 후에 큰 전구체 단백질로서 초기에 합성된다. 단백질의 C-터미널 지역은 모두 구조적으로 연관되어 있고, 다른 패밀리 맴버(family member)들은 이들의 상동성의 범위를 기초로 하여, 별개의 서브그룹(subgroup)으로 분류할 수 있다. 비록 특정한 서브그룹의 상동성이 70% 내지 90% 아미노산 서열이 동일하더라도, 서브그룹간의 상동성은 유의적으로 낮으며, 일반적으로 단지 20% 내지 50%에 이른다. 각각의 경우에서 활성 종들(active species)은 C-터미널 단편의 이황-연결된 다이머(disulfide-linked dimer)로 여겨진다. 대부분의 패밀리 맴버의 연구에서, 동종이합체 종들(homodimeric species)은 생물학적 활성이기 위해 발견되었으나, 인히빈(inhibin)(Ung, et al., Nature, 321:779, 1986) 및 TGF-β(Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)와 같은 다른 패밀리 맴버인 이종이합체(heterodimer)들 또한 검출되었고 이들은 각각의 동종이합체와는 다른 생물학적 성격을 가지고 있다.

TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리의 맴버는 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(chicken), TGF-β1, TGF-β5(Xenopus), BMP-2, BMP3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, OP-I/BMP-7, BMP-8, BMP-9, Drosophila 60A, Drosophila DPP, Vgrl, GDF-1, Xenopus Vgf, 인히빈-βB, 인히빈-α 및 MIS를 포함한다. 상기 유전자 중 다수는 Massaguem(Ann, Rev. Biochem. 67:753-791, 1998)에서 논의되었으며, 상기 전체는 참고문헌에 의해 통합된다.

바람직하게는 TGF-β유전자의 슈퍼패밀리 맴버는 TGF-β이다. 더욱 바람직하게는 맴버는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 및 BMP-9이다.

상기 지정된 이름으로 기재된 단백질은 정확한 야생형(wild-type)의 서열로 한정하지 않는 것으로 이해된다. 상기 단백질의 서열 상의 변이는 기능적인 면에서 단백질과 실제로 동일한 활성을 나타내는 다른 폴리펩티드 서열이 그에 포함되는 것이 수용된다.

신경 조직

신경 조직은 척색의 영향 하에서 배아 외배엽(embryonic ectoderm)에서 유래한다. 외배엽은 그때 분화하는 두꺼운 신경판을 형성하기 위해 유도되고, 중앙 신경계로부터 파생하는 모든 신경관을 형성하기 위해서 말단은 마침내 융합한다. 중앙신경계는 뇌, 뇌신경(cranial nerves) 및 척수(sinal cord)로 구성된다. 자율신경계는 신경능(Neural Crest)이라고 불리는 신경고랑(neural groove) 옆의 세포로부터 유래된다.

신경조직은 통합 통신 네트워크 복합체(complex integrated communications network)로 신체 전체에 분포된다. 뉴론(neuron)은 매우 간단한 형태의 범위에서 매우 복잡하고 높은 질서의 범위의 다른 뉴론들과 소통한다. 뉴론들은 실질적인 메세지 전달 및 통합을 수행한다. 신경교세포(glial cell)라 불리는 다른 신경 조직 세포들이 뉴런의 지원, 보호, 방어 및 영양에 의해 뉴론을 지원하는 동안, 뉴런은 실질적인 메세지 전달 및 통합을 한다. 뇌에서는 뉴런보다 신경교세포가 약 10배 정도 있다. 신경교세포는 뉴런 기능에 필요한 미소 서식 환경(microenvironment)을 창조하고, 때때로 신경 과정 및 활성을 보조한다. 뉴런은 흥분성 세포(excitable cell) 이다. 이는 알맞게 자극받을 때 활동 전위(action potential)는 먼 거리의 세포에 정보를 전달하기 위하여 세포막으로 전달되어 시작하게 할 수 있다. 뉴론들은 수신, 전달 및 자극 과정에 책임이 있는 독립적인 기능적 단위이다.

일반적으로 뉴론은 3 부분으로 구성되어 있다: 핵 및 세포기관들이 위치해 있는 세포체(cell body); 환경 및 다른 뉴론들로부터 자극을 수신받는 세포체에서 연장된 돌기인 수지상 돌기(dendrites); 및 다른 세포로 신경 임펄스(impulse) 전달을 위한 세포체에서 연장된 긴 하나의 돌기인 엑손(axon). 일반적으로 엑손은 이의 말초부(distal end)에서 파생하며, 다른 세포로 종결되는 각각의 분지(branch)는 구근부(bulbous end)를 가진다. 근접한 세포와의 종말구(end bulb)의 상호결합은 시냅스(synapse)라는 구조를 형성한다. 시냅스는 전기 전위(electrical potential)를 통해 신호를 수신하고 이를 변환하도록 분화되었다.

인간 신체에서 발견되는 대부분의 뉴론은 다극성(multipolar)으로, 이들은 오직 하나의 엑손과 나머지 수지상 돌기로 2개 이상의 세포 돌기를 가진다는 뜻이다. 망막 또는 후각점막의 양극성 뉴론은 하나의 가지 돌기(dendritic process)를 가지고 엑손은 세포체에서 벗겨져나온다. 척수 신경절(spinal cord ganglia)에서 발견되는 위단극(Pseudounipolar) 뉴론은 감각의 임펄스가 세포체를 통과하지 않고 직접적으로 수지상 돌기에서 엑손으로 지나갈 수 있다. 또한 뉴론은 기능에 의하여 분류될 수 있다. 감각 뉴론은 감각 중추 자극의 수신 및 전달과 관련된다. 운동(moter) 뉴론은 근육 및 분비기관을 조절하기 위해 임펄스를 보낸다. 다른 뉴론인 중간 뉴론(interneuron)은 기능적인 네트워크의 한 부분으로 뉴론들 사이의 중개자로서 작용한다.

시냅스는 세포 신호를 적달하는 기능적 세포 접합(junction)으로 특수화되었다. 대부분의 시냅스는 화학적 시냅스로서, 시냅스 전말단(presynaptic terminal)에 있는 소낭에 화학적 전달체(chemical messenger)를 포함하고, 시냅스 전말단이 자극받을 때 시냅스 틈새(synaptic cleft)로 방출된다. 화학적 전달체는 시냅스 틈새를 지나 시냅스 후막(postsynaptic membrane)의 수용체와 결합하기 위하여 확산한다. 이는 세포내 활동에 영향을 미치는 시냅스 후막의 분극 상태(polarization state) 상의 변화를 유도한다. 시냅스의 특별한 유형은 신경근연접(neuromuscular junction)이다. 35종 이상의 뉴로트렌스미터(neurotransmitter)가 알려져 있으며, 대부분은 작은 분자(일산화 탄소, 아세틸콜린), 카테콜아민(노르에피네프린, 세로토닌) 또는 신경활성 펩티드(엔도르핀, 바소프레신)이다. 이전에 사용된 뉴로트렌스미터는 효소에 의한 파괴, 확산 및 또는 전시냅스 세포(presynatic cell)에 의한 내포작용(endocytosis)에 의해 제거된다.

일부 뉴론은 미엘린(myelin)이라 불리는 단열 물질(insulating material)로 감싸여져 있다. 지질 풍부 물질(lipid rich material)은 신경교 세포에 의해 형성된다: 자율신경계의 스완 세포(Schwann cell) 및 중앙신경계의 회돌기교질세포(oligodendrocytes). 절연제는 감극되어야 하는 막 표면을 감소시킴으로 더 빠른 신경 유도를 가능하게 한다. 유수성 뉴론(myelinated neuron)에서 신경 임펄스는 하나의 무유수성 분절(unmyelinated segment)로부터 엑손의 길이를 넘어선 다른 분절로 이동한다. 미엘린 시스(sheath) 및 일부 신경 조직을 만드는 조직 안의 뉴런 세포체의 결핍은 거대발초신경(large peripheral nerves) 및 뇌의 백질(white matter)과 같이 백색을 나타낸다. 성상세포(astrocyte)라 불리우는 다른 신경교세포는 구조적 완전성(structural integrity), 뉴런 영양(neuronal nutrition) 및 신경 조직의 미소 환경을 유지하는데 관여한다. 성상세포는 간극 접합(gap junction)을 통해 다른 세포와 직접 통신하고, 국소 환경(local environment)의 조절을 통한 이들의 보호에 의하여 뉴론의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 뇌실막세포(Ependymal cell)는 척수와 뇌실을 나누고, 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 분비한다. 미세아교세포(microglia)로 불리우는 다른 작은 신경교세포는 정보에 관여하고, 성인의 중앙신경계에서 치료한다.

신경 조직은 전기적 임펄스를 수신 또는 전달할 수 있는 흥분성 조직이다. 주요한 세포 타입은 뉴론이라 불린다. 뉴론은 일반적으로 세포체, 신호를 수신하는 수지상 돌기 및 전위를 전달하는 엑손을 가진다.

뉴론은 감각, 운동, 분비 또는 연합 뉴론으로 분류할 수 있다. 이들은 흔히 전도 속도, 직경, 및 미엘린이라 불리는 특수화된 지단백질(lipoprotien) 절연체의 존재 유무에 의해 분류될 수 있다. 타입 A 섬유는 유수화(mylinated)되며, 12 - 120 m/sec 임펄스로 수행할 수 있다. 타입 B 또한 유수화된 섬유이나, 오직 3 - 5m/sec 임펄스를 전달한다. 타입 C 섬유는 무수화된(unmylinated) 섬유로 직경이 작으며, 매우 느리다(2.5 m/sec). 타입 A 섬유의 예는 비복근(gastrocnemius)을 자극하는 운동 뉴론이다. 전교감신경절 원심성 뉴론(autonomic preganglionic efferent neuron)은 타입 B 섬유의 예이며, 고통을 확산하는 정보를 운송하는 감각 뉴론은 느린 타입 C 섬유의 예이다.

