CN117529550A - 心肌细胞和组合物以及用于生产它们的方法 - Google Patents

心肌细胞和组合物以及用于生产它们的方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于产生成熟心肌细胞的方法和包含成熟心肌细胞的组合物。本文还公开了用于增强静止心肌细胞成熟的方法和包含成熟静止心肌细胞的组合物。

Description

心肌细胞和组合物以及用于生产它们的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月11日提交的美国临时申请第63/173,489号的权益。上述申请的全部教导内容以引用方式并入本文。
背景技术
由人诱导型多能干细胞(iPSC)生产心肌细胞的当前分化方案能够产生如通过心肌肌钙蛋白T的表达确定的高纯心肌细胞群体。然而，这些心肌细胞仍然不成熟，更接近类似于胎儿状态，与成人心肌细胞相比，最大收缩力较低、上行速度较慢并且线粒体功能不成熟。iPSC衍生心肌细胞的不成熟可能是心肌细胞细胞疗法临床转化用于心脏疾病的重大障碍，因为不成熟的心肌细胞展示出自律性或起搏器样活动，这导致当被递送至成体动物模型时可能出现危及生命的室性心律失常，以及具有组织性较差的肌节结构，从而无法产生足够的收缩力。在发育过程中，心肌细胞经历从胎儿时期的增殖状态向出生后更加成熟但静止的状态的转变。需要导致心肌细胞进入静止状态并且由此增强分化期间的心肌细胞成熟的改进方法。
发明内容
对用于产生用于细胞疗法和筛查等用途的成熟心肌细胞的方法或方案存在需求。在一些实施例中，通过使心肌细胞进入静止状态，可以增强心肌细胞的成熟。
本文公开了从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法。该方法包括使不成熟心肌细胞与至少一种心肌细胞成熟因子在培养中，例如在二维或三维培养(诸如脉冲培养或稳态培养)中接触。
本文还公开了诱导心肌细胞静止的方法。该方法包括使衰老心肌细胞与心肌细胞成熟因子在培养中(例如，二维或三维培养，诸如脉冲或稳态培养)中接触，从而诱导衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。
在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括p53上调剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括mTOR抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括p53上调剂和/或mTOR抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括衰老清除剂(senolytic)、MDM2抑制剂和/或mTOR抑制剂。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由衰老清除剂、MDM2抑制剂、mTOR抑制剂以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素、Torin1以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a和/或槲皮素。在一些实施方案中，该至少一种心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a、槲皮素和/或Torin1。在一些实施方案中，经由脉冲处理或经由连续处理使该至少一种心肌细胞成熟因子与不成熟心肌细胞接触。
在一些实施方案中，不成熟心肌细胞衍生自iPS细胞、ES细胞、T细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，不成熟心肌细胞类似于胎儿心肌细胞。
在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始跳动后，使该不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始跳动后，使该不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触1至3天。
在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出REST和/或GATA4的表达增加。
在一些实施方案中，成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出博动率降低。在一些实施方案中，成熟心肌细胞表现出≤-70mV的静息膜电位、<40次/分的自发博动率和/或>200伏/秒的上行速度。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是电、收缩性和/或代谢成熟的心肌细胞。
本文还公开了通过本文公开的方法中的任何方法生产的非天然存在的心肌细胞。
在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。在一些实施方案中，该一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞表现出TNNT2、TNNI3、KCNJ2和p53中的一者或多者的表达增加。
在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出博动率降低。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞表现出≤-70mV的静息膜电位、<40次/分的自发博动率和/或>200伏/秒的上行速度。在一些实施方案中，非天然存在的心肌细胞是电、收缩性和/或代谢成熟心肌细胞。
本文公开了治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用包含本文所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。本文还公开了治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用使用一种或多种本文所述的非天然存在的心肌细胞的经分离群体生产的药物组合物。本文还公开了组合物在制造用于治疗心脏疾患的药物中的用途，其中该治疗包括向有需要的受试者施用该药物，其中该组合物包含至少一种本文所述的非天然存在的心肌细胞。
在一些实施方案中，受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏疾病或其他心脏疾病或者处于患上这些疾病的风险中。
本文还公开了从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法。这些方法包括使不成熟心肌细胞与至少一种选自由nutlin-3a、槲皮素、Torin1以及它们的组合组成的组的心肌细胞成熟因子接触。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是在三维培养中生产的。在一些实施方案中，成熟心肌细胞是在二维培养中生产的。在一些实施方案中，经由脉冲处理使不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，经由连续处理使不成熟心肌细胞与该至少一种心肌细胞成熟因子接触。
除非另外指示，否则本发明的实施将通常采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学以及RNA干扰(RNAi)的在本领域的技能的范围内的常规技术。这些技术中的某些的非限制性描述见于以下出版物中：Ausubel,F.等人(编),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocolsin Immunology,Current Protocols in Protein Science,以及Current Protocols inCell Biology,全都由John Wiley&Sons,N.Y.出版,版本截至2008年12月；Sambrook,Russell和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies–A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,1988；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells,A Manual of BasicTechnique”,第5版,John Wiley&Sons,Hoboken,NJ,2005。关于治疗剂和人疾病的非限制性信息见于Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版,McGraw Hill,2005，Katzung,B.(编)Basic and Clinical Pharmacology,McGraw-Hill/Appleton&Lange；第10版(2006)或第11版(2009年7月)中。关于基因和遗传病症的非限制性信息见于McKusick,V.A.:Mendelian Inheritance in Man.A Catalog of HumanGenes and Genetic Disorders.Baltimore:Johns Hopkins University Press,1998(第12版)或更新近在线数据库：Online Mendelian Inheritance in Man,OMIMTM.McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,MD)和National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,MD),截至2010年5月1日，万维网URL：ncbi.nlm.nih.gov/omim/中，以及作为动物物种(除人和小鼠以外)中的基因、遗传病症和性状的数据库的在omia.angis.org.au/contact.shtml处的Online Mendelian Inheritance in Animals(OMIA)中。本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物(例如科学文章、书籍、网站和数据库)都通过引用以它们的整体并入本文。在说明书与任何并入参考文献之间起冲突的情况下，应以说明书(包括其任何修正，该修正可基于并入的参考文献)为准。除非另外指示，否则在本文中使用术语的标准本领域接受含义。在本文中使用各种术语的标准缩写。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一个以彩色制作的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1提供在悬浮培养中制造电成熟的iPSC-CM的方案示意图。
图2A至图2H显示nutlin-3a增加了TNNT2+iPSC-CM的百分比(图2A)、TNNT2的平均荧光强度(MFI)(图2B)、TNNI3+的百分比(图2C)、TNNI3的平均荧光强度(图2D)、表达Kir2.1的TNNT2+iPSC-CM的百分比(图2E)、Kir2.1的平均荧光强度(MFI)(图2F)、p53+TNNT2+iPSC-CM的百分比(图2G)以及通过流式细胞术测定的TNNI3和p53的平均荧光强度(图2F)。
图3A至图3D显示槲皮素提高了表达Kir2.1的TNNT2+iPSC-CM的百分比(图3A)、Kir2.1的平均荧光强度(MFI)(图3B)、p53+TNNT2+iPSC-CM的百分比(图3C)以及流式细胞术测定的p53的MFI(图3D)。
图4A至图4B显示槲皮素降低了活细胞的百分比，但增加了心肌细胞的百分比。图4A示出活细胞的百分比。图4B示出TNNT2+细胞占活细胞的百分比。通过流式细胞术定量。根据单因素方差分析，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图5显示槲皮素增加了PPARGC1a的表达。根据Kruskal-Wallis检验，****p<0.0001。
图6A至图6E显示用nutlin-3a对p53的上调增强了TNNI3表达，并与Torin1具有协同作用。图6A提供了示意图，其示出了心肌细胞成熟的拟定机制。T3，三碘甲状腺原氨酸。图6B示出细胞周期分析，其示出了在搏动开始后约2天开始用媒介物(DMSO)、nutlin-3a(10μmol/L)处理24小时后，用Torin1(200nmol/L)处理7天或用nutlin-3a(10μmol/L，用于在Torin1处理的前24小时)和Torin1(200nmol/L)同时处理7天后G0、G1或S/G2/M期中TNNT2+BJRiPS-CM的百分比。每组n＝3，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。图6C提供了来自在搏动开始后约2天开始用对照(DMSO)、Nutlin-3a处理～24小时(10μmol/L)，用Torin1处理/>～7天(200nmol/L)，或用Torin1处理/>～7天(200nmol/L)+nutlin-3a(10μmol/L)处理24小时(nutlin-3a仅在Torin1处理的前24小时期间施用)的BJRiPS衍生的心肌细胞裂解物的MDM2、p53、TNNI3和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹。治疗最后一天收获细胞，BJRiPS-CM。图6D示出通过蛋白质印迹分析的p53条带的光密度测定，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，**P<0.01，每种条件n＝3。图6E示出通过蛋白质印迹分析的TNNI3条带的光密度测定，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*P<0.05，**P<0.01，每种条件n＝3，BJRIPS-CM。DMSO表示二甲基亚砜；mTOR表示雷帕霉素的机制靶点；并且TNNT2+BJRiPS-CM表示肌钙蛋白T2、心脏型阳性BJ成纤维细胞衍生的RNA诱导型多能干细胞衍生的心肌细胞。
图7A至图7B显示Torin1±Nutlin-3a增加了TNNT2表达(图7A)并增加了2D培养中线粒体膜极化(图7B)。这表明心肌细胞中的线粒体更成熟。FACS N＝3/组，MitoTrackerRed CMXRos流式细胞术，单因素ANOVA及Tukey多重比较检验。
图8示出2D培养中的Nutlin-3a处理增加了超氧化物信号的平均荧光强度。活性氧类物质可调控心肌细胞成熟。FACS，n＝3/组。
图9A至图9B显示Torin1+Nutlin-3a处理提高了在3D悬浮培养中分化的iPSC心肌细胞中TNNT2的纯度(图9A)和TNNT2的表达(图9B)。从心肌细胞分化的第10天开始，在3D悬浮培养中每24小时对细胞脉冲处理1小时，持续2天。数据来自流式细胞仪，每组n＝3。
图10A至图10I显示Torin1处理提高了诱导型多能干细胞(iPSC)衍生的心肌细胞(CM)的细胞静止。图10A提供分化方案的示意图，除另有说明外，否则Torin1处理从搏动开始后约2天开始进行7天。图10B提供基线和用Torin1(200nM)单次处理iPSC衍生的CM(BJRiPS-CM)后30分钟和2小时、4小时、10小时、24小时和48小时时磷酸化-S6和磷酸化-Akt的蛋白质印迹分析。图10C示出分化过程中12孔板每孔的细胞计数。Torin1处理开始于第9天，大约在CM搏动开始后2天，BJRiPS-CM，每个时间点每组n＝3。图10D示出通过流式细胞术测定的TNNT2+CM占活细胞群的百分比，Gibco iPS-CM，每种条件n＝3，根据单因素方差分析，无显著性(n.s.)。图10E示出在搏动开始后约2天开始用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后iPSC衍生的心肌细胞中的选定的静止标志物(TP53、RB1、RBL2(p130)、CDKN1a(p21)、CDKN1b(p27)、CDKN2a(p16)和HES1)和增殖标志物(MKI67、CCNA1、CCNB1、CCNC1、CCND1、CDK3和E2F1)的qPCR。每种条件n＝3，通过多重t检验及Holm-Sidak方法与每种基因的对照比较，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS-CM。图10F提供对照、经10nM Torin1处理的细胞或经200nM Torin1处理的细胞(Gibco iPS-CM)的经用于区分G0、G1和S/G2/M期的Hoechst33342和Pyronin Y染色的iPSC衍生的CM的代表性流式细胞术图。
