KR20180101228A - 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법 - Google Patents
신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 체세포를 신경세포(neuron)로 직접전환하는 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 다양한 분화 유도 물질 등 저분자성 물질 중에서 보다 효율적으로 신경세포를 유도할 것으로 예상되는 저분자성 물질로 구성된 신경세포 분화용 배지 조성물을 개발하여 직접적 전환을 시도한 결과 체세포로부터 신경세포를 유도하였을 때 매우 3시간 내지 6시간이라는 매우 빠른 시간 내에 높은 수율로 직접 전환됨을 확인하였는 바, 유전자 조작 없는 자가 체세포를 이용한 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유전자 도입 없이 저분자성 물질을 이용하여 안전하고 높은 효율로 체세포로부터 화학적 유도 신경세포 (CiN, Chemically induced Neuron)를 분화시키는 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
임상 등급의 신경세포를 확보하는 것은 질병 모델링 및 약물 효능 검사뿐만 아니라, 여러 가지 신경 퇴행성 질환 및 신경손상에 대한 재생 치료에의 이용과 관련해서 매우 중요하다. 인간 배아줄기세포(ES cell, Embryonic stem cell)의 분화를 통해 생리학적으로 활성을 갖는 신경세포를 얻을 수는 있지만, 가용성, 면역 감수성, 기능적 완전성, 종양 발생 위험 및 효율성과 관련하여 문제가 되며, 또한 적절한 면역형 일치 기증자로부터 유래된 신경세포 또는 신경 전구세포의 이식이 어렵기 때문에 세포 치료제로서의 사용에 여러 가지 한계를 가지고 있다. 또한 배아줄기세포의 사용은 윤리적인 문제를 내포하고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 환자의 체세포를 역분화 시켜서 만능줄기세포를 얻는 방법이 개발되었고, 이렇게 만들어진 세포인 역분화줄기세포 (iPSC, induced pluripotent stem cell)를 분화시켜서 신경세포 및 신경줄기세포를 만들 수 있다. 하지만 이렇게 만들어진 신경세포 역시 종양발생 위험이 존재한다는 단점을 가지고 있다. 또한 역분화줄기세포를 거쳐서 체세포를 신경세포를 만드는 방법은 많은 시간과 비용이 소모된다는 단점을 가지고 있다
이러한 단점을 극복하기 위한 방법으로 체세포를 역분화를 거치지 않고 다양한 계통의 세포로 직접분화하는 기술이 개발된 바 있다. iPSC를 이용하는 경우 체세포를 이용하여 만들어진 역분화줄기세포를 분화시켜 신경줄기세포와 신경 전구세포를 거쳐서 여러 가지 신경세포로 분화시키는 반면 직접분화는 체세포를 신경 줄기세포 또는 기능성 신경세포로 직접 전환시킨다는 차이점을 가지고 있다. 이러한 이유로 직접분화에 의한 신경세포분화는 역분화를 거치는 방법에 비해 시간, 비용 및 효과면에서 큰 장점을 가지고 있다. 또한 직접분화는 환자의 체세포를 이용하여 환자맞춤형 세포제작이 가능하므로 면역반응 없는 자가이식 치료가 가능하다는 특징을 가지고 있다. 현재까지 알려진 많은 직접분화는 바이러스 혹은 플라즈미드를 이용하여 외부유전자를 세포에 직접 도입하는 방식을 통해 이루어져 왔다. 하지만, 이러한 방식은 도입된 외부 유전자가게놈내에 무작위적으로 인테그레이션 (integration)되어 유전적 불안정성 (genomic instability)을 야기하기 때문에, 향후 환자에 임상적용 시 암을 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 외부 유전자를 주입하는 방법대신 세포의 운명을 결정하는 신호나 세포의 후성유전체를 조절하는 기능을 갖는 저분자 물질을 도입하여 하여 직접분화를 유도하는 방법이 제시되고 있다.
