JP2022518138A

JP2022518138A - 体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法

Info

Publication number: JP2022518138A
Application number: JP2021538864A
Authority: JP
Inventors: キム、キョン－ギュ; デ、デボジョチ
Original assignee: セラピューティクスバイオ
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2022-03-14
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: KR20220000913A; AU2019418187C1; KR20210113197A; US20220186183A1; EP3907279A4; JP7285591B2; CA3125670A1; EP3907279A1; AU2019418187A1; WO2020141648A1; KR102450790B1; AU2019418187B2; AU2022200831A1; US20240093147A1

Abstract

本発明は、ＨＧＦ分泌量２０，０００ｐｇ／ｍｌ以上を含む、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造用化合物カクテル組成物、その製造方法、これを含む神経疾患治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法に関する。

臨床等級の細胞を得るのは、疾病モデリングおよび薬物効能検査だけでなく、様々な神経疾患に対する治療におけるその細胞の適用という点から大いに重要性がある。ヒトｉＰＳＣおよびＥＳ細胞から異なる系統に相当する生理活性細胞を得ることが可能であるが、これら細胞の広範囲な適用は入手可能性、免疫感受性、機能的完全性、腫瘍発生危険および効率性の問題に関連する問題によって阻害される（１－３）。したがって、適当な免疫型一致供与体（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ－ｍａｔｃｈｅｄｄｏｎｏｒ）由来細胞の移植が極めて重要な挑戦課題になる。

シュワン細胞（ＳＣ）は末梢神経系の主な神経膠細胞であって、いくつかの神経栄養因子を分泌しながら神経の健康を促進して効率的な神経伝導に寄与するうえで極めて重要な役割を果たす。また、ＳＣ細胞は末梢神経損傷後の神経再生過程に必須の役割を果たすので、損傷した神経部位へのＳＣ細胞の移植は軸索再生を強化して、ＰＮＳおよびＣＮＳ損傷患者に治療的利点を提供するうえでの唯一の実行可能な治療法であり得る。

シュワン細胞が多くの神経疾患において唯一の選択であり得るが、移植可能なシュワン細胞を十分に得るうえでの主な困難は、かかる治療のための自己組織または同種異型のシュワン細胞が不足するということである。多くの場合、患者または同種異型供与者の健康な神経が移植可能なシュワン細胞のソースとして切除されなければならない。また、最終分化細胞である、培養されたシュワン細胞は増殖能力が制限されるので、任意の長期間の治療効果を達成するのに十分な細胞の量が制限される。

ｉＰＳＣ細胞の場合、誘導されたシュワン細胞は、神経堤の効率的な誘導および後の、複雑な培地条件および成長因子を有するシュワン細胞への分化に依存する。これに対し、神経幹細胞および機能性ニューロンへの体細胞の分化は、マスター転写因子であるＳＯＸ１０およびＫｒｏｘ２０の強制発現により達成される。このため、大韓民国公開公報第１０－２０１７－００４５３５６号では、遺伝子発現産物を導入して製造されたシュワン細胞に対する技術が開示されているが、このような遺伝子発現産物の導入は一部の局面では効果的であり得るが、ウイルスベクター媒介遺伝子伝達、後続の遺伝子組換えおよび副作用の危険のため、臨床での広範囲な使用において問題があった。

また、低分子化合物を用いた直接分化技術も開発されているが、従来の低分子化合物を適用して分化した細胞の場合、低分子物質が除去されれば再び元の細胞に戻る可能性があり、細胞治療剤としての開発に限界があるという点が指摘されている。

大韓民国公開公報第１０－２０１７－００４５３５６号

本発明は、従来技術上の問題点を解決して、遺伝子の組換えなくても分化可能であり、体細胞から化合物カクテルの処理だけでヒトおよび／動物に由来する神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｌｃｅｌｌ）のように損傷した神経の再生および／または回復のみならず、神経自体の保護活性を有する新規な神経膠様細胞（ｇｌｉａ－ｌｉｋｅｃｅｌｌ、ＧＬＣ）を提供する。ここで、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａ）、星膠細胞あるいは星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｌｓ）、小膠細胞あるいは微小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）、衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）および上衣膠細胞（ｅｐｅｎｄｙｍａｌｃｅｌｌ）などを含む。

本発明は、体細胞から分化してＨＧＦ２００００ｐｇ／ｍｌ以上を分泌する神経膠様細胞を提供する。

また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞を提供する。

また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む神経膠様細胞製造用カクテル組成物を提供する。

また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。

また、本発明は、上述した体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。

また、本発明は、上述した体細胞から分化した神経膠様細胞を投与して神経疾患を予防および治療する方法を提供する。

本発明において、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａ）、星膠細胞あるいは星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｌｓ）、小膠細胞あるいは微小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）、衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）および上衣膠細胞（ｅｐｅｎｄｙａｌｃｅｌｌ）などを意味する。本発明が提供する新規な神経膠様細胞は、生体内に存在する神経膠細胞の神経再生、復旧および／または保護機能を有するものである。

また、本発明は、分化能のない体細胞を直接分化させるため、従来の細胞治療剤の開発に使用されている胚幹細胞、逆分化幹細胞のような全分化能細胞に比べて、癌発生の可能性がない新規な神経膠様細胞を提供することを目的とする。

また、本発明は、低分子化合物のみを使用するため、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、遺伝体変形の可能性が少なく、その分化期間が短縮され、分化価格が割安であり、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を提供可能な新規な神経膠様細胞を製造する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、分化した細胞を低分子化合物のない一般の培養液で継代培養可能な安定した細胞に維持できる再培養技術を提供することにより、従来の低分子化合物を用いた直接分化の欠点の１つである分化細胞の不安定性を克服することを目的とする。

また、本発明は、損傷した神経細胞を優れた効率で復旧、再生および／または回復可能であり、神経細胞自体を保護する活性を有する体細胞から分化した新規な神経再生保護機能細胞を含む神経疾患の予防および／または治療用細胞治療剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、患者の体細胞を直接分化させて神経疾患に対する細胞治療剤として使用できるため、従来使用あるいは研究されている幹細胞を用いた細胞治療剤とは異なり、免疫拒絶反応のない細胞治療剤を提供することを目的とする。

本発明は、化合物カクテルを用いた体細胞の分化、逆分化および／または交差分化は、伝達、再現性および効率的な拡張性を含む適用の容易な利点があり、また、最も重要なことは、任意の遺伝子組換えなくても臨床目的で容易に外挿（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）可能な効果を提供することができる。

なお、本発明は、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、その期間が短縮され、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を製造できる方法を提供することを効果とする。