감각 뉴론은 환경으로부터 정보의 확실한 타입을 인지하는데 적합하다. 압력 또는 긴장과 같은 것을 느끼는 기계적 자극 수용기(mechanoreceptor), 온도수용기(thermoreceptors), 망막의 광수용기(photoreceptors) 및 미뇌(taste bud) 또는 후각과 같은 화학 수용기(chemoreceptor)를 포함한다. 연합 뉴론 또는 중간 뉴론은 일반적으로 척수 및 뇌에서 발견되는데 이들은 감각 원심성 뉴론과 원심성 운동 또는 분비 뉴론을 연결한다.

뉴론은 시냅스라 불리는 구조를 통해 다른 하나와 소통한다. 엑손은 수많은 작은 소낭(vesicles)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 종말 버튼(terminal button)에서 끝난다. 작은 소낭들은 뉴로트렌스미터라 불리는 화학 물질로 채워져 있다. 비록 노르에피네프린, 세레토닌 및 GABA와 같은 다른 화합물은 뉴론에 의존적으로 이용되지만, 시냅스에서 아세틸콜린은 매우 흔한 뉴로트렌스미터이다.

임펄스가 엑손 아래로 이동하여 종말 버튼에 도착하면, 소낭이 뉴론 막과 융합되고 뉴로트레렌스미터가 방출된다. 화합물은 좁은 시냅스 틈을 지나 수신하는 뉴론의 시냅스 후막 상의 화합물의 특이적인 수용체로 확산한다.

뉴로트렌스미터와 수용체의 상호작용은 막 전위에 변화를 일으키고 이는 시냅스후 뉴론의 새로운 임펄스를 유도한다. 효소인 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)는 시냅스에 존재하며, 아세틸콜린을 분해하고, 자극을 종결한다. 다른 뉴로트렌스미터들은 자극을 종결하기 위하여 시냅스 후 뉴론에서 분해하거나 정체시킨다.

중앙신경계에서 많은 뉴론들은 하나의 뉴론이 한데 모여지게 할 수 있다. 시냅스 전 뉴론 각각이 시냅스 후 뉴론으로 뉴로트렌스미터를 방출할 때, 국소 막 전위는 통합되거나 총합되어진다. 수신 신호는 억제 또는 자극일 수 있다. 결과적으로 총합된 막 전위가 뉴론에 최소한의 역치로 닿으면, 활성 전위가 개시된다.

활성 전위는 도약전도(saltatory conduction)에 의해 세포체로부터 한 방향으로 이동한다. 가장 빠른 뉴론은 신경섬유 마디(node of Ranvier)라 불리는 미엘린이 덮이지 않은 뉴론 막에 의해 분리되는 지각있는 분절(discreet segment)로 구성된 미엘린 시스로 덮여있다. 도약전도에 있어서, 전위는 마디에서 마디로 이동하고, 그에 의하여 활성 전위와 관련된 막 영역을 감소시키고 전도를 가속화한다.

신경계에서 발견되는 비-뉴론 세포는 신경교세포라 한다. 성상세포는 가장 수가 많으며, 뉴론의 지속 및 자양분 공급을 제공한다. 미세아교세포는 신경 조직에 특이적인 작은 탐식세포(phagocytic cell) 이다. 뇌실계(ventricular system ) 및 척수의 중심관(central canal)을 분리하고 뇌척수액을 생산하는 세포를 뇌실막 세포(ependymal cell)라 한다. 중앙신경계에서 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 다수의 뉴론의 미엘린 시스의 분절을 형성한다. 자율신경계에서 미에린 시스의 각각 분절은 단일 슈반 세포에 의해 만들어진다.

중앙신경계( Centrol nervous system )

중앙신경계(CNS)는 뇌 및 척수로 구성된다. 뇌막들(경질막, 거미막 및 연ㅁ막)은 두개골 및 척추에 의한 보호에 더하여 중앙신경계를 보호 및 영양을 준다. 뇌척수액은 거미막 밑공간(subarachnoid space), 척추(spinal column)의 중심관 및 뇌실에서 발견된다. 연막은 가장 깊은 막이며, 신경조직에 부착되어 있다. 연막과 경질막 사이에는 거미막이 놓여있다. 단단한 섬유질의 경질막은 두개골 바로 밑에 놓여있다.

뇌는 전뇌, 중뇌 및 뇌간의 기본적인 세 영역으로 분리될 수 있다. 전뇌는 시상(thalamus), 시상하부(hypothalamus), 기저핵(basal ganglia) 및 대뇌(cerebrum)를 포함한다. 대뇌는 의식있는 생각, 감각의 해석, 모든 자발적인 운동, 정신적 능력 및 감정 등에 이용되고 있다.

대뇌 조직은 구조적 및 기능적 영역으로 분리될 수 있다. 대뇌 표면은 뇌이랑(ridges) 및 뇌고랑(grooves)으로 얽혀있다. 대뇌 피질의 감각 및 운동 영역은 각각 중심 후이랑(post central gyrus) 및 중심고랑(central sulcus)으로 지도화될 수 있다. 감각 영역은 시상 처리 후 투영된 신체의 반대편을 통해 감각을 수신한다. 더 많은 감각 신경 종결되는 신체 부분은 더 많은 감각 영역에 의해 대표된다. 운동 영역은 대측성(contralateral) 신체 부분의 수의근 운동을 조절하지만, 연합 영역은 운동 개시에 중요하다.

대뇌는 뇌의 가장 커다란 부분으로 몇 개의 엽(lobe)을 가진 좌 및 우 두 대뇌반구로 분리할 수 있다. 전두엽(frontal lobe)은 지능 및 행동에 있어서 운동 영역, 브로카 언어 영역(Broca's speech area), 연합 영역 및 기능을 포함한다. 전두엽은 감각 및 청력에 있어서 감각 영역 및 기능을 포함한다. 일차 시각 연합 영역(primary visual association areas)은 후두엽(occipital lobe)에 위치하고 있으며, 측두엽(temporal lobe)은 청각연합, 냄세 및 기억 저장을 위한 영역을 포함한다.

시상은 대뇌피질(cerebral cortex)과 뇌간 사이에 위치한다. 후각 감각을 제외한 모든 감각 투입은 다른 뇌 영역에 투영되지 전에 여기에서 처리된다. 시상하부는 시상 바로 밑에 위치하며, 내부 자극 처리 및 내부 환경 유지를 위해 이용된다. 혈압, 온도, 심박동수, 호흡, 수분대사, 삼투압, 공복 및 신경 내분비 활성의 자각하지 않은 조절 순간을 여기에서 처리한다. 뇌하수체 후엽으로부터 옥시토신 및 ADH를 분비하는 신경 내분비 세포(neuroendocrine cell)의 세포핵은 시상하부에 위치한다.

기저핵[미상핵(caudate nucleus), 창백핵(globus palladus), 흑색질(substantia nigra), 시상밑핵(subthalamic nucleus), 적핵(red nucleus)]은 대뇌의 각각의 대뇌반구에 파묻힌 뉴론의 그룹이다. 이들은 복합 운동 조절, 정보 처리 및 무의식적으로 전체적인 계획 운동을 주절과 관련되어 있다.

뇌관은 뇌간(medulla oblongata) 및 뇌교(pons)를 포함한다. 뇌간은 중요한 기능적 영역을 포함하고, 호흡, 심장 및 혈관 운동 신경의 반사작용을 위한 중추를 중계한다. 뇌교는 호흡 조절과 연관되어 있는 호흡조절 중추를 포함한다.

대뇌는 뇌간 위에 놓여있고, 감각 정도를 처리하는 것과 마찬가지로 신체, 운동, 자세 및 평행 상태의 위치에 대해 이용한다. 대뇌에서 운동이 개시되는 것이 아니라 공동작용할 수 있는 운동(coordinated movement)에 필요하다.

자율신경계( Peripheral nervous system )

자율신경계는 뇌 및 척수 밖에 위치한 신경, 신경절들, 척수 신경 및 뇌 신경을 포함한다. 12 뇌신경은 뇌간에 위치한 핵으로부터 기인하고, 후각, 시각, 타액분비(salivation), 심박동수 및 피부 감각과 같은 다양한 자율 신경계 기능을 조절하기 위하여 임펄스를 동반하여 특이적인 부위로 이동한다. 뇌신경은 많은 경우 감각 및 모터 구성요소를 지닌 것으로 혼동되나, 이들은 운동 또는 감각 섬유만을 열거한다.

뇌신경

번호	명칭	기능
Ⅰ	후각 신경(olfactory)	후각 감각
Ⅱ	시각 신경(optic)	시각
Ⅲ	동안 신경(oculomotor)	일부 안근육(eye muscle) 및 눈커플(eyelid)의 운동 제어
Ⅳ	활차 신경(trochlear)	일부 안근육의 운동 제어
Ⅴ	3차 신경(trigeminal)	저작근(chewing muscle) 및 일부 안면 감각
Ⅵ	외향 신경(abducent)	일부 안근육의 운동 제어
Ⅶ	안면 신경(facial)	안면 근육, 타액 분비의 운동 제어, 미각 및 피부 감각
Ⅷ	청각 신경(acoustic)	평행(equilibration), 평감각(static sense) 및 청각
Ⅸ	설인 신경(glossopharyngeal)	타액 분비, 피부, 미각 및 내장 감각
Ⅹ	미주 신경(vagus nerve)	심장 및 내장의 운동 제어, 흉각, 인두 및 복부 내장의 감각
ⅩⅠ	부신경(accessory)	인두 및 견갑 관절로의 운동 임펄스
ⅩⅡ	설하 신경(hypoglossal)	혀, 일부 골 근육, 일부 내장의 운동 제어, 피부 및 내부로부터의 감각

자율신경계의 감각계(sensory division)는 수용체의 다양한 타입으로부터 정보를 입력하고, 처리하고 중앙신경계로 보낸다. 감각 입력(sensory input)은 관절 및 근육 위치의 감각과 같은 내부 근원(internal sources) 또는 피부의 압력 또는 열의 감각과 같은 외부 근원(external sourcee)으로부터 온다. 특이적인 척수 신경(spinal nerves)에 의해 자극받는 피부 구역을 피부분절(dermatomes)이라 한다. 구심성 섬유(afferent fibers)는 감각 입력을 수집하고, 척수로 이동하고, 시상으로 모이고, 대뇌의 감각성 대뇌피질(sensory cortex)에서 최종적으로 끝난다. 많은 감각 수용체 즉 손가락 끝 또는 입술 구역은 뇌의 감각성 대뇌피질에서 많은 구역에 해당한다. 자기수용 정보를 지니는 섬유는 대뇌에서 분산된다. 대부분 모든 감각계는 시상 부분으로 임펄스를 전송한다. 대뇌피질은 의식적 인식(conscious perception) 및 감각 자극의 해석과 연관되어 있다.

