KR100328752B1

KR100328752B1 - 인간골형태발생단백질을사용한신경재생법

Info

Publication number: KR100328752B1
Application number: KR1019960700909A
Authority: KR
Inventors: 에이. 왕 엘리자베스; 에스. 달레싼드로 죠세핀; 토리우미 딘
Original assignee: 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈; 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 2002-09-26
Also published as: EP0716610A1; DK0716610T3; ES2265146T3; DE69434739T2; JPH09501932A; US5756457A; CA2169191A1; FI960809A; EP1716864A1; AU677866B2; NO960711D0; KR960703615A; DE69434739D1; KR100329409B1; WO1995005846A1; FI960809A0; JP2005007196A; CA2169191C; OA10358A; AU7868294A

Abstract

포유 동물에서 신경 세포의 성장을 유도하고, 신경 결함을 치료하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. 당해 방법은 상기 포유 동물의 신경 결함, 손상 또는 상실 부위에, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하거나 적당한 매트릭스에 흡착된 상태로, 유효량의 골 형태발생 단백질을 투여함을 특징으로 한다. 당해 장치는 임의로 다른 인자들과 조합하여, 적당한 매트릭스 상에 흡착되고 인공 신경 대체관 (vessel) 내에 함유된 상태인 골 형태발생 단백질을 포함한다.

Description

인간 골 형태발생 단백질을 사용한 신경 재생법

본 발명은 신경 세포의 증식 및 신경 조직 재생용 골(骨) 형태발생 단백질 (BMPs)의 약학적 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 당해 발명은 신경 세포 또는 신경 조직상의 퇴화, 죽음 또는 외상에 관한 중추 및 말초 신경계 질병뿐만이 아니라, 기계적 외상성 장애를 치료하기 위한 BMPs, 바람직하게는 BMP-2∼10의 용도에 관한 것이다.

선행기술

골 형태발생 단백질 2∼10 은 전환 성장 인자-β (TGF-β) 상족(superfamily)의 일원이다. BMPs는 원래 생체내 (in vivo)에서 골 형성을 유도할 수 있는 골 형성 단백질로 발견되었다. 전환 성장 인자는 조직 배양에서 성장한 포유 동물 세포의 표현형 전환을 유도하는 그들의 능력, 즉 전통적으로는 정상 세포로 부터 종양 세포로의 생체내 변화에 관련된 현상에 기초하여 초기에 확인되었다.

액손 유도에서 신경돌기 성장의 자극, 뉴론 형태발생 및 이동 기능을 하는 성상 세포는 신경계에서 발견되는 글리아 세포의 일 형태이다. 성상 세포는 또한 맥관 내피의 혈뇌 관문의 유도 및 뉴론으로의 혈액 수송에 관련되어 있다. 성상 세포는 세포 골격의 중간 필라멘트 단백질인 글리아 원섬유의 산성 단백질 (GFAP), 즉 매우 특이적인 성상 세포의 마커를 발현한다.

두가지 형태의 성상 세포가 위치 및 형태에 의하여 분류학적으로 나타내어 졌다. 원형질 성상 세포는 전형적으로 회백질에서 발견되며, 두껍고 널리 분지된 돌기를 갖는 반면, 섬유성 성상 세포는 백질에서 발견되며, 길고 곧은 돌기를 갖는다. 시신경에서 분리된 성상 세포는 GFAP와 표면 마커 A2B5에 대한 그들의 염색에 기초하여 항원적으로는 형태 1 및 형태 2로 나타내어 졌다. 별개의 시간대에서 두개의 상이한 발생 라인으로 부터 기인하므로, 형태 1성상 세포는 단지 GFAP에 대하여 염색되는 반면, 형태 2성상 세포는 A2B5와 GFAP 모두에 대하여 염색된다. 성상 세포는 신경 재생에서 중요한 요소인 액손 성장을 위한 유도 환경을 제공한다. 따라서, 성상 세포의 생존과 분화가 생존 및 재생이라는 뉴론 세포와 조직의 능력에 있어서 중요한 인자이다. 실버 등에 의한 미합중국 특허 제 5,202,120 호에는 활성화된 성상 세포를 사용하여 액손의 재생을 촉진시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 자가 이식과 같은 성상 세포의 공급을 필요로 한다는 점에서 불리하다.

본 발명의 요약

신경 세포의 성장을 유도할 수 있는 방법 및 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 신경 세포와 신경 조직의 발생, 및 신경 손상의 치료에 적합한 조성물 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.

한 태양에 의하면, 본 발명은 포유 동물의 신경 고갈, 손상 또는 결함 부위에 유효량의 재조합 인간 BMP (rhBMP)를 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하여 투여함을 특징으로 하는 신경 세포의 성장을 유도하는 방법을 제공한다. BMP는BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 및 BMP-2/6 과 BMP-2/7의 헤테로이합체로 구성된 군으로 부터 선택됨이 바람직하다.

또다른 태양에 의하면, 본 발명은 상기 포유 동물의 신경 고갈, 손상 또는 결함 부위에 신경 재생량의 rhBMP를 적합한 매트릭스와 조합하여 투여함을 특징으로 하는 신경 결함, 신경 손상 또는 어떤 신경 상태를 갖는 포유 동물의 치료 방법을 포함한다. BMP는 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 및 BMP-2/6 과 BMP-2/7의 헤테로이합체로 구성된 군으로 부터 선택됨이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 BMP-2, BMP-4 및 BMP-2/6 과 BMP-2/7의 헤테로이합체이다.