図１は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）が新規な神経膠様細胞（以下の実施例およびこれに対応する図面では、具体的には、「Ｇｌｉａ－ｌｉｋｅＣｅｌｌ」という。あるいは略記して「ＧＬＣ」）に分化する化学ベースの転換方式の概要に関する図である。分化は３段階（ＳｔｅｐＩ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ、ＳｔｅｐＩＩ：Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ、ＳｔｅｐＩＩＩ：Ｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）からなるが、一番目の分化誘導段階で、第１化合物カクテルを用いて線維芽細胞を神経膠様細胞に転換させ、二番目の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）段階で、第２化合物カクテルを用いて転換された神経膠様細胞を成熟させる。最後の三番目の段階である再培養段階では、分化に使用される化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）のない培養液で安定した細胞を培養する。この時、二番目のｍａｔｕｒａｔｉｏｎ段階が必ずしも必要なわけではない。図２は、神経膠様細胞への分化に使用された化合物に関する図である。図３は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である（図２のＶＣＲＦＰＴ６個の化合物を含む、第１化合物カクテルで分化誘導された後、ＣＲＦ３個の化合物を含む第２化合物カクテルで成熟した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関するものである；Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図４は、第１化合物カクテルの構成のうちＶＣＲＦＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化効率が低下することを確認する。図５は、第１化合物カクテルの構成のうちＣＲＦＰＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化効率が低下することを確認する。図６は、第１化合物カクテルの構成のうちＶＲＦＰＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化効率が低下することを確認する。図７は、第１化合物カクテルの構成のうちＶＣＦＰＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化効率が低下することを確認する。図８は、第１化合物カクテルの構成のうちＶＣＲＰＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化が行われないもので、「Ｆ」（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）がない場合、分化が全く行われないことを確認することにより、「Ｆ」が分化に必要であることを確認した。図９は、第１化合物カクテルの構成のうちＶＣＲＦＴのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）、分化効率が低下することを確認する。図１０は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する写真であり、化合物カクテルＶＣＲＦの組み合わせで進行させて体細胞から神経膠様細胞への分化効率が低下することを確認した。図１１は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する写真で、第１カクテル化合物の組み合わせであるＶＣＲＦＰを含んで体細胞から神経膠様細胞への分化がうまく行われることを確認した。したがって、線維芽細胞の神経膠様細胞の分化は「Ｔ」なくても起こり得ることを確認した（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図１２は、神経膠様細胞への分化に使用される他の種類の化合物に関する図である。図２の化合物と同じ機能を有する化合物を使用した。図１３は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である。図６の化合物の組み合わせによる第１化合物カクテルで線維芽細胞から分化誘導された新規な神経膠様細胞の形態学的特徴を示す（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図１４は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、分化誘導段階を３日に固定後に成熟させる段階を変化する方式に関するものである。図１５は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、分化誘導段階の日数を変化する方式後に成熟させる段階を含む方式に関するものである。図１６は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、化合物カクテル処理なしに再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階を含む方式に関するものである。図１７は、顕微鏡写真であってヒトのシュワン細胞の形態に関する写真である。図１８は、プロトコル１で製造された神経膠様細胞（Ｃ１－ＧＬＣ）に関する写真であり、第１カクテル化合物でＶＣＲＦＰＴ組み合わせ、第２化合物カクテルでＣＲＦ処理し、ヒトのシュワン細胞（図１７）とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞（図２１）とは異なる形態を有することを確認した。図１９は、プロトコル２で製造された神経膠様細胞（Ｃ２－ＧＬＣ）に関する写真であり、第１カクテル化合物でＶＣＲＦＰＴ組み合わせ、第２化合物カクテルでＣＲＦ処理し、ヒトのシュワン細胞（図１７）とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞（図２１）とは異なる形態を有することを確認した。図２０は、プロトコル３で製造された神経膠様細胞（Ｃ３－ＧＬＣ）に関する写真であり、第１カクテル化合物でＶＣＲＦＰＴ組み合わせ、第２化合物カクテルでＣＲＦ処理し、ヒトのシュワン細胞（図１７）とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞（図２１）とは異なる形態を有することを確認した。図２１は、顕微鏡写真であって体細胞の線維芽細胞に対する写真である。図２２は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、２２Ａは、分化に使用した線維芽細胞（ＨｕｍａｎＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、２２Ｂは、分化した神経膠様細胞（Ｃｌａｓｓ３Ｇｌｉａ－ｌｉｋｅｃｅｌｌ、Ｃ３－ＧＬＣ）、２２Ｃは、シュワン細胞（ＨｕｍａｎＳｃｈｗａｎｎｃｅｌｌ）の形態学的特徴に関する図である。各細胞の形態学的な特徴を示すために代表的な形態を示すいくつかの細胞の外郭を赤い点線で表示した（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図２３は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃｌ＿ＧＬＣ（６＋６））。分化した細胞とシュワン細胞ではシュワン細胞のマーカーが発現しているが、線維芽細胞ではシュワン細胞のマーカーがほとんど発現しないことを確認できるもので、より具体的な発現物質に関する図面は以下に記載した（図７１～７４）。図２４は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現する突起膠細胞（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）マーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。分化した細胞で突起膠細胞から発現する多くの遺伝子が発現しているが、線維芽細胞では突起膠細胞のマーカーが発現しておらず、シュワン細胞では突起膠細胞のマーカーの一部が発現していることを確認することができる。図２５は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現する星膠細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）マーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。分化した細胞で星膠細胞から発現する多くの遺伝子が発現しているが、線維芽細胞では星膠細胞のマーカーが発現しておらず、シュワン細胞では星膠細胞のマーカーの一部が発現していることを確認することができる。図２６は、Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）のマイクロアレイにより発現が増加する遺伝子を機能的に分類した時、ａｓｔｒｏｃｙｔｅおよびｍｉｃｒｏｇｌｉａのような神経膠細胞で発現するサイトカインの発現が増加する結果を示す。図２７は、分化誘導段階の日数と成熟させる段階の日数が異なる神経膠様細胞（ＧＬＣ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびヒトシュワン細胞（ＨｕｍａｎＳｃｈｗａｎｎｃｅｌｌ）で発現するマーカーとして使用される遺伝子のマイクロアレイの結果に関する図である。（Ａ）神経膠細胞のマーカー遺伝子の発現、（Ｂ）線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現。図２８は、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で示したＣ１－ＧＬＣに関するもので、Ａ、Ｂ、Ｃはそれぞれ神経膠細胞のマーカーとしてＳ１００、Ｐ０（ＭＰＺ）、ＧＦＡＰを使用した写真である。核を染色するには共通してＤＡＰＩを使用した（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図２９は、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で示したＣ３－ＧＬＣに関するもので、神経膠細胞のマーカーとしてＧＦＡＰ（緑色）を使用した写真である。核を染色するにはＤＡＰＩ（青色）を使用し、増殖中の細胞を染色するためにはＥＤＵ（赤色）を使用した（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝５０μｍ）。図３０は、プロトコルＩによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はＲＴ－ＰＣＲによって発現レベルが測定されて比較された。図３１は、プロトコルＩＩによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はＲＴ－ＰＣＲによって発現レベルが測定されて比較された。図３２は、プロトコルＩＩ、ＩＩＩによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における神経膠細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はＲＴ－ＰＣＲによって発現レベルが測定されて比較された。図３３は、神経膠様細胞の培養液に分泌されたサイトカインおよび成長因子の量を分析した図である。ＭＩＦ、ＣＸＣＬ１２、ＩＬ８、ＢＤＮＦ、ＧＲＯ－ａｌｐｈａ、ＨＧＦなどが神経膠様細胞から線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に対比して過剰分泌されていることを確認することができる。神経保護および再生機能を有すると知られたＭＬＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦなどはヒトシュワン細胞（ｈＳＣ）に対比してより多い量が神経膠様細胞で発現することを確認することができる。図３４は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図３５は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図３６は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図３７は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図３８は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図３９は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。図４０の４０Ａは、体細胞（線維芽細胞）培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、４０Ｂは、線維芽細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。図４１のＡは、プロトコルＩで分化させたＣ１－ＧＬＣ（６＋６）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Ｂは、プロトコルＩで分化させたＣ１－ＧＬＣ（６＋６）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。図４２のＡは、プロトコルＩＩで分化させたＣ２＿ＧＬＣ（１５＋３）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Ｂは、プロトコルＩＩで分化させたＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。図４３のＡは、プロトコルＩＩＩで分化させたＣ３＿ＧＬＣ（６＋３＋１２）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Ｂは、プロトコルＩＩＩで分化させたＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋１２）神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。図４４のＡは、シュワン細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Ｂは、ＮＳＣ３４シュワン細胞培養液で処理されたモーターニューロンＮＳＣ３４細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。図４５は、神経膠様細胞への転換率に対するもので、ＧＦＡＰの発現を示す細胞によって測定されたところにより８５％の収率を示す。図４６は、再培養された細胞が示す増殖特性に関するもので、細胞増殖能力の推定値としての、プロトコルＩＩＩで分化させたＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋１２）神経膠様細胞のＥｄＵ染色程度（Ａ、赤色）を示すものである。（Ｂ）は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色（青色）として核を表示し、（Ｃ）は、（Ａ）と（Ｂ）を重ねた写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝５０μｍ）。図４７は、ＥｄＵ陽性細胞の比率に対する定量的グラフに関する図である。エラーバー（Ｅｒｒｏｒｂａｒ）は、平均の標準誤差（ｓｔａｎｄａｒｄｅｒｒｏｒｏｆｍｅａｎ；ＳＥＭ）を意味する。図４８は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、凍結後に解凍したＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である。凍結および解凍過程を進行させても細胞形態の側面で変化がないことを示す図である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝５０μｍ）。図４９は、プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたＨＧＦをＥＬＩＳＡを用いて測定した量的分析グラフである。特に、Ｃ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋１２）の場合、細胞を凍結してから（Ｆ、ｆｒｅｅｚｉｎｇ）解凍（Ｔ、ｔｈａｗｉｎｇ）した後、細胞を育てながら分泌されるＨＧＦを測定した（ＦＴ）。凍結および解凍過程を進行させてもＨＧＦ発現の側面で大きな変化がないことを示す図である。図５０は、凍結および解凍過程を進行させても細胞形態および神経突起の成長の側面で変化がないことを示す図で、プロトコルＩＩＩのＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋１２）神経膠様細胞培養液でのＮＳＣ３４細胞の神経突起の成長写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図５１は、凍結および解凍過程を進行させても細胞形態および神経突起の成長の側面で変化がないことを示す図で、プロトコルＩＩＩのＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋１２）神経膠様細胞培養液でのＮＳＣ３４細胞の神経突起成長の定量分析に関するグラフである。図５２は、ロータロッド分析に関するグラフである。ネズミの大腿部神経を損傷させて慢性狭窄モデル（ｒａｔｃｈｒｏｎｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ、ＣＣＩ、ｍｏｄｅｌ）を作り、損傷した神経にヒトの線維芽細胞、ヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、８週後に神経再生程度をｒｏｔａｒｏｓ分析により測定した。ＦＢ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、線維芽細胞）、ＳＣ（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｌ、シュワン細胞）、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて神経再生がうまく行われたことを確認することができる。特に、Ｇ５（Ｃ１－ＧＬ６＋６）の場合、神経再生が最もよく行われていることを確認することができる。図５３は、ＥＭＧ分析に関するグラフである。図３７と同じ条件で実験を行い、神経再生程度をｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ（ＥＭＧ）で分析した。同じく、Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて最も神経再生がよく行われたことを確認することができる。．図５４は、髄鞘化された神経の写真である。図５２と同じ条件で実験をし、神経再生程度を髄鞘化された神経の分布で確認することができる。Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて髄鞘化が最もよく行われたことを確認することができる。図５５は、図５４の写真において髄鞘化された神経を定量的グラフで表現したものである。Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて髄鞘化された神経が最も多いことから、神経再生が最もよく行われたことを確認することができる。図５６は、髄鞘化された神経の電子顕微鏡写真である。図５２と同じ条件で実験をし、神経再生程度を神経の髄鞘化程度で確認することができる。Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて髄鞘化が最もよく行われたことを確認することができる。図５７は、図５６の電子顕微鏡写真において神経の髄鞘化程度を髄鞘の厚さを定量化してグラフで表現したものである。Ｇ５（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ６（線維芽細胞処理）、Ｇ７（ヒトシュワン細胞処理）に比べて髄鞘の厚さが最も厚いことから、神経再生が最もよく行われたことを確認することができる。図５８は、神経膠様細胞誘導過程で使用される化合物カクテルに含まれた６種類の化合物の濃度による分化の有無に関するもので、図５８には、最適化された濃度（ｗｏｒｋｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、最適化濃度の２倍の濃度（２ｘｗｏｒｋｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、各化合物のＩＣ_５０値に相当する濃度（ＩＣ_５０ｖａｌｕｅｓ）、そしてＩＣ_５０濃度の２倍の濃度（２ｘＩＣ_５０ｖａｌｕｅｓ）値を示しており、それぞれの濃度の化合物が混合されたカクテルを用いて分化を誘導させた時に得られる神経膠様細胞を顕微鏡で観察した写真をそれぞれ図５９～６２に示した（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図５９は、最適化された濃度の化合物カクテルを処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、神経膠様細胞の形態からみた時、分化がうまく行われたことを確認することができた。図６０は、最適濃度の２倍の濃度を処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化は行われたものの、転換された細胞数の減少からみて、化合物が細胞に対する毒性がややあることを確認した。図６１は、第１化合物カクテルの６種の化合物をＩＣ_５０値で処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化効率が著しく減少したことを確認した。図６２は、ＩＣ_５０値の２倍の濃度の化合物カクテルで処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化効率が著しく減少したことを確認した。図６３は、患者の皮膚細胞から分離した線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、ＣＭＴ（ｃｈａｒｃｏｔ－ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）疾患を患う患者の皮膚から採取した線維芽細胞をプロトコルＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６４は、患者の皮膚細胞から分離した線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、ＣＭＴ（ｃｈａｒｃｏｔ－ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）疾患を患う患者の皮膚から採取した線維芽細胞をプロトコルＩＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６５は、６歳男児の真皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６６は、６歳男児の真皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６７は、８２歳女性の皮膚由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６８は、８２歳女性の皮膚由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝１００μｍ）。図６９は、４７歳男性の包皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝ｌ００μｍ）。図７０は、４７歳男性の包皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルＩＩＩを用いて転換したＣ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）神経膠様細胞の顕微鏡写真である（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝ｌ００μｍ）。図７１は、図２３のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する具体的な図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。図７２は、図２３のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する具体的な図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。図７３は、図２３のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する具体的な図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。図７４は、図２３のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇに対する具体的な図である（Ｎ＿Ｈｕｍ＿Ｓｃｈｗ：ヒトシュワン細胞；Ｎ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：線維芽細胞；Ｎ＿ＳＣ＿１２ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋３）；Ｎ＿ＳＣ＿９ｄ：Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））。図７５は、ＣＭＴ患者の線維芽細胞から作った神経膠様細胞（Ｃ３－ＧＬＣ６＋３＋６）（図６４）から分泌されるＨＧＦの量に対するグラフである。図７６は、多様な線維芽細胞からプロトコルＩＩの方法で分化させた神経膠様細胞（Ｃ２－ＧＬＣ（１５＋３））から分泌されたＨＧＦの量に対するグラフである。図７７は、プロトコルＩの方法で製造した神経膠様細胞において、分化誘導段階で使用される化合物カクテルの多様な組み合わせを用いて分化させた神経膠様細胞（Ｃ１－ＧＬＣ（６＋６））から分泌されたＨＧＦの量に対するグラフである。図７８は、プロトコルＩＩおよびＩＩＩの方法で製造した神経膠様細胞から分泌されるＨＧＦの量に対するグラフである。図７９は、線維芽細胞、シュワン細胞および図５８の化合物カクテルの各濃度に関連する組み合わせの化合物カクテルを用いて分化させて製造された神経膠様細胞から分泌されるＨＧＦの量に対するグラフである。図８０は、ロータロッドおよびＢＢＢ分析に関するグラフである。ネズミの脊椎神経を損傷させて、脊髓損傷モデル（ＳＣＩ、ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ、Ｒａｔ）を作り、損傷した神経にヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、０日、１４日および２８日後の神経再生程度をｒｏｔａｒｏｄおよびＢＢＢ分析（ＢＢＢｓｃｏｒｉｎｇ：Ｂａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｉｅａｎｄＢｒｅｓｈｅｎｌｏｃｏｍｏｔｏｒｓｃａｌｅ方法）により測定した。ＦＢ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、線維芽細胞）、ＳＣ（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｌ、シュワン細胞）、Ｇ３（Ｃ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）処理）の場合、Ｇ２（無処理）、Ｇ４（ヒトシュワン細胞処理）に比べて最も神経再生がよく行われたことを確認することができる。図８１は、神経様細胞の体内分布に対するものである。Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子を有するウイルスに感染させて緑色蛍光を示すＣ３－ＧＬＣおよびヒトシュワン細胞にネズミ（Ｒａｔ）の太腿筋肉に注射器を用いて入れた後、指定された時間に蛍光の位置および明るさを観察してＣ３－ＧＬ（６＋３＋６）の変化を観察した。実験結果、最小５日以上神経様細胞が残っていることを確認することができた。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は、従来技術上の問題点を解決して、遺伝子の組換えなくても分化可能であり、体細胞から化合物カクテルの処理だけでヒトおよび／動物に由来する神経膠細胞のように損傷した神経の再生および／または回復のみならず、神経自体の保護活性を有する新規な神経膠様細胞（ｇｌｉａ－ｌｉｋｅｃｅｌｌ）を提供する。