근육 및 분비기관으로의 운동 입력은 자율 원심성 신경계 및 몸 원심성 신경계를 통해 발생한다. 관절, 힘줄 및 근육의 CNS 자극은 몸 원심성 신경계로 이동한다. 일부 근육 반응은 척수 반사를 통해 처리한다. 일례로 손가락이 뜨거운 난로와 접촉했을 때의 척수금단반사(withdrawal reflex)가 있다. 손가락을 치우는 운동은 뇌에 통증 감각이 도달하기 전에 단일 척수반사를 통해 발생한다. 이는 명백히 손상을 피하기 위한 보호 기작이다. 일반적으로 분비기관 및 평활근 근육으로의 운동 입력은 자율신경계를 통해 발생한다.

대부분의 장기는 자율 신경계(autonomic nervous system) 가지 양쪽으로부터 입력을 수신한다. 일반적으로 장기 및 조직에서 다른 하나가 억제되는 동안 하나의 가지는 흥분된다. 자율 신경계의 교감신경 가지(sympathetic branch)는 생리적 스트레스에 대한 신체를 준비시키기 위해 활동한다. 교감신경 가지의 자극은 반응에서 신체가 달리거나 싸우도록 준비시키기 위해 속도를 내는 것과 같다. 심박동수 증가, 기도의 확장 및 글리코겐 저장소로부터 글루코오스의 동원과 같은 효과가 보인다. 교감신경계는 첫번째 가슴 척추골부터 네번째 허리 척추골에서 비롯된다. 이들은 척추를 따라서 놓여있는 연쇄 신경절(chain ganglia)의 하나로 끝나는 짧은 전교감신경절 뉴론을 가진다. 아세틸콜린은 긴 전교감신결절 뉴론과 시냅스에서 뉴로트렌스미터로서, 노르에피네프린이 교감신경계 끝의 다수에서 방출될 때, 표적 조직으로 이동한다. 자극하는 한선(sweat gland) 또는 수의근 혈관계(skeletal muscle vasculature)와 같은 많은 후교감신경절 뉴론(sympathetic postganglionic neuron)은 아세틸콜린을 방출한다.

부교감신경 가지(parasympathetic branch)는 CNS의 두개골 및 천골 부위로부터 비롯된 뉴론을 통해 교감신경 가지를 평행시키는데 활동한다. 실례로, 부교감신경계 자극은 기도를 수축하고, 심박동수를 감소한다. 이는 소화, 배뇨 및 발기와 같은 휴면 활성을 조절한다. 긴 전교감신경절 뉴론(preganglionic neuron)은 말단 기관 근처의 시냅스에서 아세틸콜린을 방출한다. 또한 짧은 후교감신경절 뉴론(postganglionic neuron)은 작동 조직상에서 아세틸콜린을 방출한다.

TGF-β, 액티빈(activins) 및 BMP는 세포 분화, 성장 및 발생 중 기관 형성에 관여하는 단백질이다. BMP는 성장/분화 인자(gorwth/differentiation factor, GDF), 골형성 단백질(osteogenic protein, OP) 및 뮬러 억제 물질/항-뮬러 호르몬(Mullerian inhibiting substance/anti-Mullerian Hormone, MIS/AMH)(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15)과 함께 TGF-β 슈퍼패밀리의 맴버이다. 역사적으로 Urist(Urist, MR: Bone, formation by autoinduction, Science, 1965, 150(698): 893-899)는 설치 동물 및 토기 모두의 근육으로 탈회된 골기질(demineralized bone matrix)로 삽입환 후 연골내 골화(endochondral ossification)과 유사한 배아골화(embryonic ossification) 및 다른 처리의 현상을 관찰하였다. 이식 후 미분화중간엽세포(undifferentiated mesenchymal cell)는 유사분열(mitosis) 및 응축(condensation) 뒤에 따른 주화성(chemotaxis)에 의해 삽입된 골 조직으로 이동했다. 간엽세포(mesenchymal cell)에서 유래된 연골아세포(chondroblast)는 연골 주형의 강화된 형성인 세포외기질(extracellular matrix)에 분비된다. 세포외기질은 조혈세포(hematopoietic cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell)를 통해 혈관을 연장시킨다. 국부에서 나타나는 골아세포(osteoblast) 및 파골세포(osteoclast) 및 흡수된 연골은 골 조직으로 변형된다. 21일 후, 골의 골수(marrow core)와 소골편(ossicle)이 형성되었다(Wang et al., Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 9484-9488). 탈회된 골기질로부터 변화된 돌기와 연합하는 구성요소는 골 형태형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)로 설명된다.

1988년에 Wang 등(Wang et al., Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 9484-9488)은 우골(bovine bone)로부터 각각 16 IcDa, 18 IcDa 및 30 kDa의 분자량을 가진 3가지 폴리펩티드를 분리하였다. 후에 Wozney 등(Woozney, MoI Rep Dev, 1992, 32: 160-167)은 이들의 폴리펩티드를 프루브로 이용하여 인간 RNA 및 대응되는 DNA를 동정하였다. 후속 연구는 적어도 16개의 내생 BMP들이 존재함을 밝혔다(Wozney and Rosen, Clin Orthop, 1998, 346: 26-37).

BMPl(procollagen C-protease)을 제외하고, 이들은 모두 형질전환 성장인자(TGF)-β 유전자 수퍼패밀리의 맴버이다(Wozney and Rosen, Clin Orthop, 1998, 346: 26- 37). 구조적으로 BMP들은 15 - 25 아미노산의 신호 펩티드, 50 - 375 아미노산의 프로도메인(prodomain) 및 100-125 아미노산의 성숙한 끝 카르복실기 말단으로 구성되는 커다란 전구체 형태로 생산된다. 이후 단백질 가수 분해 과정에 의해 전구체에서 카르복실기 말단 영역이 절단된 후에 7개의 시스테인(cysteine) 잔기를 가져, 펩티드 이합체화(dimerization)를 가능하게 한다(Croteau et al., 1999; 22: 686-695). 성숙한 BMP 단백질은 각각 활성화된 동일한 단량체(monomer)로 구성된 이황-연결 동종이합체(homodimer) 또는 2가지 다른 타입의 단량체과 구성된 이황-연결 이종이합체(heterodimer)로 존재한다(Sampath et al., J Biol Chem, 1990, 265: 13198-13250). 흥미롭게도 상기 단백질의 이합체화는 이의 활성과 연결되며, BMP2 및 BMP7와 같은 이종이합체는 같은 단량체로 구성된 동종이합체보다 강한 모르포겐(morphogen) 임을 보였다(Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61; Sampath et al., J Biol Chem, 1990, 265: 13198- 13250).

BMP의 생물적 활성을 측정하기 위하여는 BMP 유전자 발현의 조절 및 세포 내에서의 BMP 이합체화의 기작을 이해하는 것이 필요하다. 비록 BMP의 유전자 발현에 대하여 많이 알려지지 않았지만, 염기 헬릭스-루프-헬릭스(basic helix-loop-helix, bHLH) 단백질에 의해 조절되는 것은 알려졌다(Ebara et al., Biochem Biophys Res Commun, 1997, 240: 136-141). bHLH 단백질은 양성 전사 활성자(positive transcriptional activators)로 작용하는 2개의 외부 도메인과 음성 조절자(negative regulator)로 작용하는 중앙 도메인인 3개의 도메인으로 구성되어 있다. 상기 도메인들 중, E-box(246 - 265 bp 범위의 DNA 서열)는 USF 전사 요소에 의해 조절되고, 마우스에서 BMP 발현을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한 BMP는 세포 죽음 경로의 조절과 관련이 있다.

BMP의 생물적 활성은 전사 레벨 및 세포외(extracellularly) 범위를 넘어서 다양한 시간대에서 엄격하게 조절된다. 초기에 BMP와 작용하고, 증가된 BMP 활성에 반응하는 억제 단백질로 작용하는 세포 외부의 BMP 수용체는 최종적으로 이들의 조절을 선도하는 음성 피드백 신호의 증강된 생산을 유도될 수 있다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15). 세포 내부에서는 신호 전달 또는 BMP가 억제 Smad 단백질의 상승 조절 발현하는 것을 의미하는 억제 Smad 단백질에 의해 조절된다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15).

세포외 레벨에서 세포는 세포 수용체에 BMP의 결합을 억제하는 노긴(noggin) 및 콘드린(chondrin)과 같은 BMP 결합 단백질에 의해 조절된다. 비틀어진 장배 형성(twisted gastrulation, Tsg)은 콘드린의 기능을 증강한다(Ebara and Nakayama, Spine, 2002, 16S: S10-S15). 폴리사틴(follisatin)은 OP-l/BMP-7 및 BMP-4 단백질에 결합하여 BMP를 억제한다(Matzuk et al., Nature, 1995, 374: 360-363).