바람직한 태양에 의하면, 본 발명은 신경 대체 장치를 포함한다. 상기 장치는 바람직하게는 소정의 위치와 배향으로 BMP를 유지시켜 신경 조직의 재생을 히용하는 매트릭스 또는 담체를 사용한다. BMP는 매트릭스 상에 흡착된다. 매트릭스는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 담체 물질로 만들어 질 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스가 콜라겐, 피브린 조직 접착제 (adhesive), 및 정상적인 신경 내막초의 성분들로 구성된 군으로 부터 선택된 적합한 물질로 구성된다. 상기 성분들은 벌시칸(versican)을 포함하여, 라미닌, 히알라우론산 (hyalauronic acid) 및 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸을 포함한다 [토나 등에 의한 J. Histochemistry and Cytochemistry, 41 : 593∼599 (1993)]. 가장 바람직한 태양에 의하면, 매트릭스는 가교 콜라겐으로 구성된다. 콜라겐은 임의의 적합한 형태일 수 있으나, 바람직하게는 스폰지 형태이다. 콜라겐은 신경 조직의 재생에 적합한 형태로 성형될 수 있다. BMP-흡착 매트릭스는 이러한 매트릭스 및 BMP를 함유하는 인공 신경 대체관에 사용될 수 있다. 인공 신경 대체관은 바람직하게는 공구 실라스틱 튜빙 (vented silastic tubing)같은 튜빙 또는 스텐트 (stent)형태이다.

본 발명가들은 놀랍게도 BMPs, 특히 BMP-2, BMP-4 및 BMP-2/6 과 BMP-2/7의 헤테로이합체가 신경 재생의 향상을 위하여 사용될 수 있음을 발견하였다. 신경 세포는 상처후 대개 증식하지 않아서, 현미외과 기술을 사용한 생리학적 치료가 최선의 돌봄에도 불구하고 종종 불완전한 기능을 가져온다. 신경 조직은 회복전에 혈관신생화 (neovascularized)가 되어야만 한다. 그러나, 혈관신생화는 다른 생물학적 계보다 신경에 있어서 훨씬 늦게 나타나서, 액손 회복의 개시를 늦추고, 종종 회복 불가능하고 시간 의존성인 운동성 종판 위축을 촉진시킨다. 또한, 보다 빠른 섬유증 (fibrotic) 상처 조직의 형성이 자연 발생적인 신경 재생의 성공을 방지할 수 있다. 결론적으로, 신경 회복을 향상시키거나 가속화하기 위한 BMPs의 사용은, 불사용시 발생하지 않을 수 있는 신경 회복을 개선시키는 방법을 제공한다.

BMPs의 DNA 서열은 다음과 같이 공지 및 개시되어있다: BMP-2 (때때로 BMP-2A 로 언급됨) 및 BMP-4 (때때로 BMP-2B 로 언급됨), 미합중국 특허 제 5,013,649호 ; BMP-3, 미합중국 특허 제 5,116,738호 ; BMP-5, 미합중국 특허 제 5,106,748호 ; BMP-6, 미합중국 특허 제 5,187,076 호 , BMP-7, 미합중국 특허 제 5,141,905 호 ; BMP-8, PCT 공개 번호 제 WO93/00432 호 ; BMP-9, 연속물 제 07/720,590 호 (1991. 6. 25 출원) ; BMP-10, 연속물 제 ............ 호 (1993. 5. 12 출원). 헤테로이합체는 미합중국 특허 출원 연속물 제 07/787,496 호 (1992. 4. 7)에 개시되어 있다. 상기 참고 문헌의 명세서를 여기에서 충분히 재현되는 것 같이, 참고로 여기에 삽입한다.

rhBMP-2같은 재조합 인간 BMP는 적당한 형질 전환 숙주 세포에서 BMP를 코드하는 DNA 서열을 발현시킴으로써 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 공지의 방법을 사용하여, BMP-2 를 코드하는 DNA를 pED 같은 발현 벡터 [Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19. 4484∼4490 (1991)] 에 연결시켜, 숙주 세포에 형질 전환시키면, 단백질 발현이 유도 및 극대화 될 수 있다. 물론, BMP의 대립 유전자 변종 (allelic variants) 을 코드하는 DNA 서열에서 가능하듯이, 인간 BMP를 코드하는 축퇴 (degenerate) DNA 서열이 또한 rhBMP를 생산하는데 사용될 수 있다.

임의의 적합한 발현 벡터가 본 발명에 사용하기 위한 rhBMP-2 같은 rhBMP 를 생산하는데 사용될 수 있다. 포유 동물의 발현을 위하여. 상기 에 언급한 pED 벡터 이외에도 pEF-BOS [Mizushima et al., Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)] ; pXM, pJL3 및 pJL4 [Gough et al., EMBO J. 4, 645∼653 (1985)] ; 및 pMT2 [pMT2-VWF 에서 유도, A.T.C.C. #67122 : PCT/US87/00033 참조] 같은 수많은 발현 벡터가 공지되어 있다. 효모, 곤충 및 박테리아 세포에서 사용하기 위한 적합한 발현 벡터들이 또한 공지되어 있다. 상기 발현 벡터의 사용 및 구조는 충분히 당해 기술 분야의 레벨 이내이다. rhBMP-2 같은 재조합 BMP가 또한, 상이한 BMP로 부터 나온 프로펩티드에 사용상 연결된 성숙한 BMP에 대하여 코드하는 키메라 DNA 서열을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 여기에 참고용으로 삽입한 미합중국 특허 제5,168,050 호의 명세서를 참조할 수 있다.

본 발명에 유용한 BMPs 의 제조를 위해 적합한 숙주 세포는 예를 들어, 중국 햄스터 난 (CHO) 세포, 원숭이 COS 세포, 생쥐 3T3 세포, 생쥐 L 세포 같은 포유 동물 세포, NSO [Galfre and Milstein, Methods in Enzymology 73, 3∼46 (1981)] 같은 골수종 (myeloma) 세포 등을 포함한다. rhBMP는 또한 공지의 방법을 사용하여, BMP를 코드하는 DNA 서열로 효모, 곤충 및 박테리아 세포의 형질 전환, 단백질 발현의 유도 및 증폭에 의하여 제조될 수 있다. 박테리아 세포에서 제조될 경우, 골 형태 발생 단백질을 용해시키는 것이 필요할수도 있다.

rhBMP-2 같은 재조합식으로 제조된 BMP는 본 발명에 사용하기 위하여 배양 매질 또는 세포 추출물로 부터 정제되어야만 한다. rhBMP를 함유하는 배양 매질 또는 세포 추출물은 시판되는 단백질 농축 필터(예 : 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 단위) 를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계후, 농축물은 겔 여과 매질 같은 정제 매트릭스에 사용될 수 있다. 대안책으로, 예를 들어, 펜던트 (pendant) 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 갖는 음이온 교환 수지가 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 흔히 사용되는 다른 형태일 수 있다. 또한, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다.