本発明において、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａ）、星膠細胞あるいは星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、シュワン細胞（Ｓｃｈｗａｎｎｃｅｌｌｓ）、小膠細胞あるいは微小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）、衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌ）および上衣膠細胞（ｅｐｅｎｄｙｍａｌｃｅｌｌ）などを含む。本発明が提供する新規な神経膠様細胞は、神経膠細胞が有する神経再生、復旧および／または保護機能を有するものである。

また、本発明は、分化能のない体細胞を直接分化させるため、従来の細胞治療剤の開発に使用されている胚幹細胞、逆分化幹細胞のような全分化能細胞に比べて、癌発生の可能性がない細胞を提供することを目的とする。

また、本発明は、低分子化合物のみを使用するため、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、遺伝体変形の危険が少なく、分化期間が短縮され、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を提供可能な新規な神経膠様細胞を製造する方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、分化した細胞を低分子化合物のない一般の培養液で継代培養が可能な安定した細胞に維持できる再培養技術を提供することにより、従来の低分子化合物を用いた直接分化の欠点の１つである分化細胞の不安定性を克服することを目的とする。本発明において、低分子化合物とは、本願発明に含まれる第１化合物カクテルまたは第２化合物カクテルを構成可能な成分を意味するものである。

また、本発明は、損傷した神経細胞を優れた効率で復旧、再生および／または回復可能であり、体細胞から分化した神経細胞自体を保護する活性を有する新規な神経再生保護機能細胞を含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤を提供することを目的とする。

本発明の新規な神経膠様細胞は、ＨＧＦ分泌量が２０，０００ｐｇ／ｍｌ以上であってもよい。

また、本発明の神経膠様細胞は、ＭＥＦ分泌量１０ｎｇ／ｍｌ以上；およびＢＮＤＦ分泌量１５０ｐｇ／ｍｌ以上を含む体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を提供し、前記神経膠様細胞は、神経再生および保護用であってもよいし、具体的には、優れた効率で損傷した神経細胞の再生、回復および／または神経の保護を可能にする。

本発明の新規な神経膠様細胞は、より具体的には、神経再生機能があるタンパク質因子であるＨＧＦ分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて１０倍以上高いか、あるいは２０，０００ｐｇ／ｍｌ以上であってもよいし、好ましくは２０，０００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは３０，０００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは５０，０００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌであってもよい。ＨＧＦは、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど優れた効果を発現することができる。また、神経再生機能がある他のタンパク質因子であるＢＮＤＦ分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて１０倍以上高いか、あるいは１５０ｐｇ／ｍｌ以上であってもよいし、好ましくは２００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは７００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１，０００～５，０００，０００ｐｇ／ｍｌであってもよい。ＢＮＤＦも、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど効果が高い。また、神経再生機能があるさらに他のタンパク質因子であるＭＩＦ分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて１０倍以上高いか、あるいは１０ｎｇ／ｍｌ以上であってもよいし、好ましくは１５～１，０００，０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０～１，０００，０００ｎｇ／ｍｌであってもよい。ＭＩＦは、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど効果が高い。ＨＧＦ、ＭＩＦおよびＢＤＮＦは、それぞれ神経保護および再生機能があると知られているタンパク質因子であるので、分泌量が前記範囲で分泌される場合、神経再生機能の側面で優れた効果を有することができる。

また、神経膠様細胞は、ヒトのシュワン細胞と類似の形態を示すが、より詳しくは、長さが５０～５００μＬであり、直径が１５～５０μＬである長い形態の細胞として膨らんでいる中心部分から両端あるいはいくつか（＜１０）の端に細くなり、ある場合、この端部分が幅１ミクロン程度の長い糸状を呈する（図２２参照）。

さらに、神経膠様細胞は、分化させるのに使用した線維芽細胞のマーカーであるＤＫＫ１やＦＢＬＮ５の発現が線維芽細胞の発現の２０％以下で観測されなければならず、神経膠細胞で発現が増加すると知られたマーカー遺伝子であるＭＢＰ、ＧＡＬＣ、ＮＤＲＧ１などの発現が線維芽細胞対比１．５倍以上増加する特徴を有する（図２７参照）。

また、神経膠様細胞は、ＮＳＣ－３２のように運動神経細胞の神経突起の成長を助ける特徴を有する。より具体的には、神経様細胞培養液を運動神経細胞の培養時に添加すれば、７０％以上の細胞が長さ５０～５００μＭの神経突起を有する。

さらに、本発明は、新規な神経膠様細胞を製造可能な第１化合物カクテルおよび第２化合物カクテルを提供する。

前記第１化合物カクテルは、体細胞を新規な神経膠様細胞に誘導するためのものであって、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含むものであってもよい。

また、第２化合物カクテルは、第１化合物カクテル処理された体細胞に後処理して成熟する段階を含むようにするものであって、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤およびｃＡＭＰ作用剤を含むものであってもよい。

本発明において、「ヒストンデアセチラーゼ抑制剤（Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、ヒストンデアセチラーゼを抑制する物質を意味し、ヒストンデアセチル化の阻害によりクロマチンを高アセチル化状態にして細胞増殖抑制因子および分化誘導に必須の遺伝子の発現を促進して癌細胞の分化を誘導し、血管新生を抑制し、細胞周期をＧ１状態に固定させて癌細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して強い細胞増殖抑制（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）の抗癌活性を示すことが知られている。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ｐＲＢ／Ｅ２Ｆを媒介として遺伝子転写（ｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を抑制し、ヒストンアセチレーション（ｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）の破壊が様々な癌の発生に関連しており、ＨＤＡＣは、低酸素症、低糖、細胞癌化などの劣悪な環境条件で高発現して細胞増殖抑制因子の発現を阻害して細胞増殖を促進させる役割を果たして、ＨＤＡＣは細胞癌化および分化調節に重要な調節因子として認識されていると知られている。特に、前記ＶＰＡは、イノシトールの減少を誘発し、ＧＳＫ－３βを阻害し、ＥＲＫｐａｔｈｗａｙを活性化させ、ＰＰＡＲの活性を刺激することが知られている。前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤（ＨＤＡＣｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は１ｎＭ～１００ｍＭ含まれる。

前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はその種類が限られてはいないが、より具体的には、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ）、プラシノスタット（Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）、トリコスタチンＡ（ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ）、ヒドロキサム酸（ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ）、サイクリックテトラペプチド（ｃｙｃｌｉｃｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）、デプシペプチド（ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、ベンズアミド（Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、エンチノスタット（Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）およびブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）から構成された群より選択された１種以上を含むことができ、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ）および／またはプラシノスタット（Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）がより好ましい。

前記化合物のうち、バルプロ酸は、５０μＭ～５ｍＭ含まれ、好ましくは２５０μＭ～４ｍＭ含まれてもよいし、より好ましくは４００μＭ～２ｍＭ、さらに好ましくは５００μＭ～１ｍＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。また、前記化合物のうち、プラシノスタットは、５０ｎＭ～２００ｎＭの範囲に含まれる場合、毒性なく体細胞を神経膠様細胞に優れて分化させることができるという点で好ましい。

発明において、「ＧＳＫ抑制剤（Ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈｅａｓｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、ＧＳＫ信号伝達過程に関与するＧＳＫ１／２のアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）分子であるＧＳＫ１／２を標的とする物質であれば限定されない。前記ＧＳＫ抑制剤（Ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｙｎｔｈｅａｓｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は１ｎＭ～１００ｍＭ含まれる。前記ＧＳＫ抑制剤は種類が限定されないが、より具体的には、Ｃｈｉｒ９９０２１（６－（２－（４－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎｉｃｏｔｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）；ＬＹ２０９０３１４（３－ｉｍｉｄａｚｏ［１，２－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－４－［１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２，ｊｋ］［１，４］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ－７－ｙｌ］）；１－ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｙｒｉｄｏ［３’，２’：２，３］ａｚｅｐｉｎｏ［４，５－ｂ］ｉｎｄｏｌ－６（５Ｈ）ｏｎｅ）；ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）；ＡＲＡ０１４４１８（Ｎ－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（５－ｎｉｔｒｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）；Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｍｏｎｏｘｉｍｅ；５－Ｉｏｄｏ－ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｍｏｎｏｘｉｍｅ；ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｏ－［３，２－ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－６（５Ｈ）－ｏｎｅ）；ＳＢ－４１５２８６（３－［（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－（２－ｎｉｔｒｏ－ｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；ＳＢ－２１６７６３（３－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；ＭａｙｂｒｉｄｇｅＳＥＷ００９２３ＳＣ（２－ａｎｉｌｉｎｏ－５－ｐｈｅｎｙｌ－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）；（Ｚ）－５－（２，３－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｅ－２，４－ｄｉｏｎｅ；ＴＷＳ１１９（３－（６－（３－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｏｌ）；Ｃｈｉｒ９８０１４（Ｎ２－（２－（４－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）－５－ｎｉｔｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－２，６－ｄｉａｍｉｎｅ）；ＳＢ４１５２８６（３－（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）－４－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；およびＴｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（２－（１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－４－（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ））から構成された群より選択された１種以上であってもよいし、好ましくは、Ｃｈｉｒ９９０２１および／またはＬＹ２０９０３１４であってもよい。

前記ＧＳＫ抑制剤のうち、Ｃｈｉｒ９９０２１および／またはＬＹ２０９０３１４は５ｎＭ～１ｍＭ含まれ、好ましくは１０ｎＭ～２０μＭ含まれてもよいし、より好ましくは２０ｎＭ～１５μＭ、さらに好ましくは１０μＭ～２０μＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。