BMP 수용체( Receptor for BMP )

BMP는 세린-트레오닌(serine-threonine) 카이네이즈(kinase) 수용체의 두 가지 타입(타입 I 및 II)에 결합한다 2개의 타입 I 수용체 및 하나의 타입 II 수용체는 포유동물에서 확인되었다(Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev, 1998, 9: 49-61). 포유동물에서 타입 I 수용체는 아이소폼(isoform) A 및 B를 가지고, 비록 구조적으로 유사하나 Smad 단백질의 활성에서 다른 작용을 가진다(Imamura et al., Nature, 1997, 389: 549- 551). 신호 전달을 위해서, 타입 I 및 II 수용체는 복합체를 형성하는데 필요하다. 세포에서 타입 I 수용체는 타입 II 수용체에 의해 활성화되고, 신호는 타입 I 수용체에 의해 전달된다. 세포 내의 신호는 Smad 단백질에 의해 전달된다. Smadl, Smad5 및 Smad8는 같은 구조에 속하며, BMP로부터의 신호를 전달한다. Smad2 및 Smad3는 TGF-β 및 액티빈으로부터의 신호를 전달한다. Smad는 이절 복합체(heteromeric complex)를 형성하고, 다양한 유전자를 활성화하기 위해 핵으로 이동한다. Smad6, Tob, Ski 및 Smurfl은 이들 유전자의 음성 조절과 연관된다. 이들 중 Smadδ는 BMP의 전사를 억제하고, BMP 신호 경로의 음성 피드백 역할을 한다(Bai et al., J Biol Chem, 2000, 275: 8267- 8270). Tob는 항증식성(antiproliferative) 단백질 패밀리의 맴버로, BMP/Smad 신호의 음성 조절과 연관된다(Yoshida et al., Cell, 2000, 103: 1085-1097). Ski 종양 단백질(oncoproein represses)은 BMP-신호(signaling) 및 BMP-감수성 유전자의 발현을 억제하고, BMP의 특성으로 Smad 복합체와 반응하여 직접적으로 BMP의 활성을 억제한다(Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 14394-14399). Smurfl은 유비퀴논 리가제(ubiquitin ligase)의 Hect 패밀리에 속하고, 수용제-조절되는 Smad와 선택적인 결합에 의해 BMP의 신호절달을 억제한다(Zuh et al., Nature, 1999, 400: 687-693).

BMP 패밀리 단백질의 기능은 이후 연구에서 진행되며, 배아기에서 신경계(Farkas et al., J Neurosci, 1999, 92: 227-235), 눈(Mohans et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998, 39: 2626-2636), 폐, 신장, 전립선, 생식기 및 모낭을 포함하는 기초 신체 형성과 연관되어 있다. 예로써 손가락 사이의 손가락 및 공간의 형성은 BMP에 의한 손가락 사이의 세포사멸(apoptosis)에 기인한 것으로 보고되었다(Zou and Niswander, Science, 1996, 272: 738). BMP는 배아기 동안에 형성, 분화 및 골격계통(skeletal system) 형성과 연관된다. 출생 후 골격계통에서 BMP는 뇌 간질(brain stroma)의 콜라겐, 골막세포(periosteum cell) 및 혈액 형성 요소로 채워진 세포간질(matrix)의 간엽세포에 존재한다. BMP는 또한 골육종(osteosarcoma) 및 연골육종(chondrosarcoma)에서 분리되었다(Lianjia and Yan, Clin Orthop, 1990, 257: 249-256). 골절 후, BMP는 흡수된 골 세포간질에서 확산되고, 골전구세포(osteoprogenitor cell)를 활성화하고, 차례로 BMP를 생산한다. BMP의 분배는 치료 시간 및 골절 위치에 좌우되며, 의존하며, 상호 반응에 비롯되어 더욱 복잡해진다. 또한 BMP 연구는 다양한 다른 기관에서 수행되었으며, 허혈(ischemia) 및 심장 근육의 재관류에서 심장 근육의 기능(Lefer et al., J MoI Cell Cardiol, 1992, 24: 585-593) 및 실험에서 복강으로 BMP를 주입한 후 대뇌 허혈(cerebral ischemia)이 유도된 광범위한 신경계의 보호 효과를 가지며, 손상된 신장의 재생 효과를 가짐을 증명하였다(Ripamonti and Duneas, Plast Reconstr Surg, 1998, 101: 227-239).

BMP 단백질 치료( BMP Protein Therapy )

본 발명은 신경 재건 또는 이후의 퇴화를 예방하기 위해 신경 퇴화 자리에 BMP 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 우선적으로 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-9이다.

치료용 조성물( Therapeutic Composition )

하나의 실시태양에 있어서, 본 발명은 신경 퇴화로 특징되는 다양한 질환의 치료에 관한 것이다. 이런 방식으로 발명된 치료용 화합물은 신경 퇴화를 억제하는 제공된 화합물에 의해 퇴화 질환으로 고통받거나 고통받기 쉬운 인간 환자에게 투여될 수 있다. 특히 질환은 특이적으로 해마(hipocampus) 및 대뇌피질에서 신경 세포의 손실되고 뉴로트렌스미터를 감소시키는 뇌의 신경퇴행성 질환, 척추의 신경을 부시는 대뇌혈관 퇴화 및/또는 신경 세포의 손실과 연관있다.

*치료용 화합물 제조는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 참고문헌은 레밍턴 약학 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA)에 알맞게 제조될 수 있다. 예를 들어 약 0.05 ㎍ 내지 약 20 m/kg/체중/1일이 투여될 수 있다. 최적 치료 반응을 제공하기 위하여, 투여 기간은 조정될 수 있다. 예를 들어 여러 번 분할된 투여는 매일 투여되거나 또는 투여량은 치료 상황의 위급도에 의해 비례적으로 감소될 수 있다. 활성 화합물은 구강(oral), 정맥내(intravenous)(수용액), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 비강(intra nasal), 피내(intradermal) 또는 좌제(suppository) 경로 또는 이식(implanting)(예 내복막(intraperitoneal) 경로를 통하여 천천히 분자를 분비 또는 생체외(in vitro)에서 민감하고, 수용체에 전달되는, 예를 들면 단핵세포(monocyte)와 같은 세포를 사용)과 같은 편리한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라 펩티드는 효소의 활성, 산 및 상기 성분을 비활성화 시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터의 보호를 위해 물질로 코딩되는 것이 필요할 수 있다.

예를 들면, 펩티드의 저 지질친화성(low lipophilicity)은 펩티드 결합을 자를 능력이 있는 효소에 의한 위장관로(gastrointestinal tract)에서의 파괴 및 산 가수분해에 의한 위에서의 파괴를 허용한다. 비경구 투여 이외 방법에 의한 펩티드를 투여하기 위하여 본 발명의 펩티드는 비활성을 예방하기 위한 물질로 코딩하거나 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 어주번트(adjuvant) 안에 담겨 투여될 수 있고, 효소 억제자 또는 리포좀(liposome) 안에 담겨 함께 투여될 수 있다. 여기서 고려되는 어주번트는 레조르시놀(resorcinols), 폴리옥시에칠렌 올레일 에테르(polyoxyethylene oleyl ether) 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르(hexadecyl polyethylene ether)와 같은 비-이온 계면활성제(surfactants)를 포함한다. 효소 억제자는 췌장 트립신 억제자(pancreatic trypsin inhibitor), 디이소프로필포스포플루오르포스페이트(diisopropylfluorophosphate, DEP) 및 트라시롤(trasylol)을 포함한다. 리포좀은 일반적인 리포좀(conventional liposome)과 같은 수중유중수적(water-in-oil-in-water) CGF 이멀젼을 포함한다.

또한 활성 화합물은 비경구 또는 복강 투여될 수 있다. 또한 분산제(dispersion)는 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜(glycerol liquid polyethylene glycols) 및 이들의 혼합물 및 오일(oli)에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 또는 사용 조건 하에서 이들의 조제는 미생물의 성장을 예방하기 위한 방부제를 포함한다.

주사제로 적합한 약학적 제형은 멸균 주사 용액 및 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 액체 용액(수용성) 또는 분산제 및 멸균 파우더를 포함한다. 모든 경우 제형은 멸균되어야 하고, 쉬운 시린지어빌리티(syringability)가 존재하는 범위에서 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 또는 진균류(fungi)와 같은 미생물의 오염 활성에 반하여 보존되어야 한다. 담체는 솔벤트(solvent) 또는 물, 에탄올, 폴리올(예, 글레시롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 분산매(dispersion medium) 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 기름일 수 있다. 적합한 유동질(fluidity)은 제조될 수 있으며, 예로써, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅의 이용, 확산제의 경우 필요한 입자 크기의 제조 및 계면활성제의 이용이 있다. 미생물 활동의 예방은 다양한 항생제 및 항균제를 통해 이루어지는데, 예로써 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀(phenol), 소르브산(sorbic acid) 등이 있다. 많은 경우 등장화제(isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직한데, 예로써 당(suger) 또는 소디움 클로라이드(sodium chloride)가 있다. 주사용 조성물의 장기 흡수는 지연 흡수제 조성물의 사용으로 이루어지는데 예로써 알루미늄 모노스테레이트(aluminium monostearate) 및 젤라틴(gelatin)이다.

멸균 주사 용액은 적합한 솔벤트와 상기 열거된 다양한 다른 유효성분을 필요한 양으로 활성 화합물과 혼합하여 제조될 수 있고, 필요에 따라 여과 멸균(filtered sterilization)한다. 일반적으로 분산제는 다양한 멸균 활성 유효성분을 염기 분산제매(dispersion medium)를 포함하는 멸균 부형제(sterile vehicle) 및 상기 열거된 필요한 다른 성분으로 혼합하여 제조될 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우, 적합한 제조 방법은 진공건조(vacuum drying) 및 유효성분의 파우더와 이전에 이들의 멸균-여과 용액으로부터 추가적으로 원하는 어떤 성분이 더하여 산출되는 냉동 건조(freeze-drying) 기술이다.

펩티드가 상기 기재된 대로 적합하게 보호받을 때, 활성 화합물은 예를 들면, 비활성 희석제(inert diluent) 또는 동화성 식용 담체로, 또는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐로 포장되거나, 타블렛(tablet)으로 압착하거나, 식이 식품에 직접적으로 혼합되어 구강투여될 수 있다.