적합한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 함유한 각종 불용성 매트릭스를 포함한다. 배양 상충액으로 부터 BMP의 정제는 또한 렉틴-아가로스,또는 시바크롬 블루 3GA같은 친화성 수지류 ; 또는 페닐 에테르, 부틸 에테르 또는 프로필 에테르 같은 수지류를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피 ; 또는 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 하나 이상의 컬럼 단계를 포함할 수 있다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매질 (예 : 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카겔) 을 사용한 하나 이상의 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계가 본 방법에 사용하기 위한 BMP를 추가로 정제하는데 사용될 수 있다. 전술한 정제 단계의 전부 또는 일부가 각종 조합하에, 실질적으로 균일한 분리된 재조합 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다.

rhBMP-2 같은 BMPs 가 각종 질병 상태에 있어서, 외과 의사에 의한 포유 동물의 생체내 치료를 위하여 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 상기 상태들은 말초 신경 손상, 말초 신경 장애 및 국소적 신경 장에 같은 말초 신경계의 질병, 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭경화증, 및 시드라거 (Shy Drager) 증후군 같은 중추 신경계의 질병을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 추가의 상태로는 머리 외상, 척추 장애 같은 기계적 외상성 장애, 및 발작 같은 대뇌 혈관 질병을 포함한다. 상기 장애의 치료를 향상 또는 촉진시키기 위해 신경 세포 및 신경 조직의 재생을 증가시키고자 BMPs 가 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여, rhBMP-2같은 BMP가 단독으로, 다른 BMPs와 조합하여, 또는 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, rhBMP-2는 신경 질병의 치료에 있어서, 사이토카인, 림포카인, 성장 인자, 또는 콜로니 자극 인자와 효율적으로 조합될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 BMP와 조합하여 사용하기 위해 예시된 사이토카인, 림포카인, 성장 인자, 및 콜로니 자극 인자는 제한함이 없이, EGF, FGF, 인터루킨 1∼12, M-CSF, G-CSF, GM-CSF, 간 (stem)세포 인자, 에리트로포이에틴 등을 포함한다. 추가로, BMPs는 CNTF, LIF, IL-6 및 인슐린 유사 성장 인자들 [IGFs] 과 같은 신경 영양성 인자와 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 신경 환경에서 일반적으로 발견되는 단백질이 본 발명에 따라 BMPs에 첨가될 수 있다. 이들은 벌시칸을 포함하여, 라미닌, 히알라우론산 및 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸을 포함할 수 있다.

본 발명의 BMP는 신경 조직의 재생을 위하여 BMP를 소정의 위치 및 배향으로 유지시킬 수 있는 매트릭스를 사용하여 투여될 수 있다. BMP가 바람직하게는 매트릭스상애 흡착될 수 있다. 매트릭스는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적당한 물질로 만들어 질수 있다. 상기 물질들은 콜라겐, 피브린 조직 접착제 및 벌시칸 (versican)을 포함하여, 라미닌, 히알라우론산 및 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸을 포함한 정상적인 신경 내막초의 성분들로 구성된 군으로 부터 선택된 적합한 물질들을 포함한다. 매트릭스가 바람직하게는 다공성으로서, 신경 조직의 재생을 위해 필요한 세포의 유입, 이동, 분화 및 증식을 허용할 수 있다. 바람직한 한 태양에 있어서, 매트릭스는 가교 콜라겐으로 구성된다. 콜라겐은 임의의 적합한 형태일 수 있으나, 바람직하게는 스폰지 형태이다. 콜라겐은 신경 조직의 재생을 위해 적합한 형태로 성형될 수 있다. 또다른 바람직한 태양에 있어서, 매트릭스는 젖산 중합체 (PLA), 글리콜산 중합체(PGA), 및 젖산과 글리콜산의 공중합체 (PLGA) 같은 생부식성 입자를 포함한다. 매트릭스로서 또한 유용한 것은 폴리오르토에스테르 중합체이다. 매트릭스는 피브린, 또는 정맥 그라프트 (graft) 같은 신경 조직의 형성을 촉진시키기 위한 물질들을 포함할 수 있다.

이어시, BMP 흡착 매트릭스는 바람직하게는 공구 실라스틱 튜빙(vented silastic tubing)같은 튜빙 또는 스텐트 형태로 인공 신경 대체관에 사용된다. 인공 신경 대체관은 BMP-흡착 매트릭스를 정위치에 유지시켜, 신경 조직의 재생을 만들 수 있는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 한 태양에 의하면, 자가 정맥 그라프트가 신경 대체관으로 사용될 수 있다. 인공 신경 대체관은 중합체 같은 재흡수 물질을 포함할 수 있다. 여러 바람직한 태양에 의하면, 매트릭스는 또한 인공 신경 대체관으로 작용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용에 적합한 약학적 조성물은 BMP 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 충진제, 염, 완충액, 안정화제, 및/또는 당해 분야에 잘 공지된 다른 물질들을 함유할 수 있다. "약학적으로 허용가능한" 이란 용어는 활성 성분(들)의 생물학적 활성 효과를 간섭하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 담체 또는 다른 물질의 특성은 투여 경로에 의존할 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, rhBMP-2 같은 BMP의 투여는 각종 공지 방법으로 수행될 수 있다. 신경 조직의 재생, 신경 결함 또는 신경 손상의 치료를 위하여, BMP의 국소적 투여가 바람직하다. 가장 바람직한 형태의 투여에서, BMP는 생체 적합성 매트릭스에 흡착되어, 인공 신경 대체관에 사용된다. 생체 적합성 매트릭스가 바람직하게는 콜라겐으로 만들어지며, 스폰지, 시트 또는 매트, 또는 촘촘히 충진된 입자 형태일 수 있다. 인공 신경 대체관은 튜브 또는 스텐트 형태일 수 있다. 인공 신경 대체관에 적합한 다른 물질들은 당업자가 곧 알 수 있다. 바람직한 태양에서, 인공 신경 대체관은 BMP-흡착 매트릭스를 함유한 공구 실라스틱 튜빙을 포함한다. 또다른 바람직한 태양에서, 인공 신경 대체관은 자가 정맥 그라프트를 포함한다. 여러 바람직한 태양에서, 동일한 물질이 매트릭스 및 인공 신경 대체관 모두로서 작용할 수 있다.

