CN117797245A - 人乳脂球表皮生长因子8用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用 - Google Patents
人乳脂球表皮生长因子8用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及人乳脂球表皮生长因子8用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。本发明提供了人乳脂球表皮生长因子8(MFG‑E8)在医药领域的一种新应用，即人乳脂球表皮生长因子8(MFG‑E8)可以作为治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物使用，拓宽了人乳脂球表皮生长因子8(MFG‑E8)的应用范围，同时也给了广大NMOSD患者提供了一种新的选择，可降低NMOSD患者视神经脊髓炎的发生及改善其生活质量，其疗效显著，未见明显毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及人乳脂球表皮生长因子8用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。
背景技术
乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8)是最初在乳房上皮细胞中发现的亲脂性糖蛋白，是乳脂球膜(milk fat globulemembrane，MFGM)中最主要的蛋白质之一。研究发现，人源的MFG-E8有3个结构域，即EGF-L、C1和C2结构域。MFG-E8能促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用，并在血管生成、自身免疫疾病和肿瘤中扮演着重要的角色。此外，外泌体上含有MFG-E8且MFG-E8还能够黏附在细胞膜上，具有运载目的蛋白的潜力。
有研究报道，MFG-E8通过NF-κB信号通路靶向软骨细胞衰老和巨噬细胞重编程，预防骨关节炎。还有研究标明，骨髓MSCs来源的MFG-E8可能通过促进血管生成、凋亡细胞的清除、M2巨噬细胞的浸润、抑制伤口区域的炎性细胞因子来加速糖尿病模型小鼠伤口的愈合。此外，在大鼠创伤性脑损伤模型中，MFG-E8通过整合素β3/FAK/PI3K/AKT信号通路减少细胞凋亡。MFG-E8通过驱动小胶质细胞向M2型极化，减轻蛛网膜下腔出血小鼠模型的炎症反应，提供神经保护并改善模型小鼠的神经功能障碍。综上所述，MFG-E8在炎症性疾病、损伤性疾病中扮演中重要角色。
视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是视神经与脊髓同时或相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变。该病由Devic(1894)首次描述，其临床特征为急性或亚急性起病的单眼或双眼失明，在其前或其后数日或数周伴发横贯性或上升性脊髓炎，后来本病被称为Devic病或Devic综合征。2015年7月14日美国神经病学会neurology杂志发表《视神经脊髓炎谱系疾病(NMSOD)诊断标准国家共识》，决定将视神经脊髓炎(NMO)统一命名为视神经脊髓炎谱系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)。
目前为止，国际上尚无准确的NMOSD流行病学数据。2018年5月11日，国家制定了《第一批罕见病目录》，视神经脊髓炎被收录其中。
目前，针对NMOSD尚未有效的治疗手段，对于NMOSD急性期患者，以减轻急性期症状、缩短病程、改善残疾程度和防治并发症为主要目标，主要治疗手段为有类固醇激素、血浆置换、免疫球蛋白以及激素联合其他免疫抑制剂等，对于NMOSD缓解期患者，以减少复发、延缓残疾进展为主要目标，最常用的药物有硫唑嘌呤，利妥昔单抗、麦考酚酯、氨甲蝶呤、米托蒽醌、环磷酰胺、环孢素A等。对于具有其他并发症的患者，同时辅以并发症治疗及康复训练等。
因此，开发针对NMOSD的药物及创新性治疗策略，具有重要的科学价值和社会意义。
发明内容
为了解决现有技术中缺少对视神经脊髓炎谱系疾病(NMSOD)具有显著治疗效果的药物为，本发明的目的在于提供人乳脂球表皮生长因子8用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种人乳脂球表皮生长因子8在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。
优选的，所述视神经脊髓炎谱系疾病包括：视神经脊髓炎、复发性视神经炎、纵向延伸横贯性脊髓炎、视神经脊髓型多发性硬化、长阶段横断性脊髓炎、单侧或双侧视神经炎、伴自身免疫性疾病的视神经炎或脊髓炎、伴有症状性或无症状性脑内病灶的视神经炎或脊髓炎。
本发明的第二个目的是提供人乳脂球表皮生长因子8在制备治疗视神经脊髓炎药物中的应用。
优选的，所述药物包含人乳脂球表皮生长因子8和药学可接受的载体。
优选的，所述载体包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和稳定剂。
优选的，所述药物为口服制剂或注射制剂。
本发明的设计原理：