本発明において、「ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤（ＡＬＫ－５ｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、ＴＧＦ－βタイプＩレセプターに結合して、ＴＧＦ－β Ｉの正常な信号伝達過程を妨げる物質を意味し、ＴＧＦ－βタイプＩ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β ｔｙｐｅＩ）は、細胞増殖、分化および多様な種類の細胞に多様な作用をする多機能性ペプチドであって、このような多機能性は、脂肪細胞形成、筋細胞形成、骨細胞形成、上皮細胞分化など様々な組織の成長および分化において中枢的な役割を果たす。

前記ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤は１ｎＭ～１００ｍＭ含まれる。

前記ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤はその種類が限定されるものではない。より具体的には、前記ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤（ＴＧＦ－βタイプＩレセプター抑制剤）は、ＲｅｐＳｏｘ（１，５－Ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ、２－［３－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］）；ＳＢ４３１５４２（４－（４－（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－５－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）；ＳＢ５２５３３４（６－（２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－４－（６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）；ＧＷ７８８３８８（４－（４－（３－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－Ｎ－（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）；ＳＤ－２０８（２－（５－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｔｅｒｉｄｉｎ－４－ａｍｉｎｅ）；Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９、４－（２－（６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）；ＥＷ－７１９７（Ｎ－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－２－ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）；ＬＹ２１０９７６１（７－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）－４－（２－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）；ＳＢ５０５１２４（２－（４－（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）：ＬＹ３６４９４７（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、４－［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］）；Ｋ０２２８８（３－［（６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ］および；ＬＤＮ－２１２８５４（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、５－［６－［４－（１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］）から構成された群より選択された１種以上であってもよいし、好ましくは、ＲｅｐＳｏｘおよび／またはＳＢ４３１５４２であってもよい。

より具体的には、ＲｅｐＳｏｘおよび／またはＳＢ４３１５４２は１ｎＭ～５００μＭ含まれ、好ましくは４ｎＭ～２０μＭ含まれてもよいし、より好ましくは８ｎＭ～７．５μＭ、さらに好ましくは５μＭ～１０μＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。

本発明において、「ｃＡＭＰ作用剤（ｃＡＭＰａｇｏｎｉｓｔ）」は、ｃＡＭＰ信号を活性化させる物質を意味する。ｃＡＭＰ作用剤は１ｎＭ～１００ｍＭ含まれる。

前記ｃＡＭＰ作用剤はその種類が限定されないが、具体的には、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＮＫＨ４７７（ａｎｏｖｅｌｆｏｒｓｋｏｌｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ＰＡＣＡＰ１－２７（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＰＡＣＡＰａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、またはＰＡＣＡＰ１－３８（ＰＡＣＡＰａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）を含むことができ、好ましくは、フォルスコリンおよび／またはＮＫＨ４７７であってもよい。

前記化合物のうち、フォルスコリンは１ｎＭ～５００μＭ含まれ、好ましくは０．５μＭ～５０μＭ含まれてもよいし、より好ましくは１μＭ～４５μＭ、さらに好ましくは２５μＭ～５０μＭ含まれてもよいし、ＮＫＨ４７７は０．５μＭ～１００μＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。

本発明において、「ヒストンデメチラーゼ抑制剤」は、ヒストンＨ３で発見される２つのリシンを選択的に脱メチル化する酵素であるＬＳＤ１を抑制する役割を果たし、モノアミンから酸化的脱アミン化を阻害する役割を果たす。ヒストンデメチラーゼ抑制剤は１ｎＭ～１００ｍＭ含まれる。

前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はその種類が限定されないが、具体的には、パルネート（ｐａｒｎａｔｅ；Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）、ＳＰ２５０９、Ｃｉｃｌｉｐｉｒｏｘ、Ｄａｍｉｎｏｚｉｄｅ、ＧＳＫＪ１、ＧＳＫＪ２、ＧＳＫＪ４、ＧＳＫＪ５、ＧＳＫＬＳＤ１、（Ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃａｃｉｄ、ＩＯＸ１、ＪＩＢ０４、ＮＳＣ６３６８１９、ＯＧ－Ｌ００２、ＰＢＩＴ、ＲＮ１ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓ２１０１、ＴＣ－Ｅ５００２であってもよいし、好ましくは、パルネート（ｐａｒｎａｔｅ；Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）および／またはＳＰ２５０９であってもよい。

前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤のうち、パルネートは１ｎＭ～１ｍＭ含まれ、好ましくは０．５μＭ～５００μＭ含まれてもよいし、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、さらに好ましくは１０μＭ～２０μＭ含まれてもよく、ＳＰ２５０９は１ｎＭ～１００ｎＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。

本発明において、前記第１化合物カクテルおよび／または第２化合物カクテルは、ＲＡＲ作用剤をさらに含む方が、神経保護および再生機能があるタンパク質因子がより優れて発現するという点でさらに好ましい。本発明において、ＲＡＲ作用剤はその種類は限定されないが、具体的には、ＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ；またはＡｒｏｔｉｎｏｉｄａｃｉｄ）であってもよい。

前記ＲＡＲ作用剤は１ｎＭ～５００μＭ含まれ、好ましくは１０ｎＭ～２μＭ含まれてもよいし、より好ましくは２０μＭ～１．５μＭ、さらに好ましくは１μＭ～２μＭ含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。本発明において、体細胞（ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌ）はその種類が限定されないが、各種組織から分離された線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、血液、脂肪細胞を含む完全分化した体細胞および／または臍帯、胎盤、臍帯血、骨髓、血、脂肪などで存在する成体幹細胞（ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌあるいはｓｏｍａｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）であってもよい。

本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤、ヒストンデメチラーゼ抑制剤、ＲＡＲ作用剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階を含んで製造される体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。

前記分化誘導段階は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化誘導するものであってもよい。本発明は、前記分化誘導段階を含んで製造された体細胞から分化した神経膠様細胞であれば制限なく使用可能であるが、前記分化誘導段階の後、再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階をさらに含むことがより好ましい。

また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階；前記分化誘導段階および再培養段階の間に、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤およびｃＡＭＰ作用剤を含む第２化合物カクテルを、第１化合物カクテル処理された体細胞に追加的に処理して成熟させる段階をさらに含むことができる。前記成熟させる段階が含まれる場合、成熟させる段階は、分化誘導段階の日数に等しいか短いことが好ましい。
さらに、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階を含む神経膠様細胞を製造する方法を提供することができる。

また、本発明は、前記分化誘導段階の後、再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階をさらに含むことができ、再培養段階が含まれる場合、低分子化合物のない培養液および／または培地で安定して継代培養可能な神経膠様細胞が提供可能であるという点でより好ましい。

本発明の製造方法は、誘導段階および再培養する段階の間に、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤およびｃＡＭＰ作用剤を含む第２化合物カクテルを、第１化合物カクテル処理された体細胞に追加的に処理して成熟させる段階をさらに含むことができる。前記成熟させる段階が含まれる場合、成熟させる段階は、分化誘導段階の日数に等しいか短いことが好ましい。

また、本発明は、前記分化誘導段階の後、細胞を成熟させる段階（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）；および前記誘導段階の後あるいは誘導および成熟段階の後、再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階をさらに含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。

前記分化誘導段階は、線維芽細胞のような分化対象細胞（例えば、線維芽細胞など）を活性化させて分化目標細胞（例えば、新規な神経膠様細胞）段階に進入させる役割を果たす。分化誘導段階は３日以上行われ、好ましくは、３日以上１８日以下であってもよい。

前記成熟させる段階は、分化目標細胞に進入した細胞が完全に目標細胞の活性を有するように培養することを意味する。分化成熟段階は３日以上行われるが、前記分化誘導段階を長く調節すれば、成熟させる段階を代替することができ、この場合、成熟段階は省略可能できる。

前記再培養段階は、分化した細胞が低分子化合物なしに継代培養可能な安定した細胞に維持できるようにするのに必要である。前記再培養段階は、分化誘導された細胞を３日以上追加培養する段階を含むことができ、再培養された細胞は安定して継代培養可能で長期間培養可能であるが、３日以上１２日以下の再培養期間がさらに好ましい。前記再培養段階は、マトリゲルが除去された状態で細胞を培地に培養させる段階を含むもので、より具体的には、再培養段階は、低分子化合物およびマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）が含まれていないまま、体細胞から分化誘導された神経膠様細胞を追加培養する段階を含むことを意味する。

より具体的には、再培養段階は下記の方法により行われ、これに限定されるものではない。１ＸＰＢＳで体細胞から分化誘導段階および／または成熟段階を経た細胞を２回洗浄し、１５分間インキュベータで暖かいａｃｃｕｔａｓｅ^Ｒ溶液（３７℃の恒温水槽で保管）３ｍｌを追加する。１５分後、光学顕微鏡（ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で細胞分離が観察されるか否かを確認する。ＣｏｍｐｌｅｔｅＤＭＥＭを添加し、前記溶液を柔らかくピペッティングして６０ｍｍの皿から細胞入りのマトリゲル層を分離する。セルストレーナー（ｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｅｒ）に溶液を通過させてマトリゲル塊を除去する。１０００ｒｐｍ／５分／ＲＴで前記濾過した細胞を遠心分離する。上澄液を捨ててｃｏｍｐｌｅｔｅシュワン細胞培地（ｓｃｉｅｎｃｅｒｅｓｅａｒｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に細胞ペレット（ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ）を柔らかく振って再度混合する過程（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ）を進行させ、これをマトリゲルなどのコーティングのない新しいプレートに添加する。細胞が添加されたプレートを３７℃のインキュベータに保管しながら、３日ごとに培地を入れ替えながら計３～１２日、好ましくは６～１２日間培養する。

前記再培養段階前の分化誘導段階および／または成熟させる段階は、マトリゲルが含まれる。

また、前記再培養段階は、液体窒素（Ｎ_２）下で凍結させる段階を含むことができる。すなわち、１２日以上長期間保管しなければならない場合、培養を継続する方法の代わりに凍結乾燥をして長期間保管し、必要時に解凍して再び再培養培地で培養することができる。

本発明の新規な神経膠様細胞は、体細胞から分化するもので、分化の効率は、神経膠様細胞で特徴づけられる形態を有する細胞の程度、あるいはＨＧＦ、ＭＩＦやＢＤＮＦで特徴づけられる神経膠様細胞で過発現するタンパク質因子の分泌程度、あるいは各細胞の発現するｇｅｎｅをマーカー（ｍａｋｅｒ）として判断することができるが、前記マーカーは、線維芽細胞で発現するＦＢＬＮ５、ＤＫＫ１、ＦＢＮ１、ＰＲＲＸ１および／またはＥＣＭ１などと、神経膠細胞で発現するＭＢＰ、ＮＤＧＲ１、ＧＡＬＣ、ＧＦＡＰおよび／またはＭＰＺなどに区分することができる。優れた効率で体細胞が神経膠様細胞に分化する場合、線維芽細胞で優れて発現するＦＢＬＮ５、ＤＫＫ１、ＦＢＮ１、ＰＲＲＸ１および／またはＥＣＭ１などの発現量が低くなり、神経膠細胞のマーカーであるＭＢＰ、ＮＤＧＲ１、ＧＡＬＣ、ＧＦＡＰおよび／またはＭＰＺなどの発現量が高くなる（図２３～２７参照）。

