KR20190063792A - 슈반세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 슈반세포로의 분화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체세포로부터 슈반세포를 분화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 슈반세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물일 이용한 체세포로부터 슈반세로의 분화방법에 관한 것으로, 본 발명은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 인간 체세포로부터 슈반세포로 직접 분화시킬 수 있어, 종래 체세포로부터 신경줄기세포로 분화를 하거나 또는 줄기세포로부터 슈반세포로 분화시키는 등 중간 단계를 거치지 않아 매우 효율이 높게 슈반세포를 제조할 수 있도록 하여, 유전자 조작 없는 자가세포를 이용한 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 슈반세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 슈반세포로의 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체세포로부터 슈반세포로의 직접 분화에 사용되며, 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 슈반세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 안전하고 높은 효율로 체세포로부터 화학적 유도 슈반세포 (CiSC, Chemically induced Schwann Cell)를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
최근 신경병증과 관련된 다양한 질환에서 세포 치료제와 관련된 연구 개발이 요구되고 있다. 예컨대, 다발성 경화증, 샤르코 - 마리 - 투스 병 (CMT), 길랑 - 바레 증후군 (GBS), 급성 염증성 탈수 초성 polyradiculopathy 형), schwannomatosis 및 만성 염증성 탈수 초성 신경 병증 (CIDP) 등의 말초 및 중추 신경계 조직을 포함하는 여러 가지 신경 퇴행성 질환 에서 손상 부위의 기능적 재생을 위한 세포 치료제에 대한 연구 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 이를 위해서는 신경계를 구성하는 여러 세포들 중, 특히 신경의 축삭을 감싸고 있는 슈반세포가 중요한 역할을 담당하는바, 세포 치료제로써 슈반세포에 대한 다량 확보가 필요하다.
슈반 세포란 말초 신경계의 신경교세포로 신경의 발생, 분화에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 신경이 손상된 경우 축삭의 재생과 재수초화(remyelination)에 필수적인 역할을 하는 세포를 의미한다. 슈반세포에 의해 수초화를 이룬 유수신경섬유는 수초의 절연체 역할에 비해 빠른 신경전도속도를 가질 수 있는 반면 수초에 손상이 있을 경우 전도 속도가 느려지고 비수초화에 의한 축삭의 이차적 손상을 야기 시킬 수 있다. 슈반 세포 (Schwann cell, SC)는 여러 가지 신경 인자를 분비하여 신경 전달을 촉진하여 신경 전달을 원활하게 하는 PNS의 기능 유지에 매우 중요한 역할을 하는 말초 신경계 (PNS)의 중요한 신경 교세포이다. SC는 또한 말초 신경 손상 (5,6)에 이어 신경 세포 재생 과정에서 필수적인 역할을하며, 손상된 신경 부위로 SC를 이식하는 것은 축삭 재생을 향상시키는 유일한 치료법으로 인식되고 있다. 따라서, 여러 경로를 통해 슈반세포를 수득하기 위한 노력이 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0045356호에는 포유 동물의 체세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입하는 공정을 포함하는, 슈반 세포를 조제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 문헌을 포함한 종래 방법은 고효율과 관련하여 효과적일지라도, 바이러스벡터 매개 유전자 전달, 후속 유전자 조작 및 불리한 결과의 위험 때문에 임상에서는 사용이 어렵다.
최근, 이러한 재프로그램 및 재분화에 있어서의 저분자성 물질의 사용이 전달, 재현성 및 효율적인 확장성을 포함하는 적용의 용이함으로 인해 많은 인기를 얻고 있다. 대한민국 특허 제1686315호에는 (a) 표피 성장 인자 (Epidermal growth factor), 섬유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor) 및 B27 첨가제를 포함하는 배지에서 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 신경구 (Neurosphere)를 유도하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 신경구(Neurosphere)를 혈소판 유래 성장인자 (Platelet-derived growth factor), 섬유아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor), 헤레굴린-β(Heregulin-β) 및 포스콜린 (Forskolin) 하에서 배양하여 슈반 세포를 유도하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 슈반 세포 분화 방법이 개시되어 있다.