图10G示出在搏动开始后约2天开始用Torin1处理(200nM)1周后G0、G1或S/G2/M期中TNNT2+心肌细胞的百分比。每种条件n＝3，通过双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，***p<0.001，****p<0.0001，Gibco iPS-CM。图10H示出在搏动开始后约2天开始用0.02％ DMSO处理1周，随后用10％ FBS或无血清对照处理后的对照CM中的G0、G1或S/G2/M期的TNNT2+CM的百分比。每组n＝3，通过双因素ANOVA及Sidak多重比较检验，**p<0.01，Gibco iPSC-CM。图10I示出在搏动开始后约2天开始用Torin1处理(200nM)1周，随后用10％ FBS或无血清对照处理后G0、G1或S/G2/M期的TNNT2+CM的百分比。n＝3/组，根据双因素ANOVA及Sidak多重比较检验，**p<0.01，Gibco iPSC-CM。DMSO，二甲基亚砜；IWP-4，Wnt产生抑制剂4；RI，ROCK(Rho关联的含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated,coiled coil containing proteinkinase))抑制剂(Y-27632)；RPMI，Roswell Park Memorial Institute1640培养基。
图11A至图11I显示Torin1处理增加了肌节基因表达并增强了iPSC衍生的心肌细胞的收缩性。图11A提供在搏动开始后约2天开始用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后选定的肌节基因(MYH6、MYH7、TNNT2、TNNI3)iPSC衍生的心肌细胞的qPCR。每种条件n＝3，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS-CM。图11B提供在搏动开始后约2天开始用Torin1处理7天后TNNT2和TNNI3的代表性蛋白质印迹分析，β-微管蛋白被描绘为负载对照，Gibco iPS-CM。图11C示出TNNT2+细胞的TNNT2-Alexa Fluor 647的平均荧光强度。每种条件n＝3，根据单因素ANOVA及Tukey多重比较检验，**p<0.01，****p<0.0001，Gibco iPS-CM。图11D提供舒张期和收缩期中MTF的代表性图像，以及舒张期和收缩期中侧视图上MTF的示意图。图11E提供在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物处理7天的接种有iPSC衍生的心肌细胞的肌肉薄膜(MTF)的代表性力与时间关系图，BJRiPS-CM。图11F示出使用肌肉薄膜定量的相对最大心脏收缩力(针对对照作归一化)。每组n＝8-9，根据由3个批次BJRiPS-CM(2批)和Gibco iPS-CM(1批)组合的Kruskal-Wallis检验，**p<0.01。图11G提供代表性的免疫染色图像，其示出了用Torin1处理(200nM×7天)或不用Torin1处理的心肌细胞，蓝色＝DAPI，绿色＝α-辅肌动蛋白，黄色＝F-肌动蛋白，洋红色＝TNNT2，BJRiPS-CM，比例尺＝10μm。图11H示出对照(n＝13个细胞)和经Torin1处理的(n＝17个细胞)BJRiPS-CM的肌节长度，根据非配对t检验，无显著性。图11I示出用DMSO处理7天(对照)、用DMSO处理7天并随后用10％胎牛血清(FBS)处理2天、用Torin1(200nM)处理7天，或用Torin1(200nM)处理7天并随后用10％ FBS处理2天后TNNT2+细胞的TNNT2-Alexa Fluor 647的平均荧光强度。每种条件n＝3，根据单因素ANOVA及Sidak多重比较检验，*p<0.01，**p<0.0001，UCSD-CM。DMSO，二甲基亚砜；TBP，TATA结合蛋白。
图12A至图12F显示Torin1提高了iPSC衍生的心肌细胞的耗氧率和线粒体极化。图12A提供如通过海马线粒体应激试验评估的针对基线作归一化的平均氧消耗率与时间的关系曲线。空心圆＝对照(n＝70孔)，实心方形＝Torin1(69孔，200nM×7天；测定前24-48小时将BJRiPS-CM重新涂铺到海马板中)，数据来自组合的两个独立实验。图12B示出最大OCR、呼吸储备容量(respiratory reserve capacity)和非线粒体OCR的针对对照基线作归一化的耗氧率(空心柱，n＝70孔)对比实心柱(空心柱，n＝69孔)，*p＜0.05，根据双因素ANOVA及Sidak多重比较检验，***p＜0.001，BJRiPS-CM。图12C示出在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的Mitotracker GreenFM平均荧光强度。根据非配对t检验，*p<0.05，每组n＝3，BJRiPS细胞系。图12D示出在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的线粒体(ND1)与核(B2M)DNA的比率。根据非配对t检验，*p<0.05，每组n＝3，BJRiPS细胞系。图12E示出在搏动开始后约2天开始用Torin1(200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后BJRiPS-CM的MitoProbe JC-1红绿荧光相对比率，测定是在Torin1处理的最后一天运行的。每组n＝6，根据Kruskal-Wallis检验，**p<0.01。图12F提供在搏动开始后约2天开始用Torin1(10nM、50nM或200nM)或媒介物对照(0.02％ DMSO)处理7天后与BJRiPS-CM的脂肪酸代谢(PPARGC1a(PGC1α)、CD36、SLC27A1(FATP1)、SLC27A6(FATP6)和LPIN1)或葡萄糖代谢(GLUT1、GLUT4、PFK和PYGM)相关的选定基因的qPCR。根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，每组n＝3。DMSO，二甲基亚砜；FCCP，2-[2-[4-(三氟甲氧基)苯基]亚肼]-丙二腈。
图13A至图13J显示Torin1处理增加了选定离子通道的表达并增加了动作电位曲线的峰值上升时间和下行速度。图13A提供在搏动开始后约2天开始用Torin1(10nM或200nM)或媒介物对照(0.02％DMSO)处理7天后iPSC衍生的心肌细胞的选定离子通道(KCNJ2、CACNA1c、RY2、ATP2a2、SCN5a、HCN4)的qPCR。每组n＝3，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*p<0.05，****p<0.001，BJRiPS细胞系。图13B提供在搏动开始后约2天开始Torin1处理7天后Kir2.1(由KCNJ2编码)的平均荧光强度的流式细胞术分析。每组n＝3，根据非配对t检验，*p<0.01，BJRiPS细胞系。图13C示出用Torin1处理或未用Torin1处理的心肌细胞的自发博动率，每个条件n＝6-10孔，根据单因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*p<0.05，***p<0.001。图13D提供代表性图像，其示出了由CyteSeer软件自动执行的细胞分割。蓝色＝Hoechst染色，绿色＝FluoVolt。图13E示出代表性的动作电位曲线，其描绘了经Torin1处理的心肌细胞与对照相比具有更加持久的平台期。CTD25(钙瞬变的25％持续时间，或从最大振幅下降25％时的持续时间)、CTD75(钙瞬变的75％持续时间，或从最大振幅下降75％时的持续时间)、T75-25(电压从最大值的75％衰减到25％的时间)。图13F示出峰值上升时间点(毫秒)，****p<0.0001，UCSD-CM。图13G示出下行速度(毫秒)，****p<0.0001，UCSD-CM。图13H示出CTD25时间(毫秒)，n.s.，UCSD-CM。图13I示出CTD75时间(毫秒)，*p<0.05，UCSD-CM。图13J示出T75-25时间(毫秒)，***p<0.001，UCSD-CM。对于Fluovolt数据，对照组n＝531个细胞，Torin1组n＝315个细胞，通过非配对t检验分析。
图14A至图14D显示Torin1增加了p53表达，并且pifithrin-α抑制了影响。图14A提供在搏动开始后约2天开始用0(DMSO)，10nM、50nM或200nM Torin1处理7天的Gibco iPS-CM裂解物中p53、磷酸化-53、p21(CDKN1a)、GATA4、NKX2.5和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹图。治疗最后一天收获细胞。图14B提供细胞周期分析，其示出了在搏动开始后约2天开始用媒介物(DMSO，二甲基亚砜)、pifithrin-α(10μM)处理1周，用Torin1(200nM)处理7天或用pifithrin-α(10μM)和Torin1(200nM)同时处理7天后G0、G1或S/G2/M期的TNNT2+BJRiPS-CM的百分比。每组n＝3，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图14C提供在搏动开始后约2天开始用对照(DMSO)、Torin1(200nM)、pifithrin-α(10μM)或Torin1(200nM)+pifithrin-α(10μM)处理7天的BJRiPS衍生的心肌细胞裂解物的p53、TNNI3、p21和β-微管蛋白的代表性蛋白质印迹。治疗最后一天收获细胞。图14D示出通过蛋白质印迹分析测定的TNNI3条带的光密度测定，n＝3/组，根据双因素ANOVA及Tukey多重比较检验，**p<0.01，BJRiPS-CM。
图15A至图15H显示来自PanCancer Pathways Panel的NanoString基因表达分析，其比较了用Torin1处理或不用Torin1处理并随后用10％胎牛血清(FBS)处理或不用FBS处理的细胞，Gibco iPS-CM。图15A示出细胞周期途径基因的无监督分层聚类。图15B示出蛋白质代谢途径基因的无监督分层聚类。图15C至图15E提供火山图，其示出了细胞周期途径基因的差异基因表达分析(图15C，对照+FBS对比对照；图15D，对照对比Torin1；图15E，Torin1+FBS对比Torin1)。图15F至图15H提供火山图，其示出了蛋白质代谢途径基因的差异基因表达分析(图15F，对照+FBS对比对照；图15G，对照对比Torin1；图15H，Torin1+FBS对比Torin1)。QC，质量控制。
图16A至图16C提供对未经解离的细胞的增殖的评估。使心肌细胞在12孔板中分化，然后将其在原板中固定和染色，以最大程度地减少选择解离后存活的细胞的可能性。图16A提供用Ki67/TNNT2/DAPI或磷酸化-H3/TNNT2/DAPI染色的细胞的代表性图像。比例尺＝100μm。蓝色＝DAPI，黄色＝Ki67，绿色＝pH3，洋红色＝TNNT2。图16B提供饼图，其描绘了与经Torin1处理的细胞(n＝837个细胞)相比对照(n＝1088个细胞)中为Ki67+或Ki67-的DAPI/TNNT+心肌细胞总数的百分比。*根据卡方分析，****P<0.0001。图16C提供饼图，其描绘了与经Torin1处理的细胞(n＝779个细胞)相比对照(n＝962个细胞)中为pH3+或pH3-的DAPI/TNNT+心肌细胞总数的百分比。DMSO，二甲基亚砜。
图17A至图17I提供与可商购获得的人胎儿和成人心脏RNA的基准样本相比选定基因的qPCR分析(图17A，TNNT2；图17B，TNNI3；图17C，PPARGC1a；图17D，RYR2；图17E，KCNJ2；图17F，CACNA1c；图17G，TP53；图17H，CDKN1a(p21)；图17I，GATA4)。每组N＝6-12，数据来自2-4个独立实验的组合。根据Kruskal-Wallis检验，*p<0.05，**p<0.01，BJRiPS-CM。竖线表示胎儿和成人心脏RNA因缺乏生物重复而未纳入统计分析(两者均来自从商业供应商处购买的单管)。由于缺乏生物重复，胎儿和成人心脏RNA的误差条未示出。DMSO，二甲基亚砜；TBP，TATA结合蛋白。
图18A至图18B提供对Torin1处理不同时间段的评估。图18A示出来自分化8-11天、8-15天、9-11天、9-16天、11-14天或11-18天的用对照(DMSO媒介物)或200nM Torin1处理后的TNNT2-AlexaFluor647的平均荧光强度。每组n＝3，通过单因素ANOVA及Dunnett多重比较检验与对照比较，*p<0.05。图18B示出来自分化8-11天、8-15天、9-11天、9-16天、11-14天或11-18天的用对照(媒介物DMSO)或200nM Torin1处理后的Kir2.1(胞外)的平均荧光强度。每组n＝3，根据单因素ANOVA及Dunnett多重比较检验与对照比较，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
具体实施方式
由人诱导型多能干细胞(iPSC)生产心肌细胞的当前分化方案能够产生如通过心肌肌钙蛋白T的表达确定的高纯心肌细胞群体。然而，这些心肌细胞仍然不成熟，更接近类似于胎儿状态，与成人心肌细胞相比，最大收缩力较低、上行速度较慢并且线粒体功能不成熟。iPSC衍生的心肌细胞的不成熟可能是用于心脏病的心肌细胞疗法的临床转化的重要障碍。在发育过程中，心肌细胞经历从胎儿时期的增殖状态向出生后更加成熟但静止的状态的转变。雷帕霉素机制性靶标(mTOR)信号传导途径在营养素感应和生长中起关键作用。
使用小分子调节Wnt途径使心肌细胞从iPSC细胞系分化。在一些实施方案中，在各种时间点使用p53上调剂，并对成熟的iPSC衍生的心肌细胞的收缩性、代谢和电生理性质进行定量。在一些实施方案中，在各种时间点使用mTOR途径抑制剂。在一些实施方案中，使用小分子抑制剂来抑制p53信号传导。在一些实施方案中，心肌细胞在二维或三维培养基中分化和/或成熟。
本公开的方面涉及用于由至少一种干细胞产生心肌细胞(本文称为非天然存在的心肌细胞、非原生心肌细胞、静止心肌细胞或成熟心肌细胞)的组合物、方法、药盒和剂，以及用于细胞疗法、测定和各种治疗方法中的由那些组合物、方法、药盒和剂产生的成熟或静止心肌细胞。
根据本文所述的方法产生的体外生产的心肌细胞展示出许多优点；例如，它们是电成熟(例如，表现出降低的自律性)、收缩性成熟和代谢成熟的。此外，所产生的心肌细胞可为细胞疗法(例如，移植到需要额外和/或功能性心肌细胞的受试者中)和研究提供新的平台。
定义
为了方便起见，在此集中了本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，术语“体细胞”是指形成生物体的身体的任何细胞，与种系细胞相反。在哺乳动物中，种系细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合从而产生称为合子的细胞，整个哺乳动物胚胎是由合子发育的。哺乳动物体内的所有其他细胞类型——除了精子和卵子、制造它们的细胞(配子体)和未分化的干细胞——都是体细胞类型：内脏器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织都由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎性体细胞”，其意指不存在于胚胎中或不从胚胎获得并且不是由此种细胞在体外的增殖产生的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成体体细胞”，其意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或者从除胚胎或胎儿以外的生物体获得或者由此种细胞在体外的增殖产生的细胞。
如本文所用，术语“成体细胞”是指胚胎发育后在全身发现的细胞。
术语“祖细胞”或“前体细胞”在本文中可互换使用，并且是指这样的细胞，该细胞相对于它可通过分化所产生的细胞，具有更原始的细胞表型(即，与完全分化的细胞相比，处于发育途径或进展中的较早的步骤)。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜力。祖细胞可产生多种不同的分化细胞类型或单一分化细胞类型，这取决于发育途径和细胞发育并分化的环境。
术语“表型”是指在一组特定的环境条件和因素下定义细胞或生物体的一种或许多种总生物学特征，而与实际基因型无关。
如本文所用的术语“多能”是指具有分化为多于一种经分化细胞类型并且优选分化为作为所有三个生殖细胞层的特征的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于它们能够分化成多于一种细胞类型，优选分化成所有三个胚层，例如使用裸小鼠畸胎瘤形成测定。胚胎干(ES)细胞标志物的表达也证明了多能性，尽管针对多能性的优选测试是证明分化成三个胚层中的每一个胚层的细胞的能力。应该注意的是，仅仅培养此类细胞本身并不能使它们具有多能性。经重新编程的多能细胞(例如，该术语在本文所被定义为的iPS)还具有相对于原代细胞亲本能够在不丧失生长潜力的情况下延长传代时间的特征，原代细胞亲本通常只能够在培养中进行有限次数的分裂。
如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导型多能干细胞”可互换使用，并且是指从非多能细胞，通常是成体体细胞(例如，通过诱导一种或多种基因的强制表达)人工衍生(例如，诱导或通过完全逆转)的多能干细胞。