본 발명의 방법에 유용한 BMP의 양은 치료되는 상태의 특성과 심각도, 및 환자가 겪은 이전 치료의 성격에 의존할 것이다. 궁국적으로는, 치료 의사가 각각의 환자를 치료할 BMP의 양을 결정할 것이다. 본 발명의 각종 약학적 조성물이 체중 kg당 약 0.1 μg ∼ 약 100 mg, 바람직하게는 약 0.1 μg ∼약 100 μg을 함유해야 함이 예견된다. 실제 복용 방법은 약의 작용을 변화시키는 각종 인자들 (예 ; 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 상태의 심각도, 투여 시간과 방법, 및 다른 임상적 요인들) 을 고려하는 치료 의사에 의하여 결정될 것이다.

본 발명의 치료 방법을 실행함에 있어서, BMP의 치료적 유효량이 상기 질병 상태를 갖는 포유 동물에게 투여된다. "치료적 유효량"이라는 용어는 의미있는 환자의 이익 (예 : 만성적 상태의 치유 또는 치료 속도의 상승) 을 보여줄 만큼 충분한 상기 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 예를 들어, 골 형태발생 단백질의 신경 재생량은 적합한 매트릭스 담체에 흡수되어 신경 손상, 결함 또는 고갈 부위에 이식될 경우, 신경 조직의 재생 및/또는 신경 손상, 결함 또는 고갈의 개선을 가져올 단백질의 양이다. 하나의 각 활성 성분에 사용되어 단독으로 투여될 경우, 상기 용어는 그 성분 단독을 의미한다. 조합하여 사용될 경우, 조합하여 순차적으로 또는 동시에 투여되던지 간에, 상기 용어는 치료 효과를 가져오는 활성 성분들의 조합된 양을 의미한다. 본 발명의 방법의 실행을 위한 BMP의 치료적 유효 복용량은 사용 체중 kg당 약 0.1 μg ∼ 약 100 mg의 범위로 생각된다. 일반적으로 투여는 초기에 복용량 범위의 하한선에서 시작하여, 미리 선별된 시간 과정에 따라 포지티브 효과가 관찰될 때까지 복용량이 상승될 것이다. 결국, 복용량에 있어서의 증가적 상승은, 나타날지도 모르는 어떠한 나쁜 영향을 고려하면서, 효과면에서 상응하는 상승을 가져오는 수준까지 복용량의 증가적 상승을 제한하도록 만들어질 것이다.

본 발명의 방법을 사용한 정맥 주사 치료의 지속은 치료하는 질병의 심각도 및 각 환자 개인의 상태와 잠재적인 특이체질의 반응에 따라 변화할 것이다. 각 BMP 사용의 지속은 12 ∼ 24 시간의 연속 투여 범위에 놓일 것이 예견된다. 궁극적으로, 치료 의사는 본 발명의 방법을 사용한 치료의 적절한 지속 여부를 결정할 것이다.

본 발명의 방법에 의하면, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합한 rhBMP-2 같은 BMP의 신경 재생량의 투여에 의하여, 포유 동물에서 신경의 재생이 달성될 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 발명에 따른 rhBMP-2 같은 BMP의 신경 재생량은 신경 재생 유도에 필요한 단백질량이다. 신경 재생은 존재하는 신경 조직의 중량 또는 부피에 의하여 측정될 것이다. 또한, BMP를 발현하도록 형질 전환된 적합한 숙주 세포는 신경 세포 또는 조직의 생존 또는 성장을 향상시키기 위하여 환자에게 투여될 것이 예상된다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하지만, 결코 이를 제한하는 것은 아니다.

BMP의 비경구적 제제예는 발열 물질이 없는 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태일 것이다. 상기 비경구적으로 허용 가능한 단백질 용액의 제제예는 pH, 등장성, 안정성 등을 적당히 생각할때, 당해 기술 분야의 범위내이다. 적당한 비경구적 제제예는 BMP 이외에, 염화나트륨 주사, 링겔 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 젖산 링겔 주사 같은 등장성 부형제, 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 부형제를 함유해야 한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충액, 항산화제, 또는 당업자에게 공지된 다른 첨가제를 함유할 것이다.

국소적으로 투여될 경우, 본 발명의 BMP는 발열 인자가 없는, 국소적으로 허용 가능한 액체 또는 연고, 크림, 로션, 거품 또는 겔 같은 반고체 제제 형태일 것이다. 상기 국소적으로 사용되는 제제예의 제제는 당해 기술 분야의 범위내이다.

실시예 I : 신경 세포에 대한 BMP의 영향

실시예 IA : 세포배양 :

발브 (Balb) c/SFME (혈청 부재 생쥐 배아 : Serum-Free Mouse Embryo) 세포를 A.T.C.C. (American Type Culture Collection) (CRL9392) 로 부터 수득하여, 앞서 기술한 바와 같이 [Sakai et al., PNAS : USA, 87 : 8378-8382 (1990)], 소 인슐린 [10 μg/㎖ (Eli Lilly)] ; 인간 트란스페린 [25 μg/㎖ (Collaborative Research] ; 인간 고밀도 지단백질 [20 μg/㎖ (sigma)] ; 인간 표피 성장 인자 [100 ng/㎖ (Pepro Tech)] ; 소 혈장 피브로넥틴 [20 μg/㎖ (GIBCO)] ; 소디움 셀레니트 [10 nM (GIBCO)] ; 페니실린-스트렙토마이신 [10 U/㎖] ; 1-글루타민 [4nM] 및 4-(2-히드록시-에틸)-피페라진-에탄술폰산 [pH 7.4 (15 mM] 을 함유한 DME/F12(1 :1) 매질 중에 성장시킨다.