이러한 소분자 물질을 이용한 슈반세포 분화는 무엇보다 유전자 조작이 없다는 점에서 임상적 목적으로 비교적 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있는바, 종래의 문제점이 없이 보다 안전하고 간편한 방법으로 체세포로부터 신경세포로의 분화방법 개발이 필요한 실정이다. 그러나, 슈반 세포는 그 공급이 원활하지 않고 생체 외 배양이 쉽지 않은 문제점이 있다. 더욱이, 말단 분화된 세포인 배양된 SC는 제한된 증식 잠재력을 가지며, 장기적인 치료 효과를 얻기에 충분한 세포의 양이 부족하다. 또한, 슈반세포(Schwann cell)를 얻기 위해서는 세포 공여부의 신경 손상이 불가피하고 세포의 양적확보가 어렵다는 단점이 있기 때문에 관련 연구 개발이 쉽지 않다. 또한, 슈반 세포 분화용 배지를 이용하여 성체 줄기세포로부터 슈반 세포로 분화를 유도하는 연구들이 일부 있지만, 분화 효율 면에서 그 이용이 매우 제한적이다. 또한, 상이한 유전적 기원, 유래 및/또는 배경을 가지는 중간엽 줄기세포들의 경우 중간엽 줄기세포를 규정하는 일부 기준들에 대해서는 서로 유의적 차이를 나타내지 아니하지만 통상적으로 각각의 생체 내 활성에 있어서는 매우 큰 차이를 나타내는바, 특정 유래의 줄기세포로부터 분화 방법 및 분화된 세포 특성에 대한 확인 역시 필요하다. 전술한 문헌을 포함한 종래 기술은 체세포로부터 슈반세포로의 직접분화가 아닌 줄기세포로부터의 분화이기에 전술한 한계가 있을 수밖에 없다.
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따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 종래 기술상의 문제점을 해결하고 체세포로부터 슈반세포로의 직접적 분화가 가능한 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 슈반세포로의 직접 분화방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 슈반세포 분화용 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 ROCK 억제제 (ROCK inhibitor)를 더 포함한 슈반세포 분화용 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히스톤 디아세틸라제 억제제가 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 발프론산 (Valproic acid), 2,4-피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxylic Acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GSK 억제제가 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ALK-5 키나아제 억제제가 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761(7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 cAMP 시그널링 액티베이터가 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27 및 PACAP 1-38 (peptide based)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ROCK 억제제가 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 및 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 모노아민 옥시다제 억제제가 트라닐시프로민(tranylcypromine)인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RAR 작용제가 TTNPB인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 슈반세포 분화용 배지 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하여 슈반세포로 직접 분화시키는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배양이 4 내지 20일간 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ)히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 배지에서 체세포를 배양하여 이를 슈반세포로 유도하는 단계; 및 ⅱ) 상기 유도된 슈반세포를 GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제, cAMP 시그널링 액티베이터, ROCK 억제제를 포함한 배지에서 숙성하는 단계를 포함한 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ⅰ)단계는 배양은 2 내지 10일의 범위에서 수행되고, ⅱ)단계는 3 내지 10일의 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 체세포가 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된 슈반세포를 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약제학적 조성물이 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌크화제, 완충제, 전달 비히클, 등장제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 인간 체세포로부터 슈반세포로 직접 분화시킬 수 있어, 종래 체세포로부터 신경줄기세포로 분화를 하거나 또는 줄기세포로부터 슈반세포로 분화시키는 등 중간 단계를 거치지 않아 매우 효율이 높게 슈반세포를 제조할 수 있도록 하여, 유전자 조작 없는 자가세포를 이용한 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 (A)본 발명의 소분자 물질로 처리한 인간 포피 섬유아세포의 Schwann 세포로의 전환 개요 (B) 다양한 연결 마커의 면역 염색 검출 결과 (C) 신경 세포 발달의 과정에서 뉴런 특이적 및 섬유아세포 특이적 전사물의 발현정도를 나타낸 mRNA 그래프
도 2는 Schwann 세포 조건 배지 (흰색 화살표) 에서 자랄 때 NSC - 34 모터 뉴런 세포의 신경 돌기 성장(A). 배지에서만 성장한 대조군 세포 또는 화학 물질과 사이토카인을 보충한 배지에서 성장한 대조군 세포 (B)
도 3은 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포 이식시 당뇨병성 말초 신경 병증 쥐 모델에서 각각 기계적 자극이 4g (A), 8g (B) 및 15g (C)이 되도록 한 von frey 분석으로 통증 민감성과 통증 감소를 평가한 결과 및 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포의 축삭 재생 효과를 평가하기 위한 면역 조직 화학적 결과(D)
도 2는 Schwann 세포 조건 배지 (흰색 화살표) 에서 자랄 때 NSC - 34 모터 뉴런 세포의 신경 돌기 성장(A). 배지에서만 성장한 대조군 세포 또는 화학 물질과 사이토카인을 보충한 배지에서 성장한 대조군 세포 (B)