如本文所用的术语“干细胞”是指能够增殖并产生更多祖细胞的未分化细胞，该祖细胞具有产生大量母细胞的能力，该母细胞进而可产生经分化的或可分化的子系细胞(daughter cell)。可诱导子系细胞本身增殖并产生子代，该子代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留具有亲本发育潜力的一种或多种细胞。术语“干细胞”是指祖细胞的子集，该子集在特定情形下具有分化成更特化或分化的表型的能力或潜力，并且在某些情形下保留了在基本上不分化的情况下增殖的能力。在一个实施方案，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同方向上通过分化，例如通过获得完全个体的特征而特化，如在胚胎细胞和组织的进行性多样化中发生的那样。细胞分化是通常通过许多细胞分裂发生的复杂过程。经分化的细胞可衍生自多潜能细胞，该多潜能细胞本身衍生自多潜能细胞，等等。虽然这些多潜能细胞中的每种多潜能细胞均可被认为是干细胞，但是每种可产生的细胞类型范围可变化很大。一些分化细胞也有产生具有更大发育潜力的细胞的能力。此种能力可以是天然的，或者可在用各种因子处理后被人工诱导的。在许多生物学实例中，干细胞也可以是“多潜能的”，因为它们可产生多于一种不同细胞类型的子代，但这不是“干细胞性(stem-ness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，并且如在本文件中所用，它是必不可少的。理论上，自我更新可通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可不对称分裂，其中一个子系保留干细胞状态，并且另一个子系表达一些不同的其他特定功能和表型。替代地，群体中的一些干细胞可对称地分裂成两个干细胞，从而在作为整体的群体中维持一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。形式上，有可能以干细胞开始的细胞可朝着分化表型行进，但然后“逆转”并重新表达干细胞表型，这一术语通常被本领域的普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文所用，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、胎盘干细胞等。
如本文所用，“静止”或“细胞静止”用于指由营养剥夺触发的细胞静息状态，并且特征在于响应于适当刺激重新进入细胞周期的能力。静止细胞保留代谢和转录活性。细胞可具有不同的静止深度，包括进入G0的过渡进入期、深度G0和G警戒状态，G警戒状态是更浅的静止状态，在此期间细胞对触发返回细胞周期的刺激的响应性更强。静止心肌细胞可表现出一种或多种静止标志物(包括p16和p130)的表达。
术语“内源性心肌细胞”或“内源性成熟心肌细胞”在本文中用于指成熟心肌细胞。成熟心肌细胞可表现出电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟。心肌细胞的表型为本领域普通技术人员所熟知，并且包括例如自发搏动的能力，诸如心肌肌钙蛋白、TNNT2、TNNI3、肌球蛋白重链、MYH6、MYH7、雷诺丁受体(ryanodine receptor,RyR)、钠通道蛋白SCN5a、钾电压门控通道KCNJ2、ATP2A2、PPARGC1a、Cx43的标志物的表达，以及不同的形态特征(诸如有组织的肌节、具有杆状细胞以及具有T小管)。
如本文所用，“心肌细胞”、“非天然存在的心肌细胞”、“非原生心肌细胞”、“静止心肌细胞”和“成熟心肌细胞”都指通过如本文公开的方法生产的心肌细胞。心肌细胞可以是心室型、心房型和/或结节型心肌细胞，或心肌细胞的混合群体。心肌细胞可表现出可与内源性心肌细胞共有的一种或多种特征，包括但不限于自发搏动的能力，为电成熟的、代谢成熟的、收缩性成熟的，表现出一种或多种基因标志物(例如，TNNI3、TNNT1、MYH6、MYH7、KCNJ2、RyR和REST)的适当表达，表现出一种或多种静止标志物(例如，p16和p130)的适当表达，表现出适当的形态特征(例如，杆状细胞和有组织的肌节)，以及在培养中的可扩增性。然而，非天然存在的心肌细胞与如本文所述的内源性心肌细胞不相同并且可与如本文所述的内源性心肌细胞区分开，包括基于基因表达的区别。
术语“心肌细胞标志物”是指但不限于蛋白质、肽、核酸、蛋白质和核酸的多态性、剪接变体、蛋白质或核酸的片段、元件以及在内源性心肌细胞中特异性地表达或存在的其他分析物。示例性心肌细胞标志物包括但不限于心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、钾通道KCNJ2、阻遏子元件1沉默转录因子(REST)、雷诺丁受体(RyR)、钠通道(SCN5a)，以及Yang等人Circ.Res.2014；114(3):511-23中描述的标志物。
如本文所用的术语“不成熟心肌细胞”是指不成熟(例如，电、代谢和/或收缩性不成熟的)心肌细胞。不成熟心肌细胞展示出自律性或起搏器样活动，具有较高的静息膜电位和较慢的上行速度，具有组织性较差的肌节结构和较低的最大收缩力，没有T小管，主要通过糖酵解(而不是氧化磷酸化)获得能量，并且可能是衰老状态而不是静止状态。
如本文所用，术语“增殖”意指细胞的生长和分裂。在一些实施方案中，如本文关于细胞所用的术语“增殖”是指在一段时间内数目可增加的一组细胞。
在细胞个体发生的背景下，形容词“分化的(differentiated)”或“分化(differentiating)”是相对术语，意指“分化的细胞”是与它所比较的细胞相比，在发育途径上进一步向下进展的细胞。因此，干细胞可分化成谱系限制性前体细胞(诸如中胚层干细胞)，该谱系限制性前体细胞进而可在该途径上进一步向下分化成其他类型的前体细胞(诸如心肌细胞前体)，且然后分化成终末期分化的细胞，该终末期分化的细胞在某种组织类型中起特征性作用，并且可保留或可不保留进一步增殖的能力。
如本文所用的术语“剂”意指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“剂”可以是任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成和天然存在的蛋白质实体和非蛋白质实体。在一些实施方案中，剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体、以及它们的修饰形式和组合等。在某些实施方案中，剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代的或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯(macrolide)、来普霉素(leptomycin)、以及它们的相关天然产物或类似物。可已知化合物具有所需活性和/或性质，或化合物可选自不同化合物的文库。
如本文所用，术语“接触”(即，使至少一种不成熟心肌细胞或其前体与成熟因子或成熟因子的组合接触)意图包括将分化培养基和/或剂与细胞一起在体外温育(例如，将成熟因子添加至培养中的细胞中)。在一些实施方案中，术语“接触”不意图包括可在受试者中自然发生的细胞在体内暴露于如本文所公开的化合物(即，可能由于自然生理过程而发生的暴露)。如在本文所述的实施方案中使至少一种不成熟心肌细胞或其前体与成熟因子接触的步骤可以任何合适的方式进行。例如，可在三维培养中处理细胞。在一些实施方案中，在促进心肌细胞形成的条件下处理细胞。本公开考虑了促进成熟心肌细胞形成的任何条件。促进成熟心肌细胞形成的条件的实例包括但不限于在低附着组织培养板、旋转烧瓶、aggrewell板中的悬浮培养。在一些实施方案中，发明人观察到成熟心肌细胞在培养基中保持稳定。在一些方面，在使细胞解离和重新涂铺之前添加血清(例如，热灭活的胎牛血清)。
应当理解，与成熟因子(例如心肌细胞成熟因子)接触的细胞也可同时或随后与另一种剂(诸如其他分化剂或环境)接触以使细胞稳定，或使细胞进一步分化或成熟。
类似地，可使至少一种不成熟心肌细胞或其前体与至少一种心肌细胞成熟因子接触，然后与至少另一种心肌细胞成熟因子接触。在一些实施方案中，使细胞与至少一种心肌细胞成熟因子接触，并且该接触是在时间上分开的，并且在一些实施方案中，使细胞与至少一种心肌细胞成熟因子基本上同时接触。在一些实施方案中，使细胞与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少10种心肌细胞成熟因子接触。
如本文所提及的术语“细胞培养基”(本文也称为“培养基(culture medium)”或“培养基(medium)”)是用于培养细胞的培养基，其含有维持细胞活力和支持增殖的营养物。细胞培养基可含有呈适当的组合的形式的以下物质中的任一者：一种或多种盐、一种或多种缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或一种或多种其他糖、抗生素、血清或血清替代物，以及其他组分，诸如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。
术语“细胞系”是指在很大程度上或基本上相同的细胞群体，该细胞群体通常衍生自单个祖先细胞或衍生自限定的和/或基本上相同的祖先细胞群体。细胞系可能已经或可能能够在培养物中被维持延长的时间段(例如，数月、数年、无限的时间段)。它可能经历了自发或诱导的转化过程，从而赋予细胞无限的培养寿命。细胞系包括本领域公认如此的所有那些细胞系。应当理解，细胞随时间推移获得突变和可能的表观遗传变化，使得细胞系的单个细胞的至少一些性质可相对于彼此不同。在一些实施方案中，细胞系包含本文所述的心肌细胞。
术语“外源性”是指存在于细胞或生物体中的除其原生来源以外的物质。例如，术语“外源性核酸”或“外源性蛋白质”是指已经通过涉及人工的过程引入到生物系统(诸如细胞或生物体)中的核酸或蛋白质，在该生物系统中该核酸或蛋白质通常不存在或以较低量存在。如果将物质引入到细胞或继承该物质的细胞的祖先中，则该物质将被视为外源性的。相比之下，术语“内源性”是指对于生物系统来说是原生的物质。
如本文所用的术语“经遗传修饰(的)”或“经工程化(的)”细胞是指具有已通过涉及人工的过程引入的外源性核酸的细胞(或此种已继承了该核酸的至少一部分的细胞的后代)。该核酸可例如含有对细胞来说是外源性的序列，该核酸可含有原生序列(即，天然存在于细胞中的序列)(但是其处于非天然存在的排列中(例如，与来自不同基因的启动子连接的编码区))，或原生序列的改变型式等。将核酸转移至细胞中的过程可通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔以及使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中，将多核苷酸或其一部分整合到细胞的基因组中。核酸可随后从基因组中去除或切除，条件是此种去除或切除导致细胞相对于未经修饰但在其他方面等同的细胞发生可检测的改变。应当理解，术语“经”遗传修饰(的)”意图包括将经修饰的RNA直接引入到细胞中(例如，合成的、经修饰的RNA)。此类合成的经修饰的RNA包含用于防止被核酸内切酶和核酸外切酶快速降解以及用于避免或减少细胞对RNA的先天免疫或干扰素响应的修饰。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用经修饰的碱基、稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩增的配偶体库碱基配对的碱基、或缀合的碱基置换；(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖的置换；以及(d)核苷间键联修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或置换。在此类修饰干扰翻译(即，导致翻译相对于缺乏该修饰的情况减少50％或更多——例如，在兔网织红细胞体外翻译测定中)的情况下，该修饰不适用于本文描述的方法和组合物。
术语“表达”是指涉及生产RNA和蛋白质以及在适当情况下分泌蛋白质的细胞过程，包括在适当情况下但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。
如本文所用的术语“经分离(的)”或“经部分纯化(的)”在核酸或多肽的情况下是指这样的核酸或多肽，其与至少一种与在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在和/或当由细胞表达时将与该核酸或多肽一起存在或在分泌的多肽的情况下被分泌的其他组分(例如核酸或多肽)分离。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“经分离(的)”。
如本文所用的术语“经分离的细胞”是指从最初发现它的生物体中移出的细胞，或此种细胞的后代。任选地，该细胞已经在体外被培养，例如在其他细胞存在下被培养。任选地，随后将该细胞引入到第二生物体中或重新引入到该细胞所分离自的生物体(或该细胞所起源自的细胞)中。
如本文所用的关于经分离的细胞群体的术语“经分离的群体”是指已从混合或异质的细胞群体中移出并分离的细胞群体。在一些实施方案中，经分离的群体是细胞的基本上纯的群体，这是与该细胞所分离或富集自的异质群体相比较而言的。
关于特定细胞群体的术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群体的细胞为至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％且最优选至少约95％纯的细胞群体。换言之，关于心肌细胞群体的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的不是由本文的术语定义的心肌细胞的细胞的细胞群体。在一些实施方案中，本发明涵盖扩增心肌细胞群体的方法，其中该经扩增的心肌细胞群体是基本上纯的心肌细胞群体。
术语“富集”或“经富集的”在本文中可互换使用，并且意指一种类型的细胞的产量(分数)与起始培养物或制备物中该类型的细胞的分数相比增加至少10％。
术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，并且用于指干细胞通过在长时间段和/或数月至数年内分裂成相同的非特化细胞类型而自我更新的能力。在一些情况下，增殖是指通过将单个细胞重复分裂成两个相同的子系细胞来扩增细胞。
术语“调节”与其在本领域中的使用一致地被使用，即意指引起或促进所关注的过程、途径或现象中的定性或定量的变化、改变或修改。非限制性地，此种变化可以是过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性的增加、减少或变化。“调节剂”是引起或促进所关注的过程、途径或现象中的定性或定量变化、改变或修改的剂。
如本文所用，术语“DNA”被定义为脱氧核糖核酸。
如本文所用的“标志物”被用于描述细胞的特征和/或表型。标志物可用于选择包含所关注的特征的细胞。标志物因特定细胞而异。标志物是特征，无论是特定细胞类型的细胞的形态、功能或生物化学(酶)特征，还是由该细胞类型表达的分子。优选地，此类标志物是蛋白质，并且更优选地，具有抗体或本领域可用的其他结合分子的表位。然而，标志物可由在细胞中发现的任何分子(包括但不限于蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇)组成。形态特征或性状的实例包括但不限于形状、大小和核质比(nuclear to cytoplasmicratio)。功能特征或性状的实例包括但不限于粘附至特定基底的能力、掺入或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力以及沿特定谱系分化或去分化的能力。可通过本领域技术人员可用的任何方法检测标志物。标志物也可以是形态特征的缺失或蛋白质、脂质等的缺失。标志物可以是多肽的存在和缺失的一组独特特征与其他形态特征的组合。
术语“可选择的标志物”是指当表达时赋予细胞可选择的表型的基因、RNA或蛋白质，该可选择的表型诸如对细胞毒性剂或细胞生长抑制剂的抗性(例如抗生素抗性)、营养原养型，或可用作区分表达该蛋白质的细胞与不表达该蛋白质的细胞的基础的特定蛋白质的表达。其表达可容易地检测到的蛋白质，诸如荧光或发光蛋白质或作用于底物从而产生有色、荧光或发光物质的酶(“可检测标志物”)构成可选择的标志物的子集。与对于通常在多能细胞中被选择性或排他性表达的基因来说是原生的表达控制元件连接的可选择的标志物的存在使得鉴定和选择已重编程为多能状态的体细胞成为可能。可使用多种可选择的标志物基因，诸如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)和hisD基因。可检测的标志物包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白、天蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和青色荧光蛋白以及这些中任一者的变体。荧光蛋白诸如荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶)也可使用。如本领域技术人员显而易见的，如本文所用的术语“可选择的标志物”可指基因或基因的表达产物，例如编码的蛋白质。