저분자를 이용한 직접분화는 다른 분화 방법과 비교하였을 때 위에서 제시한 임상적인 측면의 장점이외에도 연구방법적인 측면에서 분자도입의 용이성, 결과의 재현성 및 효율적인 확장성을 포함하는 장점을 가지고 있다. 따라서 종래의 분화방법으로 제작하는 세포치료제가 가진 문제점이 없이 보다 안전하고 간편한 방법으로 체세포로부터 신경세포를 직접분화시키는 방법을 개발하는 것이 신경손상 관련 질환을 치료하는데 필요한 신경세포치료제를 만드는데 반드시 필요하다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 비교적 빠른 시간안에 효율적으로 체세포로부터 신경세포로의 직접 분화가 가능하도록 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신경세포 분화용 배지 조성물을 이용하여 체세포로부터 신경세포를 유도하는 신경세포 분화방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)를 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ROCK 저해제 (ROCK inhibitor)를 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 사이토카인인 NT3, BDNF, GDNF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상,; BMP4 저해제 (BMP4 inhibitor); 및 보충제인 B27 및 N2 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히스톤 디메틸라제 저해제(Histone demethylase inhibitor)를 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히스톤 아세틸전달효소 저해제 (Histone Acetyltransferase inhibitor)를 더 포함한 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히스톤 디아세틸라제 저해제가 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 발프론산 (Valproic acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GSK 저해제가 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ALK-5 저해제가 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 cAMP 시그널링 액티베이터가 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27 및 PACAP 1-38 (peptide based)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히스톤 아세틸전달효소 저해제가 가르시놀 (Garcinol), C646 (4-[(4Z)-4-[[5-(4,5-dimethyl-2-nitrophenyl)furan-2-yl]methylidene]-3-methyl-5-oxopyrazol-1-yl]benzoic acid), MG 149 (2-(4-heptylphenethyl)-6-hydroxybenzoic acid), NU 9056 (1,2-di(isothiazol-5-yl)disulfane) 및 Anacardic acid (2-hydroxy-6-pentadecylbenzoic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 브로모영역 저해제가 (+)- JQ1, ARV825, Bromosporine (ethyl (3-methyl-6-(4-methyl-3-(methylsulfonamido)phenyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-8-yl)carbamate), GW841819X ((R)-benzyl (6-(4-chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-benzo[f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)carbamate), CPI-203 ((S)-2-(4-(4-chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)acetamide), 및 RVX-208 (2-[4-(2-hydroxyethoxy)-3,5-dimethylphenyl]-5,7-dimethoxy-1H-quinazolin-4-one)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ROCK 저해제가 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 및 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ)히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)를 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물 존재하에 체세포를 배양하여 이를 신경세포로 유도하는 단계; 및 ⅱ) 상기 유도된 신경세포를 GSK 저해제, ALK-5 저해제, cAMP 시그널링 액티베이터 및 ROCK 저해제를 포함한 배지에서 숙성하는 단계를 포함한 체세포로부터 신경세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포 분화용 배지 조성물이 ROCK 저해제를 더 포함한 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ⅰ)단계는 배양은 2시간 내지 10일의 범위에서 수행되고, ⅱ)단계는 2 내지 10일의 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 체세포가 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법을 제공한다.
본 발명은 상기 분화방법에 의해 분화된 신경세포를 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약제학적 조성물이 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌크화제, 완충제, 전달 비히클, 등장제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 체세포로부터 신경세포로 직접 분화하였으며, 매우 빠른 시간안에 높은 수율로 직접분화됨을 확인하였는바, 저분자성 물질을 포함한 배양액에서 세포를 배양하는 간단한 방법을 통하여 섬유아세포를 신경세포로 직접분화하는 기법을 보여줌으로써, 유전자 조작 없는 자가세포를 이용한 안전한 세포치료제로 유용하며, 본 발명에 의해 생산된 신경세포는 뇌졸중 (stroke), 뇌성마비 (cerebral palsy)같은 신경질환 척추손상 (spinal cord injury)을 포함하는 사고로 인한 신경손상질환, 배턴병 (battens disease)을 포함하는 유전적 이상에 의한 신경 질환, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭병, 헌팅턴병을 포함하는 퇴행성 신경질환을 예방, 치료 및 개선하기 위한 세포 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 인간 표피 섬유아세포로부터 본 발명의 화학물질 처리시 신경세포로의 분화 과정을 개략적으로 나타낸 도
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 분화된 신경세포 마커의 발현을 나타낸 도
도 3은 신경세포-특이적 및 섬유아세포 특이적 전사물질의 발현을 비교한 도
도 4는 본 발명에 따른 신경세포 분화용 배지 조성물 중 필수조성을 확인하기 위하여 전체 조합에서 개별 성분을 하나씩 제외하며 분화한 결과를 나타낸 그림
도 5는 본 발명의 실시예 3의 조성물을 이용하여 인간 표피 섬유아세포로부터 본 발명의 화학물질 처리시 신경세포로의 분화 과정을 개략적으로 나타낸 도
도 6은 본 발명에 따른 실시예 3의 조성물로 신경세포 분화를 시간별로 관찰한 결과
도 7은 실시예 3에서 분화된 신경세포의 발현을 확인하기 위한 신경세포 마커 확인 결과
도 8(A) 및 (B)는 각각 실시예 3 및 4의 조성을 이용하여 신경세포를 분화시킨 결과를 관찰한 결과
도 9(A)는 섬유아세포에 실시예 4의 조성물을 적용하고 3시간 후에 관찰한 결과이고, 도 9(B)는 실시예 5의 조성물을 적용하고 6시간 후에 관찰한 결과
도 10은 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물을 이용하여 쥐의 배아섬유아세포를 신경세포로 직접분화하여 만든 신경세포의 현미경 사진
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 분화된 신경세포 마커의 발현을 나타낸 도
도 3은 신경세포-특이적 및 섬유아세포 특이적 전사물질의 발현을 비교한 도
도 4는 본 발명에 따른 신경세포 분화용 배지 조성물 중 필수조성을 확인하기 위하여 전체 조합에서 개별 성분을 하나씩 제외하며 분화한 결과를 나타낸 그림
도 5는 본 발명의 실시예 3의 조성물을 이용하여 인간 표피 섬유아세포로부터 본 발명의 화학물질 처리시 신경세포로의 분화 과정을 개략적으로 나타낸 도
도 6은 본 발명에 따른 실시예 3의 조성물로 신경세포 분화를 시간별로 관찰한 결과
도 7은 실시예 3에서 분화된 신경세포의 발현을 확인하기 위한 신경세포 마커 확인 결과
도 8(A) 및 (B)는 각각 실시예 3 및 4의 조성을 이용하여 신경세포를 분화시킨 결과를 관찰한 결과
도 9(A)는 섬유아세포에 실시예 4의 조성물을 적용하고 3시간 후에 관찰한 결과이고, 도 9(B)는 실시예 5의 조성물을 적용하고 6시간 후에 관찰한 결과
도 10은 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물을 이용하여 쥐의 배아섬유아세포를 신경세포로 직접분화하여 만든 신경세포의 현미경 사진
이하 본 명세서에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 용어 "신경세포"는 전술한 신경세포 및 성숙과정을 거쳐 신경세포가 될 수 있는 능력을 가진 유사 신경세포를 포함하며, 적어도 하나 이상의 신경세포 특이적 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 신경세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 신경 전구세포 또는 신경세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 신경 전구세포 또는 신경세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 신경세포에 특이적인 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 체세포의 신경세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다. 즉, 다능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도 유용한 지표로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 신경세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포 (모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기 (embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한 (matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 신경세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 체세포로 섬유아세포를 사용하였으며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.
