CN112640887B

CN112640887B - 一种神经干细胞冻存液及其应用

Info

Publication number: CN112640887B
Application number: CN202011563983.1A
Authority: CN
Inventors: 魏君; 蔡萌; 曹培; 周佳; 候梦莹
Original assignee: Wuhan Iregene Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Iregene Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112640887A

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞冻存液及其应用，涉及生物技术领域。本发明的冻存液包括无机盐，维生素，化学小分子抑制剂，细胞因子和DMSO等成份，冻存液成分明确，不含血清或动物源性成分。本发明的干细胞冻存液既不使用动物血清，也不含有动物源成分，该冻存液化学成分明确，能够大大提高细胞复苏后细胞活力。此外，本发明与商品化对照相比，价格低廉，使用方便，大大降低了细胞冻存过程中的死亡率。因此，本发明所述冻存液大大拓展了诱导神经细胞的临床应用前景。

Description

一种神经干细胞冻存液及其应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种神经干细胞冻存液及其应用。

【背景技术】

外胚层是胚胎发育过程中形成的最外层，随着器官发生的开始，外胚层细胞逐渐分化为大脑，脊髓，感觉器官等重要的系统。其中神经系统是负责思维，情感，感知，运动等功能的重要系统。相比于肿瘤等疾病，目前神经系统疾病的药物数量较少，且研发周期漫长，其中最为重要的一个原因为外胚层谱系中多种原代细胞的特殊性，例如原代神经元的不可再生性造成了神经系统药物体外药物筛选平台的稀缺。

除了可以用于药物筛选之外，外胚层细胞的体外再生能治疗多种退行性疾病，例如神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，该疾病的治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。神经退行性疾病和脊髓损伤的研究难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，体外疾病模型的稀缺是基础研究的限制性因素，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。而再生医学的发展为神经退行性领域的发展提供了新的思路。

再生医学是指利用多种新型技术学科来重建老化或功能损失的组织和器官，并通过多种医学手段来进行相关疾病治疗的新兴科学。再生医学的重要研究方向为正常组织特征与功能的机理，创伤后修复的生物学基础，以及组织器官的再生机制及多种干细胞分化机理，从而最终获得有效的生物治疗方法。其研究方法综合了多种手段，包括生命科学、材料科学，临床医学等学科的原理和方法，综合解决用于替代、修复、重建或再生人体各种组织器官的临床解决方案。

2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4,SOX2,KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化神经性的干细胞，这种干细胞被称为诱导神经干细胞(induced pluripotent cells)(Takahashi K,etal.，Cell，2006，126(4)pp.663-676；Takahashi K andYamanaka S，Cell，2007，131(5)pp.861-872)。这些干细胞具有和胚胎干细胞(embryonic stem cells)类似的分化潜能，能够形成人体发育最基本的三个胚层：外胚层，中胚层及内胚层，并最终形成多种成体细胞。这一发明突破了在医学上使用人胚胎干细胞的伦理限制。以神经系统为例，目前在再生医学领域，神经干细胞及神经元的诱导多采取SMAD途径双重抑制法(Dual SMAD inhibition)(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol，2009，27(3):275-80)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFBeta途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。其中LDN-193189和SB431542是广为使用的两种化学小分子抑制剂，分别通过作用于BMP4途径中的ALK2和ALK3，以及TGFBeta途径中的ALK5来达到移植内胚层及中胚层形成，从而起到诱导外胚层发育及神经发生的作用。通过这种方法，可以在血清类成分(Knockout Serum Replacement)的存在下得到诱导的神经细胞(Chambers SM,et.al.,Nat Biotechnol.，2013，30(7):715–720)。这些诱导神经细胞的研究为神经退行性疾病的治疗提供了崭新的思路。