在一些实施方案中，相对于不表达可选择的标志物或以显著较低水平表达可选择的标志物的细胞，可选择的标志物赋予表达它的细胞增殖和/或存活优势。此种增殖和/或存活优势通常发生在细胞被维持在某些条件，即“选择性条件”下时。为确保有效选择，细胞群体可在一定条件下被维持足够长的时间段，以使不表达标志物的细胞不增殖和/或不存活并从群体中消除，或者它们的数目减少至只占该群体的很小的一部分。通过将细胞群体维持在选择性条件下以在很大程度上或完全消除不表达标志物的细胞来选择表达赋予增殖和/或存活优势的标志物的细胞的过程在本文中称为“阳性选择”，并且该标志物被称为“可用于阳性选择”。在本文所述的某些方法中，阴性选择和可用于阴性选择的标志物也是受关注的。相对于不表达标志物或以显著较低水平表达标志物的细胞，此类标志物的表达赋予表达该标志物的细胞增殖和/或存活劣势(或者，考虑另一种方式，相对于表达标志物的细胞，不表达该标志物的细胞具有增殖和/或存活优势)。因此，当在选择性条件下被维持足够长的时间段时，表达标志物的细胞可在很大程度上或完全从细胞群体中被消除。
术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人，可从其获得细胞和/或向其提供用如本文所述的细胞进行的治疗(包括预防性治疗)的人。对于对特定动物诸如人受试者具有特异性的那些感染、疾患或疾病状态的治疗，术语受试者是指该特定动物。如本文中可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、母牛、猪和非人灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，受试者是哺乳动物,诸如人；或其他哺乳动物，诸如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等；或生产哺乳动物，例如母牛、羊、猪等。
如应用于经分离的细胞的术语“处理(treat)”、“处理(treating)”、“处理(treatment)”等包括使细胞经受任何种类的过程或条件或对细胞进行任何种类的操作或程序。如应用于受试者的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指向个体提供医疗或手术照护、护理或管理。该个体经常生病或受伤，或者相对于群体的平均成员患病的风险增加并且需要这种照护、护理或管理。它可包括向受试者施用有效量的组合物，以使得受试者表现出疾病的至少一种症状的减轻或疾病的改善，例如，有益的或所需的临床结果。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解还是全部缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可指如与未接受治疗时预期的存活期相比延长存活期。因此，本领域技术人员认识到治疗可改善疾病状态，但可能不是疾病的完全治愈。术语“治疗”包括预防治疗。需要治疗的那些包括已被诊断患有疾患(例如肌肉病症或疾病)的那些，以及可能由于遗传易感性或其他因素而患上疾患的那些。
术语“组织”是指一起执行某些特殊功能的一组或一层特化细胞。术语“组织特异性”是指来自特定组织的细胞来源。
术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”或“抑制”在本文一般均用于意指减少统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“减少的”、“减少”或“降低”或“抑制”意指与参考水平相比减少了至少10％，例如如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的减少或多达并包括100％的减少(即与参考样品相比不存在的水平)，或10％-100％之间的任何减少。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”在本文一般均用于意指增加统计学上显著的量，为了避免任何疑问，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“激活”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加，或多达并包括100％的增加，或10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加，或在2倍与10倍或更大之间的任何增加。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且一般意指低于正常或更低的标志物浓度的两个标准偏差(2SD)。该术语指的是存在差异的统计证据。它被定义为当零假设实际上为真时作出否决零假设的决定的概率。该决定通常使用p值作出。
如本文所用，术语“包含/包括(comprising)”或包含/包括(comprises)在提及本发明所必需的组合物、方法及其一种或多种相应组分被使用时仍然为包括未指定的要素的开放式的术语，无论该要素是否必需。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许存在不实质上影响本发明的该实施方案的一个或多个基本的和新颖的或功能性的特征的附加要素。
术语“由......组成”是指如本文所述的组合物、方法及其相应组分不包括实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文中另外明确指示，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数提及物。因此，例如对“该/所述方法”的提及包括本文所述类型的和/或在阅读本公开内容等后对于本领域技术人员将变得清楚的一种或多种方法和/或步骤。
干细胞
干细胞是保留通过有丝细胞分裂自我更新的能力且能够分化成各种各样的特化细胞类型的细胞。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：在胚泡中发现的胚胎干细胞(ES)和在成体组织中发现的成体干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞可分化成所有特化胚胎组织。在成体生物体中，干细胞和祖细胞充当身体的修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官(如血液、皮肤或肠道组织)的正常更替。多能干细胞可分化成衍生自三个胚层中的任一个胚层的细胞。
尽管下文参考干细胞用于生产心肌细胞(例如成熟心肌细胞)或其前体的用途描述了某些实施方案，但生殖细胞可用于代替干细胞或与干细胞一起使用以使用与本文描述的说明性方案类似的方案提供至少一种心肌细胞。例如，可从末次月经日期后约8-11周采集的人胎儿材料中存在的原初生殖细胞制备合适的生殖细胞。例如，说明性生殖细胞制备方法描述于例如Shamblott等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998和美国专利第6,090,622号中。
具有几乎无限的复制能力和分化成大多数细胞类型的潜力的ES细胞，例如人胚胎干细胞(hESC)或小鼠胚胎干细胞(mESC)，原则上提供了无限的起始材料来产生用于临床疗法的分化的细胞(stemcells.nih.gov/info/scireport/2006report.htm,2006)。ES细胞的一种可能应用是通过首先从例如hESC生产心脏祖细胞，以及然后使心脏祖细胞进一步分化成至少一种不成熟心肌细胞或其前体，以及然后使该至少一种不成熟心肌细胞或其前体进一步分化成心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)来产生用于心力衰竭(例如，慢性心力衰竭)的细胞替代疗法的新的心肌细胞。
hESC细胞例如由Cowan等人(N Engl.J.Med.350:1353,2004)和Thomson等人(Science 282:1145,1998)描述；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞、恒河猴干细胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)、狨猴干细胞(Thomson等人，Biol.Reprod.55:254,1996)和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)也可用于本文公开的方法中。mESC例如由Tremml等人(Curr Protoc Stem Cell Biol.Chapter 1:Unit 1C.4,2008)描述。干细胞可以是例如单能的、全能的、多潜能的(multipotent)或多能的(pluripotent)。在一些实施例中，能够产生作为至少一个生发层或所有三个生发层的衍生物的子代的灵长类动物起源的任何细胞都可用于本文公开的方法中。
在某些实例中，ES细胞可以例如如Cowan等人(N Engl.J.Med.350:1353,2004)和美国专利第5,843,780号和Thomson等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995中所述进行分离。例如，hESC细胞可以使用Thomson等人(美国专利第6,200,806号；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998)和Reubinoff等人自NatureBiotech.18:399,2000描述的技术从人胚泡细胞制备。hESC的等效细胞类型包括它们的多能衍生物，诸如原始外胚层样(EPL)细胞，如例如WO01/51610(Bresagen)中所概述。hESC也可从人植入前胚胎获得。替代地，还可以使用体外受精(IVF)胚胎，或将单细胞人胚胎扩增到胚泡阶段(Bongso等人，Hum Reprod 4:706,1989)。将胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养到胚泡阶段(Gardner等人，Fertil.Steril.69:84,1998)。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从已发育的胚泡中移除透明带。内细胞团可通过免疫手术进行分离，其中将胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清1:50稀释液30分钟，然后在DMEM中洗涤三次，每次5分钟，并暴露于豚鼠补体(Gibco)的1:5稀释液3分钟(Solter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:5099,1975)。在DMEM中再洗涤两次后，通过平缓移液将裂解的滋养层细胞从完整的内细胞团(ICM)中移除，并且将ICM涂铺在mEF饲养层上。在9至15天后，可通过暴露于含有1mM EDTA的无钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、暴露于分散酶或胰蛋白酶或通过用微量移液器机械解离来使内细胞团衍生的长出物解离成团块；且然后将其在新鲜培养基中重新涂铺在mEF上。可通过微量移液器单独选择具有未分化形态的生长集落，将其机械地解离成团块，并且重新涂铺。ES样形态被表征为具有明显高核质比和突出核仁的致密集落。然后可例如通过短暂的胰蛋白酶消化、暴露于杜尔贝科氏PBS(含有2mM EDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过经由微量移液器选择单个集落来每1-2周常规地分裂所得的hESC。在一些实例中，约50至100个细胞的团块大小是最佳的。mESC细胞可以使用例如Conner等人(Curr.Prot.in Mol.Biol.Unit 23.4,2003)描述的技术来制备。
胚胎干细胞可以从灵长类物种的成员的胚泡中分离(美国专利第5,843,780号；Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)。人胚胎干(hES)细胞可以使用Thomson等人(美国专利第6,200,806号；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998)和Reubinoff等人自Nature Biotech.18:399,2000描述的技术从人胚泡细胞制备。与hES细胞等效的细胞类型包括它们的多能衍生物，诸如原始外胚层样(EPL)细胞，如WO01/51610(Bresagen)中所概述。
可替代地，在一些实施方案中，hES细胞可从人植入前胚胎获得。替代地，还可以使用体外受精(IVF)胚胎，或将单细胞人胚胎扩增到胚泡阶段(Bongso等人，Hum Reprod 4:706,1989)。将胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养到胚泡阶段(Gardner等人，Fertil.Steril.69:84,1998)。通过短暂暴露于链霉蛋白酶(Sigma)从已发育的胚泡中移除透明带。内细胞团是通过免疫手术进行分离，其中将胚泡暴露于兔抗人脾细胞抗血清1:50稀释液30分钟，然后在DMEM中洗涤三次，每次5分钟，并暴露于豚鼠补体(Gibco)的1:5稀释液3分钟(Solter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:5099,1975)。在DMEM中再洗涤两次后，通过平缓移液将裂解的滋养层细胞从完整的内细胞团(ICM)中移除，并且将ICM涂铺在mEF饲养层上。
在9至15天后，通过暴露于含有1mM EDTA的无钙和镁的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、暴露于分散酶或胰蛋白酶或通过用微量移液器机械解离，使内细胞团衍生的长出物解离成团块；且然后将其在新鲜培养基中重新涂铺在mEF上。通过微量移液器单独选择具有未分化形态的生长集落，将其机械地解离成团块，并且重新涂铺。ES样形态被表征为具有明显高核质比和突出核仁的致密集落。然后通过短暂的胰蛋白酶消化、暴露于杜尔贝科氏PBS(含有2mMEDTA)、暴露于IV型胶原酶(约200U/mL；Gibco)或通过经由微量移液器选择单个集落来每1-2周常规地分裂所得的ES细胞。约50至100个细胞的团块大小是最佳的。
在一些实施方案中，人胚胎生殖(hEG)细胞是多能干细胞，其可在如本文公开的方法中被用于分化成原始内胚层细胞。可从末次月经日期后约8-11周采集的人胎儿材料中存在的原初生殖细胞制备所使用的hEG细胞。合适的制备方法描述于Shamblott等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998和美国专利第6,090,622号，其通过引用方式以其整体并入本文。
简言之，对生殖嵴进行加工以形成解聚细胞。EG生长培养基为DMEM、4500mg/L D-葡萄糖、2200mg/L mM NaHCO3；15％ ES合格胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/mL人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/mL人重组bFGF(Genzyme)；以及10μM佛司可林(forskolin)(在10％ DMSO中)。准备九十六孔组织培养板，其中将饲养细胞(例如，STO细胞，ATCC编号CRL1503)的亚汇合层在不含LIF、bFGF或佛司可林的改良EG生长培养基中培养3天，用5000拉德γ-照射灭活，将约0.2mL原代生殖细胞(PGC)悬浮液添加至每个孔中。第一次传代在EG生长培养基中7-10天后进行，将每个孔转移至预先准备的含有经照射的STO小鼠成纤维细胞的24孔培养皿的一个孔中。培养细胞，每天更换培养基，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4次传代后。
在某些实例中，根据如本文公开的方法，在暴露于至少一种心肌细胞成熟因子之前，干细胞可以是未分化的(例如，未定向至特定谱系的细胞)，而在其他实例中，可能需要在暴露于至少一种本文所述的心肌细胞成熟因子之前使干细胞分化成一种或多种中间细胞类型。例如，干细胞可展示出未分化细胞的形态学、生物学或物理特征，该特征可用于将它们与胚胎或成体起源的分化细胞区分开来。在一些实例中，未分化细胞可在二维微观视图中在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落中出现。干细胞可以是它们本身(例如，基本上不存在任何未分化细胞)，或者可在分化细胞存在的情况下使用。在某些实例中，干细胞可在存在合适的营养物和任选的其他细胞的情况下培养，以使得干细胞可生长且任选地分化。例如，胚胎成纤维细胞或成纤维细胞样细胞可存在于培养物中以帮助干细胞生长。成纤维细胞可在干细胞生长的一个阶段期间存在，但不一定在所有阶段存在。例如，成纤维细胞可在第一培养阶段添加至干细胞培养物中，并且在一个或多个后续培养阶段不添加至干细胞培养物中。
在本发明的所有方面中使用的干细胞可以是衍生自任何种类的组织(例如胚胎组织，如胎儿或胎前期组织，或成体组织)的任何细胞，该干细胞具有能够在适当条件下产生不同细胞类型的子代，例如3个生发层(内胚层、中胚层和外胚层)中的至少一个生发层的全部衍生物的特征。这些细胞类型可以已建立的细胞系的形式提供，或者它们可直接从原代胚胎组织获得并立即用于分化。包括在NIH人胚胎干细胞记录中列出的细胞，例如，例如hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen,Inc.)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)；Miz-hES1(MizMedi Hospital-Seou NationalUniversity)；HSF-1、HSF-6(University of California，San Francisco)；以及H1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute))。在一些实施方案中，用于化学诱导分化成成熟心肌细胞的人干细胞或多能干细胞的来源不涉及破坏人胚胎。