본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물은 히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)의 기본 5가지 성분을 필수적으로 포함하며, 선택적으로는 ROCK 저해제 (ROCK inhibitor), 히스톤 디메틸라제 저해제(Histone demethylase inhibitor) 및/또는 히스톤 아세틸전달효소 저해제 (Histone Acetyltransferase inhibitor)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물은 사이토카인인 NT3, BDNF, GDNF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상,; BMP4 저해제 (BMP4 inhibitor); 및 보충제인 B27 및 N2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor)"는 히스톤으로부터 아세틸 그룹을 제거하는 효소의 활성을 억제하는 물질들을 의미한다. 상기 히스톤 디아세틸라제 저해제는 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 발프론산 (Valproic acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Trichostatin A일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 히스톤 디아세틸라제 저해제(Histone deacetylase inhibitor)는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 히스톤 디아세틸라제 저해제의 함량이 위 범위를 벗어나는 경우에는 신경세포로의 전환율이 낮아지거나 이상세포의 발생 등 문제가 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, "GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor)"는 Wnt 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2를 표적으로 하여 GSK의 활성을 억제하여 궁국적으로 Wnt신호를 활성화 시키는 물질들을 의미한다. 상기 GSK 저해제는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Chir 99021일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 GSK 저해제는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우에는 신경세포로의 전환에 문제가 있기 때문이다.
본 발명에 있어서, "ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor)"는 본 발명에 있어서, "ALK5 저해제 (ALK-5 inhibitor)"는 ALK5 (activin A receptor type II-like kinase 5)에 결합하여 TGF-β 타입 I (Transforming growth factor-β type I)의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미하며, 상기 ALK5는 TGF-β 타입 I 리셉터라고도 불리우며, 상기 TGF-β 타입 I 은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 ALK-5 저해제 (TGF-β 타입 I 리셉터 저해제)는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Repsox일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 ALK-5 저해제는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator)"는 cAMP 신호를 활성화시키는 물질을 의미한다. 상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27 및 PACAP 1-38 (peptide based)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Forskolin일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 100μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "브로모영역 (bromodomain)"은 히스톤의 아세틸화되어 있는 라이신을 인식하는 영역으로, 히스톤 아세틸전달효소 (HAT) 또는 크로마틴재편성인자 등의 핵내 단백질에 존재하는 100~110 아미노산으로 구성하는 영역을 의미한다. 상기 브로모영역 저해제는 (+)-JQ1, ARV825, Bromosporine (ethyl (3-methyl-6-(4-methyl-3-(methylsulfonamido)phenyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-8-yl)carbamate), GW841819X ((R)-benzyl (6-(4-chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-benzo[f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)carbamate), CPI-203 ((S)-2-(4-(4-chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)acetamide) 및 RVX-208 (2-[4-(2-hydroxyethoxy)-3,5-dimethylphenyl]-5,7-dimethoxy-1H-quinazolin-4-one)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 (+)- JQ1일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 브로모영역 저해제는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "히스톤 아세틸전달효소 저해제 (Histone Acetyltransferase inhibitor)"는 히스톤 탈아세틸화 효소와 함께 정상 세포에서 히스톤 아세틸화를 억제하는 물질을 의미한다. 상기 히스톤 아세틸전달효소 저해제는 가르시놀 (Garcinol), C646 (4-[(4Z)-4-[[5-(4,5-dimethyl-2-nitrophenyl)furan-2-yl]methylidene]-3-methyl-5-oxopyrazol-1-yl]benzoic acid), MG 149 (2-(4-heptylphenethyl)-6-hydroxybenzoic acid), NU 9056 (1,2-di(isothiazol-5-yl)disulfane) 및 Anacardic acid (2-hydroxy-6-pentadecylbenzoic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Garcinol일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 히스톤 아세틸전달효소 저해제는 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "ROCK 저해제 (ROC Kinase inhibitor)"는 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 및 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Y-27632일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물에 있어서 상기 ROCK 저해제는 신경세포로의 분화속도를 높이는 역할을 하며, 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물은 히스톤 디메틸라제 저해제를 더 포함할 수 있다. 상기 히스톤 디메틸라제의 바람직한 예로는 2,4-피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxylic Acid)을 들 수 있으며, 그 함량은 전체 조성물을 기준으로 0.5 내지 1,000μM 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물은 사이토카인인 NT3, BDNF, GDNF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상,; 저분자성 화합물인 GSK 저해제, cAMP 시그널링 액티베이터, BMP4 저해제 (BMP4 inhibitor) 및 ROCK 저해제 (ROCK inhibitor)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상; 및 보충제인 B27 및 N2 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 종류가 제한되지 않는다.