神经系统细胞冻存是再生医学细胞药物保存的主要研究方向之一。为了能够将神经细胞长期保存，应用和长距离运输，应该使用有效的细胞冻存液及冻存方法，并且保持细胞反复复苏后特性不变。冷冻保存可以帮助在任何时候都及时使用细胞，同时降低微生物污染的风险，降低与其他细胞系交叉污染的风险。因此，神经细胞的冻存方法的研究显得尤为重要。细胞和组织的“玻璃化冻存”(vitrification cryopreservation)，可以让细胞及其保护剂溶液以足够快的速率降温，从而让生物材料转化为完全玻璃化状态，并以这种状态实现低温下的长期保存。由于在这一过程中细胞内外避免了结冰，从而避免了细胞损伤。实现“玻璃化”的关键是细胞冻存剂，细胞冻存剂可以减少细胞或者组织在冻存过程中冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。常用的细胞冻存剂包括二甲基亚砜(DMSO)，乙二醇(EG)和丙二醇(PG(Almansoori KA et.al.,Cryobiology.2012Jun；64(3):185-91)。目前，人源神经细胞一般采用DMSO作为冻存剂，DMSO为低分子化合物,相对分子质量小，溶解度大，渗透性强，可使冰点下降，提高胞膜对水的通透性，在降温过程中减少胞内形成冰晶的机会，减少冰晶对细胞的损伤，从而对细胞达到保护作用。高浓度的DMSO有细胞毒性，可以与细胞内蛋白质的疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，造成细胞损伤或者失活；而且在造血干细胞临床经验中，DMSO的残留会引起一定的副作用(Zambelli A et.al.,Anticancer Res1998；18(6B):4705-4708)。10％DMSO是一种对细胞安全的使用浓度，因此，目前人类细胞一般采用90％(胎)牛血清加10％DM SO作为冻存液来进行细胞冻存(Hanna J and Hubel A,Organogenesis,01Jul2009,5(3):134-137)。虽然很多科学家通过多种含有血清成分的培养基来降低血清成分的浓度，但是这种通过大量动物血清来保护细胞活性的方法并不适于再生医学产品的开发，血清成份会携带多种动物源性成分或者病毒，会引起严重的感染和并发症。

因此，如何开发一种无血清，化学成分明确，且能够保证神经干细胞活力的冻存试剂，是拓展神经干细胞的临床使用及应用前景的重要工具。

【发明内容】

本发明要解决的问题是提供一种神经干细胞冻存液及其应用，本发明所述冻存液可以保证神经干细胞活力的前提下，化学成分明确，避免了血清传播动物源性病原体的风险，确保超低温冻存的安全性。

鉴于此，实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种神经干细胞冻存液，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括LY2157299，DMSO以及Y-276322HCl。

具体地，所述添加剂包括：5nmol/L-25μmol/L LY2157299，2.5-10v/v％DMSO以及10nmol/L-10μmol/LY-276322HCl；所述DMSO优选5-10v/v％。

本发明所述冻存液中，所述添加剂还包括无机盐、氨基酸及细胞因子。

其中，所述维生素包括1.2μmol/L维生素B12，64mg/L维生素C；所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6μg/L亚硒酸钠；所述生长因子包括22μg/ml IGF，5μmol/mlOptiferrin，50ng/mL植物源重组人碱性生长因子。

根据本发明的实施例，本发明所述冻存液还包括6.3ng/ml黄体酮，23μg/ml腐胺。

根据本发明的实施例，本发明所述基本培养基为DMEM培养基。

本发明的另一个目的在于，提供上述冻存液在冻存人源诱导神经干细胞中的应用。

本发明还有一个目的在于，提供一种人源诱导神经干细胞的冻存方法，包括如下步骤：将扩增和传代后的诱导神经干细胞悬液离心，去上清，然后与本发明上述神经干细胞冻存液混合，分装，冻存。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明提供一种不使用动物源性成分，化学成分明晰的细胞冻存液，与商品化冻存液相比，不仅大大提高细胞复苏后细胞活力，而且经过长时间冻存后细胞功能完备。

2.本发明提供的冻存液DMSO浓度低，毒副作用小，可靠性强。

3.本发明配置简便，使用方便，大大拓展了神经干细胞的临床应用前景。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO)和商品化冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后的细胞生长状态比较示意图。

图2是本发明NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO)和商品化冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较(LDH检测法)示意图。