また、本発明は、上述した体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。前記神経疾患とは、神経退行性疾患、遺伝による神経疾患、神経損傷による疾患などを意味し、前記神経退行性疾患とは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉痴呆（ＦＴＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆、ハンチントン病などを含み、遺伝による神経疾患は、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症侯群（ＧｉｌｌｅｓｄｅｌａＴｏｕｒｅｔｔｅｓ’ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、先天性運動および感覚神経病症、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、家族性自律神経失調症（ＦａｍｉｌｉａｌＤｙｓａｕｔｏｎｏｍｉａ）、ロー症候群、ロウエ症侯群（Ｌｏｗｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レット症候群（ＲｅｔｔＳｙｎｄｒｏｍｅ）、ＣｅｒｅｂｒａｌＡｕｔｏｓｏｍａｌＤｏｍｉｎａｎｔＡｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｙｗｉｔｈＳｕｂｃｏｒｔｉｃａｌＩｎｆａｒｃｔｓａｎｄＬｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ（ＣＡＤＡＳＩＬ）、結節性硬化症（ＴｕｂｅｒｏｕｓＳｃｌｅｒｏｓｉｓ）、毛細管拡張性運動失調症候群（Ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、神経線維腫症（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）などがあり、損傷による神経疾患には、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、急性炎症性脱髄鞘性神経病症（ｐｏｌｙｒａｄｉｃｕｌｏｐａｔｈｙ型）、ｓｃｈｗａｎｎｏｍａｔｏｓｉｓおよび慢性炎症性脱髄鞘性神経病症（ＣＩＤＰ）、糖尿病性神経病症、抗癌剤による神経病症、外傷による末梢神経切断、および脊椎損傷（ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ）、緑内障などの末梢および中枢神経系組織を含む様々な神経損傷疾患などが挙げられる。

また、本発明は、上述した体細胞から分化した神経膠様細胞を、神経疾患が誘発された個体に投与する段階を含む、神経疾患を予防および治療する方法を提供することができる。

本発明による細胞治療剤は、薬学的に有効な量の神経膠様細胞を含むか、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記薬学的に有効な量とは、免疫疾患の症状を予防、改善および治療するのに十分な量をいう。

本発明による活性成分である神経膠様細胞は、１ｘｌ０^２～１ｘ１０^１５の細胞数で含まれ、前記薬学的に有効な量は、免疫疾患症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路および治療期間などによって適宜変化可能である。

また、前記薬学的に許容されるとは、生理学的に許容され、ヒトおよび／または哺乳動物などに投与される時、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応、またはこれと類似の反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などを追加的に含むことができる。

さらに、本発明の細胞治療剤は、ヒトおよび／または哺乳動物などに投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように当業界にて公知の方法を使用して剤形化可能である。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。

また、本発明による神経疾患を治療および／または予防するための治療剤は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通して投与可能であり、損傷部位に直接注射するか、および／または手術による移植方法などで投与可能である。さらに、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの様々な因子によって適宜選択可能であり、本発明による免疫疾患の予防または治療用組成物は、免疫疾患の症状を予防、改善または治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。

本発明は、シュワン細胞と非常に類似の特性を有する神経再生、復旧および神経保護細胞機能を有する新規な神経膠様細胞へのヒト線維芽細胞の化学ベースの転換の開発を報告する。我々はヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む化合物カクテルがこのような転換に重要と判断し、このような新規な神経細胞タイプの様々な様相を特定して究明し、その機能性を評価するために、下記のような製造例、実施例などを提供する。ただし、本発明の実施が下記に限るものではない。

製造例：多様なプロトコル下での神経膠様細胞（神経復旧および神経保護機能を有する細胞；Ｎｅｕｒｏｒｅｐａｉｒ－ａｎｄ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｃｅｌｌ；以下、「神経膠様細胞」という）の製造、神経膠様細胞の生成

製造例１：細胞培養
ヒト包皮（ｆｏｒｅｓｋｉｎ）線維芽細胞（ＳＣＣ０５８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）が添加された高濃度グルコースＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）で培養した。ヒトシュワン細胞を、成長添加剤（Ｓｃｉｅｎｃｅ社）および１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）を含有するシュワン細胞基本培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）から構成されたシュワン細胞培地で培養した。ヒトニューロン細胞株ＮＳＣ３４を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）が添加された高濃度グルコースＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）で培養した。

製造例２：分化に使用される培地の製造
分化誘導培地（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｍｅｄｉａ；ＲＭ）：ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、１５％ノックアウト血清補充物、５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）およびＩＸペニシリン／ストレプトマイシン、第１化合物カクテル（表１、あるいは図２：５００μＭバルプロ酸（Ｖ）、１０μＭＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）；５μＭＲｅｐＳｏｘ（Ｒ）；２５μＭフォルスコリン（Ｆ）；１０μＭトラニルシプロミン（Ｐ）；１μＭＴＴＮＰＢ（Ｔ））、（カクテルに使用されたすべての小分子物質はＭｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社から入手）。

成熟培地（ＭＭ）：ノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、１５％ノックアウト血清補充物、５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）および１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン）、１０μＭＣＨＩＲ９９－２１（Ｃ）；５μＭＲｅｐＳｏｘ（Ｒ）；２５μＭフォルスコリン（Ｆ）から構成された第２化合物カクテルを含有。

再培養培地（ｒｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ）：成長添加剤（Ｓｃｉｅｎｃｅ社）および１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）を含有するシュワン細胞基本培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌ１社）から構成されたシュワン細胞培地で培養した。

製造例３：分化に使用される培地の製造
表１あるいは図２に示されている第１化合物カクテルに使用された化合物の代わりに、表２あるいは図６に示されている化合物に代替されたという点だけを除けば、製造例２と同一の構成で培地を製造した。第２化合物カクテルの場合、下記表２にて、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ－４３１５４２およびＮＫＨ４７７が含まれた以外は、製造例２の成熟培地の製造方法と同様に製造した。

実施例：プロトコルＩ、ＩＩ～ＩＩＩで製造した神経膠様細胞の製造
図３に示されるように、初期転換を確認した後、我々はいくつかの他の転換プロトコルを用いて転換効率をモニタリングした。転換条件により、神経膠様細胞は３つのプロトコル、すなわち、プロトコルＩ（図１４）、プロトコルＩＩ（図１５）およびプロトコルＩＩＩ（図１６）の神経膠様細胞タイプに分類される（図１４～１６）。プロトコル１は、成熟時間の変化により誘導時間が固定される特徴があり、プロトコル２は、誘導時間が変化する特徴があり、プロトコル３は、分化した細胞が化学物質なしに再培養される特徴がある。プロトコルＩ、プロトコルＩＩおよびプロトコルＩＩＩによって転換された神経膠様細胞は、それぞれＣ１－神経膠様細胞（Ｃ１－ＧＬＣ）、Ｃ２－神経膠様細胞（Ｃ２－ＧＬＣ）およびＣ３－神経膠様細胞（Ｃ３－ＧＬＣ）と称し、これらそれぞれの細胞形態を顕微鏡分析により調査した時（図１８～２０）、分化に使用された本来のヒト包皮線維芽細胞（図１７）とは異なる形態を見せたが、ヒトシュワン細胞（図２１）と類似の形態であることが分かった。

実施例１：プロトコル１（Ｃ１－神経膠様細胞の製造）：
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、ＲＭに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた６０ｍｍの組織培養プレート（室温で２時間１：１００のマトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で予めコーティングされる）に６ｘ１０^５細胞数の密度で分注する。その培養液を３日ごとに新しいＲＭ培地に入れ替えて、分化誘導段階による培養を進行させる。前記分化誘導段階による誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を６日まで継続する。誘導６日目に、培養液をＭＭに入れ替え、追加の３～１２日間成熟させる段階による培養を継続する。

実施例１－１：Ｃ１－神経膠様細胞（６＋３）
前記実施例１において成熟させる段階による培養を３日にした以外は、実施例１と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例１－２：Ｃ１－神経膠様細胞（６＋６）
前記実施例１において成熟させる段階による培養を６日にした以外は、実施例１と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例１－３：Ｃ１－神経膠様細胞（６＋９）
前記実施例１において成熟させる段階による培養を９日にした以外は、実施例１と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例１－４：Ｃ１－神経膠様細胞（６＋１２）
前記実施例１において成熟させる段階による培養を１２日にした以外は、実施例１と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例２：プロトコルＩＩ（Ｃ２－神経膠様細胞の製造）：
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、ＲＭに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた６０ｍｍの組織培養プレート（室温で２時間１：１００のマトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で予めコーティングされる）に６ｘｌ０^５細胞数の密度で分注する。その培養液を３日ごとに新しいＲＭ培地に入れ替えて分化誘導段階による培養を行う。分化誘導段階による培養を６～１５日間継続し、誘導期間後、直ちに３日間の固定成熟期間（ｆｉｘｅｄｍａｔｕｒａｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄ）をおいた。あるいは成熟期間なしに１８日間誘導した。

実施例２－１：Ｃ２－神経膠様細胞（６＋１２）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を６日、成熟させる段階による培養を１２日にした以外は、実施例２と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例２－２：Ｃ２－神経膠様細胞（９＋９）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を９日、成熟させる段階による培養を９日にした以外は、実施例２と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例２－３：Ｃ２－神経膠様細胞（１２＋６）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を１２日、成熟させる段階による培養を６日にした以外は、実施例２と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例２－４：Ｃ２－神経膠様細胞（１５＋３）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を１５日、成熟させる段階による培養を３日にした以外は、実施例２と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例２－５：Ｃ２－神経膠様細胞（１８＋０）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を１８日、成熟させる段階による培養を０日にした以外は、実施例２と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例３：プロトコルＩＩＩ（Ｃ３－神経膠様細胞の製造）
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、ＲＭに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた６０ｍｍの組織培養プレート（室温で２時間１：１００のマトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で予めコーティングされる）に６ｘ１０^５細胞数の密度で分注する。その培養液を３日ごとに新しいＲＭ培地に入れ替える。誘導を６日まで継続する。誘導６日目に、培養液をＭＭに入れ替え、追加の３日間成熟させる段階による培養を継続するか、成熟させる段階を省略する。このような分化誘導段階または成熟段階による培養の終了時、その細胞をアクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）細胞脱着溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）処理により収獲し、その収獲された細胞をシュワン細胞培地に再懸濁し、新しい組織培養プレートに分注する。細胞を追加の６～１２日間成長させる。培養液には３日ごとに新しい培地を補充した。

実施例３－１：Ｃ３－神経膠様細胞（６＋０＋１２）
前記実施例３において分化誘導段階による培養を６日、成熟させる段階による培養を省略後、１２日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例３と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例３－２：Ｃ３－神経膠様細胞（６＋３＋６）
前記実施例３において分化誘導段階による培養を６日、成熟させる段階による培養３日後、６日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例３と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例３－３：Ｃ３－神経膠様細胞（６＋３＋１２）
前記実施例２において分化誘導段階による培養を６日、成熟させる段階による培養６日後、１２日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例３と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞

実施例４：プロトコルＩＩＩ－１（Ｃ３－神経膠様細胞の凍結後の再培養）
プロトコルＩＩＩで製造したＣ３－神経膠様細胞を６～１２日の再培養の終了時にトリプシン処理し、凍結培地（２０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯを含有する高濃度グルコースＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）に再懸濁し、追加の使用時まで液体Ｎ_２で凍結保存する。使用時、Ｃ３神経膠様細胞のバイアルを解凍し、その細胞を完全シュワン細胞培地に分注する。