상기 "BMP4 저해제 (BMP4 inhibitor)"는 DM3189 (Quinoline, 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-), Dorsomorphin 2HCl (6-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine;dihydrochloride) 또는 MP470 (N-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-([1]benzofuro[3,2-d]pyrimidin-4-yl)piperazine-1-carbothioamide)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 DM3189일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 체세포를 배양하는 배양액은 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지 배양액을 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 배지는 DMEM/F12, N2, B27, bFGF (basic fibroblast growth factor), 및 EGF (epidermal growth factor)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Isocove's Modified Dulbecco's Medium 및 Neurobasal Plus media containing 1% B27 supplement 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포 분화용 배지 조성물 존재하에 체세포를 배양하여 신경세포로 분화하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, 체세포를 직접분화하는 방법을 이용하여 신경세포로 유도하는 대부분의 방법은 외부 유전자를 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 다만, 바이러스를 이용하여 유전자를 도입하는 것은 외부 유전자의 무작위적인 인테그레이션 (integration)으로 인한 유전적 불안정성 (genomic instability)을 야기하여, 향후 환자에 임상적용 시 암이 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 점차적으로 외부 유전자를 주입하지 않고 저분자성 물질 (small molecule)을 이용하는 방법들이 제시되고 있는 실정이다. 그러나 최근 다양한 저분자성 화합물들을 이용하여 직접분화를 유도하는 연구가 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 최소한 하나의 유전자는 이용되고 있으며, 유전자 도입 없이는 여전히 인간 체세포로부터 원하는 신경세포로 전환할 수 없는 상태이다.
그러나, 본 발명은 외부 유전자의 도입 없이 체세포로부터 신경세포를 유도하는 유전적 안정성이 확보된 방법으로써, 기존의 유전자를 이용한 유전적 결손을 유도하는 방법을 해결하고자 고안된 것이다. 본 발명에서는 저분자성 물질의 조합만을 이용하여 체세포를 신경세포로 직접 분화하였다. 이에, 기존의 기술이 가진 많은 문제점들을 극복함으로써, 환자를 위한 세포치료제로 활용 가능성이 매우 높다. 본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 체세포를 고효율로 빠른 시간 안에 직접 신경세포로 변화시키는 방법을 찾고자 기전에 알려져 있는 세포분화관련 신호조절물질을 아래와 같이 조합하였다; (1) Wnt/beta-catenin신호를 활성화시키는 glycogen synthase kinase저해제, (2) TFG-beta신호 저해하는 ALK-5 kinase저해제 , (3) 세포신호전달물질인 cyclic AMP (cAMP)를 합성을 증가시키는 cAMP signaling activator. 이러한 조건하에서 분화세포내에서 전사작용을 활성화 시키기 위해 후생유전체를 조정한다고 알려져 있는 후성유전체 관련 효소들의 저해제를 여러 가지 조합으로 처리 한 결과 (1) histone deacetylase의 저해제 (2) histone acetyltransferase의 저해제 (3) histome demethylase의 저해제를 조합하였을 때 체세포의 신경세포 분화가 활성화됨을 확인함으로써 6가지 화합물에 의해 신경분화가 가능함을 확인하였다. 또한, 신경세포의 분화효율을 높이기 위해 추가적으로 여러 가지 후성유전체 변형 효소 저해제를 처리한 결과 bromodomain 저해제가 첨가 되었을 때 80% 이상의 효율로 신경세포분화가 일어나는 것을 확인 하였다.
또한 ROCK 저해제가 분화된 신경세포의 사멸을 감소시키고 neurite의 성장을 빠르게 하여 신경세포분화 효율을 높일 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 체세포로부터 신경세포로의 분화방법은 단일 단계(single step)으로 수행될 수도 있으나, 효율을 위해 2단계로 수행될 수도 있다. 즉, ⅰ)히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)를 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물 존재하에 체세포를 배양하여 이를 신경세포로 유도하는 단계; 및 ⅱ) 상기 유도된 신경세포를 GSK 저해제, ALK-5 키나아제 저해제, cAMP 시그널링 액티베이터, ROCK 저해제를 포함한 배지에서 숙성하는 2 step 단계를 거쳐 신경세포로 분화할 수 있다. 상기 ⅰ)단계의 배양은 신경세포로 분화를 유도할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 2시간 내지 10일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 3시간 내지 3일 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 ⅱ)단계의 배양은 상기 분화가 유도된 세포가 성숙할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 2 내지 10일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 3 내지 8일 동안 수행될 수 있다. 상기 기간을 벗어나는 경우 신경세포로의 전환이 부족하거나 세포사멸의 부작용이 있기 때문이다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 분화방법을 사용하는 경우, 종래의 알려진 화학적 유도 세포 분화 방법과 비교하여, 보다 짧은 시간의 처리만으로 목적하는 세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물은 배지조성물을 이용하여 분화된 신경세포를 신경질환 치료용 세포치료제(약제학적 조성물)로 사용가능하다. 상기 신경질환은 뇌졸중 (stroke), 뇌성마비 (cerebral palsy)같은 신경질환 척추손상 (spinal cord injury)을 포함하는 사고로 인한 신경손상질환, 배턴병 (battens disease)을 포함하는 유전적 이상에 의한 신경 질환, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭, 헌팅턴 등을 포함하는 퇴행성 신경질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"는 상기 세포치료제의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. '치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.