在另一个实施方案中，干细胞可从包括实体组织的组织中分离。在一些实施方案中，该组织是皮肤、脂肪组织(fat tissue)(例如脂肪的组织(adipose tissue))、肌肉组织、心脏(heart)或心脏的(cardiac)组织。在其他实施方案中，该组织是例如但不限于脐带血、胎盘、骨髓或软骨。
所关注的干细胞还包括各种类型的胚胎细胞，例如Thomson等人(1998)Science282:1145描述的人胚胎干(hES)细胞；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，诸如恒河猴干细胞(Thomson等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844)；绒猴干细胞(Thomson等人(1996)Biol.Reprod.55:254)；以及人胚胎生殖(hEG)细胞(Shambloft等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。所关注的还有谱系定向干细胞，诸如中胚层干细胞和其他早期心源性细胞(参见Reyes等人(2001)Blood98:2615-2625；Eisenberg&Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16；等)。干细胞可从任何哺乳动物物种，例如人、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、灵长类动物等获得。在一些实施方案中，人胚胎未被破坏用于如本文公开的方法和组合物中所使用的多能细胞的来源。
当ES细胞尚未定向至特定分化谱系时，它们被认为是未分化的。此类细胞展示出使它们与胚胎或成体起源的分化细胞区分开来的形态特征。未分化的ES细胞容易被本领域技术人员识别，并且通常在二维微观视图中在具有高核/质比和突出核仁的细胞集落中出现。未分化的ES细胞表达可用作标志物以检测未分化细胞的存在的基因，并且该基因的多肽产物可用作阴性选择的标志物。例如，参见美国申请序列号2003/0224411A1；Bhattacharya(2004)Blood 103(8):2956-64；以及Thomson(1998)，同上，每一者都通过引用方式并入本文。人ES细胞系表达表征未分化的非人灵长类动物ES和人EC细胞的细胞表面标志物，包括阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和碱性磷酸酶。携带SSEA-4表位的globo系列糖脂GL7是通过将唾液酸添加至携带SSEA-3表位的globo系列糖脂GbS中形成的。因此，GL7与针对SSEA-3和SSEA-4两者的抗体发生反应。未分化的人ES细胞系不对SSEA-1染色，但分化的细胞对SSEA-I强烈染色。用于以未分化形式增殖hES细胞的方法描述于WO 99/20741、WO 01/51616和WO 03/020920中。
可通过本领域已知的方法从哺乳动物供体收获来自内皮、肌肉和/或神经干细胞的合适来源的细胞混合物。合适的来源为造血微环境。例如，可从受试者中取出循环外周血，优选经动员的(即，经募集的)。替代地，骨髓可获自经受自体移植的哺乳动物，如人患者。在一些实施方案中，干细胞可以例如使用如美国专利第7,390,484号和第7,429,488号中公开的来自Cytori的CELUTIONTM系统从受试者的脂肪组织中获取，该专利以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，人脐带血细胞(HUCBC)可用于如本文公开的方法中。人UBC细胞被认为是造血和间充质祖细胞的丰富来源(Broxmeyer等人，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4109-4113)。以前，脐带血和胎盘血被认为是婴儿出生时通常会被丢弃的废物。脐带血细胞被用作可移植干细胞和祖细胞的来源以及骨髓再生细胞的来源，用于治疗恶性疾病(即急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和成神经细胞瘤)和非恶性疾病如范科尼氏贫血(Fanconi'sanemia)和再生障碍性贫血(Kohli-Kumar等人，1993Br.J.Haematol.85:419-422；Wagner等人，1992Blood 79；1874-1881；Lu等人，1996Crit.Rev.Oncol.Hematol 22:61-78；Lu等人，1995Cell Transplantation 4:493-503)。HUCBC的显著优势是这些细胞的不成熟免疫与胎儿细胞非常相似，从而大大降低了宿主排斥的风险(Taylor和Bryson,1985J.Immunol.134:1493-1497)。人脐带血中含有间充质和造血祖细胞以及可在组织培养中扩增的内皮细胞前体(Broxmeyer等人，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4109-4113；Kohli-Kumar等人，1993Br.J.Haematol.85:419-422；Wagner等人，1992Blood 79；1874-1881；Lu等人，1996Crit.Rev.Oncol.Hematol 22:61-78；Lu等人，1995CellTransplantation 4:493-503；Taylor和Bryson,1985J.Immunol.134:1493-1497；Broxmeyer,1995Transfusion 35:694-702；Chen等人，2001Stroke 32:2682-2688；Nieda等人，1997Br.J.Haematology98:775-777；Erices等人，2000Br.J.Haematology 109:235-242)。脐带血中造血祖细胞的总含量等于或超过骨髓，并且此外，高增殖性造血细胞在HUCBC中比骨髓中高八倍，并且表达诸如CD14、CD34和CD45的造血标志物(Sanchez-Ramos等人，2001Exp.Neur.171:109-115；Bicknese等人，2002Cell Transplantation 11:261-264；Lu等人，1993J.Exp Med.178:2089-2096)。
在另一个实施方案中，多能细胞是造血微环境如循环外周血中的细胞，优选来自哺乳动物的外周血、脐带血、骨髓、胎肝或卵黄囊的单核级分。干细胞，尤其是神经干细胞，也可衍生自中枢神经系统(包括脑膜)。
在另一个实施方案中，存在于胚状体中的多能细胞是通过用短暂蛋白酶消化收获ES细胞并允许未分化人ESC的小团块在悬浮培养中生长而形成的。通过撤出条件培养基诱导分化。将所得胚状体涂铺到半固体基底上。约7天至约4周后可观察到分化细胞的形成。通过使胚状体或类似结构部分解离以提供细胞聚集体，从干细胞的体外培养物中选择能活的分化细胞。使用在聚集体中基本上维持细胞与细胞接触的方法来针对表型特征选择包含所关注的细胞的聚集体。
在替代的实施方案中，干细胞可以是重编程的干细胞，诸如衍生自体细胞或分化细胞的干细胞。在此种实施方案中，去分化的干细胞可以是例如但不限于赘生性细胞、肿瘤细胞和癌细胞，或者可替代地诱导型重编程细胞，诸如诱导型多能干细胞或iPS细胞。
克隆和细胞培养
可用于本文所述的技术中的分子遗传学和遗传工程的说明性方法可在例如当前版本的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Sambrook等人,Cold SpringHarbor)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller和Calos编著)；以及Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著，Wiley&Sons)中找到。例如，细胞生物学、蛋白质化学和抗体技术可在例如Current Protocols in ProteinScience(J.E.Colligan等人编著，Wiley&Sons)；Current Protocols in Cell Biology(J.S.Bonifacino等人，Wiley&Sons)和Current protocols in Immunology(J.E.Colligan等人编著，Wiley&Sons.)中找到。用于遗传操纵的说明性试剂、克隆载体和药盒可以例如从BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech和Sigma-Aldrich Co.商购获得。
合适的细胞培养方法可在例如当前版本的Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique(R.I.Freshney编著，Wiley&Sons)；General Techniques of CellCulture(M.A.Harrison和I.F.Rae,Cambridge Univ.Press)和Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(K.Turksen编著，Humana Press)中找到。合适的组织培养用品和试剂可例如从Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.和ICNBiomedicals商购获得。
多能干细胞可由本领域普通技术人员使用促进增殖而不促进分化的培养条件在培养中连续增殖。示例性的含血清ES培养基用80％DMEM(如敲除DMEM、Gibco)、20％确定的胎牛血清(FBS、Hyclone)或血清替代物(WO98/30679)、1％非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制备。临使用前，将人bFGF添加到4ng/mL中(WO99/20741,Geron Corp.)。传统上，ES细胞是在一层饲养细胞(通常为来自胚胎或胎儿组织的成纤维细胞)上培养的。
替代地，即使没有饲养细胞，多能SC也能被维持在未分化状态。无饲养细胞培养的环境包括合适的培养基底，特别是细胞外基质，诸如(胶状蛋白混合物)或层粘连蛋白。通常，在细胞完全分散之前(使用胶原酶IV时约5分钟)停止酶促消化。然后，将约10至2,000个细胞的团块直接涂铺到基底上，无需进一步分散。
产生心肌细胞
本公开的方面涉及产生心肌细胞(例如，成熟的静止心肌细胞)。一般地，根据本文公开的方法生产的心肌细胞展示出功能成熟的静止心肌细胞的几个特征，包括但不限于电成熟(例如，表现出下降的自律性)、收缩性成熟和代谢成熟。
可以根据任何合适的培养方案或一系列培养方案生产心肌细胞，以使干细胞或多能细胞分化到所需的分化阶段。在一些实施方案中，通过在适合于至少一种多能细胞分化成心肌细胞或其前体的条件下将至少一种多能细胞培养一段时间来生产心肌细胞或其前体。在一些实施方案中，心肌细胞是通过使不成熟心肌细胞从衰老状态转变为静止状态，从而提高该心肌细胞的成熟来生产。
在一些实施方案中，心肌细胞是基本上纯的心肌细胞群体。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体的群体包括多能细胞或分化细胞的混合物。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体的群体基本上不含或不含胚胎干细胞或多能细胞或iPS细胞。
在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)可例如作为组织活检物(例如皮肤活检物)从受试者中被分离出来，并且被重编程为诱导型多能干细胞以用于进一步分化产生用于本文所述的组合物和方法中的心肌细胞或其前体。在一些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)通过本领域普通技术人员已知的方法被维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过如本文公开的方法转化为心肌细胞之前进行繁殖。
在一些实施方案中，心肌细胞或其前体通过本领域普通技术人员已知的方法维持在培养物中，并且在一些实施方案中，在通过如本文公开的方法转化为心肌细胞之前繁殖。
进一步地，心肌细胞或其前体，例如不成熟心肌细胞，可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠科动物、牛科动物、猿、猪科动物、马科动物、绵羊或人细胞。为了清楚和简便起见，本文方法的描述指的是哺乳动物心肌细胞或其前体，但应该理解的是，本文描述的所有方法都可以很容易地应用于其他细胞类型的心肌细胞或其前体。在一些实施方案中，心肌细胞或其前体衍生自人个体。
本公开的各个方面涉及不成熟、衰老的心肌细胞。本文使用的不成熟心肌细胞可以衍生自任何来源或根据任何合适的方案产生。在一些方面，多能干细胞，例如iPSC或hESC，分化为不成熟心肌细胞。在一些方面，不成熟心肌细胞进一步成熟为成熟心肌细胞。在一些实施方案中，使用Lian等人(Nat Protoc.2012；8(1):162-175)描述的分化方案(其通过引用方式并入本文)使多能干细胞分化为不成熟心肌细胞。在一些实施方案中，Lian描述的分化方案如本文所述进行修改。在一些实施方案中，使多能干细胞与一种或多种小分子接触以操纵Wnt途径，从而使多能干细胞分化为不成熟心肌细胞。在一些方面，该一种或多种小分子选自由CHIR 99021和IWP4组成的组。在一些实施方案中，使多能干细胞群体与第一Wnt途径调节剂(例如，CHIR 99021)接触，然后与第二Wnt途径调节剂(例如，IWP4)接触。
本公开的方面涉及心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。本文使用的心肌细胞可以衍生自任何来源，或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，衰老的心肌细胞(例如，不成熟心肌细胞)被诱导成静止心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。细胞静止可以促进心肌细胞成熟。在一些方面，不成熟心肌细胞被诱导为成熟为成熟心肌细胞。
在一些方面，本公开提供了用于诱导心肌细胞的静止(例如，使心肌细胞转变为静止状态)的方法在某些方面，诱导心肌细胞的静止能增强心肌细胞的成熟。在一些实施方案中，通过上调心肌细胞中的细胞周期调控因子的表达来使心肌细胞转变为静止状态。在某些实施方案中，通过上调心肌细胞中p53的表达来使心肌细胞转变为静止状态。可以通过使心肌细胞与p53的激活剂接触来上调p53在心肌细胞中的表达。在一些实施方案中，p53的激活剂是小分子。在某些实施方案中，p53的激活剂是Torin1。在某些实施方案中，p53的激活剂不是Torin1。在一些实施方案中，p53的激活剂是MDM2的抑制剂。在某些实施方案中，p53的激活剂是nutlin-3a。在一些实施方案中，p53的激活剂是衰老清除剂。在某些实施方案中，p53的激活剂是槲皮素。在一些实施方案中，p53的激活剂是两种或更多种剂的组合。
在一些实施方案中，通过抑制mTOR信号转导和上调p53的表达来使心肌细胞转变为静止状态。在一些实施方案中，通过上调p53的表达而不抑制mTOR信号转导来使心肌细胞转变为静止状态。在一些方面，可以通过使心肌细胞与mTORC1和mTORC2的抑制剂接触来抑制心肌细胞中的mTOR信号转导。在一些实施方案中，mTORC1和mTORC2的抑制剂是Torin1。在一些实施方案中，mTORC1和mTORC2的抑制剂不是Torin1。在某些实施方案中，通过使心肌细胞与单一的剂接触来上调p53表达并抑制mTOR信号转导。在某些实施方案中，单一的剂是Torin1。在其他实施方案中，单一的剂不是Torin1。
在一些方面，本公开提供了用于从不成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，该方法包括诱导心肌细胞的静止(即，使心肌细胞转变为静止状态，即成熟状态)。在一些实施方案中，通过上调p53表达来使心肌细胞转变为静止状态(例如，成熟状态)。可以通过使不成熟心肌细胞与p53激活剂(例如，nutlin-3a或槲皮素)接触来使心肌细胞转变为静止状态。在一些实施方案中，通过上调p53表达并且下调mTOR信号转导来使心肌细胞转变为静止状态(例如，成熟状态)。在一些实施方案中，通过上调p53表达而不下调mTOR信号转导来使心肌细胞转变为静止状态。在一些实施方案中，通过使不成熟、衰老心肌细胞与Torin1接触来使心肌细胞转变为静止状态。在一些实施方案中，通过使不成熟、衰老心肌细胞与不是Torin1的剂接触来使心肌细胞转变为静止状态。