구강 치료용 투여를 위해 활성 화합물은 첨가제와 혼합될 수 있고, 섭취용 타블렛(ingestible tablet), 구강 타블렛(buccal tablet), 정제(troches), 캡슐(capsules), 엘릭시르(elixirs), 현탁액(suspension), 시럽(syrup), 웨이퍼(wafer) 등등의 제형으로 이용될 수 있다. 상기 조성물 및 조제물은 활성 화합물을 중량(weight)의 적어도 1% 포함될 수 있다. 조성물 및 조성물의 퍼센트는 물론 다양할 수 있으며, 유닛(unit)의 중량(weight)의 약 5% 내지 약 80% 사이가 적합할 것이다. 상기 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 포함된다. 본 발명에 따른 적합한 조성물 또는 조제물은 구강 투여 유닛 제형으로 활성 화합물 0.1 ㎍ 내지 2000 mg을 포함하도록 제조된다.

타블렛, 알약(pill), 캡슐 등은 또한 하기를 포함할 수 있다: 트랜거캔서 고무(gum tragacanth), 아카시아(acacia), 옥수수 녹말(corn starch) 및 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate)와 같은 첨가제; 옥수수 녹말, 감자 녹말(phtato starch), 알긴산(alginic acid) 등과 같은 붕해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)와 같은 윤활제(lubricant); 및 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미제(sweetining agent) 또는 페퍼민트(peppermint), 노루발풀(winter green) 기름 또는 체리향과 같은 향미제(flavoring agent). 투여량 유닛 제형이 캡슐일 때, 상기 타입의 물질에 더하여 추가적으로 액체 담체가 포함외욀 수 수 있다. 다른 다양한 물질는 코팅 또는 투여량 유닛의 물리적 제형이 다른 방법으로 변형되어 존재될 수 있다. 예를 들면, 타블렛, 알약 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당 또는 두 가지 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로오스, 방부제로서 메틸파라벤(methylparaben) 및 프로필파라벤(propylparaben), 염료(dye) 및 체리향 또는 오렌지 향과 같은 향미제를 포함할 수 있다. 물론 여러 투여량 유닛을 제조하는데 이용되는 모든 물질는 약제학적으로 순수하고, 채택되는 양에서 충분히 비독성이다. 그에 더하여 활성 화합물은 지속성 방출 제제 및 제조와 통합된다.

여기에서 이용되는 "약학적으로 허용가능한 매질 및/또는 희석제"는 또는 어떤 모든 솔벤트, 분산매(dispersion media), 코닝 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등이다. 약학적인 활성 물질을 위한 상기 매질과 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 유효성분과 상반되는 어떠한 전통적인 매질 또는 작용제에 한하여 제외하고, 치료적 조성물에 있어서 이들의 이용은 고려된다. 또한 추가 유효성분은 상기 조성물에 통합될 수 있다.

투여의 간단함 및 투여량의 동일성을 위한 투여량 유닛 제형(dosage unit from)에서 비경구 조성물로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 여기에서 사용된 투여량 유닛 제형은 포유류 대상을 치료하기 위한 단일 투여량으로 적합하게 물리적으로 분리된 것을 말한다; 활성 물질의 미리 결정된 양을 포함하는 각각의 유닛은 필요한 약제학적 담체와 연합하여 원하는 치료 효과를 생산하기 위하여 계산되었다. 본 발명의 투여량 유닛 제형을 위한 명세서에서는 (a) 성취하기 위한 활성 제재의 독특한 특성 및 특정한 치료 효과 및 (b) 신체 건강을 손상하는 질환 조건을 가진 살아있는 대상체에서 질환 치료를 위한 활성 물질을 조성하는 당업계의 고유한 한계에 직접적으로 의존하며, 구술되었다.

주요 유효성분은 투여량 유닛 제형에서 적합하게 약제학적으로 허용가능한 매질과 함께 유효량으로 편리하고 효과적인 투여를 위해 합성되었다. 예를 들면 유닛 투여 제형은 0.5 ㎍ 내지 약 2000 mg의 범위의 량에서 주요 활성 화합물을 포함할 수 있다. 비율 안에서, 활성 화합물은 일반적으로 담체의 약 0.5 ㎍/㎖로 존재한다. 보조 유효성분을 포함한 조성물의 경우, 투여량은 일반적인 투여량 및 상기 성분의 투여 방법을 참조하여 결정된다.

전달 시스템( Delivery Systems )

다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 화합물에 적용되어 이용될 수 있는데, 예로써, 리포좀, 극미립자(microparticle), 미소캡슐(microcapsule)의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개의 엔도사이토시스(endocytosis), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로의 핵산의 구축 등이 있다. 도입 방법은 피내(intradermal), 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내(subsutaneous), 비강내, 경막밖(epidural) 및 구강 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 화합물 또는 조성물은 어떤 편리한 경로로든 투여될 수 있는데, 예를 들면 주입(infusion) 또는 환약 주입(injection), 상피 또는 점막피부(mucocutaneous) 안(예; 구강 점막, 직장 및 창자 점막 등)을 통해 흡수되고, 또한 다른 생물학적인 활성 작용제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국부로 될 수 있다. 추가적으로 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물은 뇌실내(intraventricular) 및 포막내(intrathecal) 주입을 포함하는 어떠한 적합한 경로를 통해 중앙신경계로 적용하는 것이 바람직하다; 뇌실내 주입은 뇌실도관(intraventricular cathether)을 통해 용의하며, 예를 들어 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)와 같은 리버저가 추가된다. 또한 폐 투여(Pulmonary administration)는 예를 들어 인할러(inhaler) 및 네불라이져(nebulizer)의 이용 및 에어로졸 제제의 제조가 쓰일 수 있다.

특이적 실시태양에 있어서, 본 발명의 약학적 화합물 및 조성물은 치료가 필요한 지역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직하다; 예를 들어 수술 중의 국소 주입, 수술 후 상처 드레싱과 합께 결합하는 국소 적용, 주입, 카페터, 좌약, 다공성, 비-다공성 또는 시알라스틱(sialastic) 막을 포함하는 막 또는 섬유를 포함하는 삽입(implant)에 의해 성취될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체 또는 펩티드를 포함하는 단백질을 적용할 때 바람직하게는 보관시 반드시 단백질을 흡수하지 않은 물질을 사용해야 한다. 다른 실시태양에서 화합물 또는 조성물은 액포(vesucle)로, 바람직하게는 리보좀으로 전달될 수 있다. 또 다른 실시태양에서는 화합물 또는 조성물은 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시태양에서는 펌프(pump)가 이용될 수 있다, 다른 실시태양에서는 중합체 물질(polymeric material)이 이용될 수 있다. 또 다른 실시태양에서는 방출 조절 시스템은 예로써 오직 국소 투여량의 분획(fraction)이 필요한 뇌와 같은 치료 목적의 근접한 부분에 위치할 수 있다.

투여가 수용하는 동물에 의해 내성 또는 다른 점에서 동물의 적용에 알맞을 때 화합물을 "약학적 또는 생리학적으로 허용가능"하나고 말할 수 있다. 투여된 총량이 생리학적인 의미가 있다면 상기 작용제는 "치료학적으로 유효한 양"이 적용되었다고 말할 수 있다. 수용하는 환자의 생리학에서 검출가능한 변화가 유래된다면 작용제는 생리학적으로 의미가 있다.

유전자 치료( Gene Therapy )

특이적인 실시태양에서, TGF 수퍼패밀리 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 유전자 치료 과정에 의해 신경 퇴화와 연관된 질환 또는 증상을 치료, 억제 또는 예방하기 위해 투여되었다. 유전자 치료는 발현되거나 또는 발현 가능한 핵산을 대상에 투여를 수행하는 치료를 말한다. 본 발명의 실시태양에서 핵산은 치료 효과를 달성하는 암호화된 단백질을 생산한다.

유전자 치료 방법의 일반적인 고찰을 위해 Goldspiel 등(Clinical Pharmacy 12:488-505, 1993); Wu 및 Wu(Biotherapy 3:87-95, 1991); Tolstoshev(Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596, 1993); Mulligan(Science 260:926-932, 1993); 및 Morgan 및 Anderson(Ann. Rev. Biochem. 62:191-217,1993); May(TIBTECH 11(5):155- 215, 1993)을 참조하라. 재조합 DNA 기술의 당업계에 알려진 일반적인 방법은 Ausubel 등(eds.), Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, NY, 1993); 및 Kriegler(Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990)에 기재된 것을 이용할 수 있다.

바람직한 양상에서, 핵산 서열은 TGF 수퍼패밀리 폴리펩티드에 속하는 단백질을 암호화할 수 있고, 핵산 서열은 적합한 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 바람직하게는 상기 핵산 서열은 프로모터(promoter)에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드 코딩 지역(coding region)을 가지며, 상기 프로모터는 유도성 또는 구조적이며, 선택적으로 조직 특이적이다. 다른 특정한 실시태양에서 핵산 분자는 폴리펩티드를 암호화하는 서열로 이용되고, 어떤 원하는 서열은 게놈 상의 원하는 자리에 상동 재조합(homologus recombination)을 증진시키는 지역에 의해 측면에 위치한다. 그러므로 항체 암호화 핵산의 염색체내 발현을 제공한다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

환자로의 핵산의 전달은 직접적 또는 간접적일 수 있는데, 직접적일 경우 환자는 핵산 또는 핵산을 보유한 벡터에 직접적으로 노출되고, 간접적일 경우 생체외(in vitro)에서 맨 처음 세포가 핵산에 의해 형질전환되고, 이후 환자에게 이식된다. 두 경우 각각 모두 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo) 유전자 치료로 각각 잘 알려져 있다.