Ｃ３－神経膠様細胞が機能性の損失なしに安全に凍結され、解凍後に再び再培養できるか否かを確認するために、我々は前記凍結および再培養実験を行った。凍結されたＣ３－神経膠様細胞の解凍および培養後、我々は細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）（図４８）、サイトカイン放出（図４９）および神経突起の成長促進能力（図５０および５１）において凍結前の細胞との有意な変化を観察することができなかった。

実験例
実験例１：低分子化合物を用いた線維芽細胞の神経膠様細胞への直接分化
体細胞からの神経膠様細胞の分化に関連し、従来のいくつかの重要な信号伝達経路を調節する小分子物質（化合物）がマウス線維芽細胞を全分化能幹細胞（ＣｉＰＳＣ）に転換できることが報告されてはいる。また、体細胞から全分化能プログラムの一時的な活性化はこれらの細胞を活性化した状態にするというのが、従来の研究で報告された。すなわち、このような活性化された細胞は、これらをいくつかの成長因子およびサイトカインに単純に露出させることでいくつかの系統（ｌｉｎｅａｇｅ）に誘導できる可能性が提示されてきた。そこで、本発明は、ＣｉＰＳＣ細胞を生成するために使用されたものと類似の化学物質を用いて類似の活性化された状態を生成しようと試み、このような状態を様々な系統に誘導しようと試みた。我々はこのような化学物質を用いた簡略な処理方式により様々な系統に誘導できる活性化状態につながると仮定して、本発明を改良した（図１）。

したがって、我々はヒト線維芽細胞を６～１８日間分化誘導培地（ＲＭ）で６種の化学物質、すなわち、バルプロ酸（Ｖ）、Ｃｈｉｒ９９０２１（Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（Ｒ）、フォルスコリン（Ｆ）、Ｐａｒｎａｔｅ（Ｐ）およびＴＴＮＰＢ（Ｔ）で処理した後（表１あるいは図２）、追加の３～１２日間ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（Ｒ）およびフォルスコリン（Ｆ）を含有した成熟培地（ＭＭ）で維持して神経膠様細胞に転換し、転換された細胞を化合物なしにシュワン細胞培地で再培養した（図１）。このように得られた神経膠様細胞は、ヒト線維芽細胞とは全く異なる形態を有するが、ヒトシュワン細胞に似ている核／細胞質の比を有するスピンドル状の細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を有することを確認した。（図３、図２２）。より詳しくは、神経膠様細胞は長さが５０～３００ｖＬ、直径が１５～５０ｖＬの長い形態の細胞として膨らんでいる中心部分から両端あるいは数個（＜１０）の端に細くなり、ある場合、この端部分が幅１ミクロン程度の長い糸状を呈する。

神経膠様細胞は、誘導段階（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）、成熟段階（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、そして再培養（ｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）過程を経て作られるが（図１）、各段階のために細胞をそれぞれ誘導培地、成熟培地あるいは再培養培地に維持するが、この時、維持時間を多様に変化させても（３～１５日、図１４～１６）、神経膠様細胞の分化に大きな変化はなかった（図１８～２０）。

成功的分化の有無は、このような細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）に基づく基準により判断され（図３）、我々は最小限の必要な化合物カクテルを把握した。このために、我々は基本化学カクテルから１回に１つの化学物質を除去し（図４～１１参照。）、顕微鏡的明視野イメージを用いて、６種の化合物（Ｖ、Ｃ、Ｒ、Ｆ、ＰおよびＴ）を用いて、転換された神経膠様細胞に対する、得られた細胞の類似性（ｒｅｓｅｍｂｌａｎｃｅ）を評価した（図３）。よって、Ｖ、Ｃ、Ｒ、およびＰのいずれか１つを除去した時は、神経膠様細胞の分化効率が低下することを観察した（図４～９）。また、我々はフォルスコリンの除去が転換収率に最も激しい影響を及ぼすことを観察した（図８）。ＰａｒｎａｔｅおよびＴＴＮＰＢの除去は、転換収率が低下したものの転換は可能であることを確認し（図１０）、ＴＴＮＰＢの除去は、最小限の影響あるいはほとんど影響を及ぼさなかった（図１１）。このような観察結果をまとめて、我々はＶ、Ｃ、Ｒ、ＦおよびＰが線維芽細胞を神経膠様細胞の形態を示すのに必要、充分条件に該当するもので、第１化合物カクテルとして選定した。

これに加えて、製造例２の化合物カクテル（図１２）で処理された場合のヒト線維芽細胞も、製造例１の化合物カクテルで処理された線維芽細胞と同じ細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）の変化を示し、製造例１の化合物カクテルにより得たものと非常に類似して神経膠様細胞に分化した（図１３）。

実験例２：Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（図２３～２７および図７１～７４）
ＤＮａｓｅＩで処理した全体ＲＮＡを上述のようにＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抽出した。ＧｅｎｅＣｈｉｐＭｏｕｓｅ２．０ＳＴａｒｒａｙｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ＣＡ、ＵＳＡ）への混成化を行った。得られるデータを要約し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＲＰｏｗｅｒＴｏｏｌｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施されたロバスト多重平均（ｒｏｂｕｓｔｍｕｌｔｉ－ａｖｅｒａｇｅ）方法を利用して正規化した。

遺伝子クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）のためには、ＧＳＥデータベース（ＧＳＥ８７３８５）に入っているヒトシュワン細胞、星膠細胞および突起膠細胞のマイクロアレイの結果から各細胞で発現が増加する遺伝子と、本実験で使用した線維芽細胞、神経膠様細胞、シュワン細胞のマイクロアレイの結果から発現が２倍以上増加する遺伝子とを、Ｖｅｎｎｙ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ）ｆｍｆを用いて比較分析して、２つのグループで共通して発現が増加する遺伝子を選択し、ＣｌｕｓｔＶｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｉｔ．ｃｓ．ｕｔ．ｅｅ／ｃｌｕｓｔｖｉｓ／）を用いて遺伝子ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇをしてｈｅａｔｍａｐを描いた（図２３～２５参照；図２３のより具体的な図面は図７１～７４に記載した）。

また、分析結果は遺伝子水準分析として送り出され、差別発現遺伝子（ＤＥＧ）分析が行われた。発現データの統計的有意性は倍数変化（ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ）を用いて確認した。ＤＥＧセットの場合、類似性の尺度として完全連結（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｉｎｋａｇｅ）およびユークリッド距離（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎｄｉｓｔａｎｃｅ）を用いて階層的群集分析を行った。有意なプローブリストに対する遺伝子増幅および機能的注釈（Ｇｅｎｅ－ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎｎｏｔａｔｉｏｎ）分析を遺伝子オントロジー（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）およびＫＥＧＧ（ｈｔｔｐ：／／ｋｅｇｇ．ｊｐ）を用いて行った（図２６）。データ分析および差別発現遺伝子の視覚化はすべてＲ３．０．２（ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｉｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて行った。

前記実験例２で実施された実験に対する結果値は図２３－２５に記載した。

前記図２３～２５による結果をみると、ヒトシュワン細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現しないものの、本実験で使用したヒトシュワン細胞および神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。また、ヒト星膠細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現せず、本実験で使用したヒトシュワン細胞では一部発現するものの神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。さらに、ヒト突起膠細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現せず、本実験で使用したヒトシュワン細胞では一部発現するものの神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。

前記図２６による結果をみると、神経膠様細胞で発現する遺伝子をみると、ａｓｔｒｏｃｙｔｅやｍｉｃｒｏｇｌｉａのような神経膠細胞で発現する遺伝子の発現が増加していることを確認することができる。

前記図２７の結果をみると、神経膠細胞のマーカー遺伝子であるＭＢＰ、ＧＦＡＰ、ＮＤＲＧ１、ＧＡＬＣ、ＭＰＺなどの発現は、神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で増加しているが、線維芽細胞の特徴的なマーカー遺伝子であるＦＢＮ１、ＦＢＬＮ５、ＰＲＲＸ１、ＥＣＭ１、ＤＫＫ１などは神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で著しく減少していることを確認することができる。

実験例３：免疫染色
誘導段階および／または成熟段階、あるいは再培養段階の後のヒト線維芽細胞由来の神経膠様細胞（Ｇｌｉａ－ｌｉｋｅＣｅｌｌ、ＧＬＣ）を収穫し、１ＸＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１０分間固定した後、２２℃で１０分間ＰＢＳで０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ＵＳＢＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）で透過処理し、ＰＢＳで各５分ずつ２回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳで１％ＢＳＡ（Ａｍｒｅｓｃｏ社）、２２．５２ｍｇ／ｍＬグリシン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を含有するブロッキング溶液で６０分間ブロッキングした。次に、その細胞を４℃で一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体で染色した。使用された抗体はウサギ抗－ＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ社、希釈１：１００）、ウサギ抗Ｓ－１００抗体（Ａｂｃａｍ社、希釈１：１００）、およびマウスモノクローンＰ０（ＭＢＰ）抗体（Ａｂｃａｍ社、希釈１：１００）であった。一次抗体の培養後、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、１：１００で希釈したＡｌｅｘａ－４８８－接合ヤギ二次抗マウス抗体（Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＡｌｅｘａ－５６３－結合ヤギ二次抗ウサギ抗体（Ａ２１４２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と室温で２時間培養した。細胞を１μｇ／ｍＬＤＡＰＩ（Ｄ９５４２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）と５分間室温で培養して核を染色した。次いで、蛍光顕微鏡（ＩＸ７１Ｓ１Ｆ３、Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を用いてサンプルを可視化した。

前記実験例３で実施された実験に対する結果値は図２８および図２９に記載した。前記図２８および２９の結果をみると、大部分の神経膠様細胞が神経膠細胞の特徴的なマーカータンパク質であるＳ１００、ＭＢＰ、ＧＦＡＰを発現していることを確認することができる。神経膠様細胞が神経の復旧および保護に必須の重要な神経膠細胞のマーカーを発現したため、神経膠様細胞が神経膠細胞と類似して神経細胞を保護および復旧する特性を有するという結論を得た。

実験例４：定量的ＲＴ－ＰＣＲ
次に、我々は複数の時点でＣ１－神経膠様細胞のグローバル遺伝子の発現パターンをプロファイリングし、重要なシュワン細胞／神経膠細胞のマーカーについて調査した。

神経膠様細胞を複数の時点で収穫し、全体ＲＮＡをＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、５μｇの全体ＲＮＡをＲＮＡｔｏｃＤＮＡＥｃｏＤｒｙＰｒｅｍｉｘ（ＯｌｉｇｏｄＴ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡで合成した。Ｂｉｏ－ＲａｄＰｒｉｍｅＰＣＲ機器上でＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。前記ｑＲＴ－ＰＣＲの条件は９５℃で３０秒、５８℃で１５秒および７２℃で１５秒を１サイクルとする４０サイクルであった。本実験で使用されたプライマーは表３に示す。

体細胞、シュワン細胞および１、２～３のプロトコルによって製造された神経膠様細胞の前記ＲＴ－ＰＣＲの各遺伝子の発現レベルの結果は図３０～３２に示した。

前記図３０～３２による結果をみると、神経膠様細胞では線維芽細胞の代表的なマーカー遺伝子であるＤＫＫ１やＦＢＬＮ５の発現はほとんどないか著しく減少しているが、神経膠細胞のマーカー遺伝子であるＭＢＰ、ＧＡＬＣ、そしてＮＤＲＧ１の発現量が高くなっていることを確認することができた。このような結果は、神経膠様細胞が線維芽細胞の特徴を失って神経膠細胞の特徴を得たことを物語る。