본 발명의 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 신경세포 1일 투여량은 1.0ㅧ104 내지 1.0ㅧ1010 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0ㅧ105 내지 1.0ㅧ109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내 (intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. FCRPGTJ 화합물 조합에 의한 섬유아세포의 화학적 유도 신경세포 (CiN)로의분화 방법
세포신호조절에 관여하는 여러 화합물을 스크리닝하여 C (Chir99021), 및 R (Repsox), F (Forskolin)의 조합에 의해 상이한 염색질 변형이 유도되는 것을 확인하였다. 이러한 화합물 조합을 세포에 처리한 후, 3일 후에 여러 가지 후생유전체 조절자 (epigenetic modifiers)을 스크린 한 결과, 2,4-Pyridinedicarboxylic Acid (P), Garcinol (G) 및 Trichostatin A (T)이 미성숙한 신경돌기를 갖는 세포가 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 신경세포의 분화효율을 증가시키기 위해 이 6가지 화합물 조합 조건에 브로모영역 억제제 (bromodomain inhibitor)들을 추가로 스크린한 결과, (+)-JQ1이 추가되었을 때 보다 많은 신경돌기를 갖는 세포가 유도된다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이들 7가지 화합물 (CRFPGTJ 조합)을 이용하여 체세포의 신경세포 실험을 수행하였다 (도 1, 2, 3).
1-1. 세포 분리 및 배양
인간 표피 섬유아세포 (Human foreskin fibroblasts, SCC058, Millipore)를 10 % FBS, 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신 (Welgene)이 첨가된 고-글루코스 DMEM (Welgene)에서 배양하였다.
1-2. 신경세포 형성 (Generation of chemically induced Neuron)
인간 표피 섬유아세포 (HFF)를 상온에서 2 시간 동안 1:100 마트리겔 (BD Biosciences)로 예비 코팅한 후, 플레이트당 60,000 세포의 밀도로 35 mm 플레이트에 씨딩하고, NRM (Neuron Reprogramming Medium: 녹아웃 DMEM (Gibco), 1 % Glutamax (Gibco), 1 % 비 필수 아미노산 (Gibco), 0.1 mM β- 메르캅토에탄올 (Sigma) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신) CRFPGTJ와 같은 화학적 화합물 조합을 포함한다.
상기 CRFPGTJ 조합은 각각 5 μM CHIR99021 (C), 5 μM RepSox (R), 50 μM Forskolin (F), 3.5 μM 2,4-Pyridinedicarboxylic Acid (P), 3.5 μM Garcinol (G), 3.5 μM Trichostatin A (T) 및 1 μM (+)-JQ-1 (J)로 이루어지는 군으로부터 선택되었다 (Medchemexpress). 섬유아세포는 3 일 동안 유도 (induction phase)하였다. 분화 유도 3 일 후, 세포를 다양한 사이토카인 혼합물 (20 ng/ml FGF2 (Preprotech), 20 ng/ml Neurotrophin-3 (NT3, R&D), 20 ng/ml Brain Derived Growth Factor (BDNF, Preprotech), 20 ng/ml Glial Derived Growth Factor (BDNF, Preprotech), 5 μM CHIR99021 (Medchemexpress), 5 μM RepSox (R), 5 μM ROCK inhibitor Y27632, 250 nm DM3189, 200 μg/ml Phospho Ascorbic Acid (Sigma), 및 1X B27/N2 보충제 (Lifetechnologies))이 포함된 NMM 배지 (녹아웃 DMEM/F12:Neurobasal 배지 (1:1, Gibco), 1 % Glutamax (Gibco), 1 % 비필수아미노산 20 ng/ml, 및 1X 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하였다. 이러한 과정은 도 1에 정리하였다.
1-3. 면역염색 (Immunostaining)
유도 단계 또는 성숙 단계 후에 인간 섬유아세포 유래 신경세포를 각각 5 일 또는 10 일째에 수확하고, 1X PBS (Welgene)로 2 회 세척한 후, 4 % 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 10 분 동안 고정시키고 0.25 % 트리톤 X-100 (USB Corporation) 함유 PBS를 22 ℃에서 10분 동안 처리한 후, PBS로 각각 2 회씩 5분 동안 세척하였다. PBS에서 1 % BSA (Amresco), 22.52 mg/ml 글리신 (Affymetrix), 및 0.1 % Tween 20 (Affymetrix)를 포함하는 차단 용액으로 60 분간 차단하고, 블로킹 용액으로 희석한 적절한 일차 항체로 4 ℃에서 밤새 염색하였다. 사용된 항체는 토끼 anti-Tubulin β-3 (TUBB3, Biolegend, 802001, 희석 1:100), 토끼 Doublecortin (ab18723, Abcam, 희석 1:100) 및 마우스 단클론성 NeuN, 클론 A60 (MAB377, Millipore, 희석 1:100)이다. 일차 항체로 배양 후, 세포를 PBST에서 3 회 세척하고, 1:100으로 희석한 Alexa-488-접합 염소 이차 anti-마우스 항체 (A11001, Invitrogen) 또는 Alexa-563-접합 염소 이차 anti-토끼 항체 (A21428, Invitrogen)로 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 세포를 1 μg/ml DAPI (D9542, Sigma-Aldrich)와 함께 실온에서 5 분간 배양하여 핵을 염색하고, 형광 현미경 (IX71S1F3, Olympus)을 사용하여 시각화하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
1-4. Quantitative RT-PCR
유도 단계 3 일째에 인간 표피 섬유아세포 유래 신경세포를 수확하고, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)로 총 RNA를 추출한 후, 총 RNA 5 μg을 RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT, Clontech)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 정량적 RT-PCR은 Bio-Rad Prime PCR 기기에서 SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였으며, 총 RNA를 사용하여 P19 세포로부터 유래된 심근세포로부터의 심장 마커 유전자의 mRNA 수준을 평가하였다. qRT-PCR 조건은 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 15 초의 40 주기였다. 본 발명에서 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다. 이러한 실험 결과는 도 3에 나타내었다.