특이적인 실시태양에서, 핵산 서열은 생체내(in vivo)에서 직접적으로 주입되고, 암호화된 생산물을 생산하기 위해 발현된다. 이는 적합한 핵산 발현 벡터의 부분에 구축하고 이들이 세포내로 들어가도록 투여하는 방법, 불완전하거나 독소를 약화시킨 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 이용하여 감염하는 방법, 또는 그대로의 DNA(naked DNA) 또는 지질(lipid) 또는 세포-표면 수용체 또는 형질도입제로 코딩한 DNA, 리포좀, 극미립자 또는 미소캡슐의 캡슐화된 DNA의 집접적인 주입, 또는 핵 내로 들어간다고 알려진 펩티드와 연결하여 이들은 투여하는 방법, 수용체-매개 엔도싸이토시스되는 리간드와 연결하여 이를 투여하는 방법(참조, 예, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987)(특이적으로 수용체를 발현하는 목적 세포 타입을 이용할 수 있다)등과 같은 여러 방법 중 어느 하나로 성취될 수 있다. 다른 실시태양에서, 핵산-리간드 복합체는 핵산이 리보좀 퇴화를 피하기 위해 엔도좀(endosoem)을 교란하기 위한 용해성 바이러스 펩티드(fusogenic bial peptide)를 포함하는 리간드로 형성될 수 있다. 또 다른 실시태양에서 핵산은 세포 특이적 업-테이크(uptaek) 및 발현을 위해 특이적 수용체의 표적화를 통해 생체내(in vivo)에서 표적화할 수 있다. 대안적으로 핵산은 상동 재조합에 의하여 발현을 위해 세포 내에 도입될 수 있고, 숙주 세포 DNA에 통합될 수 있다(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935, 1989; Zijlstra et al., Nature 342:435-438, 1989).

특이적 실시태양에 있어서, 폴리펩티드를 암호화한 핵산 서열을 포함한 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 유전자 치료에 이용되는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열은 하나 또는 그 이상의 벡터로 클론될 수 있고, 환자에게로 유전자 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 부속 바이러스는 바이러스 벡터의 예로서 이용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 포장 및 숙주 세포 DNA의 통합에 필요한 구성성분을 포함한다.

*아데노바이러스는 특히 호흡기 상피(respiratory epithelia)에 유전자를 전달하는데 매력적인 매개체인데, 이들은 자연적으로 호흡기 상피에 감염되어 가벼운 병의 원인이 되기 때문이다. 아데노바이러스-기초 전달 시스템의 다른 표적은 간, 중앙신경계, 상피 세포 및 근육이 있다. 추가적으로 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV)는 또한 유전자 치료의 이용에 제안되었다.

유전자 치료의 다른 접근은 전기 천공법(electroporation), 리포펙션(lipofaction), 칼슘 포스페이트 매개 형질감염(transfection) 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 조직 배양시 세포에 유전자를 전달하는 것이 연관된다. 일반적으로 전달 방법은 세포의 선별적 마커를 전달하는 것을 포함한다. 세포는 선택되고 전달된 유전자를 발현하는 세포를 분리하기 위하여 선별 하에 평가된다. 그러한 세포는 환자에게 전달된다.

*실시태양에서, 핵산은 재조합 세포를 생체내(in vivo)로 투여하기 전에 세포로 도입된다. 상기 도입은 이에 한정되는 것은 아니나, 형질감염, 전기천공법, 미세주입(microinjection), 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터의 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 미세세포(microcell)-매개 유전자 전달, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등으로 당업자에게 알려진 방법과 같은 수행될 수 있다. 많은 기술이 세포에 외래 유전자를 도입하는 방법으로 당업계에 공지되었으며, 이는 수여자 세포의 필요한 개발 및 생리학적 기능을 제공하기 위해, 본원 발명과 일치하게 이용될 수 있다. 상기 기술은 세포에서 핵산의 안전하게 전달하기 위해 제공되어야 하고, 상기 핵산은 세포에서 발현될 수 있고, 상기 세포 자손에게 유전적으로 전달되고 발현되는 것이 바람직하다.

핵산이 유전자 치료를 위해 도입될 수 있는 세포는 어느 것을 원하던 이용될 수 있는 모든 세포를 포함하고, 이에 한정되는 것은 아니나 상피 세포, 내피 세포(endothelial ceoll), 각질형성세포(keratinocyte), 섬유아세포, 근육 세포, 간 세포; T-림프구, B-림프구, 백혈구 세포(monocyte), 대식세포(macrophage), 호중성 백혈구(neutrophil), 호산구(eosinophils), 거대핵세포(megakaryocyte), 과립구(granulocyte)와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기세포 또는 원조 세포(progenitor cell), 특히 예로써 골수, 제대혈(umbilical cord blood), 말초 혈액, 태아 간(fetal liver) 등에서 수득되는 조혈 줄기 세포 또는 원조 세포를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 유전자 치료에 이용된 세포는 환자에게 자가 조직이다. 대안적으로 환자는 자가 조직일 수 있다.

특이적인 실시태양에서, 유전자 치료를 목적으로 도입된 핵산은 암호화된 지역과 실질적으로 연결되어 유도가능한 프로모터로 구성된다. 상기 핵산의 발현은 전사의 적합한 유도자의 존재 유무의 조절에 따라 조절될 수 있다.

특이적으로 BMP-3 또는 BMP-4를 암호화하는 유전자가 형질전환된 NIH3T3 세포가 세포독성제인 메스암페타민(methamphetamine)에 노출되었을 때 세포는 보다 적게 사멸하였다. 이후 신경 독성 카인산(kainate)에 노출된 마우스에 BMP-4를 암호화하는 유전자가 형질전환된 NIH3T3 세포로 치료되었을 때, 신경보호 작용이 발생하였다.

실시예

실시예 1 - 재료 및 방법

재료

400 ± 10 g 무게의 성숙한 Sprague-Dawley계 랫트(rat: 16-18 주령)를 본 연구에 이용하였다. 성숙한 랫트를 이용한 이유는 성장기의 랫트와 비교하여 신경 재생 및 생리 변화를 관찰하기 용이하기 때문이다.

방법

기능적 단백질 BMP를 말초신경에 주입하는 것은 기술적으로 어렵다. 그러므로 본 발명에서는 BMP2, BMP4, BMP9를 생산하는 랫트 섬유아세포 및 신경교세포 유래 신경영양성 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)를 말초 신경에 직접적으로 세포감염시켰고, 이로써 BMP2, BMP9 및 GDNF가 국소적으로 분비되었다. 60마리 랫트 전체는 5 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 신경에 손상이 있는 12마리 랫트로 구성되었다. 첫번째 그룹은 전달 유전자 없이 비변형 섬유아세포가 처리된 신경 손상이 있는 랫트인 대조군 그룹이다. 두번째 그룹(BMP2 그룹)은 BMP-2 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 또한 세번째 그룹(BMP3 그룹)은 BMP-4 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 4번째 그룹(BMP9 그룹)은 BMP-9 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 5번째 그룹(GDNF 그룹)은 GDNF 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유하세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 조직의 조직학적 검사(Histological examination)는 처리 후 2, 4 및 8주 후에 각 그룹 당 2마리씩 희생하고 양쪽 다리로부터 좌골 신경(sciatic nerves)을 수득하여 수행하였다. 또한 신경 운동 전도 연구는 대퇴에서 유래된 좌골 신경으로 수행하였으며, 실험전을 최초 기본값으로 세팅하고, 수술 후 8주 동안 그 주가 끝나기 전에 신경 전도를 측정하였다.

신경 손상( Nerve Injury )

백색 랫트를 4% 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate)를 300 mg/kg 농도로 복부강에 주입하여 마취하였다. 털은 엎드린 자세로 고정시키기 전에 후부(posterior) 및 오른쪽 다리의 대퇴부(femoral region)로부터 제거하였다. 대퇴부를 포다딘(potadine) 및 70% 알코올로 소독한 후, 대퇴부 중심 부분 주위의 표피(epidermis) 1 - 1.5 cm 정도를 수직으로 절개하고, 좌골 신경을 들어내기 위하여 바깥쪽으로 잡아당겼다. 신경 손상은 DeKoning 등(De Koning et al., J Neurol Sci, 1986, 74: 237-246)의 방법에 따라 넓적다리와 전체 무릎 관절(total knee joint) 사이를 2 - 2.5 cm 길이로 절개하고, 좌골신경을 노출하기 위하여 후부 및 전체 무릎 관절 근육을 벗긴 후, 좌골 탈출(sciatic herniation)로 노출된 신경을 30초간 지혈 겸자(haemostatic forcep, Crile, 15 cm)로 압박하여 수행되었다.

겸자는 유지력(holding strength)의 3가지 다른 레벨이 되도록 하고, 고정된 지역에 신경 손상을 위한 동일한 강도의 유지력을 적용하기 위해 검은색은 가장 강한 유지 레벨로 고정된 지역에서 압박된 신경 끝으로부터 5 cm로 겸자에 표시되었다. 지혈 겸자를 제거한 후 첫번째 또는 대조군 그룹은 완충액과 0.05 ㎖ 비-변형 섬유아세포(유닛 : 5 × 10⁵ 세포/50 ㎕)를 울트라 파인 니들(30 게이지) 주사기를 이용하여 손상 지역 2 mm에 주입되었다. 두번째 및 세번째 실험 그룹은 상처 지역을 봉합하고 살균하지 전에 BMP2, BMP4, BMP9, GDNF를 각각 분비하는 유전자-변형 섬유아세포를 상기 같은 방법으로 주입하였다.

신경 전도 테스트( Nerve Conduction Test )

신경 전도 테스트는 4% 클로랄 하이드레이트로 랫트를 마취한 후에 수행되었다. 좌골절흔(sciatic notch)을 자극하기 위하여 활성-기록 전극(activity-recording electrode)은 종아리 근육에 두었고, 참조 전극(reference electrode)은 발에 두었으며, 접지 전극(ground electrode)은 자극하는 전극 및 참조 전극 사이에 두었다. 패치 전극(patch-like electrode)은 기록 전극으로 사용되었고, 접지 전극은 바늘 전극(needle electrode)을 이용하여 피부 밑에 두었다. 신경 전도 테스트는 KeyPoint(Dantec, Denmark)를 이용하여 하였다. 빈번하게 본 연구의 기록 인쇄 속도(recording printing rate) 및 기록 감수성(recording sensitivity)은 각각 2 - 10,000 Hz, 2 msce/division, 5 mV/division로 정하였다. 신경 전도 테스트는 매 2주마다 수행되었다. 측정은 실험의 시작 및 그 후 2, 4, 6 및 8주에 이루어졌다. 테스트 중의 지연(latency) 및 진폭(amplitude)은 기준선과 음성 전극 포인트 사이의 진폭으로 측정되었다. 신경 전도 연구를 위해 각 그룹에서 5 마리의 랫트가 선별되었고, 양쪽의 그룹에서 10번의 측정치를 얻었다. 실험실 및 랫 트의 온도는 각각 25℃ 및 30℃로 유지되었다.