実験例５：サイトカイン検出およびドットブロット
末梢神経系および中枢神経系で神経膠細胞を支持する神経保護および復旧特性は一般的に、その細胞によって放出されるいくつかの成長因子およびサイトカインによって付与される。様々な種類の生成された神経膠様細胞も類似のタンパク質分泌特性を有するか否かを確認するために、我々は分泌されたサイトカインおよび成長因子をプロファイリングした。線維芽細胞を実施例１、２～３のプロトコルに基づいて神経膠様細胞（ＧＬＣ）に転換する。調節された培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａ）を上記で各プロトコルの最後の段階で回収し遠心分離して任意の細胞カスまたは粒子状物質を除去した。前記調節された培地をドットブロットキット（Ｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｏｍｅｐｒｏｆｉｌｅｒ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）に提供された希釈緩衝液に２０倍希釈した。異なるプロトコルにより作製された神経膠様細胞の調節された培地で分泌される様々なサイトカインや成長因子を検出するためのドットブロット実験を製造会社のプロトコル（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。前記ドットブロットキットで提供されるサイトカインや成長因子の分泌をドットブロットにより確認し、これらの中で線維芽細胞に比べて神経膠様細胞で分泌量が明確に増加する因子は図３３に示されているものであった。

前記図３３による結果をみると、試験された様々なサイトカインや成長因子のうち、いくつかは線維芽細胞におけるものより有意に多い量で誘導および分泌された。例えば、ＭＩＦ、ＣＸＣＬ１２、ＩＬ８、ＢＤＮＦ、ＧＲＯ－ａｌｐｈａ、ＨＧＦなどが誘導神経膠細胞で多く分泌された。これらのうち、ＭＩＦ、ＢＤＮＦおよびＨＧＦの量はヒトシュワン細胞におけるものより有意に多く分泌される（図３３）。

実験例６：ＥＬＩＳＡ
様々なプロトコルの神経膠様細胞によって培地内に放出された様々なサイトカインの定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）をＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ＩＬ８、ＨＧＦ、ＭＩＦ、ＧＲＯ－ａ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）に対する商業的に利用可能なキットを用いて行った。上述した様々なプロトコルによって線維芽細胞を神経膠様細胞に転換する。調節された培地を言及したように複数の時点で回収し、遠心分離して任意の細胞カスおよび粒子状物質を除去した。前記調節された培地をＥＬＩＳＡキットに提供された希釈緩衝液に２０倍希釈した。ＥＬＩＳＡ定量を製造会社のプロトコルによって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。本実験では、面積が２８．２ｃｍ^２である６０ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈで３．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓを３日間育てる間に培地に分泌された各因子の濃度に対して測定した。

前記実験例６に対する結果値は図３４～３９に記載した。

前記図３４～３９による結果をみると、大部分のサイトカインや成長因子の分泌が線維芽細胞に比べて体細胞から分化した神経膠様細胞（ＧＬＣ）で有意により高いことを確認した（図３４～図３９参照）。興味深いことに、実施例３のプロトコルＩＩＩによって製造されたＣ３－神経膠様細胞（ＧＬＣ）は、他の実施例によって作られた神経膠様細胞（Ｃ１－ＧＬＣとＣ２－ＧＬＣ）と比較してＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＭＩＦ、ＨＧＦの分泌がより多く（図３４～３９）、Ｃ３－神経膠様細胞は、ヒトシュワン細胞および他のプロトコルによる神経膠様細胞より画期的に多いＨＧＦを分泌した（図７５～７９参照）。

実験例７：神経膠様細胞用調節培地の製造および神経突起の成長促進分析
シュワン細胞は、軸索の健康および機能性を促進し軸索の再生に役立つ多くの神経栄養および神経保護因子を分泌することが知られている。複数の部類に属する我々の化学的に誘導された神経膠様細胞が機能的な生理学的対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と一致するか否かを確認するために、我々は調節された培地を製造し、運動神経細胞であるＮＳＣ－３４を処理し、神経突起の成長に及ぼすその培地の影響を評価しようとした。

実施例１～３で示したプロトコルによって線維芽細胞を神経膠様細胞（ＧＬＣ）に転換する。それぞれの場合ごとに転換の終了時、調節された培地を回収し、遠心分離して任意の細胞カスまたは粒子状物質を除去した。このような調節された培地を後の使用のために－８０℃で保管する。

ＮＳＣ－３４運動神経細胞を用いて神経突起の成長促進分析を行った。このような細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）が添加された高濃度グルコースＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社）で維持する。分析のために、このような細胞を１ＸＰＢＳで洗浄し、ＳＣ細胞用調節培地に移動させ、追加の４８時間成長させた。次に、神経突起の促進を顕微鏡分析により評価し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。

前記に対する結果値は図４０～４４に記載した。

前記図４０～４４による結果をみると、我々の仮説と一致して、前記調節された培地は、シュワン細胞用調節培地と非常に類似して（図４４Ａ）、神経突起の成長を促進した（図４１、図４２および図４３のＡ）。しかし、このような成長促進活性が線維芽細胞用調節培地では確認されなかった（図４０Ａ）。また、調節培地による神経突起の成長程度を定量した結果、神経膠様細胞調節培地を処理した結果、長さの長い神経突起を有する運動神経細胞数が、シュワン細胞調節培地を処理した場合と同じく、神経膠様細胞調節培地を処理した場合に増加することを確認することができた（図４１、図４２および図４３のＢ）。しかし、線維芽細胞調節培地を処理した場合、長さの長い神経突起を有するニューロンがほとんど発見されなかった（図４０Ｂ）。

実験例８：分化効率
神経膠様細胞を神経膠細胞の特徴的なマーカーであるＧＦＡＰ抗体で免疫染色した後、ＤＡＰＩ染色核を基準として免疫陽性細胞を計数することにより、転換効率の定量を行った（図２８）。ＧＦＡＰの発現を示す細胞によって決定されたもので、神経膠様細胞への転換収率は８５％である（図４５）。

実験例９：Ｃ３－神経膠様細胞の増殖能（５－エチニル－２’－ジオキシウリジン染色分析）
再生医学および治療分野において神経膠様細胞の適用の可能性に関連して重要な特徴の１つは、細胞増殖および拡張の能力である。このような特徴を評価するために、再培養の６日目にＣ３－神経膠様細胞を１２時間Ｅｄｕを混入した後（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ^ＴＭＥｄＵＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^ＴＭ５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社のプロトコルによって細胞の製造を行った。次に、その細胞を核を検出するためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で同時染色した。ＥＤＵ＋Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞を２つの個別的な顕微鏡視野（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｆｉｅｌｄ）で計数し、その顕微鏡視野に存在する全体Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞の百分率で表した。

前記に対する結果値は図４６および４７に記載した。

前記図４６および４７による結果をみると、実際に免疫蛍光データはＣ３－神経膠様細胞が有糸分裂活性があることを示し（図４６）、定量結果は培養液内の３０％がＥｄｕ／ＤＡＰＩ二重陽性細胞であることを示す（図４７）。

実験例１０：神経膠様細胞の凍結および解凍
神経膠様細胞を用いた治療剤の開発において最も重要な点の１つは、作製された細胞を安定して保管し運搬できなければならないという点である。細胞を補完する最も良い方法の１つは、細胞を低い温度で凍結させる方法がある。本技術により作製された神経膠様細胞を凍結し解凍した時、活性変化を調査するために、Ｃ３－ＧＬＣ冷凍培養液（２０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳを含有した高濃度ブドウ糖ＤＭＥＭ）に培養後、液体窒素で急速に凍結させ、１週間後に解凍してシュワン細胞培養液で再培養しながら細胞の特徴を調査した。

前記に対する結果値は図４８～５１に記載した。

前記図４８～５１による結果をみると、凍結後に解凍された細胞は、凍結前の細胞と比較して同じ形態の細胞形態を維持しており（図４８）、解凍された細胞を培養した時、凍結前の細胞と比較してやや減少したが（図４９）、線維芽細胞およびヒトシュワン細胞に比べて過剰のＨＧＦが分泌されていることを確認することができた。また、解凍細胞培養液を用いて運動神経細胞の細胞突起の成長を誘導した時、凍結前の細胞と類似の活性を示すことを確認することができた（図５０および５１）。このような結果は、今後、本発明により長期保存後にも使用可能な神経膠様細胞を提供可能であることを確認できるようにしたものである。

実験例１１：ＲＡＴＣＣＩモデルの確立および神経膠様細胞の移植
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの大腿部神経を損傷させて慢性狭窄モデル（ｒａｔｃｈｒｏｎｉｃｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ、ＣＣＩ、ｍｏｄｅｌ）を作り、損傷した神経にヒトの線維芽細胞、ヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、８週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。

手術により坐骨神経を露出させた後、外科縫合で収縮させてＲＡＴＣＣＩモデルを製造した。成熟の終了時、様々なプロトコルによって製造された多様な種類の神経膠様細胞を収穫し、ＰＢＳに入った５．５ｘｌ０^５個の細胞に同量のＴｉｓｓｅｌ溶液を混合し、それぞれのネズミに移植した。８週後、ロータロッドレイテンシ（ｒｏｔａｒｏｄｌａｔｅｎｃｙ）試験、筋電図測定、染色分析により治療的改善を評価し、移植のないネズミまたは神経損傷のない野生型ネズミと比較した。ヒトシュワン細胞および線維芽細胞も同一の方式で試験した。ロータロッド（図５２）および筋電図測定（ＥＭＧ）（図５３）の試験結果は、神経膠様細胞（Ｇ３～Ｇ５）は、対照群（Ｇ２、無処理；Ｇ６、線維芽細胞処理；Ｇ７、ヒトシュワン細胞処理）と比較して神経復旧機能を有することを立証する。また、坐骨神経の染色写真（図５４）を用いてミエリンが回復した神経の数を定量した結果（図５５）も、試験群が対照群に比べて高い治療効果を奏することを見せた。さらに、坐骨神経のエクソン部位を電子顕微鏡で観察し（図５６）、およびミエリン層（Ｍｙｅｌｉｎｌａｙｅｒ）の厚さを観察した結果（図５７）、試験群が対照群に比べて有意にミエリン層が厚くなっているという事実を確認することができた（図５７）。このような結果は、低分子化合物を用いて誘導された神経膠様細胞はネズミＣＣＩモデルで神経再生を促進することを確認する。

実験例１２：カクテル化合物の濃度による効果検討
神経膠様細胞への転換に必要なカクテルで使用された化学物質の用量（ｄｏｓｅ）は、使用された化学物質のＩＣ_５０値および文献に報告された用量から選択された。追加的に最適化し転換に使用された化学物質の用量範囲のアイディアを得るために、我々は初期転換に使用された濃度の２倍を含む用量およびＩＣ_５０値などの様々な用量範囲を選択して細胞転換実験を行った。我々は使用された化学物質の毒性とともに転換収率をモニタリングした。化合物カクテルは表４（図５８）によって製造され、分化結果に対する効果の評価は図５９～６２に示した。前記図５９～６２による結果をみると、最適化された濃度より多い濃度が使用された時、細胞に対する毒性が一部見えるが、細胞転換は効果的に行われるということを確認することができ、ＩＣ_５０またはその２倍程度の濃度を使用した時は、細胞転換が効果的に行われないことを確認することができた。