在一些方面，本公开提供了用于从不成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，该方法包括使包含不成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种包含p53激活剂和/或mTOR抑制剂的心肌细胞成熟因子接触，以诱导群体中至少一种不成熟心肌细胞成熟(例如，体外成熟)为心肌细胞。在一些实施方案中，使包括不成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(例如，p53激活剂和/或mTOR抑制剂)接触。在一些方面，将p53表达上调与mTOR抑制相组合以增强衍生自干细胞的心肌细胞的成熟。在一些方面，在不抑制mTOR的情况下上调p53表达以增强衍生自干细胞的心肌细胞的成熟。
本公开考虑了使用任何促进不成熟心肌细胞从衰老状态转变为静止状态的(例如，分化和/或成熟为心肌细胞的(例如，单独或与另一种心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂)组合的))p53激活剂。在一些实施方案中，p53激活剂是p53表达的上调剂。p53的上调可以包括总p53和磷酸化p53蛋白的增加。p53激活剂或上调剂的实例包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环及其他分子。在一些方面，p53上调剂是MDM2抑制剂。在某些方面，p53上调剂是nutlin-3a。在一些方面，p53上调剂是衰老清除剂。在某些方面，p53上调剂是槲皮素。在一些方面，p53上调剂是Torin1。在一些方面，p53上调剂是并非Torin1的剂。在一些方面，p53上调剂是并非mTOR抑制剂的剂。在一些方面，p53上调剂是nutlin-3a和Torin1的组合。在一些方面，p53上调剂是nutlin-3a和槲皮素的组合。在一些方面，p53上调剂是nutlin-3a、槲皮素和Torin1的组合。
在一些方面，本公开提供了用于从不成熟心肌细胞产生成熟心肌细胞(例如，电成熟、收缩性成熟和/或代谢成熟)的方法，该方法包括使包含不成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种包含mTOR抑制剂的心肌细胞成熟因子接触，以诱导群体中至少一种不成熟心肌细胞成熟(例如，体外成熟)为心肌细胞。在一些实施方案中，使包括不成熟心肌细胞的细胞群体与至少一种心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂、PI3K抑制剂或Akt抑制剂)接触。在一些方面，操纵(例如，抑制)PI3K/Akt/mTOR途径以增强衍生自干细胞的心肌细胞的成熟。
本公开考虑了使用任何促进不成熟心肌细胞分化和/或成熟为心肌细胞的(例如，单独或与另一种心肌细胞成熟因子(例如，p53上调剂)组合的)mTOR抑制剂。在一些实施方案中，mTOR包括mTORC1和/或mTORC2。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTORC1和/或mTORC2的抑制剂。在一些实施方案中，mTOR抑制剂抑制4E-BP1的磷酸化。抑制4E-BP1的磷酸化可能会影响氧化磷酸化途径的调控。抑制4E-BP1的磷酸化可能会降解p21，并从而上调p53。氧化磷酸化途径调节剂的非限制性实例包括4EGI-1、JR-AB2-011(mTORC2抑制剂)、AICAR(AMPK激活剂)、二甲双胍(AMPK激活剂和mTORC1/2抑制剂)和HLM006474(E2F抑制剂)。在一些实施方案中，mTOR抑制剂抑制4E-BP1和核糖体蛋白S6的磷酸化。在一些实施方案中，mTOR抑制剂包括Torin1、Torin2、雷帕霉素、依维莫司和/或坦罗莫司。在某些实施方案中，使包含不成熟心肌细胞的细胞群体与Torin1接触，以诱导该群体中至少一种不成熟心肌细胞成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，使包含不成熟心肌细胞的细胞群体与Torin2接触，以诱导该群体中至少一种不成熟心肌细胞成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
在一些实施方案中，该接触可以通过将该至少一种不成熟心肌细胞或其前体维持在包含该一种或多种心肌细胞成熟因子的培养基中来进行。在一些实施方案中，该接触可以通过将该至少一种不成熟心肌细胞或其前体维持在包含该一种或多种心肌细胞成熟因子的二维(2D)培养基中来进行。在其他实施方案中，该接触可以通过将该至少一种不成熟心肌细胞或其前体维持在包括该一种或多种心肌细胞成熟因子的三维(3D)培养基中来进行。在一些方面，该一种或多种心肌细胞成熟因子以脉冲处理施加到培养基(例如，2D或3D培养基)中。在一些实施方案中，脉冲处理进行1至24小时、5至18小时或10至12小时。在一些实施方案中，脉冲处理进行1小时或更长时间。在一些实施方案中，脉冲处理进行24小时或更短时间。在一些实施方案中，脉冲处理进行1至5天或2至3天。在一个实施方案中，脉冲处理在预先确定的时间下以预先确定的时长进行2-3天，从而模拟昼夜节律周期。在一些方面，该一种或多种心肌细胞成熟因子利用连续处理施加到培养基(例如，2D或3D培养基)中。
在一些实施方案中，可以对至少一种不成熟心肌细胞或其前体进行遗传工程化。在一些实施方案中，可以将至少一种不成熟心肌细胞或其前体遗传工程化为表达一种或多种如本文公开的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)标志物，例如表达至少一种选自TNNI3、KCNJ2、REST/NRSF、Ryr和SCN5a的多肽，或与其基本同源的氨基酸，或它们的功能片段或功能变体。
在将不成熟心肌细胞或其前体维持在体外条件下的情况下，可以使用常规组织培养条件和方法，并且常规组织培养条件和方法是本领域技术人员已知的。用于各种细胞的分离和培养方法完全在本领域技术人员的能力范围内。
在本公开的方法中，至少一种心肌细胞或其前体通常可以在标准的温度、pH值和其他环境条件下培养，例如，在含有5-10％ CO2的气氛中在37℃下在组织培养板中作为粘附细胞培养或者在Erlenmeyer烧瓶中以3D培养的形式来培养。对细胞和/或培养基进行适当改良以实现向如本文所述的心肌细胞的转化。
在某些实例中，心肌细胞成熟因子可被用于通过以下方法诱导至少一种不成熟心肌细胞或其前体分化：使至少一种不成熟心肌细胞或其前体暴露在有效量的本文所述的心肌细胞成熟因子中或者与有效量的本文所述的心肌细胞成熟因子接触，以使该至少一种不成熟心肌细胞或其前体分化成至少一种心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些方面，不成熟心肌细胞在心肌细胞成熟因子中的暴露或与心肌细胞成熟因子的接触是连续进行的，或者在其他方面，经由脉冲处理进行。
因此，本文包括了通过本文所述的方法制备的细胞和组合物。心肌细胞成熟因子的确切用量和类型可能随不成熟心肌细胞或其前体的数目、所需的分化阶段以及之前已进行的分化阶段的数目而改变。
在某些实例中，心肌细胞成熟因子以有效量存在。如本文所用，“有效量”是指为了使不成熟心肌细胞或其前体的群体中至少10％或至少20％或至少30％的细胞分化成心肌细胞而应该存在的化合物的量。
在另外的实例中，心肌细胞成熟因子可以存在于该至少一种不成熟心肌细胞或其前体的培养基中，或者替代地，心肌细胞成熟因子可以在一些生长阶段期间被添加到该至少一种不成熟心肌细胞或其前体中。
在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始搏动之后，使该不成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。在一些方面，不成熟心肌细胞在与心肌细胞成熟因子接触之前搏动1至5天、1至4天、1至3天、1至2天、1天、2天、3天、4天或5天的时段。在一些方面，不成熟心肌细胞在与心肌细胞成熟因子接触之前搏动1至40天、2至35天、3至30天、4至25天、5至20天、7至35天、14至30天或21至28天的时段。在一些方面中，如果不成熟心肌细胞尚未开始搏动，则不使不成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。
在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T(TNNT2)和肌球蛋白重链6(MYH6)之后，使该不成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。在一些实施方案中，在不成熟心肌细胞开始表达肌钙蛋白T(TNNT2)、肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链6(MYH6)和肌球蛋白重链7(MYH7)之后，使该不成熟心肌细胞与心肌细胞成熟因子(例如，mTOR抑制剂和/或p53上调剂)接触。
在将至少一种不成熟心肌细胞或其前体维持在体外条件下的情况下，可以使用常规组织培养条件和方法，并且常规组织培养条件和方法是本领域技术人员已知的。用于各种细胞的分离和培养方法完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一些方面，在RPMI+B27中培养多能干细胞，并在分化方案的第0天使该多能干细胞与GSK3抑制剂/WNT激活剂(例如，CHIR 99021)接触。在方案的第2天移除WNT激活剂(例如，CHIR 99021)。在方案的第3天，添加WNT抑制剂(例如，IWP4)，并在第5天移除WNT抑制剂(例如，IWP4)。在第7天，向培养物中添加胰岛素，并且每2-3天更换培养基。在第11天，添加mTOR抑制剂(例如，Torin1)，并将其维持在培养物中直至第18天。在分化方案完成时，从培养基中获得成熟心肌细胞。
在一些方面，在RPMI+B27中培养多能干细胞，并在分化方案的第0至2天使该多能干细胞与GSK3抑制剂/WNT激活剂(例如，CHIR 99021)接触。从方案的第2至4天，添加WNT抑制剂(例如，IWP4)。在第7天，向培养物中添加胰岛素，并且每2-3天更换培养基。在搏动后，在搏动开始后大约2天开始用Torin1对心肌细胞进行处理，持续7天。在替代的方面，在搏动后，在搏动开始后大约2天开始用并非Torin1的心肌细胞成熟因子(例如，nutlin-3a和/或槲皮素)对心肌细胞行处理，持续5天。在处理完成后，将培养基转换回RPMI/B27/胰岛素并以每2-3天更换培养基来维持培养基。在分化方案完成时，从培养基中获得成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，从不成熟心肌细胞或其前体获得心肌细胞的分化方案是在二维培养系统中进行的。在一些实施方案中，从不成熟心肌细胞或其前体获得心肌细胞的分化方案是在三维培养系统(例如，使用3D生物反应器系统)中进行的。
本公开的方面涉及产生在形式和功能上类似于内源性成熟心肌细胞，但与原生心肌细胞不同的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞的形态类似于内源性心肌细胞的形态。在一些实施方案中，心肌细胞是静止的。在一些实施方案中，心肌细胞表现出静止标志物(例如，p16、p53和p130)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增殖标志物(例如，细胞周期蛋白C1、E2F1和Ki67)的表达降低。在一些实施方案中，心肌细胞表现出抑制剂E2F因子(例如，E2F3b-8)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出刺激性E2F因子(例如，E2F1-3a)的表达降低。
在一些实施方案中，心肌细胞是成熟的。在一些实施方案中，心肌细胞表现出肌节蛋白(例如，TNNT2、TNNI3、MYH6和/或MYH7)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞如与胎儿或不成熟心肌细胞相比表现出博动率降低。在一些实施方案中，心肌细胞表现出离子通道(例如，KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和/或SERCA2a(ATP2a2))的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出脑利钠肽的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出核转录因子(例如，REST/NRSF、GATA4、TBX20、BRG1、YAP、ERBB2、PITX2、MEIS1、ATA4、Nkx2-5、TBX5、NFAT、TEAD、HAND、CHF1、FoxO3/FoxO4、CHF1/Hey2、CHF1/Hey2、FoxO1、Mef2C、SRF、p53、NFkB以及它们的组合)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径调控因子(例如，PGC1-α)的表达增加。
通过使用本公开的方法使至少一种不成熟心肌细胞或其前体转化或成熟来产生心肌细胞具有许多优点。首先，本公开的方法允许产生自体心肌细胞，该自体心肌细胞对个体是细胞特异性的并且与个体遗传匹配。一般而言，与非自体细胞相比，自体细胞不太可能经受免疫排斥。该细胞衍生自至少一种不成熟心肌细胞或其前体，例如通过以下方式获得的心脏祖细胞：将来自个体的体细胞(例如，成纤维细胞)重编程为诱导型多能状态，以及然后培养多能细胞以使至少一些多能细胞分化为至少一种不成熟心肌细胞或前体，随后将该至少一种不成熟心肌细胞在体外诱导成熟为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。
在一些实施方案中，至少一种不成熟心肌细胞或其前体所获自的受试者是哺乳动物受试者，诸如人受试者。在一些实施方案中，受试者患有心脏病症。在一些实施方案中，受试者患有慢性心力衰竭。在一些实施方案中，受试者患有室性心律失常。在此类实施方案中，可将该至少一种不成熟心肌细胞或其前体通过如本文所述的方法离体分化成心肌细胞，然后在用于治疗该细胞所收获至的受试者的心脏病症(例如，心力衰竭)的方法中施用于该受试者。
在一些实施方案中，至少一种不成熟心肌细胞或其前体位于受试者内(体内)，并通过如本文公开的方法在体内转化从而变为心肌细胞。在一些实施方案中，可以通过向受试者施用包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种如本文所述的心肌细胞成熟因子的组合物来实现至少一种不成熟心肌细胞或其前体在体内向心肌细胞的转化。在一些实施方案中，可以通过向受试者施用包含至少一种、至少两种、至少三种或至少四种如本文所述的心肌细胞成熟因子的组合物来实现至少一种不成熟心肌细胞或其前体在体内向心肌细胞的转化。
心肌细胞
在一些实施方案中，本公开提供了成熟心肌细胞。本文公开的心肌细胞与原生心肌细胞共有许多区分特征，但在某些方面(例如，基因表达谱)中有所不同。在一些实施方案中，心肌细胞是非原生或非天然存在的。如本文所用，“非原生(的)”或“非天然存在(的)”意指所述心肌细胞在某些方面与自然界中存在的心肌细胞(即原生心肌细胞)有明显的差异。然而，应当理解的是，这些明显的差异通常与可导致该心肌细胞表现出某些功能差异的结构特征有关，例如，尽管该心肌细胞的基因表达模式与原生心肌细胞不同，但该心肌细胞以与原生心肌细胞类似的方式起作用，但与原生心肌细胞相比，某些功能可能改变(例如，改善)。
本公开的心肌细胞与原生心肌细胞共有许多特征性特征，这些特征对于正常心肌细胞功能是重要的。成熟心肌细胞的特征描述于Yang等人Circ.Res.2014；114(3):511-23中。
在一些实施方案中，该心肌细胞是静止的。在一些实施方案中，心肌细胞在静止状态下保留新陈代谢和转录活性。在一些实施方案中，静止状态促进心肌细胞成熟。在一些实施方案中，心肌细胞表达或以增加的水平(即，与对照相比)表达某些静止标志物，包括p16、p53和p130。在一些实施方案中，心肌细胞不表达或以下降的水平(即，与对照相比)表达增殖标志物，诸如Ki67、细胞周期蛋白C1和E2F1。在一些实施方案中，心肌细胞表现出抑制性E2F因子(例如，E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7和E2F8)的表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出刺激性E2F因子(例如，E2F1、E2F2和E2F3)的表达降低。
在一些实施方案中，心肌细胞是电成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出降低的自律性。原生成熟成体人心肌细胞以20-30次/分钟自然搏动。在一些方面，本文所述的心肌细胞表现出较慢的固有博动率。在一些实施方案中，心肌细胞以每分钟15至35次搏动、每分钟15至20次搏动或每分钟30至35次搏动而搏动。在某些实施方案中，心肌细胞表现出低于40次/分钟的自发搏动率。较慢的固有博动率可能表明自律性降低，而自律性降低(即，自发搏动的驱动力降低)的心肌细胞可能会降低细胞疗法中心律失常的风险。