图3是本发明NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO、7.5％DMSO、5％DMSO、2.5％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后的细胞生长状态图。

图4为本发明不不同浓度DMSO的NouvNeu-F细胞冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较结果示意图。

图5为本发明不同浓度LY2157299的NouvNeu-F细胞冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较结果示意图。

图6为本发明不同浓度Y-276322HCl的NouvNeu-F细胞冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较结果示意图。

图7为本发明NouvNeu-F细胞冻存液(7.5％DMSO)和商品化冻存液冻存的人源诱导神经干细胞分别在冻存后2周、4周、8周复苏后凋亡率的比较结果示意图。

图8为本发明NouvNeu-F细胞冻存液冻存过的人源神经干细胞复苏后的分化能力示意图。

【具体实施方式】

本发明提供一种神经干细胞液冻存液，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括5nmol/L-25μmol/L LY2157299，2.5-10v/v％DMSO以及10nmol/L-10μm ol/L Y-276322HCl。

根据本发明的一个实施例，所述DMSO优选为5-10v/v％。

本发明提供的神经干细胞冻存液，根据需要，所述添加剂还包括维生素、无机盐及细胞因子。

根据本发明的一个实施例，所述维生素包括1.2μmol/L维生素B12，64mg/L维生素C。根据本领域常识，所述维生素还可以选择其他常用的维生素，如维生素B6、维生素B2等。

根据本发明的一个实施例，所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6μg/L亚硒酸钠。根据本领域常识，还可以选择其他常用的无机盐。

根据本发明的一个实施例，所述细胞因子包括22μg/ml IGF，50ng/mL植物源重组人碱性生长因子，5μmol/L Optiferrin。根据本领域常识，还可以选择其他常用的细胞因子。

本发明所述冻存液还包括6.3ng/ml黄体酮，23μg/ml腐胺。

根据本发明的一个实施例，所述基本培养基为DMEM培养基。

特别地，在冻存液的另一件申请中，多能干细胞冻存液中的TGF，不能用到神经干保存液中；同样，本发明神经干细胞冻存液含有LY2751299，也不能够用作多能干细胞保存液，否则会出现分化，影响保存质量。

以下实例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1人源诱导神经干细胞液冻存液NouvNeu-F的配制

按照如下配方配置NouvNeu-F细胞冻存液，以下简称NouvNeu-F：

杜氏改良伊格尔培养基(DMEM培养基)，维生素B12(1.2μmol/L)，维生素C(L-ascorbic acid，64mg/L)，黄体酮(Progesterone，6.3ng/ml)，腐胺(Putrescine，23μg/ml)，氯化钠(Sodium Chloride，0.5g/L)，亚硒酸钠(13.6μg/L)，IGF(22μg/ml)，Optiferrin(5μmol/L)，植物源重组人碱性生长因子(OsrbFGF，50ng/mL)，LY2157299(5nmol/L-25μmol/L)，2.5-10v/v％DMSO，Y-276322HCl(10nmol/L-10μmol/L)。

对照试验使用

DMSO Free GMP grade(ZENOAQ)冻存液，以下简称CELLBANKER；

GMP级细胞冻存液(友康)冻存液，以下简称友康；

CS2(STEMCELL)冻存液，以下简称CS2；

CS10(STEMCELL)冻存液，以下简称CS10R。

实施例2人源诱导神经干细胞的冻存

人源诱导神经干细胞使用Poly-L-ornithine(Sigma)包被T25细胞培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3个小时以上，然后使用Laminin-521(STEMCELL Technologies)包被第二层，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3个小时以上。按照1x10⁷/瓶的细胞数接种于T25培养瓶中进行扩增和传代。使用杜氏改良伊格尔培养基(DMEM培养基)及2％GS21(Sigma，G0800)，于37℃、5％的CO₂中进行培养。当细胞生长达到70％的覆盖率时，使用0.05％trypsin/EDTA，在37℃孵育5min进行消化，消化后的细胞离心洗涤后按照1×10⁷/毫升的密度重悬于NouvNeu-F细胞冻存液中，然后将细胞放入程序降温冻存盒中，并置于-80℃冰箱24小时，之后转入液氮长期保存。对照试验采取同一批细胞进行，细胞使用CELLBANKER、友康、CS2、CS10及其它测试体系冻存。