도 3은 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포 이식시 당뇨병성 말초 신경 병증 쥐 모델에서 각각 기계적 자극이 4g (A), 8g (B) 및 15g (C)이 되도록 한 von frey 분석으로 통증 민감성과 통증 감소를 평가한 결과 및 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포의 축삭 재생 효과를 평가하기 위한 면역 조직 화학적 결과(D)
이하에서 본 명세서에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
천연의 슈반세포는, 외배엽에서 직접 유래하는 신경 세포와는 달리, 신경능에서 유래한다. 성숙한 슈반세포는, 슈반 전구 세포, 미성숙 슈반 세포를 거쳐 형성된다. 또한, 슈반 세포에는, 미엘린을 형성하는 슈반 세포, 미엘린을 형성하지 않는 유주성의 슈반 세포(미분화 슈반세포) 등이 있으며, 본 명세서에서는 이들 모두가 「슈반 세포」에 포함된다.
본 명세서에서 용어 "슈반세포"는 전술한 슈반세포 및 성숙과정을 거쳐 슈반세포가 될 수 있는 능력을 가진 유사 슈반세포를 포함하며, 적어도 하나 이상의 슈반세포 특이적 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 슈반세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 신경 전구세포 또는 슈반세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 신경 전구세포 또는 슈반세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 슈반세포에 특이적인 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 체세포의 슈반세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 슈반세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포 (모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기 (embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한 (matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 골격근육세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 체세포로 섬유아세포를 사용하였으며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.
본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물은 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한다.
본 발명에 있어서, "히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor)"는 히스톤 디아세틸라아제를 억제하는 물질을 의미하며, 크로마틴을 고아세틸화 상태로 만들어 세포증식억제인자 및 분화유도에 필수적인 유전자들의 발현을 촉진하여 암세포의 분화를 유도하고 혈관신생을 억제하며, 세포주기를 G1상태로 고정시켜 암세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하여 강한 세포증식억제 (cytostatic) 항암활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)는 pRB/E2F를 매개로 유전자 전사 (gene transcription)을 억제하며, 히스톤 아세틸레이션(histone acetylation)의 파괴가 여러 가지 암 발생과 관련되어 있고, HDAC는 저산소증, 저당, 세포암화 등 열악한 환경조건에서 고발현되어 세포증식억제인자의 발현을 저해하여 세포증식을 촉진시키는 역할을 하여, HDAC는 세포암화 및 분화조절에 중요조절인자로 인식되고 있다고 알려져 있다. 특히, 상기 VPA는 이노시톨 감소를 유발하고, GSK-3β를 저해하고 ERK pathway를 활성화시키고, PPAR 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 상기 히스톤 디아세틸라아제 억제제 (HDAC inhibitor)는 농도는 너무 낮으면 효과를 보기 어렵고, 농도가 너무 높으면 독성을 가지게 되므로 세포의 종류에 따라 적정한 농도를 확인해야 한다. 상기 히스톤 디아세틸라제 억제제는 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 2,4-피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxylic Acid), 발프론산 (Valproic acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor)"는 GSK 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2의 업스트림 (upstream) 분자인 GSK1/2를 표적으로 하는 물질들을 의미한다. 상기 GSK 억제제는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및; LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 Chir 99021일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor)"는 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미하며, TGF-β 타입 I (Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 ALK-5 키나아제 억제제 (TGF-β 타입 I 리셉터 억제제)는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및; LDN-212854(Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 Repsox일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물은 cAMP 시그널링 액티베이터를 포함한다. cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator)"는 cAMP 신호를 활성화시키는 물질을 의미한다. 상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27, 또는 PACAP 1-38 (peptide based)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Forskolin일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물은 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor)를 포함한다. 상기 모노아민 옥시다제 저해제는 모노아민으로부터 산화적 탈아민화를 저해하는 역할을 하며, 히스톤 H3 에서 발견되는 2 개의 라이신을 선택적으로 탈메틸화하는 효소인 LSD1 을 억제하는 것으로 알려져 있다. 상기 모노아민 옥시다제 억제제의 예로는 트라닐시프로민(tranylcypromine)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물은 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한다. 상기 RAR작용제는 TTNPB인 것이 바람직하다.