부피비 1 : 2로 트립신/EDTA 및 콩 트립신 저해제 (1 mg/㎖)를 사용하여 세포를 통과시키고, 통로 (passages) 19 와 50 사이에 사용한다. 세포는 다른 언급이 없는 한, 쿨터 진단 계수기를 사용하여 그 수를 센다.

실시예 IB : 성장 및 분화 인자 :

사용한 모든 제조합 인간 단백질의 순도는 90 %를 넘는다. EGF는 Pepro Tech (NJ)로 부터 구입하고 , 재조합 인간 액티빈-A 는 헬렌뉴(Hclen New)의 증여물이며 ; TGF-β1은 R & D 시스템으로 부터 구입하고 ; BMPs는 제네틱스 인스터튜트에서 여러 정제 단계를 통한 CHO 조건의 매질로 부터 정제한다.

실시예 IC : 분화 연구 :

다른 언급이 없는한, 모든 면역 형광법과 FACS 분석을 위하여, 세포를 2.5∼5×10⁴/㎠에서 얇게 펴고, BMP-2를 16∼20시간에서 지시한 시간대중 상기 농도에서 첨가한다.

실시예 ID : 생존 연구 :

세포를 EGF가 없는 매질에서 2회 세척하고, 이어서, 0.8∼1×10⁵/㎠에서 각종 성장 인자가 보충된 동일한 매질에 얇게 편다. 이것은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-2/6 헤테로이합체, BMP-2/7 헤테로이합체 및 TGF-β1을 포함한다. 트립판 블루 염색 배제법에 의하여 44∼48시간에서, 샘플당 최소 400 세포수를 세는 혈구계를 사용하여 % 변수 및 세포수를 이중으로 측정한다. 세포 증식이 여러상태에서 관찰되므로, % 변수는 총 생세포수를 끝지점에서의 총 세포수로 나눔으로써 계산한다.

실시예 IE : 면역 형광 항체 염색 :

4 웰 (well) 유리 또는 플라스틱 체임버 (chamber) 슬라이드 [Lab Tek] 중의 세포로 부터 매질을 제거하여, PBS-Ca+2, Mg+2 부재 (CMF)로 세포를 2회 세척한다. 항체 A2B5 (Boehringer-Mannheim)로 표면 염색을 위하여, 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 10분간 초기에 고정시키고, PBS로 세척한뒤, PBS증 1 % 토끼 혈청으로 배양하여, 비특이적 결합을 방지한다. 항체를 PBS중 1 % 토끼 혈청에서 희석하여 1시간 동안 배양한뒤, 비오틴화 토끼 항-생쥐 항체에 이어 스트렙타비딘-FITC (Zymed)결합체 (conjugate)를 사용한 탐지 이전에, PBS 중 1 % 토끼 혈청으로 세포를 세척한다. 추가의 이중 염색 실험 즉 GFAP에 대한 하나의 내부 염색을 위하여, - 20℃에서 10분간 아세톤/메탄올 (50 : 50) 중에 세포를 고정시킨다. 0.2 % 트리톤 X-100과 제 2 단계 시약에 따라 PBS중 1 %의 염소 또는 토기 혈청을 사용하여 침투화 및 봉쇄를 수행한다. 1차 항체는 지적한 바와 같이 토끼의 다클론 (1 : 200) 또는 생쥐의 단일 클론 (5 μg/㎖)으로서, 각각 PBS중 1 % 의 염소 또는 토기 혈청에 희석하여, 1시간 동안 배양한다. 탐지는 2 차 디오틴화 항체 (Zymed) 와 스트렙타비딘 피코에리트린 (PE) (Zymed)의 어느 하나 또는 결합된 항 IgG1-PE 항체 (Zymed)를 가지고 행한다. 세포는 형광외 광학 렌즈 (epifluorescent optics)를 장착한 자이스 악시오포트 (Zeiss Axiophot) 또는 올림푸스 BH2-RFC 현미경을 가지고 조사하여, 엑타크롬 1600 ASA 필름을 가지고 사진을 찍는다.

실시예 IF : FACS 분석 :

이러한 실험을 위하여, 실온에서 20분간 EDTA/염으로 배양하기 전에 PBS로 1회 및 EDTA/염으로 1회 세포를 세척한다. 이어서, 플레이트의 표면상에 온화한 피페팅 (pipetting) 으로 세포를 제거한다. 플레이트를 EDTA/염으로 세척한뒤, 회전 침강된 세포와 조합하여, PBS로 한번 더 세척하고 난 뒤 수를 센다. 각각의 항체 배양을 위하여 사용된 세포 수는 1 × 10⁶였다. 4℃ 에서 A2B5 표면 염색을 위하여, 우선 세포 펠렛을 열에 의해 불활성화된 토끼 혈청 50 ㎕를 사용하여 배양함으로써 비특이적 결합을 봉쇄하고, 1 % 토끼 혈청/PBS중에 희석한 5 μg/㎖에서 A2B5 항체 (Boehringer-Mannheim) 또는 대조군 분류 (class) 특이적 IgM 을 사용하여 1 시간 동안 배양한다. 탐지는 직접 결합한 항 IgM-PE (Zymed)를 통하여 행한다. 추가의 이중 염색 실험, 즉 GFAP 에 대한 하나의 내부 염색을 위하여, 4℃에서 1시간 동안 0.25% 파라포픔알데히드 중에 세포를 고정시켜 회건 침강시킨 다음, PBS/아지드(Azid) 중 0.2 % 트윈 20의 1㎖에 재현탁시키고, 37℃ 에서 15분간 배양한다. 2% 의 열에 의해 불활성화된 토끼 혈청/PBS 1 ㎖ 를 첨가하여, 세포를 회전 침강시킨다. 펠렛을 토끼 혈청 50 ㎕ 중에 재현탁시킨 뒤, PBS중 1 % 도끼 혈청 100 ㎕에 1차 항체와 분류 (class) 특이적 대조군을 5 μg/㎖로 희석시킨다. 최종 탐지는 직접 결합한 항 IgG1-FITC 항체 (Zymed, Fisher Biotech)를 사용하여 행한다. 1 % 토끼 혈청, PBS/아지드 중 0.2 % 트윈 20, 이어서 PBS로 세포를 세척한뒤, 최종적으로 1 % 파라포름알데히드 중에 재현탁시킨다. 형광색소 여기 (excitation) 를 위하여 15 mw, 488 nm 공기 냉각 아르곤 이온 레이저를 사용한 FACScan (Becton Dickinson, San Jose, Ca) 상에서 FACS 분석을 수행한다. 표준 FACScan 구성 : 530 nm (FITC), 585 nm (PE) 및 > 650 nm (적색 형광) 에서 형광 발산을 측정한다.