| Primer Name | Forward Primer (5`-3`) | Reverse Primer (5`-3`) |
| Ascl1 | CAAGAGAGCGCAGCCTTAG | GCAAAAGTCAGTGCTGAACG |
| Brn2 | AATAAGGCAAAAGGAAAGCAACT | CAAAACACATCATTACACCTGCT |
| Myt1 | CAATGGAAAGGGATTTTAAGCA | TTTGAGATTATGTACCAACGTTAGATG |
| NeuroD1 | GTTATTGTGTTGCCTTAGCACTTC | AGTGAAATGAATTGCTCAAATTGT |
| Ngn2 | TCAGACATGGACTATTGGCAG | GGGACAGGAAAGGGAACC |
| FoxA2 | AGCAGAGCCCCAACAAGATG | TCTGCCGGTAGAAGGGGAAGA |
| Nurr1 | GTTCAGGCGCAGTATGGGTC | CTCCCGAAGAGTGGTAACTGT |
| Col1A | GAGGGCCAAGACGAAGACATC | CAGATCACGTCATCGCACAAC |
| Dkk3 | CTGGGAGCTAGAGCCTGATG | TCATACTCATCGGGGACCTC |
| Thy1 | ATCGCTCTCCTGCTAACAGTC | CTCGTACTGGATGGGTGAACT |
| Ctgf | CATCTCCACCCGGGTTACCAA | AGTACGGATGCACTTTTTGC |
| Cdh2 | AGTCAGTCGGAAAGTGAGCAG | ACATCAGCTATCCGTTCCTTCT |
1-5. 신경세포 분화의 확인
또한, 7가지 화합물을 조성물로 하는 직접 분화에 의해 섬유아세포가 신경세포로 분화함을 확인하고 검증하기 위하여, 분화된 세포에서의 신경세포 특이적 마커의 발현을 확인하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 βTubulin III 및 Doublecortin과 같은 성숙 신경세포 마커에 대해 면역 양성 반응이 나타남을 확인하였다. 또한 분화된 세포에서는 신경세포에서만 발현되는 유전자들은 발현되지만 섬유아세포에서 발현되는 유전자의 발현이 없음을 RT-PCR을 통해 확인할 수 있었다(도 3). 이러한 결과는, 상기 조성물에 의해 섬유아세포가 신경세포의 성질을 가지는 세포로 분화된다는 것을 의미하고, 결과적으로 화학-유도 신경세포 제작이 가능함을 의미한다.
위 실시예 1의 실험결과를 바탕으로 분화시킨 신경세포의 신경돌기 (neurite) 성장을 촉진시키고 및 신경세포 사멸을 감소시키는 조건을 추가로 조사하였고, ROCK 억제제 (Y-27632)가 첨가되었을 때 신경세포 생존 및 성숙이 촉진된 다는 것을 확인하였다. 따라서 실시예 1의 배지조성에 Y27632 10μM을 추가하는 8가지 화합물의 조합 (CRFPGTJY)을 효율적인 신경세포 분화조건으로 사용하였다.
실시예 2. 필수성분의 확인
8가지 화합물의 역할을 보다 자세히 조사하고 각 물질의 필요성을 추가로 검증하기 위해서 8가지화합물을 하나씩 제거한 조건에서 신경분화실험을 진행하였고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 붉은색 글씨로 표시된 성분들인 히스톤 디아세틸라제 억제제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 kinase inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 억제제 (bromodomain inhibitor)는 신경세포 분화에 필수적임을 알 수 있고, 푸른색으로 표시된 히스톤 디메틸라제 억제제(Histone demethylase inhibitor), 히스톤 아세틸 전달효소 억제제 및 ROCK 억제제 (ROCK inhibitor)는 신경세포 분화에 필수적이지는 않은 것으로 판정되었다. 이 과정에서 본 발명자들은 Y, 즉 ROCK 저해제가 없는 조건에서도 분화가 일어나지만 신경세포분화시간 및 분화된 신경세포의 갯 수 측면에서 분화효율이 떨어짐을 확인하였다. 따라서 최종적으로 6가지 화합물로 이루어진 조성물에 의해 체세포의 신경세포 분화가 가장 높은 효율로 유도됨을 확인하였다.