본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물은 ROCK 억제제를 더 포함할 수 있다. 상기 "ROCK 억제제 (ROCK inhibitor)"는 신경세포와 신경줄기세포의 세포사멸을 유도하는 Rho/ROCK 신호를 막고 신경줄기세포의 증식을 억제하는 PTEN 신호를 막는다고 알려져 있어, 신경줄기세포의 세포사멸 억제와 자가재생능력과 자가증식능력을 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다(Matthias Groszer, et al., Science 294: 2186, 2001). 배지에 처리하여 유효 농도로 포함되도록 하며, 배지의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다. 상기 ROCK 억제제 (ROCK inhibitor)의 예로는 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 또는 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Y-27632일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 슈반세포 전환용 배지 조성물은 배양액 형태로 제공되어 체세포를 슈반세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 상기 슈반세포 유도 물질의 농도는 체세포를 슈반세포로 유도할 수 있는 농도이면 특별히 제한이 없으며, 예를 들어 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor) 10 내지 1,000μM , GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor) 1~100 μM, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor) 1~100 μM, cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator) 1~200 μM, 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 1~100 μM, RAR 작용제(RAR agonist) 1~100 μM 및 ROCK 저해제 1 내지 10의 μM 범위의 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 체세포를 배양하는 배지는 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 기본배지, 예를 들면 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분 등을 더 포함할 수 있다. 상기 배지는 DMEM/F12, N2, B27, bFGF (basic fibroblast growth factor), 및 EGF (epidermal growth factor) 등 기본적인 배지성분을 더 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 기본 배지는 이를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보충제인 B27 또는 N2 중 하나 이상이 더 포함될 수 있으며, 그 종류가 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 슈반세포 분화용 배지 조성물 존재하에 체세포를 배양하여 슈반세포로 분화하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 체세포를 직접전환 (Direct conversion) 방법을 이용하여 슈반세포로 유도하는 대부분의 방법은 외부 유전자를 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 다만, 바이러스를 이용하여 유전자를 도입하는 것은 외부 유전자의 무작위적인 인테그레이션 (integration)으로 인한 유전적 불안정성 (genomic instability)을 야기하여, 향후 환자에 임상적용 시 암이 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 점차적으로 외부 유전자를 주입하지 않고 저분자성 물질 (small molecule)을 이용하는 방법들이 제시되고 있는 실정이다. 그러나 최근 다양한 저분자성 화합물들을 이용하여 직접전환을 유도하는 연구가 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 최소한 하나의 유전자는 이용되고 있으며, 유전자 도입 없이는 여전히 인간 체세포로부터 원하는 골격근육세포로 전환할 수 없는 상태이다.
그러나, 본 발명은 외부 유전자의 도입 없이 체세포로부터 슈반세포를 유도하는 유전적 안정성이 확보된 방법으로써, 기존의 유전자를 이용한 유전적 결손을 유도하는 방법을 해결하고자 고안된 것이다. 본 발명에서는 저분자성 물질의 조합만을 이용하여 체세포를 슈반세포로 직접전환하였다. 이에, 기존의 기술이 가진 많은 문제점들을 극복함으로써, 환자를 위한 세포치료제로 활용 가능성이 매우 높다.