데이타를 수득하고, LYSYS II 소프트웨어 (Becton Dickinson, San Jose, Ca) 를 사용하여, 휴레트 패카르드 (Hewlett Packard) 340 C 컴퓨터 시스템 상에서 분석한다. 이소타입 (Isotype) 대조군을 각 샘플에 대하여 수행하고, 입구 (gates)는 3 % 이하의 세포를 포함하도록 단일 염색 실험을 위해 정해진다.

실시예 IG : 웨스턴 분석 :

6-웰 디쉬의 이중 웰 (well) 내에 세포를 2.5 × 10⁴/㎠으로 얇게 펴서, 16 시간에서 1, 10 및 100 ng/㎖로 적합한 BMP 또는 TGF-β1을 첨가한다. 44 시간후 세포를 수집한다. 하나의 웰에 트립신 처리를 하여 수를 세고, 두번째 것은 PBS 로 세척하여, 1 mM 페파블록(Boehringer-Mannheim 으로 부터 수용성 프로테아제 저해제) 을 함유하는 빙냉 PBS 중에 세포를 넣고, 400 × G 에서 원심 분리시킨다. 1∼2 부피의 0.1 % 트리톤 X-100, 1 mM 페파블록, 0.125 M Tris 염기, pH 6.8, 250 U/㎖의 DNAse를 세포 펠렛들에 첨가하여 혼합한다. 최종적으로 0.5 % SDS 및 20 mM DTT를 각각에 첨가한다. 이중 웰의 세포수를 기초로 하여, 각 조건의 5 × 10⁵세포를 함유한 등가의 부피를 12 %, 1 mm 라엠리 미니겔 (Novex) 각각의 레인 (lane)에 올린다. 또한, 소 GFAP를 10 및 100 ng으로 채운다. 전개후, 0.05 % SDS의 존재하에 300 mAmps × 1 시간에서 0.45 μ 니트로셀룰로스로 옮긴다.

블롯을 에어 (air) 염색시켜, 1 % KOH 중에 고정시키고 세척하여, TBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.5) 중 0.5 % 트윈 20 에서 반응을 차단시킨뒤, 1 : 1000 으로 희석한 GFAP 항혈청 (BTI) 에서 하룻밤 동안 배양한다. TBS 중 0.5 % 트윈 20 에서 세척후, 1 : 3000 으로 희석한 염소 항-토끼 HRP 중에 1시간 동안 블롯을 배양한뒤, 증진된 화학 루미네슨스 (아멀샴 키트)에 의하여 발현시킨다. 요약하면, TBS-트윈 20에 이어 TBS 중에 블롯을 세척하고, 시약 A와 B의 1 : 1 혼합물에서 1 분간 배양한뒤, 필름에 노출시켜 현상한다.

결과

SFME 세포를 TGF-β1 또는 혈청으로 처리하면, 성상 세포-특이적 분별 마커 GFAP (Sakai et al., supra)의 발현을 수반한 뚜렷한 형태변화를 가져온다. TGF-β1을 처리하면 GFAP로 염색된 양 말단에 원형질 돌기를 갖는 신장된 양극 세포 형태를 가져온다. 대조적으로, 태내 송아지 혈청 (FCS) 처리 세포는 GFAP로 매우 강하게 염색된 고분지 필라멘트 망상 조직을 가지며, 크기면에서 보다 크다.

10 ng/㎖ 에서 BMP-2, 4, 5, 6, 7 및 BMP-2/6 과 2/7 헤테로이합체로 SFME를 처리하면, GFAP의 발현을 수반하여, 그 외형에서 극적인 형태 변화를 가져온다. 상기 세포는 배양시 1 차 성상 세포의 특징인 수많은 기다란 원형질 돌기를 수득한다. 전체적으로, BMPs와 송아지 혈청으로 관찰된 GFAP 염색의 강도는 TGF-β 에 대하여 관찰된 것보다 훨씬 크다.

BMP-2 및 BMP 2/7 헤테로이합체는 송아지 혈청에서 관찰된 것과 유사하게 보다 큰 형태의 세포 형태를 유도하는 반면, BMP-7은 보다 섬유성인 특성을 갖는 형태를 유도한다. 상기 형태들이 유도된 세포 형태 (형태 1 성상 세포 : 형태 2 성상 세포) 에서 표현형의 차이, 또는 GFAP 나 다른 세포 골격 단백질의 다양한 레벨을 반영하는 것이 가능하다. 대조군 세포는 섬유아세포 유사 형태를 가지며, GFAP 로 염색되지 않는다.

TGF-β 의 활성과 비교하는 것 이외에, BMP 에 의하여 유도된 GFAP 발현 레벨을 측정하기 위하여, 형광 활성화 세포 구분 (sorting) 에 의한 정량 분석을 설립한다. 각각의 BMP, TGF-β1 및 액티빈의 10 ng/㎖, 및 10 % 송아지 혈청으로 세포를 처리한다. 집단 (population) 반응 백분율과 평균 형광 강도에 의하여 데이타를 분석한다.