实施例3人源诱导神经干细胞的复苏

人源诱导神经干细胞使用Poly-L-ornithine(Sigma)包被T25细胞培养瓶，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3个小时以上，然后使用Laminin-521(STEMCELL Technologies)包被第二层，铺板后置于37℃恒温箱中孵育3个小时以上。将使用本发明NouvNeu-F冻存液和对照组(CELLBANKER、友康、CS2、CS10)冻存液冻存的细胞在37℃水浴快速解冻，解冻后细胞用DMEM培养基洗涤去除DMSO，消化后的细胞离心洗涤后按照1×10⁷/10毫升的密度接种于T25细胞培养板，于37℃、5％的CO₂细胞培养箱中进行培养。

实施例4人源诱导神经干细胞复苏后活力检测

4.1不同冻存液之间短期复苏的活力差异

将在液氮罐中保存一个星期的细胞按照实施例3的步骤进行复苏，并于复苏后第1天收集上清液，第3天收集人源诱导神经干细胞培养液和细胞。细胞的活率的检测通过乳酸脱氢酶(LDH)实验进行(碧云天)。通过检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)释放的浓度与贴壁细胞总的LDH浓度，计算细胞凋亡率的公式为：上清液LDH浓度/(上清液LDH浓度+贴壁细胞LDH浓度)×100％。检测结果如图1-图4所示。

其中，图1a、图1b分别显示CELLBANKER冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第3天的细胞形态图；图1c、图1d分别显示CS2冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第3天的细胞形态图；图1e、图1f分别显示CS10冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第3天的细胞形态图；图1g、图1h分别显示友康冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第3天的细胞形态图；图1i、图1j分别显示NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第3天的细胞形态图。

图2显示NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO)和商品化冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较(LDH检测法)。

图3显示NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO、7.5％DMSO、5％DMSO、2.5％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后的细胞生长状态图；其中，图3a、图3b、图3c分别显示NouvNeu-F细胞冻存液(10％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第2天、第3天的细胞形态图；图3d、图3e、图3f分别显示NouvNeu-F细胞冻存液(7.5％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第2天、第3天的细胞形态图；图3g、图3h、图3i分别显示NouvNeu-F细胞冻存液(5％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第2天、第3天的细胞形态图；图3j、图3k、图3l分别显示NouvNeu-F细胞冻存液(2.5％DMSO)冻存的人源诱导神经干细胞复苏后第1天、第2天、第3天的细胞形态图。

图4显示不同浓度DMSO的NouvNeu-F细胞冻存液冻存的人源诱导神经干细胞复苏后凋亡率的比较(LDH检测法)。

以上结果表明，NouvNeu-F复苏后的细胞凋亡低于商品化冻存液，NouvNeu-F中DMSO浓度最佳范围为5％-10％，在此范围内，细胞复苏后的凋亡率小于10％。

4.2不同浓度成分对复苏后活力的影响

用不同浓度LY2157299的NouvNeu-F冻存液冻存细胞，按照实施例3中的方法复苏后，使用Cyquant试验来进行细胞活力定量检测，从而比较不同浓度的Optiferrin的冻存液在此过程中对细胞活力的影响。包被96孔不透光细胞培养板，包被完成后将细胞按照5×10⁴每孔的细胞数量分别接种，并设置三组平行重复(三组的平均值作为数据进行计算)。在复苏24小时后取样，细胞活力检测使用CyQuant Kit(Invitrogen，X12223)进行，按照使用说明书操作，使用SpectraMax i3Multi-Mode Microplate Reader(VWR，型号ID3-STD)进行数据读取。结果如图5所示，细胞复苏后的活力与LY2157299浓度呈正相关，但在高浓度下细胞有聚团分化现象出现。其中，图5a-5d显示不同浓度LY2157299对复苏后细胞形态的影响；图5e显示细胞复苏后的活率比较(Cyquant法)。