본 발명에서 상기 배양은 슈반세포로 분화를 유도할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 2 내지 20일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 내지 15일 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법은 단일 단계(single step)으로 수행될 수도 있으나, 효율을 위해 2단계로 수행될 수도 있다. 즉, ⅰ)히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 배지에서 체세포를 배양하여 이를 슈반세포로 유도하는 단계; 및 ⅱ) 상기 유도된 슈반세포를 GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제, cAMP 시그널링 액티베이터, ROCK 억제제를 포함한 배지에서 숙성하는, 2단계로 수행되는 경우 분화 유도단계 및 숙성의 2단계로 구분할 수 있다. 상기 ⅰ)단계의 유도단계는 2 내지 10일의 범위에서 수행되고, ⅱ)숙성 단계는 3 내지 10일의 범위에서 수행될 수 있다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 분화방법을 사용하는 경우, 종래의 알려진 화학적 유도 세포 분화 방법과 비교하여, 보다 짧은 시간의 처리만으로 목적하는 세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, "치료"는 상기 세포치료제의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. '치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 슈반세포의 1일 투여량은 1.0ㅧ104 내지 1.0ㅧ1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0ㅧ105 내지 1.0ㅧ109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내 (intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 세포 분리 및 배양
인간 포피 섬유아세포 (Human foreskin fibroblasts, SCC058, Millipore)를 10 % FBS, 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신 (Welgene)이 첨가된 고-글루코스 DMEM (Welgene)에서 배양하였다.
1-2. 슈반세포 형성 (Generation of chemically induced Schwann Cell)
인간 포피 인간 포피 섬유아세포를 플레이트 당 60,000 세포의 밀도로 35mm 플레이트 (1 : 100 Matrigel (BD Biosciences)로 상온에서 2 시간 동안 예비 - 코팅) 상에 시딩하고, NRM (Neuron Reprogramming Medium : 녹아웃 DMEM (Gibco), 1% Glutamax (Gibco), 1% 비 필수 아미노산 (Gibco), 0.1 mM β- 메르캅토에탄올 (Sigma) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신) 200μg / ml Phospho Ascorbic Acid (Sigma), 1X B27 및 N2 보충제 (Lifetechnologies) (VCRFPT와 같은 화합물 화합물 조합 포함). VCRFPT 칵테일은 500 μM Valproic Acid, 10 μM CHIR99021 (C), 10 μM RepSox (R); 50 μM 포스 콜린 (F); 10μM 트라닐시프로핀 (P); 1 μM TTNPB (T), 5 μM ROCK 억제제 Y27632 (Medchemexpress의 모든 소형 분자). 섬유아세포는 8일 동안 상기 배지에서 배양한 다음, 10 μM CHIR99021 (C); 10 μM RepSox (R); 50 μM Forskolin (F) 및; 5 μM ROCK 억제제 Y27632를 포함한 배지에서 추가로 6 일간 배양하였다.
1-3. 면역염색 (Immunostaining)
유도 단계 및 성숙 단계 후에 인간 섬유아세포에서 유래 된 Schwann 세포를 14 일째에 수확하고 4 % 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 10 분간 고정시킨 후 1X PBS (Welgene)로 2 회 세척 한 후 0.25 % Triton X- 100 (USB Corporation)을 PBS에서 10 분간 22 ℃로 가열하고 PBS로 5 분씩 각각 2 회 세척 하였다. 1 % BSA (Amresco), 22.52 mg / mL 글리신 (Affymetrix), PBS 중 0.1 % Tween 20 (Affymetrix)를 포함하는 차단 용액으로 60 분간 차단하였다. 이어서, 세포를 4 ℃에서 블로킹 용액으로 희석한 적절한 1 차 항체로 밤새 염색하였다. 사용된 항체는 토끼 항-GFAP 항체 (Abcam, 희석 1 : 100), 토끼 항 S-100 항체 (Abcam, 희석 1 : 100) 및 마우스 단일 클론 P0 항체 (Abcam, 희석 1 : 100)였다. 일차 항체 배양 후, 세포를 PBST에서 3회 세척하고 Alexa-488-접합 염소 2차 항마우스항체 (A11001, Invitrogen) 또는 Alexa-563-접합 염소 2차 항토끼항체 (A21428, Invitrogen) 100으로 실온에서 2 시간 동안 교반 하였다. 세포를 1 μg/mL DAPI (D9542, Sigma-Aldrich)와 함께 5 분 동안 실온에서 배양하여 핵을 염색하였다. 이어서 형광 현미경 (IX71S1F3, Olympus)을 사용하여 샘플을 시각화했다.