실시예 3. CFRTJY 조합을 이용한 신경세포 분화 실험
신경세포 분화용 배지조성으로 각 5 μM CHIR99021 (C), 5 μM RepSox (R), 50 μM Forskolin (F), 3.5 μM Trichostatin A (T), 1 μM (+)-JQ-1 (J), 및 5 μM Y27632(ROCK 억제제)으로 조합하고 1% B27 보충제를 포함한 Neurobasal Plus media를 적용한 것으로 제외하고는 위 실시예 1과 동일한 조건으로 각각 6, 12 및 24시간 동안 신경세포 분화를 유도 (induction phase)하였다. 그 후 숙성배지에 옮겨 숙성을 하였다. 도 5는 본 발명의 실시예 3에 따라 인간 표피 섬유아세포로부터 본 발명의 화학물질 처리시 신경세포로의 분화 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물을 체세포에 처리한 후 시간에 따른 세포전환 정도를 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 정리하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 신경세포 분화용 배지조성물을 섬유아세포에 처리한 결과 불과 6시간 안에 신경세포 분화가 일어나는 것을 볼 수 있었고, 숙성 4일 만에 시냅스가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다(도 6 하단 사진의 백색 화살표). 또한, 도 7는 실시예 3의 신경세포 분화용 배지 조성물을 이용하여 처리한 섬유아세포의 신경세포로 전환된 후의 세포특성을 복수의 마커로 분석한 결과이다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신경세포 분화용 배지 조성물을 이용하여 분화시킨 신경세포는 분화시간이 매우 단축되었음에도 신경세포의 특성을 잘 보여주고 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 신경세포 분화용 배지조성의 조합 변화
위 실시예 3의 조성과 관련하여 사용된 화합물 대신 동일한 기능을 갖는 동중의 화합물을 이용한 분화가 가능함을 증명하기 위해, 아래 표 2과 같이 배지조성을 변경하여 실험을 하였다.
위 실시예 3 및 4의 조성을 이용하여 신경세포를 분화시킨 결과를 관찰하여 각각 도 8(A) 및 (B)로 표시하여 정리하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 동일한 역할을 수행하는 각 성분을 교체하더라도 신경세포의 분화가 동일하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 신경세포 분화용 배지조성의 조합 변화
또한, 위 실시예 4의 조성을 적용하는 경우 실시예 3의 조성에 비해 동일조건에서 신경세포의 분화가 더욱 빨리 일어나는 것으로 확인되었다. 즉, 위 표2의 실시예 3의 조성의 경우 섬유아세포가 신경세포로 분화하는데 6시간이 걸렸지만, 실시예 4의 조성으로 실험한 결과 섬유아세포가 3시간 만에 신경세포로 변환됨을 확인하였는데, 본 발명자들은 교체된 성분 중 어떤 것이 이러한 효과를 가져오는지 확인하기 위해 6가지 성분을 한 가지씩 치환하며 그 결과를 관찰하였다. 그 결과, 신경세포 분화용 배지조성 중 ROCK 저해제 성분이 신경세포 분화의 속도에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 아래 표 3은 실시예 4 및 실시예 4의 조건에서 ROCK 저해제만을 Y27632로 바꾼 실시예 5의 조성을 정리한 것이다.
그 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9(A)는 섬유아세포에 실시예 4의 조성물을 적용하고 3시간 후에 관찰한 결과이고, 도 9(B)는 실시예 5의 조성물을 적용하고 6시간 후에 관찰한 결과이다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 같은 ROCK억제제를 사용했지만 Y-33075를 사용한 경우 3시간 만에 신경세포의 분화가 완료되는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 마우스 실험
C57BL.6 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 분리 하였다. 또한, 마우스 배아에서 머리, 척수 및 내부 기관을 조심스럽게 제거하여 신경제세포의 오염 가능성을 제거하였다. 0.25 % 트립신 -EDTA (GIBCO)로 나머지 조직을 절단하고 트립신 처리하여 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. MEFs는 이어서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 및 스트렙토 마이신 (Welgene)으로 보충 된 고 포도당 DMEM (Welgene)에서 배양되었다. 쥐 뉴런 유도를 위해 MEF 세포를 24 웰 배양 접시에 40000 세포 / 웰의 파종 밀도로 접종 하였고, 파종 18 시간 후에 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물을 함유하는 유도 배지 (1 % B27이 첨가 된 Neurobasal)를 첨가 하였다. 화학적 칵테일 조성은 실시예 4의 조성을 사용하였다. 유도 배지에서 24 시간 배양 한 후, 숙성 배지 (10uM Chir99021, 25uM 포스 콜린, 10uM Repsox, 0.5uM DM3189, 10uM Y27632, 2ng / ml NT3, 20ng / ml BDNF, 20ng / ml와 함께 1 % B27을 첨가 한 Neurobasal GDNF)를 첨가하고 추가 5 일 동안 배양하였다. 도 10은 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물을 이용하여 쥐의 배아섬유아세포를 신경세포로 직접분화하여 만든 신경세포의 현미경 사진이다. 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 신경세포 분화용 배지조성물은 인간 체세포 뿐 아니라 쥐의 체세포에도 작용하여 신경세포로 분화함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (20)
- 히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)를 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물.