用不同浓度Y-276322HCl的NouvNeu-F冻存液冻存细胞，并按照上述方法用Cyquant试验进行细胞活力定量检测。结果如图6所示，其中，图6a-6d显示不同浓度Y-276322HCl对复苏后细胞形态的影响；图6e显示细胞复苏后的活率比较(Cyquant法)。结果显示，细胞复苏后的活力与Y-276322HCl浓度呈正相关。

4.3不同冻存冻存液之间长期冻存的活力比较

参照实施例3及实施例4.1，依次在冻存后2周、4周、2月后进行细胞复苏，并收集样本并进行复苏后细胞活率检测。检测结果如图7所示。结果表明，使用NouvNeu-F的人源诱导神经干细胞在不同时间段(2周、4周、2月)复苏后的细胞凋亡率差异不显著，且对细胞活率的影响较小；同时，NouvNeu-F系列比商品化冻存液产生的细胞凋亡率要小。

实施例5人源诱导神经干细胞复苏后分化能力检测

5.1 DRG神经元分化

人诱导DRG神经元使用将实施例3中复苏的神经干细胞，在NouvNeu基础培养基中加入3uM CHIR99021(Selleck，货号：S2924)，10uM SU5402(Tocris，货号：3300/1)，10uMDAPT(Selleck，货号：S2215)，每隔3天更换新鲜培养基，直至第21天。培养条件为37℃，5％的CO₂(Panasonic，MCO-18AC)。

5.2星状胶质细胞分化

人诱导星状胶质细胞使用实施例3中复苏的神经干细胞，在NouvNeu基础培养基中加入10ng/mL PDGFAA(R&D Systems)，20ng/mL fibroblast growth factor 2(禾元生物)，20ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor，Peprotech)，Human LIF(10ng/mL,Alomone Labs)，10％胎牛血清(洁特生物)，每隔3天更换新鲜培养基，直至第21天。培养条件为37℃，5％的CO₂(Panasonic，MCO-18AC)。

5.3分化神经元的荧光免疫鉴定

取诱导完成后的，分别取每组对照两种材料进行免疫荧光染色鉴定：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1％Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后依次加入用含2％马血清和0.1％Triton X-100的DPBS缓冲液稀释的一抗和二抗，每次都于37℃孵育2小时，最后用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。抗体使用细节如表1所示。结果如图8所示，图8a显示诱导得到的DRG神经元，表达DRG神经元特异标志物TRPC6和神经细胞标志物Nestin；图8b表示诱导得到的星状胶质细胞，形态呈扁平星状，表达星状胶质细胞标志物GFAP。

表1：定向分化免疫荧光染色所用抗体

需要说明的是，上述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，并不以任何形式限制本发明，凡根据本发明的技术方案等同替换或改变获得的技术方案，均涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种神经干细胞冻存液，其特征在于，包括基本培养基和添加剂，所述添加剂包括5nmol/L-25μmol/L LY2157299，2.5-10v/v% DMSO以及10nmol/L-10μmol/L Y-27632 2HCl。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO为5-10v/v%。

3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述添加剂还包括无机盐、维生素及细胞因子。

4.根据权利要求3所述的冻存液，其特征在于，所述维生素包括1.2μmol/L 维生素B12，64mg/L维生素C。

5.根据权利要求3所述的冻存液，其特征在于，所述无机盐包括0.5g/L氯化钠，13.6μg/L亚硒酸钠。

6.根据权利要求3所述的冻存液，其特征在于，所述细胞因子包括22μg/ml IGF，5μmol/ml Optiferrin ，50ng/mL植物源重组人碱性生长因子。

7.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，还包括6.3ng/ml黄体酮，23μg/ml腐胺。

8.权利要求1所述的冻存液在冻存人源诱导神经干细胞中的应用。

9.一种人源诱导神经干细胞的冻存方法，包括如下步骤：将扩增和传代后的诱导神经干细胞悬液离心，去上清，然后与权利要求1～7任意一项所述的神经干细胞冻存液混合，分装，冻存。