在一些实施方案中，心肌细胞是收缩性成熟的心肌细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出收缩蛋白质(例如，肌节收缩蛋白质)的RNA和蛋白质表达增加(即，如与不成熟心肌细胞相比)。在一些方面，心肌细胞表现出心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链蛋白6(MYH6)和肌球蛋白重链蛋白7(MYH7)中的至少一者的RNA和蛋白质表达增加。在一些实施方案中，心肌细胞表现出该蛋白质的RNA表达以剂量依赖性方式增加(例如，在用mTOR抑制剂处理不成熟心肌细胞后)。一种或多种肌节蛋白的表达增加可增强心肌细胞的收缩性。在一些方面，心肌细胞表现出TNNI3的总含量或量增加，以及在一些方面，TNNI3含量或量相对于TNNI3的慢骨骼形式增加。在一些方面，心肌细胞表现出MYH7含量或蛋白质相对于MYH6含量或蛋白质(例如，在人中)增加。在一些实施方案中，心肌细胞中的TNNI3表达如与不成熟心肌细胞相比增加了近5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍。在一些方面，心肌细胞的收缩性可通过测量细胞运动(例如，使用一种或多种成像方法)来测量。将随着心肌细胞收缩而弯曲的软基底可与一种或多种成像方法结合使用以定量收缩性。在一些方面，心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比具有增加的收缩性。
在一些实施方案中，心肌细胞是代谢成熟的心肌细胞。在一些方面，心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比具有增加的代谢收缩性。在一些实施方案中，心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比具有增加的氧消耗量和/或细胞外酸化率。代谢成熟可使用海马线粒体应激代谢测定(Agilent)进行定量。该测定可被用于测量对一种或多种影响线粒体功能的化合物(例如，小分子化合物)作出响应的耗氧率和细胞外酸化率。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出类似于内源性成熟心肌细胞形态的形态。在一些实施方案中，心肌细胞形成杆状细胞。在一些实施方案中，心肌细胞表现出有组织的肌节结构。在一些方面，平均肌节长度为1.0至4.0μm、1.5至3.5μm或2.0至3.0μm。在一些方面，平均肌节长度为约1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm或3.0μm。
在一些方面，心肌细胞表现出成熟的离子通道表达谱。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的离子通道表达(即，与不成熟心肌细胞相比)。离子通道表达对于KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c或SERCA2a(ATP2a2)中的一者或多者可能是增加的。在一些方面，KCNJ2在心肌细胞中的表达以剂量依赖性方式增加(例如，在2D或3D培养中用一种或多种心肌细胞成熟因子处理不成熟心肌细胞后)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的SCN5a、KCNJ2和RYR2的表达(即，与不成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞的静息膜电位在-70至-150mV、-75至-125mV、-80至-100mV或-85至-95mV的范围内。在一些实施方案中，心肌细胞的静息膜电位为约-85mV、-86mV、-87mV、-88mV、-89mV、-90mV、-91mV、-92mV、-93mV、-94mV或-95mV。在某些实施方案中，心肌细胞的静息膜电位为小于或等于-70mV。在一些实施方案中，心肌细胞的上行速度在150至350伏/秒、175至325伏/秒、200至300伏/秒或225至275伏/秒的范围内。在一些实施方案中，心肌细胞的上行速度为约200伏/秒、210伏/秒、220伏/秒、230伏/秒、240伏/秒、250伏/秒、260伏/秒、270伏/秒、280伏/秒、290伏/秒或300伏/秒。在某些实施方案中，心肌细胞的上行速度大于200伏/秒，例如为约250伏/秒。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的转录因子(例如，核转录因子)表达。在一些实施方案中，心肌细胞表现出增加的一种或多种转录因子表达。在一些实施方案中，心肌细胞表现出核转录因子阻遏子元件-1沉默转录因子(REST)(也称为神经元限制性沉默因子)的表达增加(即，如与不成熟心肌细胞相比)。在一些方面，REST的表达压制HCN4的表达。在一些实施方案中，心肌细胞表现出REST表达以剂量依赖性方式增加(例如，在2D或3D培养中用一种或多种心肌细胞成熟因子处理不成熟心肌细胞后)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出选自由以下组成的组的转录因子的表达增加：REST/NRSF、GATA4、TBX20、BRG1、YAP、ERBB2、PITX2、MEIS1、ATA4、Nkx2-5、TBX5、NFAT、TEAD、HAND、CHF1、FoxO3/FoxO4、CHF1/Hey2、CHF1/Hey2、FoxO1、Mef2C、SRF、p53、NFkB以及它们的组合。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径调控因子的表达增加(即，如与不成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出氧化磷酸化途径调控因子PGC1-α(PPARGC1a)的表达增加。成熟心肌细胞由从糖酵解获取能量转变为氧化磷酸化。PGC1α的上调可能加强与氧化磷酸化相关的途径。在一些实施方案中，代谢主要由脂肪酸发生，例如由脂肪酸β-氧化(例如，而不是糖酵解)发生。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出脑利钠肽(BNP)的表达增加(即，如与不成熟心肌细胞相比)。在一些实施方案中，心肌细胞表现出利钠肽B(NPPB)的表达增加。
在一些实施方案中，心肌细胞表现出线粒体含量增加(即，如与不成熟心肌细胞相比)。例如，心肌细胞可具有增加的线粒体长度和增加的线粒体膜电位。在一些实施方案中，线粒体占心肌细胞的按体积计的约5％至70％、10％至60％、15％至50％或20％至40％。在一些方面，线粒体以晶体状晶格图案分布在整个心肌细胞中。
在一些实施方案中，心肌细胞具有约0.15至2.5米/秒、0.2至2.0米/秒、0.25至1.5米/秒或0.3至1.0米/秒的传导速度。在一些实施方案中，心肌细胞具有约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0米/秒的传导速度。
在一些实施方案中，心肌细胞表达作为内源性成熟心肌细胞的特征的选自由以下组成的组的至少一种标志物：TNNT2、TNNI3、MYH7、MYH6、KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c、SERCA2a(ATP2a2)、NPPB(BNP)、REST和PPARGC1a(PGC1a)。在一些实施方案中，心肌细胞表达作为内源性成熟心肌细胞的特征的选自由以下组成的组的至少一种标志物：TNNT2、TNNI3、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。
心肌细胞是由任何起始细胞在体外分化而成，因为本发明不意图受限于心肌细胞所衍生自的起始细胞。示例性起始细胞包括但不限于不成熟心肌细胞或其任何前体，诸如心脏祖细胞、多能干细胞、胚胎干细胞和诱导型多能干细胞。在一些实施方案中，心肌细胞是由经重编程的细胞、经部分重编程的细胞(即，这样的体细胞(例如成纤维细胞)，其已经被部分重编程为以介于诱导型多能性细胞与该诱导型多能性细胞所衍生自的所述体细胞之间的中间状态存在)或经转分化的细胞在体外分化而成。在一些实施方案中，本文公开的心肌细胞可由不成熟心肌细胞或其前体在体外分化而成。在一些实施方案中，心肌细胞是由选自由以下组成的组的前体在体外分化而成：不成熟心肌细胞、心脏祖细胞和多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞选自由胚胎干细胞和诱导型多能干细胞组成的组。在一些实施方案中，心肌细胞或心肌细胞所衍生自的多能干细胞是人的。在一些实施方案中，心肌细胞是人的。
在一些实施方案中，心肌细胞是未经遗传修饰的。在一些实施方案中，心肌细胞在不存在细胞的遗传修饰的情况下获得其与原生心肌细胞所共有的特征。在一些实施方案中，心肌细胞是经遗传修饰的。
在一些方面，本公开提供了包含本文所述的心肌细胞的细胞系。在一些实施方案中，心肌细胞可被冷冻、解冻和传代。心肌细胞可被传代至少5次而没有显著的形态变化。
本公开的方面涉及根据本文所述的方法生产的心肌细胞的经分离的群体。在一些实施方案中，心肌细胞群体是通过使至少一种不成熟心肌细胞与至少一种本文所述的心肌细胞成熟因子接触而生产的。
本公开的方面涉及包含本文所述的细胞(例如，心肌细胞)的经分离的群体的微囊。微囊是本领域众所周知的。微囊的合适实例描述于文献(例如，Orive等人,“Application of cell encapsulation for controlled delivery of biologicaltherapeutics”,Advanced Drug Delivery Reviews(2013),dx.doi.org/10.1016/j.addr.2013.07.009；Hernandez等人,“Microcapsules and microcarriers for in situcell delivery”,Advanced Drug Delivery Reviews 2010；62:711-730；Murua等人,“Cellmicroencapsulation technology:Towards clinical application”,Journal ofControlled Release2008；132:76-83；以及Zanin等人,“The development ofencapsulated cell technologies as therapies for neurological and sensorydiseases”,Journal of Controlled Release 2012；160:3-13)中。微囊可以多种方式配制。示例性微囊包含由聚阳离子层包围的海藻酸盐核心，该聚阳离子层由外部海藻酸盐膜覆盖。聚阳离子膜形成赋予稳定性和生物相容性的半透膜。聚阳离子的实例包括但不限于聚L-赖氨酸、聚L-鸟氨酸、壳聚糖、经乳糖修饰的壳聚糖、以及光聚合生物材料。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生包含具有共价缀合的寡肽的海藻酸盐核心的骨架，该寡肽具有RGD序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生以共价方式强化的微囊，该微囊具有稳定性得以增强的以化学酶法工程化的海藻酸盐。在一些实施方案中，海藻酸盐核心被修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合来组装的膜模拟薄膜。在一些实施方案中，微囊由使用差向异构酶以酶法修饰的海藻酸盐组成。在一些实施方案中，微囊在微囊膜的相邻层之间包含共价键。在某一实施方案中，微囊包含含有与酚部分偶联的海藻酸盐的亚筛尺寸囊。在一些实施方案中，微囊包含含有海藻酸盐-琼脂糖的骨架。在一些实施方案中，心肌细胞在囊封在海藻酸盐内之前用PEG加以修饰。在一些实施方案中，细胞(例如，心肌细胞)的经分离的群体被囊封在光反应性脂质体和海藻酸盐中。应了解，微囊中采用的海藻酸盐可用其他适合生物材料替换，该生物材料包括但不限于PEG、壳聚糖、PES中空纤维、胶原、透明质酸、具有RGD的右旋糖酐、EHD和PEGDA、PMBV和PVA、PGSAS、琼脂糖、具有明胶的琼脂糖、PLGA、以及这些生物材料的多层实施方案。
在一些实施方案中，包含根据本文所述的方法生产的心肌细胞的群体的组合物也可被用作机械装置的功能部件。例如，装置可在半透膜后面含有心肌细胞的群体(例如，由不成熟心肌细胞或其前体的群体生产)，该半透膜阻止细胞群体通过，将它们保留在装置中。装置的其他实例包括考虑用于植入到心脏疾病患者内或用于体外疗法的装置。
本公开的各个方面涉及包括本文所述的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的经分离的群体的测定。在一些实施方案中，该测定可被用于鉴定一种或多种促进或抑制成熟心肌细胞命运的候选剂。在一些实施方案中，该测定可被用于鉴定一种或多种促进至少一种不成熟心肌细胞或其前体分化为心肌细胞的候选剂。在一些实施方案中，该测定可被用于鉴定一种或多种促进处于衰老状态的不成熟心肌细胞向处于静止状态的成熟心肌细胞转变的候选剂。
本公开考虑了这样的方法，其中根据本文所述的方法从衍生自提取或分离自患有疾病(例如，心力衰竭或心脏相关病症)的个体的细胞的iPS细胞产生心肌细胞，并且将这些心肌细胞与来自未患该疾病的健康个体的正常心肌细胞比较以鉴定该心肌细胞与正常心肌细胞之间的差异，该差异可以用作疾病的标志物(例如，表观遗传和/或遗传)。在一些实施方案中，从患有心力衰竭的个体获取心肌细胞，并将该心肌细胞与正常心肌细胞比较，以及然后将该心肌细胞重编程为iPS细胞并且分析该iPS细胞中存在于从患有心力衰竭的个体获取的心肌细胞中、但不存在于正常心肌细胞中的遗传和/或表观遗传标志物，以鉴定标志物(例如，心力衰竭前)。在一些实施方案中，iPS细胞和/或来源于患者的心肌细胞被用于筛选剂(例如，能够调节导致心力衰竭表型的基因的剂)。
心肌细胞的存在的确认和鉴定
可以使用本领域普通技术人员常用的任何手段来确认如与衰老心肌细胞的存在相比的静止心肌细胞的存在。可以使用本领域普通技术人员常用的任何手段来确认心肌细胞(例如通过暴露于如本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子使至少一种不成熟心肌细胞或其前体分化而生产的成熟心肌细胞)的存在。
在一些实施方案中，静止标志物的存在可以通过检测一种或多种指示静止状态的标志物的存在或不存在来完成。在一些实施方案中，该方法可以包括检测静止标志物p16、p53和/或p130的阳性表达。在一些实施方案中，该方法可以包括检测增殖标志物Ki67、细胞周期蛋白C1和/或E2F的阴性表达。
在一些实施方案中，心肌细胞标志物(例如经化学诱导的心肌细胞)的存在可以通过检测一种或多种指示内源性心肌细胞的标志物的存在或不存在来完成。在一些实施方案中，该方法可以包括检测心肌细胞标志物的阳性表达(例如存在)。在一些实施方案中，该方法可以包括检测一种或多种肌节蛋白(例如，心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、心肌肌钙蛋白I(TNNI3)、肌球蛋白重链蛋白6(MYH6)和肌球蛋白重链蛋白7(MYH7))的阳性表达。在一些实施方案中，该方法可以包括检测一种或多种离子通道(例如KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a(ATP2a2))的阳性表达。在一些实施方案中，该方法可以包括检测脑利钠肽(BNP)的阳性表达。在一些实施方案中，该方法可以包括检测一种或多种转录因子(例如，REST)的阳性表达。在一些实施方案中，该方法可以包括检测氧化磷酸化途径的一种或多种调控因子(例如，PGC1-α(PPARGC1a))的阳性表达。在一些实施方案中，可以使用试剂(例如，用于检测TNNT2、TNNI3和/或KCNJ2的试剂)检测标志物。在一个方面，本文的心肌细胞表达TNNI3和KCNJ2，并且不表达显著水平的将指示不成熟心肌细胞的其他标志物。在一个方面，本文的心肌细胞表达TNNT2和KCNJ2，并且不表达显著水平的将指示不成熟心肌细胞的其他标志物。心肌细胞还可以通过特定标志物的下调来表征。例如，心肌细胞可通过HCN4的统计学上显著的下调来表征。
例如，用于标志物的试剂可以是例如针对标志物的抗体或用于RT-PCR或PCR反应(例如，半定量或定量RT-PCR或PCR反应)的引物。此类标志物可以用于评估是否已产生心肌细胞。抗体或其他检测试剂可以与标签，例如用于检测中的放射性标签、荧光标签(例如，GFP)或比色标签连接。如果检测试剂是引物，则它可以以干制剂(例如，冻干)或溶液形式供应。
至少一种不成熟心肌细胞从衰老状态向静止状态的进展可以通过确定作为静止心肌细胞的特征的标志物的表达来监测。在一些工艺中，某些标志物的表达是通过检测标志物的存在或不存在来确定的。替代地，某些标志物的表达可以通过测量该标志物在细胞培养物或细胞群体的细胞中存在的水平来确定。在某些工艺中，确定作为静止心肌细胞的特征的标志物的表达以及作为该静止心肌细胞所衍生自的衰老心肌细胞的特征的标志物的显著表达的缺乏。
至少一种不成熟心肌细胞或其前体向心肌细胞的进展可以通过确定作为成熟心肌细胞的特征的标志物的表达来监测。在一些工艺中，某些标志物的表达是通过检测标志物的存在或不存在来确定的。替代地，某些标志物的表达可以通过测量该标志物在细胞培养物或细胞群体的细胞中存在的水平来确定。在某些工艺中，确定作为成熟心肌细胞的特征的标志物的表达以及作为该成熟心肌细胞所衍生自的不成熟心肌细胞或其前体的特征的标志物的显著表达的缺乏。
如结合监测来自不成熟心肌细胞的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的产生所描述的，可以使用本领域普通技术人员通常已知的方法使用定性或半定量技术诸如印迹转移法和免疫细胞化学法测量标志物表达。替代地，可以通过本领域普通技术人员已知的方法通过使用诸如定量PCR的技术来准确地定量标志物表达。此外，可以利用用于测量细胞外标志物含量的技术(诸如ELISA)。