1-4. Quantitative RT-PCR
유도 단계 이후 3 일째에 인간 포피 섬유아세포 유래 슈반세포를 수확하고, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)로 총 RNA를 추출한 후, 총 RNA 5 μg을 RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT, Clontech)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 정량적 RT-PCR은 Bio-Rad Prime PCR 기기에서 SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였으며, 총 RNA를 사용하여 P19 세포로부터 유래된 심근세포로부터의 심장 마커 유전자의 mRNA 수준을 평가하였다. qRT-PCR 조건은 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 15 초의 40 주기였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
| Primer Name | Forward Primer ( 5`- 3` ) | Reverse Primer ( 5`- 3` ) |
| Krox20 | CCTTTGACCAGATGAACGGAGTG | GAAGGTCTGGTTTCTAGGTGCAG |
| MPZ | CTATCCTGGCTGTGCTGCTCTT | ACTCACTGGACCAGAAGGAGCA |
| Neurogenin1 | GCCTCCGAAGACTTCACCTACC | GGAAAGTAACAGTGTCTACAAAGG |
| DCT | CTCAGACCAACTTGGCTACAGC | CAACCAAAGCCACCAGTGTTCC |
| GAPDH | TGCACCACCAACTGCTTAGC | GGCATGGACTGTGGTCATGAG |
실시예 2. 배양된 슈반세포의 평가
2-1.Schwann 세포 배양 배지 및 신경 돌기 성장 촉진 분석
섬유 아세포는 위에서 언급 한 것처럼 14 일 동안 배양하여 Schwann 세포로 전환된다. 15 일째에 세포를 1X PBS에서 2 회 세척하고 10 % FBS 및 1 % 페니실린 및 스트렙토 마이신 (Welgene)으로 보충된 고포도당 DMEM (Welgene)에서 24 시간 동안 성장시켰다. 24 시간 후 이 배지를 수집하고 원심 분리하여 세포 찌꺼기 또는 미립자 물질을 제거하였다. 이 조건부 미디어는 향후 사용을 위해 -80℃로 저장하였다.
신경 돌기 성장 촉진 분석은 NSE34 운동 뉴런 세포로 수행하였다. 이 세포들은 10 % FBS와 1 % 페니실린과 스트렙토마이신 (Welgene)으로 보충된 고포도당 DMEM (Welgene)에서 유지된다. 분석을 위해 이들 세포를 1XPBS로 세척하고 SC 컨디셔닝된 배지로 옮기고 추가로 48 시간 동안 배양 하였다. 신경 돌기 성장 촉진은 이어서 현미경으로 평가 하였다.
2-2. RAT DPN 모델 설정 및 SC 주입
8주된 쥐에 streptozotocin (STZ)을 사용하여 당뇨병을 유도하였다. 처리된 쥐 중에서는 발에 주어지는 기계적 자극에 과민성을 나타내는 동물이 적용되었다 (von Frey 분석). 이 동물 그룹은 당뇨병성 말초 신경 병증의 모델로 사용되었다 (n = 8). 상기 실시예 1에서 준비한 CiSC 세포를 트립신 처리하고 수확하였다. STZ로 치료한지 4주 후 동물의 한쪽 다리 허벅지 근에 1x10^6 개의 CiSC를 주입하였다. 다른 쪽에는 배지만 주입하고 비교군으로 나타냈다. Von Frey 분석은 일주일에 한 번씩 4주에서 8주까지 시행되었다.