병리학적/조직학적 조사( Pathological / Histological Tissue Examination )

자연 치유 현상을 관찰하기 위하여 랫트의 신경조직 검사는 실험 시작에서 손상이 있기 전의 정상 신경을 조사하였다. 4마리의 랫트(8개의 신경)가 전달 유전자 생산이 결핍된 세포가 있는 신경재생 관찰에 이용되었다. 각 그룹으로부터 무작위로 선정된 2마리의 랫트(4개의 신경) 및 조직은 2,4 및 8주 후에 조사되었다. 조직 검사를 위하여, 약 2 cm의 좌골 신경은 마취된 랫트의 압박된 손상 지역으로부터 벗겨졌다. 신경조직에서의 변화는 완충된 포름알데하이드(formaldehyde) 용액으로 고정되고, 헤마토실린-에오신(hematoxylin-eosin, H & E) 및 변형된 트리크롬(modified trichrome, MT) 염색으로 염색된 후 광학 현미경으로 관찰되었다.

데이타 분석( Data Anylysis )

신경 손상 후 2, 3, 6 및 8주에서 활성 전위의 최대 진폭 및 각각의 그룹으로부터 화합물 근육 지연 동안의 변화는 참조 그룹과의 비교를 통해 분석되었고, 통계 분석은 SPSS-PC 프로그램으로 수행되었다. 각각의 그룹 사이의 비교는 ANOVA 및 t-테스트(t-test)로 수행되었고, 유의값은 0.05로 정하였다. 손상 및 재생의 정도는 병리학자가 해성된 조직학적 데이터로 결정되었다.

실시예 2 - 체중 변화( wheght change )

초기에 랫트는 400 ±10 g 몸무게가 나갔다. 이후 체중 변화는 표 2에서 보여주었다. 2주에서는 각각의 그룹 사이에 변화가 관찰되지 않았으나, 4 및 6 주에서 BMP9 그룹이 다른 그룹과 비교했을 때 약간의 차이(P<0.05)를 보였다. 8주 후, 그룹들간의 통계적으로 유의한 차이가 없었다(p>0.05)(표 1).

실험 그룹의 체중 변화

	2주	4주	6주	8주
Sham	380.7±29.0	365.0 ±57.7	430.0 ±57.7	460.0 ±46.2
BMP2	370.6 ±24.8	368.3 ±74.7	382.5 ±141.5	470.0 ±40.9
BMP4	375.3 ±23.6	369.3 ±76.9	395.5 ±85.5	490.0 ±50.8
BMP9	366.8 ±34.2	442.0 ±79.8	505.0 ±77.6	508.0 ±60.6
GDNF	378.4 ±22.7	398.2 ±64.2	422.3 ±89.5	498.0 ±55.9

실시예 3- 지연 변화( Changes of Latency )

실험 전에 각 그룹에서 무작위적으로 측정된 기본값은 1.44 ±0.11 msec 지연이었다. 외상 후 지연은 2 및 4주에서 대조군 그룹, BMP2 그룹, BMP4 그룹, BMP9 그룹 및 GDNF 그룹 간의 차이를 보여주나 통계적 유의성(p>0.05)는 결여되었다. 6주에서 대조군 그룹과 비교했을 때 BMP2 및 BMP9 그룹의 지연은 유의적으로 단축되었다(p<0.05). 그러나 8주에서 5 그룹 중 지연에는 차이가 없었다(p>0.05)(표 3).

그룹의 지연 변화

	2주	4주	6주	8주
Sham	1.30 ±0.11	1.29 ±0.04	1.25 ±0.21	1.10 ±0.0
BMP2	1.24 ±0.14	1.25 ±0.07	1.08 ±0.07*	1.04 ±0.04
BMP4	1.25 ±0.13	1.26 ±0.08	1.07 ±0.05*	1.14 ±0.03
BMP9	1.19 ±0.12	1.23 ±0.10	1.06 ±0.03*	1.15 ±0.07
GDNF	1.22 ±0.14	1.24 ±0.05	1.09 ±0.06*	1.15 ±0.05

실시예 4-진폭 변화( Changes of Amplitude )

실험 전 각 그룹으로부터 무작위적으로 측정한 기본값은 23.9 ±4.3 mV 진폭이었다. 외상 후 2 및 4주에서 대조군 그룹과 비교했을 때 BMP9 그룹의 진폭이 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 6주 후 대조군 그룹과 비교했을 때 BMP2 및 BMP9 그룹은 유의적 차이를 보였고(p<0.05), 유의적 차이는 8주에서 BMP9, BMP2 및 대조군 그룹에서 보였다(p<0.05)(표 4).

진폭 변화

	2주	4주	6주	8주
Sham	3.98 ±1.52	6.17 ±1.27	6.33 ±1.27	6.3 ±1.31
BMP2	6.14 ±1.51	7.51 ±1.29	9.00 ±1.69*	7.17 ±0.50*
BMP4	6.54 ±1.52	8.51 ±1.31*	8.90 ±1.59*	7.35 ±0.60*
BMP9	6.79 ±1.34*	9.53 ±4.47*	9.47 ±1.22*	10.26 ±2.27*
GDNF	6.94 ±1.53	9.51 ±3.29	10.10 ±1.69*	11.17 ±1.80*

실시예 5- 조직학 및 병리학적 관찰

변화를 보이는 각각의 그룹에서 무작위적으로 선별된 조직학적 신경조직 조사는 신경 생리학적 조사 결과 유사하다. 신경조직의 엑손으로부터 가장 더딘 회복 속도를 보여준 대조군 그룹은 재생되지 않고, 염증성 반응이 남아있었다. BMP2, BMP4, BMP-9 또는 GDNF를 분비하는 유전자 변형 섬유아세포가 형질감염된 그룹은 초기에는 대조군과 비교했을 때 어떠한 유의적 차이를 보이지 않았으나, 모든 그룹은 2주에서 신경의 압박 손상으로 인해 액포(vacuolar) 변화 및 염증성 단핵구의 침윤 및 신경외막 정맥(epineurium vein)의 출혈과 같은 격한 병리학적 징후를 보였다. 대조군 그룹에서 이러한 현상은 8주간 계속되었다. 그러나 BMP2 그룹은 염증 반응의 크기 및 액포 변화가 유의적으로 감소하였고, 4주 및 8주에서 그룹의 절반만이 상기와 같은 증상을 보였다. BMP4, BMP9 또는 GDNF 그룹에서 4주 및 8주때 상기 효과가 더욱 탁월하였고, 이들 중 오직 1/3만이 엑손 손실 및 액포 변화를 보였다. 염증 반응은 매우 적었다.

실시예 6

재료

400 ± 10 g 무게의 성숙한 Sprague-Dawley계 랫트(rat: 16-18 주령)를 본 연구에 이용하였다. 성숙한 랫트를 이용한 이유는 성장기의 랫트와 비교하여 신경 재생 및 생리 변화를 관찰하기 용이하기 때문이다.

방법

최대한 안전한 결과를 얻기 위해 암 형성의 가능성을 회피할 목적으로 방사선이 조사된 슈반 세포(schwann cell)를 주입하였다. 그러므로 본 연구에서, BMP2, BMP4 및 GDNF를 생산하는 랫트 슈반세포는 15 Gy 강도로 방사선 처리되었으며, BMP2, BMP4 및 GDNF가 국소적으로 분비되도록 직접적으로 말초신경으로 형질감염되었다. 60마리 랫트 전체는 5 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 신경에 손상이 있는 12마리 랫트로 구성되었다. 첫번째 그룹은 전달 유전자 없이 비변형 섬유아세포가 처리된 신경 손상이 있는 랫트인 대조군 그룹이다. 두번째 그룹(BMP2 그룹)은 BMP-2 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 또한 세번째 그룹(BMP3 그룹)은 BMP-4 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 4번째 그룹(BMP9 그룹)은 BMP-9 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유아세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 5번째 그룹(GDNF 그룹)은 GDNF 전달 유전자로 유전자 변형된 섬유하세포가 처리된 신경 손상된 랫트로 구성되었다. 조직의 조직학적 검사(Histological examination)는 처리 후 2, 4 및 8주 후에 각 그룹 당 2마리씩 희생하고 양쪽 다리로부터 좌골 신경(sciatic nerves)을 수득하여 수행하였다. 또한 신경 운동 전도 연구는 대퇴에서 유래된 좌골 신경으로 수행하였으며, 실험전을 최초 기본값으로 세팅하고, 수술 후 8주 동안 그 주가 끝나기 전에 신경 전도를 측정하였다.

신경 손상( Nerve Injury )

백색 랫트를 4% 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate)를 300 mg/kg 농도로 복부강에 주입하여 마취하였다. 털은 엎드린 자세로 고정시키기 전에 후부(posterior) 및 오른쪽 다리의 대퇴부(femoral region)로부터 제거하였다. 대퇴부를 포다딘(potadine) 및 70% 알코올로 소독한 후, 대퇴부 중심 부분 주위의 표피(epidermis) 1 - 1.5 cm 정도를 수직으로 절개하고, 좌골 신경을 들어내기 위하여 바깥쪽으로 잡아당겼다. 신경 손상은 DeKoning 등(De Koning et al., J Neurol Sci, 1986, 74: 237-246)의 방법에 따라 넓적다리와 전체 무릎 관절(total knee joint) 사이를 2 - 2.5 cm 길이로 절개하고, 좌골신경을 노출하기 위하여 후부 및 전체 무릎 관절 근육을 벗긴 후, 좌골 탈출(sciatic herniation)로 노출된 신경을 30초간 지혈 겸자(haemostatic forcep, Crile, 15 cm)로 압박하여 수행되었다.