- 제1항에 있어서,
ROCK 저해제 (ROCK inhibitor)를 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
사이토카인인 NT3, BDNF, GDNF 및 bFGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상,; BMP4 저해제 (BMP4 inhibitor); 및 보충제인 B27 및 N2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
히스톤 디메틸라제 저해제(Histone demethylase inhibitor)를 더 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
히스톤 아세틸전달효소 저해제 (Histone Acetyltransferase inhibitor)를 더 포함한 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 히스톤 디아세틸라제 저해제는 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 발프론산 (Valproic acid), 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat) 및 부틸레이트 (butyrate)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 히스톤 디메틸라제 저해제는 2,4-피리딘디카르복시산 (2,4-Pyridinedicarboxylic Acid)인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 GSK 저해제는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); BIO ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N'-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3'-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3'-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)) 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 ALK-5 저해제는 RepSox(1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]),; SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline),; GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide),; SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine),; Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide),; EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine),; LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline),; SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]),; SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide),; K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol] 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 cAMP 시그널링 액티베이터는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477 isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27 및 PACAP 1-38 (peptide based)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 히스톤 아세틸전달효소 저해제는 가르시놀 (Garcinol), C646 (4-[(4Z)-4-[[5-(4,5-dimethyl-2-nitrophenyl)furan-2-yl]methylidene]-3-methyl-5-oxopyrazol-1-yl]benzoic acid), MG 149 (2-(4-heptylphenethyl)-6-hydroxybenzoic acid), NU 9056 (1,2-di(isothiazol-5-yl)disulfane) 및 Anacardic acid (2-hydroxy-6-pentadecylbenzoic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 브로모영역 저해제는 (+)- JQ1, ARV825, Bromosporine (ethyl (3-methyl-6-(4-methyl-3-(methylsulfonamido)phenyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-8-yl)carbamate), GW841819X ((R)-benzyl (6-(4-chlorophenyl)-8-methoxy-1-methyl-4H-benzo[f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-4-yl)carbamate), CPI-203 ((S)-2-(4-(4-chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)acetamide), 및 RVX-208 (2-[4-(2-hydroxyethoxy)-3,5-dimethylphenyl]-5,7-dimethoxy-1H-quinazolin-4-one)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 ROCK 저해제는 Y-27632 (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide), Y-33075 (4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide), Y-39983 dihydrochloride (4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide;dihydrochlorid), SR-3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-3-carboxamide) 및 AS1892802 ((S,Z)-N'-(2-hydroxy-1-phenylethyl)-N-(4-(pyridin-4-yl)phenyl)carbamimidic acid)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 BMP4 저해제는 DM3189 (Quinoline, 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-), Dorsomorphin 2HCl (6-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine;dihydrochloride) 및 MP470 (N-(1,3-benzodioxol-5-ylmethyl)-4-([1]benzofuro[3,2-d]pyrimidin-4-yl)piperazine-1-carbothioamide)으로 이루어진는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 신경세포 분화용 배지 조성물. - ⅰ)히스톤 디아세틸라제 저해제 (Histone deacetylase inhibitor),; GSK 저해제 (Glycogen synthease kinase inhibitor),; ALK-5 저해제 (ALK-5 inhibitor),; cAMP 시그널링 액티베이터 (cAMP signaling activator); 및 브로모영역 저해제 (bromodomain inhibitor)를 포함한 신경세포 분화용 배지 조성물 존재하에 체세포를 배양하여 이를 신경세포로 유도하는 단계; 및
ⅱ) 상기 유도된 신경세포를 GSK 저해제, ALK-5 저해제, cAMP 시그널링 액티베이터 및 ROCK 저해제를 포함한 숙성배지에서 숙성하는 단계를 포함한 체세포로부터 신경세포로의 분화방법. - 제15항에 있어서,
ⅰ)단계는 2시간 내지 10일의 범위에서 수행되고, ⅱ)단계는 2 내지 10일의 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법. - 제15항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법. - 제15항에 있어서,
상기 신경세포 분화용 배지 조성물은 ROCK 저해제 (ROCK inhibitor)를 더 포함한 것을 특징으로 하는 체세포로부터 신경세포로의 분화방법. - 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법으로 분화된 신경세포를 포함한 약제학적 조성물.
- 제19항에 있어서,
담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌크화제, 완충제, 전달 비히클, 등장제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2018/002520 WO2018160028A1 (ko) | 2017-03-02 | 2018-03-02 | 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170027285 | 2017-03-02 | ||
| KR20170027285 | 2017-03-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180101228A true KR20180101228A (ko) | 2018-09-12 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180024656A KR20180101228A (ko) | 2017-03-02 | 2018-02-28 | 신경세포 분화용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 체세포로부터 신경세포로의 분화 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20180101228A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020242212A1 (ko) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 성균관대학교산학협력단 | 신규한 유사신경교세포 제조용 칵테일 조성물, 이를 이용하여 제조된 신규한 유사신경교세포, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제 |
| KR20210156550A (ko) | 2020-06-18 | 2021-12-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물 |
| WO2023214791A1 (ko) * | 2022-05-03 | 2023-11-09 | 연세대학교 산학협력단 | 치수-상아질 복합체 재생용 조성물 및 이의 제조방법 |
-
2018
- 2018-02-28 KR KR1020180024656A patent/KR20180101228A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020242212A1 (ko) * | 2019-05-29 | 2020-12-03 | 성균관대학교산학협력단 | 신규한 유사신경교세포 제조용 칵테일 조성물, 이를 이용하여 제조된 신규한 유사신경교세포, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 신경 질환 예방 또는 치료용 세포 치료제 |
| KR20210156550A (ko) | 2020-06-18 | 2021-12-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 프로폴리스를 포함하는 신경세포분화 촉진용 조성물 |
| WO2023214791A1 (ko) * | 2022-05-03 | 2023-11-09 | 연세대학교 산학협력단 | 치수-상아질 복합체 재생용 조성물 및 이의 제조방법 |
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