実験例１３：多様な体細胞を用いた神経膠様細胞の分化
本技術を患者に合わせた細胞治療剤の開発に用いるためには、本技術が多様な線維芽細胞に適用可能であることを確認しなければならない。したがって、ＣＭＴ（ｃｈａｒｃｏｔ－ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）疾患を患う患者の皮膚およびＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した、互いに異なる３つの線維芽細胞を用いてそれぞれ異なる細胞を使用したことを除けば、実施例２、３の方法と同様に、Ｃ２－ＧＬＣ（１５＋３）およびＣ３－ＧＬＣ（６＋３＋６）を作製した。神経膠様細胞の分化の確認は顕微鏡の観察により分化した細胞の形態をみて判断した。

（１）ＣＭＴ（ｃｈａｒｃｏｔ－ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ）患者の皮膚由来線維芽細胞（図６３および６４）

（２）６歳男児の真皮由来線維芽細胞（図６５および６６）

（３）８２歳女性の皮膚由来線維芽細胞（図６７および６８）

（４）４７歳男性の包皮由来線維芽細胞（図６９および７０）

前記細胞に対する神経膠様細胞の分化に対する結果値は図６３～７０に記載した。

本実験結果は、患者を含む多様な起源の体細胞を用いても神経膠様細胞への転換が可能であることを確認することができた。

また、前記図７５～７６による結果をみると、患者を含む多様なヒト由来線維芽細胞から分化した神経膠様細胞においても多い量のＨＧＦが分泌されていることを確認することができた。

前記図６３～７０、図７５～７６による結果をみると、ヒト由来の多様な線維芽細胞が神経膠様細胞に効果的に分化できることが分かる。このような結果は、今後、神経膠様細胞を用いた細胞治療剤の開発時に患者の線維芽細胞を用いることにより、他人から得られた、あるいは由来の細胞治療剤において問題になる免疫拒絶反応のような副作用がない治療剤の開発が可能であることを意味する。

実験例１４：ＲＡＴＳＣＩモデルの確立および神経膠様細胞の移植
体細胞から分化した神経膠様細胞の中枢神経関連の疾患に対する細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの脊髄を損傷させて脊髓損傷モデル（ｒａｔｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙｍｏｄｅｌ、ＳＣＩ）を作り、損傷した神経にヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、２週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。

手術により脊髓を露出させた後、圧力をかけてＲＡＴＳＣＩモデルを製造した。成熟の終了時、様々なプロトコルによって製造された多様な種類の神経膠様細胞を収穫し、ＰＢＳに入った５．５ｘ１０^５個の細胞をネズミの脊髓に移植した。２週後、ロータロッドレイテンシ（ｒｏｔａｒｏｄｌａｔｅｎｃｙ）試験、ＢＢＢ分析により治療的改善を評価し、移植のないネズミまたは神経損傷のない野生型ネズミと比較した。ヒトシュワン細胞も同一の方式で試験した。ロータロッドおよびＢＢＢ分析の結果（図８０）をみると、損傷直後（０週）に損傷を与えたすべての群において活動性が格段に低下していたが、細胞の投入後２週後に、神経膠様細胞処理群（Ｇ３）およびヒトシュワン細胞処理群（Ｇ４）において対照群（Ｇ２、無処理）に比較して神経復旧機能をみることができた。また、神経膠様細胞処理群（Ｇ３）においてヒトシュワン細胞処理群（Ｇ４）に比べてより向上した治療効果を観察することができた。このような結果は、低分子化合物を用いて誘導された神経膠様細胞はネズミＳＣＩモデルで神経再生を促進することを確認する。また、この結果は、神経膠様細胞が中枢神経疾患に細胞治療剤として使用できることを物語る。

実験例１５：神経膠様細胞移植後の体内残存
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性のために、細胞が体内移植後どの程度体内に留まるかを確認することが必要である。ウイルスを用いて緑色蛍光を発するタンパク質（ＧＦＰ、ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子を神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で発現させ、ＰＢＳに入った５．５ｘ１０^５個のＧＦＰ－発現神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞を同量のＴｉｓｓｅｌ溶液に混合してネズミ（Ｒａｔ）の大腿部に移植した。指定された時間後、蛍光イメージングによりネズミの大腿部で発生する蛍光の強度を測定した（図８１）。

図８１の結果を分析すれば、細胞注入直後から５日まで蛍光を観察することができたが、７日からは蛍光を観察することができなかった。この結果は、注入された細胞が５日～６日の間に死滅するということを物語る。

本結果は、免疫低下のない野生のネズミにヒトの細胞を注入したにもかかわらず、移植された細胞が生体内に５日以上留まることができるという事実を確認した。したがって、免疫活性のない生体あるいは患者から分離した細胞を用いて作製した神経様細胞を患者に移植した場合より長い期間移植された細胞が活性を示し得ると判断される。

本発明は、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法およびこれを含む神経疾患治療用細胞治療剤および上述した細胞を投与して神経疾患を予防および治療する方法を提供する。

Claims

ＨＧＦ分泌量２０，０００ｐｇ／ｍｌ以上を含む、体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、ＢＮＤＦ分泌量１５０ｐｇ／ｍｌ以上；およびＭＩＦ分泌量が１０ｎｇ／ｍｌ以上をさらに含む、請求項１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含んで製造されるものである、請求項１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、分化誘導段階の後、再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階をさらに含んで製造されるものである、請求項３に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記第１化合物カクテルは、ＲＡＲ作用剤をさらに含むものである、請求項３に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）；血液、脂肪細胞を含む完全分化した体細胞；および臍帯、胎盤、臍帯血、骨髓、血および脂肪に存在する成体幹細胞からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞は、皮膚由来線維芽細胞である、請求項１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記皮膚は、表皮、真皮および脂肪層からなる群より選択される１種以上である、請求項７に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記皮膚由来線維芽細胞は、包皮由来線維芽細胞である、請求項７に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含んで製造される、体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、ＨＧＦ分泌量２０，０００ｐｇ／ｍｌ以上を含むものである、請求項１０に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、ＢＮＤＦ分泌量１５０ｐｇ／ｍｌ以上；およびＭＩＦ分泌量が１０ｎｇ／ｍｌ以上をさらに含む、請求項１１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第１化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含む体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
前記製造方法は、分化誘導段階の後、再培養（ｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅ）する段階をさらに含むものである、請求項１３に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
再培養する段階は、体細胞から分化した神経膠様細胞を低分子化合物およびマトリゲルを含まない培養液で追加培養する段階を含むものである、請求項１４に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
前記製造方法は、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤およびｃＡＭＰ作用剤を含む第２化合物カクテルを、第１化合物カクテル処理された体細胞に追加的に処理して成熟させる段階をさらに含むものである、請求項１３に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
前記分化誘導段階は、３日以上行われるものである、請求項１３に記載の神経膠様細胞の製造方法。
前記再培養する段階は、３日以上である、請求項１５に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、第１化合物カクテルにＲＡＲ作用剤をさらに含むものである、請求項１３に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
請求項１～１２のいずれか１項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤。
ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、ＧＳＫ抑制剤、ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤、ｃＡＭＰ作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む、体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記カクテル組成物は、ＲＡＲ作用剤をさらに含むものである、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤は、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃａｃｉｄ）、プラシノスタット（Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）、トリコスタチンＡ（ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ）、ヒドロキサム酸（ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄ）、サイクリックテトラペプチド（ｃｙｃｌｉｃｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）、デプシペプチド（ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、ベンズアミド（Ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、エンチノスタット（Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）およびブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）から構成された群より選択された１種以上である、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ＧＳＫ抑制剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１（６－（２－（４－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎｉｃｏｔｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）；ＬＹ２０９０３１４（３－ｉｍｉｄａｚｏ［１，２－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－４－［１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２，ｊｋ］［１，４］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ－７－ｙｌ］）；１－ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｙｒｉｄｏ［３’，２’：２，３］ａｚｅｐｉｎｏ［４，５－ｂ］ｉｎｄｏｌ－６（５Ｈ）－ｏｎｅ）；ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ）：ＡＲＡ０１４４１８（Ｎ－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（５－ｎｉｔｒｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）；Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｍｏｎｏｘｉｍｅ；５－Ｉｏｄｏ－ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｍｏｎｏｘｉｍｅ；ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｏ－［３，２－ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－６（５Ｈ）－ｏｎｅ）；ＳＢ－４１５２８６（３－［（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－（２－ｎｉｔｒｏ－ｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；ＳＢ－２１６７６３（３－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；ＭａｙｂｒｉｄｇｅＳＥＷ００９２３ＳＣ（２－ａｎｉｌｉｎｏ－５－ｐｈｅｎｙｌ－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）；（Ｚ）－５－（２，３－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｅ－２，４－ｄｉｏｎｅ；ＴＷＳ１１９（３－（６－（３－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｏｌ）；Ｃｈｉｒ９８０１４（Ｎ２－（２－（４－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）－５－ｎｉｔｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－２，６－ｄｉａｍｉｎｅ）；ＳＢ４１５２８６（３－（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）－４－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）；およびＴｉｄｅｇｌｕｓｉｂ（２－（１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－４－（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ））から構成された群より選択された１種以上である、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ＡＬＫ－５キナーゼ抑制剤は、ＲｅｐＳｏｘ（１，５－Ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ、２－［３－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］）；ＳＢ４３１５４２（４－（４－ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－５－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）；ＳＢ５２５３３４（６－（２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－４（６－ｍｅｔｙｈｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）；ＧＷ７８８３８８（４－（４－（３－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－Ｎ－（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）；ＳＤ－２０８（２－（５－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｔｅｒｉｄｉｎ－４－ａｍｉｎｅ）；Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９、４－（２－（６－ｍｅｔｙｈｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）；ＥＷ－７１９７（Ｎ－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－２－ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）；ＬＹ２１０９７６１（７－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）－４－（２－（ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）；ＳＢ５０５１２４（２－（４－（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）；ＬＹ３６４９４７（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、４－［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］）；Ｋ０２２８８（３－［（６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ］および；ＬＤＮ－２１２８５４（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、５－［６－［４－（１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］）から構成された群より選択された１種以上である、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ｃＡＭＰ作用剤は、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ、ＮＫＨ４７７（ａｎｏｖｅｌｆｏｒｓｋｏｌｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ＰＡＣＡＰ１－２７（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＰＡＣＡＰａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、およびＰＡＣＡＰ１－３８（ＰＡＣＡＰａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）から構成された群より選択される１種以上である、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤は、パルネート（ｐａｒｎａｔｅ；Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）、ＳＰ２５０９、Ｃｉｃｌｉｐｉｒｏｘ、Ｄａｍｉｎｏｚｉｄｅ、ＧＳＫＪ１、ＧＳＫＪ２、ＧＳＫＪ４、ＧＳＫＪ５、ＧＳＫＬＳＤ１、（Ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃａｃｉｄ、ＩＯＸ１、ＪＩＢ０４、ＮＳＣ６３６８１９、ＯＧ－Ｌ００２、ＰＢＩＴ、ＲＮ１ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓ２１０１およびＴＣ－Ｅ５００２から構成された群より選択される１種以上である、請求項２１に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
前記ＲＡＲ作用剤は、ＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ；およびＡｒｏｔｉｎｏｉｄａｃｉｄから構成された群より選択される１種以上である、請求項２２に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞製造用化合物カクテル組成物。
請求項１～１２のいずれか１項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞を、神経疾患が誘発された個体に投与する段階を含む、神経疾患を予防および治療する方法。