本发明提供的人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)对NMSOD具有显著的治疗效果。MFG-E8对NMOSD细胞模型及小鼠模型的试验结果显示，与模型对照组相比，MFG-E8治疗抑制了星形胶质细胞的损伤及小胶质细胞的激活，并改善了NMOSD小鼠模型的运动功能损伤及相关的组织病理学损伤，说明本发明提供的MFG-E8对NMSOD具有显著的治疗效果。
因此，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)在医药领域的一种新应用，即人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)可以作为治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物使用，拓宽了人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)的应用范围，同时也给了广大NMOSD患者提供了一种新的选择，可降低NMOSD患者视神经脊髓炎的发生及改善其生活质量，其疗效显著，未见明显毒副作用。
附图说明
图1为细胞免疫荧光分析结果图；
图2为本发明MFG-E8对NMOSD小鼠模型治疗方案图；
图3为疲劳转棒实验结果图；
图4为步态分析实验结果图；
图5为组织病理学结果图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
设备仪器：
所述人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)购自Signalway Antibody(SAB)，货号AP70540-1；
所述疲劳转仪购自成都泰盟软件有限公司，型号ZB-200；
所述步态实验分析系统购自上海欣软科技有限公司，型号XR-FP101。
实施例1细胞试验
1.1NMOSD细胞模型的构建
1)星形胶质细胞分离及培养
使用多聚-D-赖氨酸(PDL)预先包被培养瓶(购自Thermo Fisher Scientific，货号156367)，配制星形胶质细胞完全培养基(45mL DMEM/F12+5mL FBS+500μl NEAA+500μl谷氨酰胺+500μl双抗体+100μl丙酮酸钠)，选取出生1天C57乳鼠(实验室内部繁育获得)，消毒，断头，剥脑壳，去脑膜，取皮层，0.05％胰酶消化，离心(300g，10分钟)，弃上清，重新加入培养基，轻柔吹打，置于70μm滤网过滤，首次，隔日换液，此后，每3天换液，连续培养14天。
2)细胞造模
将星形胶质细胞)种植至24或6孔板中，待细胞汇和度至70-80％，鉴定星形胶质细胞纯度后，用水通道蛋白4(AQP4)阳性患者血清IgG(hsAQP4-IgG)(100ng/mL)进行处理造模，处理时间为4h。
通过GFAP抗体(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-33673)及AQP4抗体(SantaCruz Biotechnology，货号sc-20812)免疫荧光染色，当与未造模对照组相比，AQP4荧光强度明显降低时，则判定造模成功。
1.2MFG-E8对NMOSD细胞模型治疗效果
实验组分为3组，具体如下：
1)阴性对照组：小鼠星形胶质细胞健康人血清对照IgG(hsCtrl-IgG)(100ng/mL)处理，然后用星形胶质细胞完全培养基处理4h；
2)NMOSD模型对照组：小鼠星形胶质细胞用hsAQP4-IgG(100ng/mL)处理，然后用星形胶质细胞完全培养基处理4h；
3)MFG-E8处理组：小鼠星形胶质细胞用hsAQP4-IgG(100ng/mL)处理，然后用含MFG-E8(100ng/mL)的星形胶质细胞完全培养基处理4h；
处理完毕后，进行GFAP、AQP4免疫荧光染色，具体步骤如下：将经4％多聚甲醛固定的细胞爬片使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗3次，5分钟/次，封闭液室温孵育1小时，加入一抗(GFAP抗体或AQP4抗体)，4℃冰箱摇床孵育过夜，第二天取出，PBS漂洗3次，5分钟/次，加入荧光二抗，室温摇床避光孵育1小时，PBS漂洗3次，5分钟/次，最后使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的抗淬灭封片剂封片，晾干后，可在激光共聚焦显微镜(Leica，TCS SP8)下观察，并拍照并对荧光信号强度进行定量分析。
实验结果如图1所示，由图1可知，MFG-E8抑制了GFAP阳性星形胶质细胞的过度激活，并恢复了星形胶质细胞AQP4的表达水平。
实施例2动物实验
本发明MFG-E8对NMOSD小鼠模型治疗方案如图2所示，其中，将实验小鼠分为健康对照组、NMOSD模型组、hMFG-E8单次组和hMFG-E8两次组，按图2所示小鼠治疗方案进行实验，图2给出了D(-7)至D10各实验阶段。其中，D(-7)至D0为造模阶段，D0-D10每天给予hsCtrl-IgG/hsAQP4-IgG，hMFG-E8单次组(D2)和hMFG-E8两次组(D2和D6)给予hMFG-E8，期间给予相关行为学评估及干预处理，D10麻醉、灌注后取材。
动物分组及给药如下所示：
将小鼠分为4组，10只/组，按图2所示小鼠治疗方案进行实验，具体如下：
1)健康对照组：在实验阶段D2及D6，给予尾静脉注射药物干预，PBS，每只、每次注射200ul PBS；