2-3.siatic 신경 및 immunohistochemistry의 표본 추출
8 주 후에 시험용 쥐를 희생시키고 좌골신경(siatic nerve)을 다리에서 수확하고 4 % 파라 포름 알데히드 (Sigma-Aldrich)로 하룻밤 동안 고정시켰다. 고정된 샘플을 3일 동안 30%의 수크로즈에 담갔다. 이어서 샘플을 절제하고 유리 슬라이드상에 놓았다. 슬라이드를 건조한 다음 증류수로 3회 세척하고, 10 mM Sodium citrate, pH6.0, 0.05 % Tween 20에 슬라이드를 담금으로써 항원 회수를 수행하고, 90 ℃에서 15 분 동안 항온 배양 하였다. 그 다음, 슬라이드를 1X PBS로 3 회 세척하고, 이어서 슬라이드를 10 분 동안 2X SSC 용액으로 세척하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고 0.25 % Triton X-100 (USB Corporation) PBS로 2시간 동안 투과처리하였다. 이어서, 4 ℃에서 밤새 블로킹 용액 (PBS 중 1 % BSA, 0.25 % triton X-100)으로 희석한 적절한 1 차 항체로 슬라이드를 염색하였다. 사용된 항체는 토끼 항-튜불린 β-3(TUBB3) 항체(Biolegend, 802001 희석 1 : 100) 및 마우스 단일 클론 Krox20 항체 (Abcam, 희석 1:100)였다. 일차 항체 배양 후, 세포를 PBST에서 3회 세척하고 Alexa-488-접합 염소 2차 항마우스 항체 (A11001, Invitrogen) 또는 Alexa-563-결합 염소 2차 항토끼항체 (A21428, Invitrogen) 100으로 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 세포를 1 μg/mL DAPI (D9542, Sigma-Aldrich)와 함께 5 분 동안 실온에서 배양하여 핵을 염색하였다. 이어서 형광 현미경 (IX71S1F3, Olympus)을 사용하여 샘플을 가시화했다.
2-4. 인간 섬유아세포로부터의 화학 칵테일에 의한 슈반세포 (CiSC)의 유도
특정 신호 전달 경로의 유전적 요인을 변조하지 않고 iPSC를 생성하기 위해서는 pluripotency (10)의 성공적인 유도가 이루어 졌다는 것이 이전에 보고된 바 있다. 이러한 화학 물질 중 일부를 간략하게 처리하면 슈반 세포에 대한 결실로 이어질 것이라는 가설을 세웠다. 따라서 유전자 조작없이 Schwann 세포를 만들려고 시도하면서 F, C, R (C, Chir99021, R, Repsox, F, Forskolin)으로 인간 섬유아세포를 처리하여 다른 염색질을 표적으로 하는 화합물을 포함한 후생 라이브러리를 선별했고, 레티노산 수용체 작용제(RAR 작동제) TTNPB (T)와 함께 2 개의 후성적 변형인자, 발프로산 (V) 및 트라닐시프로민 (P)의 조합으로 이루어진 배지에서 8일, 그 후 10 μM CHIR99021 (C); 10 μM RepSox (R); 50 μM Forskolin (F) 5 μM ROCK 억제제 Y27632를 6일간 처리한 결과, Schwann 세포 (그림 1A)와 유사한 높은 핵- 세포질 비율로 스핀들 모양의 형태를 형성하는 데 도움이 되었음을 알 수 있었다.
이 초기 실험에서 ROCK 억제제와 B27 및 N2 배지 보충제를 통합하여 나중에 처리한 상당한 세포 사멸을 관찰한 결과, Schwann 세포 발현은 면역 염색에 의한 Schwann 세포 특이 마커 발현에 의해 확인되었다 (도 1B 및 RT PCR (도 1C)).
2-5.화학적으로 유도된 Schwann 세포 (CiSC) 조건 배지의 시험관내에서 신경 돌기 성장 촉진 확인
Schwann 세포는 축삭의 건강과 기능을 촉진하고 축삭 재생에 도움이 되는 많은 신경 영양 및 신경 보호 인자를 분비하는 것으로 알려져 있다. 화학적으로 유도된 SC가 기능 생리적 대응물과도 일치하는지를 보기 위해, SC 조건 배지를 준비하고 운동 뉴런 세포 NSC-34를 처리하고 신경 돌기 성장에 대한 배지의 효과를 평가하려고 시도했다. 조절된 배지는 대조군만으로 처리된 세포 또는 Schwann 세포를 유도하는데 사용된 화학물질을 함유하는 배지에서는 관찰되지 않은 신경 돌기 성장을 촉진시켰다 (도 2A 및 2B).