집단 반응의 백분율은 발현 레벨과는 독립적으로, GFAP를 발현하는 세포수를 반영한다. BMP-2, 4, 5, 6, 7, 2/6 헤테로이합체와 2/7 헤테로이합체, TGF-β 및 송아지 혈청은 대조군과 비교시 GFAP의 발현을 현저하게 유도한다. 액티빈, TGF-β 상족의 다른 일원은 또한, 아무런 영향을 갖지 않는다. BMP-2/6과 2/7 헤테로이합체가 상기 변수중 가장 효과적이므로, 약 65 ∼ 72 %의 반응 세포를 가져온다. BMP-2, 4, TGF-β1 및 태내 송아지 혈청 처리는 약 53 ∼ 58 %의 반응 세포를 가져오고 ; BMP-5, 6 및 7 처리는 약 30 ∼ 40 %의 반응 세포를 가져온다.

평균 형광 강도 (MFI)는 GFAP의 발현 레벨을 가리키며 ; 평균 형광이 높을수록, 발현되는 GFAP의 레벨이 높다. BMP-2/6 및 2/7 헤테로이합체 유도된 세포는 TGF-β1 유도 세포보다 약 8배 높은 평균 형광을 갖는다. BMP-2, 4, 5, 6 및 7 유도된 세포는 송아지 혈청보다 약 2 내지 4 배 높은 평균 형광을 갖는다. TGF-β와송아지 혈청 모두 대조군 보다 현저히 높은 수치를 가져온다.

BMPs와 TGF-β1 이 GFAP를 유도하는 능력을 비교하기 위하여, BMP-2, BMP-6, BMP-2/6 헤테로이합체 및 TGF-β1 을 0 ∼ 10 ng/㎖의 농도 범위상에서 시험하고, GFAP 발현의 정량화를 위하여 FACS 분석을 사용한다. 상대 활성을 비교하기 위하여, 각 인자가 GFAP 평균 형광 수치 5 (대조군 0.5 에 대한 10 배) 를 가져오는 농도가 사용된다. TGF-β1 와 비교한 상대 활성이라는 측면에서, BMP-2/6 헤테로이합체는 약 18배 더 활성적이며, BMP-2와 BMP-6는 약 3 ∼ 4배 더 활성적이다. BMP-2 와 BMP-2/6 가 0 ∼ 0.08 ng/㎖ 범위로 탐지 가능한 레벨의 GFAP 를 유도하는 반면, TGF-β1 을 사용한 1 차 탐지 가능한 GFAP 증가는 0.4 ∼ 2 ng/㎖ 범위이다.

웨스턴 분석은 또한, BMPs에 노출후 SFME 세포에 의하여 생산된 높은 레벨의 GFAP 를 확인해 준다. BMP 또는 TGF-β1 처리 세포 추출물에 있어서, 탐지용 다클론 GFAP 항체는 40 ∼ 50 kD 범위의 단백질로서, 52 kD 소 GFAP 표준의 약간 아래로 전개되는 단백질을 특히 인식한다. 관찰된 넓은 범위의 분자량은 대략 단백질 가수분해의 결과이다. 1 ∼ 100 ng/㎖에서 BMP-2 와 BMP-6 처리를 하면, 단백질 레벨에 있어서 복용량에 의존하는 증가가 있다. TGF-β 처리로 유도된 GFAP는 10 ng/㎖ 복용량에서 최대이고, 단지 1 ng/㎖ 의 BMP-2 에서 관찰된 것과 대략 동일하다. 상기 레벨은 100 ng/㎖ 복용량에서 조차 증가될 수 없을 것이다. BMPs는 TGF-β1 보다 더 높은 레벨의 GFAP를 유도한다.

SFME 세포를 BMPs 로 처리하면, "섬유아세포 유사" 세포로 부터 두개의 뚜렷한 GFAP-포지티브 형태로의 전환을 가져온다. 소량의 돌기를 갖는 하나의 크고 납작한 형태는 성상 세포의 원형질 형태를 생각나게 하며 ; 매우 긴 원형질 돌기를 갖는 다른 세포 형태는 섬유성 성상 세포의 특징이다.

상기 세포들은 A2B5 와 GFAP 에 대한 이중 면역형광 항체 염색에 의하여 더 특징지어진다. BMP-2/6 집단에는 형태 1과 형태 2의 성상 세포 계열의 세포 모두가 존재한다. A2B5가 아닌 GFAP에 대해 염색되는 다수의 세포는 형태 2 성상 세포 계열이다. 대조군 세포는 그 표면상에서 A2B5 에 대하여 염색되나, GFAP에 대하여는 염색되지 않는다. 면역형광 염색에 의하여 보여지는 세포 집단을 정량화 하기 위하여, 우리는 이중 염색 FACS 분석을 사용하였다. 표 1의 데이타는 3개 이상의 실험 평균 ± 표준 편차로서 표현된다. 대조군 세포는 약 37 % A2B5 포지티브이다. 대조군 세포는 성상 세포 라인 마커에 대하여 포지티브하게 염색되지 않는다. BMP-2, 6과 2/6 처리 세포는 A2B5에 대하여 염색될 뿐만이 아니라, 두개의 성상 세포 라인 집단으로 구성된다. 60 % 이상이 GFAP 단독에 대하여 포지티브한 것은 이들이 형태 1라인 임을 가리키며, 약 18 %가 A2B5와 GFAP 모두에 대하여 포지티브한 것은 이들이 형태 2 라인임을 가리킨다. TGF-β1 처리는 또한, 유사한 크기의 형태 2 라인 세포 집단 (약 14 %)만이 아나라, 약 40 %의 형태 1 라인 세포 집단을 가져온다. 또한, A2B5에 대하여 단일 염색되는 작은 집단의 세포 (약 7 %) 가 잔존한다. 전체적으로, BMPs 나 TGF-β1을 사용한 SFME 세포의 처리는 A2B5/GFAP 집단에서 완전히 설명되어 질 수 없는 A2B5 발현의 손실을 가져온다.