겸자는 유지력(holding strength)의 3가지 다른 레벨이 되도록 하고, 고정된 지역에 신경 손상을 위한 동일한 강도의 유지력을 적용하기 위해 검은색은 가장 강한 유지 레벨로 고정된 지역에서 압박된 신경 끝으로부터 5 cm로 겸자에 표시되었다. 지혈 겸자를 제거한 후 첫번째 또는 대조군 그룹은 완충액과 0.05 ㎖ 비-변형 섬유아세포(유닛 : 5 × 10⁵ 세포/50 ㎕)를 울트라 파인 니들(30 게이지) 주사기를 이용하여 손상 지역 2 mm에 주입되었다. 두번째 및 세번째 실험 그룹은 상처 지역을 봉합하고 살균하지 전에 BMP2, BMP4, BMP9, GDNF를 각각 분비하는 유전자-변형 섬유아세포를 상기 같은 방법으로 주입하였다.

말초 신경 테스트( Peripheral Nerve Test )

측정은 실험의 시작 및 그 후 2, 4, 6 및 8주에 이루어졌다. 테스트 중의 지연(latency) 및 역치(threshold)는 기계역치(mechanical threshold)를 위해 Randall Selitto법에 의해 측정되었고, 온도 역치를 위해 뜨거운 욕조(49℃)에 의해 측정되었다. 실험실 및 랫 트의 온도는 각각 25℃ 및 30℃로 유지되었다.

데이타 분석

신경 손상 후 2, 3, 6 및 8주에서 각각의 그룹에서 최대 지연 및 역치는 참조 그룹과의 비교를 통해 분석되었고, 통계 분석은 SPSS-PC 프로그램으로 수행되었다. 각각의 그룹 사이의 비교는 ANOVA 및 t-테스트(t-test)로 수행되었고, 유의값은 0.05로 정하였다.

실시예 7-온도 지연의 변화

실험 전 각 그룹으로부터 무작위로 측정된 기초값은 12.44 ±3.13 sec 지연이었다. 외상 후 지연은 대조군 그룹, BMP2 그룹, BMP4 그룹 및 GDNF 그룹간의 차이를 보였다. BMP2, BMP4 및 GDNF 그룹의 지연은 6주에서 대조군과 비교했을 때 유의적으로 단축되었다(p<0.05)(표 5).

그룹 내 지연 변화

	3일	6일	9일	12일
Sham	11.25 ±1.17	12.29 ±1.04	12.85 ±1.21	11.10 ±2.09
BMP2	10.28 ±2.15	8.27 ±3.05	7.08 ±1.07*	8.04 ±3.34
BMP4	11.17 ±1.16	10.28 ±2.56	9.07 ±2.95	7.14 ±2.23*
GDNF	7.25 ±1.15*	6.52 ±2.18*	7.09 ±2.06*	6.15 ±2.05*

실시예 8 - 기계 역치의 변화( Changes of Mechanical threshold )

실험하기 전 각 그룹에서 무작위적으로 측정된 기본값은 12.1 ±1.0 g 역치였다. GDNF 그룹의 역치는 외상 후 6일 및 9일에서 대조군과 비교했을 때 유의적으로 감소하였다(p<0.05). BMP2 및 BMP4 그룹은 9일에서 대조군 그룹과 비교했을 때 유의적으로 차이가 있음을 보였다(p<0.05)(표 6).

진폭 변화

	3일	6일	9일	12일
Sham	10.59 ±1.52	9.37 ±1.57	10.31 ±1.20	11.3 ±1.01
BMP2	9.14 ±1.51	7.41 ±1.19	7.00 ±1.39*	10.17 ±0.50
BMP4	8.54 ±1.52	8.61 ±1.01	6.90 ±1.54*	9.35 ±0.40
GDNF	6.84 ±1.01*	6.31 ±1.19*	5.10 ±1.09*	8.17 ±1.80

실시예 9 - 조직학적 및 생리학적 관찰

변화를 보이는 각각의 그룹에서 무작위적으로 선별된 조직학적 신경조직 조사는 신경 생리학적 조사 결과 유사하다. 신경조직의 엑손으로부터 가장 더딘 회복 속도를 보여준 대조군 그룹는 재생되지 않고, 염증성 반응이 남아있었다. BMP2, BMP4, 또는 GDNF를 분비하는 유전자 변형 섬유아세포가 형질감염된 그룹은 초기에는 대조군과 비교했을 때 어떠한 유의적 차이를 보이지 않았으나, 모든 그룹은 2주에서 신경의 압박 손상으로 인해 액포(vacuolar) 변화 및 염증성 단핵구의 침윤 및 신경외막 정맥(epineurium vein)의 출혈과 같은 격한 병리학적 징후를 보였다. 대조군 그룹에서 이러한 현상은 8주간 계속되었다. 그러나 BMP2 그룹은 염증 반응의 크기 및 액포 변화가 유의적으로 감소하였고, 4주 및 8주에서 그룹의 절반만이 상기와 같은 증상을 보였다. BMP4, BMP9 또는 GDNF 그룹에서 4주 및 8주때 상기 효과가 더욱 탁월하였고, 이들 중 오직 1/3만이 엑손 손실 및 액포 변화를 보였다. 염증 반응은 매우 적었다.

실시예 10 - 메스암페타민( methamphetamine , MAP ) 유도성 세포독성에 답하는 BMP-3의 신경보호 효과

DMEM은 NIH 3T3 세포(대조군), BMP3 또는 BMP4를 위한 배양 배지로 이용되었다. 메스암페타민(MAP)의 높은 투여량(1 mM)에 24시간 동안 노출은 3T3 세포에서 유의적으로 세포독성을 유발한다(도 1의 "3T3" 그룹 위의 마름모 바; 사진 D를 나타냄. 세포 생존능은 3T3 세포 단독과 비교했을 때 대략 40% 이다. 도 1의 "3T3" 위의 닫힌 바; 사진 A를 나타낸다. 세포 생존능은 대략 100% 였다. 3T3 + MAP VS. 3T3 단독, P<0.01(Students' t-test)).

MAP-유도된 세포독성은 BMP-3 + MAP의 처리에서 유의적으로 관찰되지 않았다(도 1, "3T3-PMT-BMP3" 그룹 위의 닫힌 바와 마름모 모양의 바; 대표적인 사진 B는 3T3/BMP-3 단독을, 대표 사진 E는 MAP에 노출된 3T3/BMP-3를 보여준다. 3T3 + MAP vs. 3T3/BMP3 + MAP, P < 0.01 (Students' t-test)).

그러나 BMP-4는 MAP-유도 세포독성을 예방하지 못했다(도 1의 "3T3-hBMP4" 그룹 위의 닫힌 바 및 마름모 바. 닫힌 바는 3T3-BMP-4 단독을 의미한다; 대표 사진 C. 마름모 바는 MAP가 처리된 3T3/BMP-4 세포를 의미한다; 대표사진 F. 3T3/BMP4 단독 vs. 3T3/BMP4 + MAP, P < 0.01 (Students' t- test)). 세포 수/각 웰은 약 300,000이다.

실시예 11- BMP4 처리는 마우스에서 카인산 -유도된 뉴론 퇴화를 유의적으로 예방했다.

카인산(Kainate, KA)은 흥분신경 독소(excitoneuro toxin)로서 인간 측두엽(temperal lobe epilepsy)의 모델에서 잘 인지된다. 추가적으로 신경퇴화 변화에서 측정을 위한 생체내 유용한 도구이다. KA-유도된 뉴론 손실은 KA 수용체 활성을 통한다. KA 수용체는 해마의 CA3 영역에 주로 위치한다. CA 영역에서 해마에서 살린(saline) 용액 + KA를 수득하는 동물은 유의적인 뉴론 손실이 나타난다(좌측 C-like 영역의 세포 군집은 유의적으로 감소된다). 3T3의 대뇌뇌실내 주입(Intracerebroventricular injection, I. CV.)은 CA3 영역의 KA(LCV)-유도 뉴론 손실에 영향을 주지 않는다. 그러나 KA(I.C.V) 처리 전에 6시간 가량 BMP4를 발현하도록 재조합된 3T3 세포의 I.CV.는 CA3 영역내에서 뉴론 손실이 감소되었다(P < 0.01 vs. Sal + KA). 그러므로 BMP4는 KA-유도된 해마 퇴화에 반응하는 보호 요소이다.

여기의 모든 참고문헌은 이들의 전체 참고문헌에 의해 통합된다. 본 발명은 이곳에 기재된 특정한 실시태양에 의해 한정되지 않는다. 아울러 이곳이 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 앞선 명세서와 동봉된 도면으로부터 당업자에게 명백하다.

Claims (9)

1. 프로모터에 작동가능하게 연결된 형질전환 성장 인자(transforming growth factor; TGF) 슈퍼패밀리(superfamily)의 BMP(bone morphogenic protein)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포를 포함하고 손상된 신경의 주변 영역에 상기 형질감염된 세포 군집을 직접 이식하여 상기 손상된 신경의 주변 영역에서 상기 DNA 서열이 발현함으로써 신경 퇴화를 늦추는 것을 특징으로 하는 손상된 신경 또는 중추 신경계 병변의 퇴화 보호용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 BMP는 BMP-2, BMP-3, BMP-4 및 BMP-9로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 방사선 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 헤르페스(herpes) 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 손상된 신경 또는 중추 신경계 병변은 뇌신경퇴화를 일으키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 손상된 신경 또는 중추 신경계 병변은 간질을 일으키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포(fibroblast)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1항에 있어서, 상기 중추 신경계는 질병 상태에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 질병 상태는 뇌의 질병 상태인 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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