2-6.화학적으로 유도 된 슈반 세포 (CiSC)의 쥐 당뇨병 말초 신경 병증 모델에서 신경 재생 촉진 효과 관찰
화학적으로 유도된 SC의 기능을 평가하기 위해 일부 병에 걸린 동물 모델에서 SC 이식의 효과를 관찰하였다. 이를 위해 당뇨병성 말초신경병증을 선택했다. 이 병증은 환자가 통증과 과민증을 앓고있는 심각한 당뇨병 관련 2차 병증의 하나이며 가능한 치료법이 없는 심각한 신경 퇴화의 징후이다. 당뇨병은 8주된 쥐에 streptozotocin (STZ) (췌장 β 세포에 대한 특이 적 독성을 갖는 화합물)을 사용하여 유도하였다. 처리 된 쥐 중에서는 기계적 자극에 과민성을 나타내는 동물이 당뇨병성 말초 신경 병증의 모델로 사용되었다(von Frey 분석).
세포 이식을 위해, CiSC 세포를 트립신 처리하고 수확하였다. STZ로 처치한지 4주 후 동물의 한 쪽 다리 허벅지근에 1x10^6 개의 CiSC를 주입하였고, 반면 다른 다리에는 배지만 주입하고 이를 비교군으로 사용하였다. Von Frey 분석은 일주일에 한 번씩 4주에서 8주까지 시행하였다. 도 3은 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포 이식시 당뇨병성 말초 신경 병증 쥐 모델에서 각각 기계적 자극이 4g (A), 8g (B) 및 15g (C)이 되도록 한 von frey 분석으로 통증 민감성과 통증 감소를 평가한 결과이고, 도 4는 본 발명의 슈반세포 분화용 배지 조성물을 사용하여 제조한 슈반세포의 축삭 재생 효과를 평가하기 위한 면역 조직 화학적 결과이다. 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 비교군과 비교시 이식된 세포를 가진 쥐가 기계적 자극(Von Frey 필라멘트, 4g 및 8g) 및 개선된 통증 감수성이 감소된 것을 관찰했다(도 3A-C).
또한, 다른 그룹의 쥐에서 떼어낸 좌골 신경을 시각화하여 이식된 세포의 연결 재생 및 기능적 통합을 평가한 결과, 비교군(sham control)과 대조적으로 세포 이식군에서 Schwann 세포의 축삭 재생효과를 확인할 수 있었다 (도 3D).
앞에서 설명된 본 발명의 일실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.
Claims (18)
- 체세포로부터 슈반세포로의 직접 분화에 사용되며,
히스톤 디아세틸라제 억제제(Histone deacetylase inhibitor),; GSK 억제제(Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터(cAMP signaling activator),; 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및; RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
ROCK 억제제를 더 포함한 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 히스톤 디아세틸라제 억제제는 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 발프론산 (Valproic acid), 2,4-피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxylic Acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
GSK 억제제가 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
ALK-5 키나아제 억제제가 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 cAMP 시그널링 액티베이터가 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27 및 PACAP 1-38 (peptide based)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 모노아민 옥시다제 억제제가 트라닐시프로민(tranylcypromine)인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 RAR 작용제가 TTNPB인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 배지 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 ROCK 억제제는 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 및 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 슈반세포 분화용 조성물. - 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator),; 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및; RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 배지에서 체세포를 배양하여 슈반세포로 직접 분화시키는 체세포로부터 슈반세포를 분화하는 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 배양은 4 내지 20일간 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법. - 제10항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포를 분화하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 배지는 ROCK 억제제를 더 포함한 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포를 분화하는 방법. - ⅰ)히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator), 모노아민 옥시다제 억제제(monoamine oxidase inhibitor) 및 RAR 작용제(RAR agonist)를 포함한 배지에서 체세포를 배양하여 이를 슈반세포로 유도하는 단계 및;
ⅱ) 상기 유도된 슈반세포를 GSK 억제제, ALK-5 키나아제 억제제, cAMP 시그널링 액티베이터, ROCK 억제제를 포함한 배지에서 숙성하는 단계를 포함한 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법. - 제14항에 있어서,
상기 ⅰ)단계는 배양은 2 내지 10일의 범위에서 수행되고, ⅱ)단계는 3 내지 10일의 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법. - 제14항에 있어서,
상기 체세포가 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는 체세포로부터 슈반세포로의 분화방법. - 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분화된 슈반세포를 포함한 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌크화제, 완충제, 전달 비히클, 등장제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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| N231 | Notification of change of applicant |