2)NMOSD模型组：在实验阶段D2及D6，给予尾静脉注射药物干预，PBS，每只、每次注射200ul PBS；
3)hMFG-E8单次组：在实验阶段第D2，给予尾静脉注射药物干预，每只、每次注射hMFG-E8(20μg/kg)；
4)hMFG-E8两次组：在实验阶段第D2及D6，给予尾静脉注射药物干预，每只、每次注射hMFG-E8(20μg/kg)。
2.1小鼠视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)动物模型的构建
方法如下：选择8周龄SPF级成年C57/BL6J雌性小鼠(由广东省动物监测研究所提供，体重20-25g)，为了破坏小鼠的血脑屏障并防止其自我修复，预处理阶段，D(-7)时，取小鼠后背四点作皮下注射，每点注射50ug热灭活H37Ra结核菌素(BD-DIFCO)及50uL完全弗氏佐剂混合物(购自Sigma-Aldrich)，并予腹腔注射200ng日咳毒素(购自Enzo LifeScience)，D(-4)时，再次腹腔注射百日咳毒素；D(-1)时，再次腹腔注射百日咳毒素；D0至D10，连续腹腔注射纯化的hsCtrl-IgG/hsAQP4-IgG，期间给予相关行为学评估及干预处理，D10麻醉、灌注后取材。
造模期间通过行为学进行评估，包括疲劳转棒实验及步态分析实验，评估造模效果。具体实验流程如下：
1)疲劳转棒实验
在小鼠造模的后第0、2、4、6、8和10天进行行为测试。旋转棒任务测试使用6道疲劳转仪进行，该设备要求小鼠在旋转圆柱体上保持平衡和行走，从每分钟10圈开始，在5分钟内均匀加速至每分钟40圈。每只小鼠在15分钟的时间间隔内测试三次，并将小鼠在设备上停留到降落的时长计算为三次的平均值。
2)步态分析实验
步态分析使用Catwalk辅助步态分析系统(XR-FP101，SHXINRUAN)进行，该系统由小鼠在狭窄的地带上自由行走组成，后肢步幅的长度计算为五个连续步骤的平均值。
3)行为学评价
疲劳转棒实验结果如图3所示，由实验结果可知，与NMOSD模型组相比，MFG-E8单次或两次给药，均可以显著延长NMOSD模型小鼠在转棒上的停留时间，从而改善了改善NMOSD模型小鼠的运动障碍。
步态分析实验结果如图4所示，由实验结果可知，与NMOSD模型组相比，MFG-E8单次或两次给药，均可以显著提高NMOSD模型小鼠的步幅长度，从而改善了改善NMOSD模型小鼠的运动障碍。
2.2MFG-E8对NMOSD小鼠模型治疗效果
取造模成功的小鼠，牺牲处理后，通过组织病理学、免疫组化/荧光及分子生物学手段评估模型组及不同剂量、给药次数的干细胞干预组的治疗效果。
2.2.1组织准备
4％多聚甲醛灌注固定，取小鼠脊髓，4％多聚甲醛浸泡过夜，更换30％蔗糖，组织沉底后，行冰冻切片，切片厚度约40μm，切片浸泡入冻存液，放4℃冰箱保存备用。
2.2.2免疫荧光实验
使用PBS漂洗3次，5分钟/次，封闭液室温孵育1小时，加入一抗(GFAP抗体、AQP4抗体、IBA1抗体(Wako Chemicals，货号019-19741))，4℃冰箱摇床孵育过夜，第二天取出，PBS漂洗3次，5分钟/次，加入荧光二抗，室温摇床避光孵育1小时，PBS漂洗3次，5分钟/次，最后使用含DAPI的抗淬灭封片剂封片，晾干后，可在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照并对荧光信号强度进行定量分析。
2.2.3疗效评价
组织病理学实验结果如图5所示，由实验结果可知，与NMOSD模型组相比，MFG-E8单次或两次给药，激活型(GFAP阳性细胞)星形胶质细胞的数量显著降低，星形胶质细胞AQP4的表达水平明显恢复，代表炎症的小胶质细胞(IBA-1阳性细胞)的数量明显减少，证明MFG-E8可以抑制星形胶质细胞的病理学改变并抑制炎症。
综上所述，本发明通过NMOSD细胞模型及动物模型试验，证明了人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)可以作为治疗视神经脊髓炎谱系疾病的药物使用，拓宽了人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)的应用范围。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.人乳脂球表皮生长因子8在制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述视神经脊髓炎谱系疾病疾病包括：视神经脊髓炎、复发性视神经炎、纵向延伸横贯性脊髓炎、视神经脊髓型多发性硬化、长阶段横断性脊髓炎、单侧或双侧视神经炎、伴自身免疫性疾病的视神经炎或脊髓炎、伴有症状性或无症状性脑内病灶的视神经炎或脊髓炎。
3.人乳脂球表皮生长因子8在制备治疗视神经脊髓炎药物中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物包含人乳脂球表皮生长因子8和药学可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和稳定剂。
6.根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射制剂。
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