표 1 : 성상 세포

SFME 세포 생존 연구

SFME 세포의 생존을 위하여 EGF가 필요하며, FGF와 TGF-β 같은 다른 인자들은 이것을 대신할 수 없다. EGF의 부재시, BMP2, 7, 2/7 헤테로이합체, TGF-β1 및 액티빈으로 SFME 세포를 처리한다. 액티빈은 P 19 세포에 대한 신경 세포 생존 분자로 밝혀졌다 [Schubert et al., Nature 344 : 868∼870 (1990)]. EGF 부재중 48 시간후, 단지 약 30 % 의 생존 세포만이 존재하며, 세포수에 있어서 전체적으로 감소한다. EGF를 첨가하면, 세포수에 있어서 5배의 증가를 수반한 약 95 %의 세포 생존 비율을 가져온다. BMP-2, BMP-7 및 BMP-2/7 헤테로이합체로 처리한 세포는 접종 밀도의 약 70 ∼ 80 % 로 세포수를 유지한다. 그러나, 세포는 증식하지 않는다. BMP-2 처리 세포는 생존할 뿐만이아니라, 분화하는 것으로 나타난다. 생존 비율은 약 80 ∼ 85 %이다. TGF-β1 이나 액티빈으로 세포를 처리하면, < 10 % 의 생존 비율 및 적어도 10 배의 세포수 감소를 가져온다. 더 높은 농도의 TGF-β1은 생존을 증가시키지 않는다.

실시예 II : BMP-2를 사용한 포유 동물에서의 말초 신경 재생

A : 콜라겐 스폰지의 제조

콜라겐 스폰지 (콜라스타트^R, 비타포아 운드 힐링사)를 약 2 × 2 × 18 mm 길이로 잘라, 살균한 유리중에 증류수로 세척, 동결 건조시키고, BMP-2 첨가전에 산화에틸렌으로 살균 및 탈기한다.

45 % 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산중 0.5 μg 의 BMP-2 를 상기 길이의 각각의 제조 스폰지상에 균일하게 퍼뜨린다. 이어서, 이것을 튜브에 넣고, 액체 질소중에 얼려서 동결 건조시킨다. BMP-2 가 없는 45 % 아세토니트릴, 0.1 % 트리플루오로아세트산 완충 용액을 사용하는 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 대조군 이식물을 제조한다.

동결 건조후, 충진한 BMP-2와 대조군 스폰지를 약 1.6 × 20 mm 길이의 살균한 공구 실라스틱 튜빙의 내부에 넣는다. 모든 조작은 살균 상태하에 수행한다. 이식물의 한쪽 말단에서 과량의 튜빙 (tubing)은 수술전 수술실에서 제거한다.

6 마리 루이스 쥐의 좌골 신경을 절단한다. 내부 직경 1.6 mm × 길이 17 mm의 공구 실라스틱 또는 생분해 가능한 스텐트를 삽입한다. 스텐트는 rhBMP-2가 있거나 없는 콜라겐 매트릭스 담체를 함유한다. 콜라겐 매트릭스 담체는 콜라겐 스폰지 (콜라스타트) (약 1.5 mm × 15 mm) 를 함유한다. 좌골 신경을 절단하고 재부착을 방지하기 위하여 안으로 연결한 동물이 포지티브 대조군으로 작용한다. 조작을 가하지 않은 뒷다리는 연령에 따라 조합한 네가티브 대조군으로 작용한다.

좌골 신경의 절단된 신경 말단부에 미시적으로 스텐트를 적용하여 문합한다.각 말단부의 1 mm에 대하여 신경 말단부를 스텐트 내에 삽입하여, 15 mm의 틈을 남긴다. 이식후 6, 8 및 12주에서 동물들에게 기능에 대한 전기적 응답 시험을 한다. 복합 근육 활동 전위 (CMAP) 를 조사하면, 기능 응답 (functional return) 정도를 측정하는데 정확한 재현가능한 확실한 경피적 과정을 알 수 있다. 진폭과 잠복기는 연령 의존적이며, 재신경지배 액손/운동 종판의 수에 정비례한다.

12주 PI에서 병리학적 시험을 위하여 동물들을 희생시킨다. 염색은 H&E, 은, 루솔에 강한 블루 (Luxoi-fast blue) 및 S 100 을 포함한다. 스텐트 내의 기부, 중심 및 말초부 원소들의 무편향적(unbiased) 정량화를 수행한다. 여러 쥐들의 경피 조직내에 놓인 스텐트는 염색용 대조군으로 작용한다.

결과는 12주후 콜라스타트 스폰지상에 부착된 BMP-2 장치당 0.5 μg으로 처리한 6 마리의 동물중 4마리에서 15 mm 신경 결함에 걸친 우수한 신경 재생을 보여준다. BMP-2가 없는 대조군은 15 mm 신경 결함에 걸친 어떠한 성장도 보이지 않는다.

Claims

BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 및 BMP-2/6 과 BMP-2/7 의 헤테로이합체로 이루어진 군으로부터 선택된 골 형태발생 단백질의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는, 성상세포 형성 유도에 사용되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 골 형태발생 단백질이 BMP-2, BMP-4, BMP-2/6 헤테로이합체 및 BMP-2/7 헤테로이합체로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 골 형태발생 단백질이 적합한 매트릭스에 흡착됨을 특징으로하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 매트릭스가 스폰지 형태의 콜라겐을 함유함을 특징으로하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 매트릭스가 인공 신경 대체관 내에 함유됨을 특징으로하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 인공 신경 대체관이 공구 실라스틱 튜빙(vented silastictubing)을 함유함을 특징으로하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 골 형태발생 단백질이 BMP-2 임을 특징으로하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 골 형태발생 단백질이 BMP-2 임을 특징으로하는 조성물.