应当理解，本发明不局限于本文作为心肌细胞标志物列出的那些标志物，并且本发明还涵盖诸如细胞表面标志物、抗原和其他基因产物的标志物，包括EST、RNA(包括微小RNA和反义RNA)、DNA(包括基因和cDNA)以及它们的部分。
心肌细胞的富集、分离和纯化
本发明的另一个方面涉及从细胞的异质群体，诸如包含成熟心肌细胞和成熟心肌细胞所衍生自的不成熟心肌细胞或其前体的细胞的混合群体中分离心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的群体。在一些方面，静止心肌细胞群体是从细胞的异质群体，诸如包含衰老心肌细胞和静止心肌细胞的细胞的混合群体中分离的。由上述工艺中任何工艺生产的心肌细胞群体可以通过使用存在于心肌细胞上、不存在于成熟心肌细胞所衍生自的不成熟心肌细胞或其前体上的任何细胞表面标志物进行富集、分离和/或纯化。此类细胞表面标志物也被称为亲和标签，它对心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)具有特异性。对心肌细胞具有特异性的亲和标签的实例是对存在于心肌细胞的细胞表面上、但基本上不存在于其它细胞类型(例如不成熟心肌细胞)上的标志物分子如多肽具有特异性的抗体、配体或其它结合剂。在一些工艺中，与心肌细胞上的细胞表面抗原结合的抗体用作亲和标签，以用于富集、分离或纯化由本文所述的工艺生产的经化学诱导(例如通过与如本文所述的至少一种心肌细胞成熟因子接触)的心肌细胞。此类抗体是已知的，并且可以商购获得。
熟练的技术人员将很容易理解使用抗体富集、分离和/或纯化心肌细胞的工艺。例如，在一些实施方案中，将试剂(诸如抗体)与包含心肌细胞的细胞群体一起温育，其中该细胞群体已被处理以减少细胞间和基底粘附。然后对细胞群体进行洗涤、离心和重悬。在一些实施方案中，如果该抗体尚未用标签进行标记，则将细胞悬浮液与二抗(诸如能够与一抗结合的FITC缀合的抗体)一起温育。然后对心肌细胞进行洗涤、离心，并重悬于缓冲液中。然后使用荧光激活细胞分选仪(FACS)对心肌细胞悬浮液进行分析和分选。将抗体结合的荧光重编程细胞与未结合的非荧光细胞分开收集，从而使心肌细胞与细胞悬浮液中存在的其他细胞(例如不成熟心肌细胞或其前体)分离。
在本文所述的工艺的另一个实施方案中，可通过使用替代的基于亲和力的方法或通过使用对心肌细胞具有特异性的相同或不同标志物的额外轮次分选，进一步纯化包含心肌细胞的经分离的细胞组合物。例如，在一些实施方案中，FACS分选被用于首先使细胞群体中单独或与KCNJ2表达或可替代地与本文公开的心肌细胞标志物一起表达TNNT2的心肌细胞与不表达那些标志物之一的细胞(例如阴性细胞)分离。在一些方面，TNNI3和/或MYH7也可单独或与TNNT2和/或KCNJ2组合用作FACS分选的标志物。第二FACS分选(例如使用FACS再次分选阳性细胞以分离与第一分选相比对不同标志物呈阳性的细胞)富集重编程细胞的细胞群体。
在替代的实施方案中，FACS分选被用于通过对存在于大多数不成熟心肌细胞上、但不存在于心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)上的标志物进行阴性分选来分离细胞。
在本文所述的工艺的一些实施方案中，在不使用抗体的情况下对心肌细胞进行荧光标记，然后通过使用荧光激活细胞分选仪(FACS)将该心肌细胞与未经标记的细胞分离。在此类实施方案中，编码GFP、YFP的核酸或编码可表达荧光标志物基因(如编码荧光素酶的基因)的另一种核酸被用于使用上述方法标记重编程细胞。
除了刚刚描述的程序外，经化学诱导的心肌细胞也可通过用于细胞分离的其他技术进行分离。此外，心肌细胞也可通过在促进心肌细胞的选择性存活或选择性扩增的生长条件下进行连续继代培养的方法来富集或分离。此类方法为本领域的普通技术人员所知。
使用本文所述的方法，可以从不成熟心肌细胞或其前体(其是通过本文所述的方法从多能干细胞分化而成的)在体外生产经富集、分离和/或纯化的心肌细胞群体。在一些实施方案中，优选的富集、分离和/或纯化方法涉及由人不成熟心肌细胞或其前体(其是从人多能干细胞或从人诱导型多能干(iPS)细胞分化而成的)体外生产人心肌细胞。在此类实施方案中，在心肌细胞从先前衍生自iPS细胞的不成熟心肌细胞分化而成的情况下，心肌细胞对于从中获得细胞以产生iPS细胞的受试者而言可以是自体的。
使用本文所述的方法，如与化学诱导不成熟心肌细胞或前体之前的细胞群体相比，心肌细胞的经分离的细胞群体的心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)含量富集了至少约1至约1000倍。在一些实施方案中，如与化学诱导不成熟心肌细胞或前体群体之前的细胞群体相比，心肌细胞群体被诱导、增强、富集或增加了至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、50％、70％、80％、90％、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多倍。
包含心肌细胞的组合物
本发明的一些实施方案涉及包含心肌细胞的细胞组合物，如细胞培养物或细胞群体，其中该心肌细胞衍生自至少一种不成熟心肌细胞。在一些实施方案中，细胞组合物包含不成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，细胞组合物包含静止心肌细胞，其中该静止心肌细胞已由至少一种衰老心肌细胞衍生得到。在一些实施方案中，细胞组合物包含衰老心肌细胞。
根据某些实施方案，经化学诱导的心肌细胞是哺乳动物细胞，并且在优选的实施方案中，此类心肌细胞是人心肌细胞。在一些实施方案中，不成熟心肌细胞已由多能干细胞(例如，人多能干细胞)衍生得到。
在一些实施方案中，细胞组合物包含成熟心肌细胞，其中该成熟心肌细胞是使用本文所述的方法由至少一种不成熟心肌细胞衍生得到。例如，细胞组合物包含通过在2D或3D培养中培养不成熟心肌细胞获得的成熟心肌细胞，其中使该不成熟心肌细胞与一种或多种心肌细胞成熟因子接触。
本发明的其他实施方案涉及包含通过如本文公开的方法生产的心肌细胞的组合物，诸如经分离的细胞群体或细胞培养物。在此类实施方案中，心肌细胞占心肌细胞群体中总细胞的小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约12％、小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。在一些实施方案中，组合物包含心肌细胞的群体，该心肌细胞占细胞群体中总细胞的超过约90％，例如占细胞群体中总细胞的约至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少约99％、或约至少100％。
本发明的某些其他实施方案涉及包含心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)和心肌细胞所衍生自的不成熟心肌细胞或其前体的组合的组合物，诸如经分离的细胞群体或细胞培养物。在一些实施方案中，心肌细胞所衍生自的不成熟心肌细胞占经分离的细胞群体或培养物中总细胞的小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
本发明的另外的实施方案涉及通过本文所述的工艺生产并且包含经化学诱导的心肌细胞作为主要细胞类型的组合物，诸如经分离的细胞群体或细胞培养物。在一些实施方案中，本文所述的方法和工艺生产经分离的细胞培养物和/或细胞群体，其包含至少约99％、至少约98％、至少约97％、至少约96％、至少约95％、至少约94％、至少约93％、至少约92％、至少约91％、至少约90％、至少约89％、至少约88％、至少约87％、至少约86％、至少约85％、至少约84％、至少约83％、至少约82％、至少约81％、至少约80％、至少约79％、至少约78％、至少约77％、至少约76％、至少约75％、至少约74％、至少约73％、至少约72％、至少约71％、至少约70％、至少约69％、至少约68％、至少约67％、至少约66％、至少约65％、至少约64％、至少约63％、至少约62％、至少约61％、至少约60％、至少约59％、至少约58％、至少约57％、至少约56％、至少约55％、至少约54％、至少约53％、至少约52％、至少约51％或至少约50％的心肌细胞。
在另一个实施方案中，细胞(或细胞培养物)的经分离的细胞群体或组合物包含人心肌细胞。在其他实施方案中，如本文所述的方法和工艺可以生产经分离的细胞群体，其包含至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约24％、至少约23％、至少约22％、至少约21％、至少约20％、至少约19％、至少约18％、至少约17％、至少约16％、至少约15％、至少约14％、至少约13％、至少约12％、至少约11％、至少约10％、至少约9％、至少约8％、至少约7％、至少约6％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％的心肌细胞。在优选的实施方案中，经分离的细胞群体可以包含人心肌细胞。在一些实施方案中，计算细胞培养物或群体中心肌细胞的百分比，无需考虑培养物中剩余的饲养细胞。
本发明的又其他实施方案涉及包含心肌细胞和心肌细胞所分化自或成熟自的不成熟心肌细胞或其前体的混合物的组合物，诸如经分离的细胞群体或细胞培养物。例如，对于约每95个不成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约5个心肌细胞的细胞培养物或细胞群体。在其他实施方案中，对于约每5个不成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约95个心肌细胞的细胞培养物或细胞群体。此外，考虑了包含其他比率的心肌细胞与不成熟心肌细胞或其前体的细胞培养物或细胞群体。例如，对于约每1,000,000个、或至少100,000个细胞、或至少10,000个细胞、或至少1000个细胞或500个、或至少250个或至少100个或至少10个不成熟心肌细胞或其前体，可产生包含至少约1个心肌细胞的组合物。
本发明的进一步实施方案涉及包含展示出内源性心肌细胞的至少一种特征的人细胞(包括人心肌细胞)的组合物，诸如细胞培养物或细胞群体。
在本发明的优选实施方案中，心肌细胞的细胞培养物和/或细胞群体包含为非重组细胞的人心肌细胞。在此类实施方案中，细胞培养物和/或细胞群体不含或基本上不含重组人心肌细胞。
心肌细胞成熟因子
本公开的方面涉及使不成熟心肌细胞或其前体与心肌细胞成熟因子接触，例如，以诱导不成熟心肌细胞成熟或其前体分化为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。术语“心肌细胞成熟因子”是指促进或有助于至少一种不成熟心肌细胞或其前体转化为心肌细胞的剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导多能细胞(例如，iPSC或hESC)分化为不成熟心肌细胞，例如，根据本文所述的方法。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导不成熟心肌细胞成熟为心肌细胞，例如，根据本文所述的方法。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子诱导衰老心肌细胞向静止心肌细胞转变。
一般来说，可将至少一种本文所述的心肌细胞成熟因子单独使用，或与其他心肌细胞成熟因子组合使用，以根据如本文公开的方法产生心肌细胞。在一些实施方案中，本文所述的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种心肌细胞成熟因子被用于产生心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的方法中。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR途径的调节剂(例如，抑制剂)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括mTOR途径的抑制剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括PI3K和/或Akt的抑制剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环或其他分子。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由Torin1、Torin2、雷帕霉素、依维莫司和坦罗莫司组成的组。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin2。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是雷帕霉素。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是依维莫司(everolimus)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是坦罗莫司(temsirolimus)。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括衰老细胞调节剂。例如，衰老细胞调节剂可以是衰老清除剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子减少衰老细胞，并且在某些方面消除衰老细胞。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由以下组成的组：非瑟酮(fisetin)、木犀草素(luteolin)、姜黄素(curcumin)、格尔德霉素(geldanamycin)、坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimyycin)、荜茇酰胺(piperlongumine)、FOXO4相关肽、Nutlin-3a、乌巴因(ouabain)、原海葱苷A、地高辛、槲皮素、达沙替尼、navitoclax以及它们的组合。在某些实施方案中，心肌细胞成熟因子是槲皮素。在某些方面，槲皮素增加p53和/或Kir2.1的表达。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括细胞周期调控因子p53的调节剂(例如，上调剂)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括p53上调剂或激活剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子包括小分子、核酸、氨基酸、代谢物、多肽、抗体和抗体样分子、适体、大环或其他分子。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是一种MDM2抑制剂。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由以下组成的组：RG7112、依达奴林(idasanutlin)、AMG-232、APG-115、BI-907828、CGM097、西瑞马林(siremadlin)、米拉美坦(milademetan)、nutlin-3a以及它们的组合。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是MDM2抑制剂(例如，nutlin-3a)。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是衰老清除剂(例如，槲皮素)。
在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子选自由以下组成的组：Torin1、nutlin-3a和槲皮素。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是nutlin-3a。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子是槲皮素。在一些实施方案中，通过施用坚果素-3a、槲皮素和Torin1中的一种或多种来上调(例如，协同地)p53。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子不是Torin1。在一些实施方案中，心肌细胞成熟因子不是mTOR抑制剂。
组合物和药盒
本文描述了组合物，其包含本文所述的心肌细胞(例如，成熟和/或静止心肌细胞)。在一些实施方案中，组合物还包括本文所述的成熟因子和/或细胞培养基。本文还描述了包含本文所述的化合物的组合物(例如，包含一种或多种本文所述的化合物的细胞培养基)。
本文还描述了用于实施本文公开的方法和用于制造本文公开的心肌细胞(例如，成熟和/或静止心肌细胞)的药盒。本文还描述了用于治疗慢性心力衰竭和降低室性心律失常发生率的药盒。在一个方面，药盒包含至少一种不成熟和/或衰老心肌细胞或其前体和至少一种如本文所述的成熟因子，并且任选地，药盒可以进一步包含使用本文所述的方法(例如，使用2D或3D培养)将至少一种不成熟心肌细胞或其前体转化为成熟心肌细胞群体的说明书。在一些实施方案中，药盒包括至少两种成熟因子。在一些实施方案中，药盒包括至少三种成熟因子。在一些实施方案中，药盒包括成熟因子的任何组合。
在一些实施方案中，药盒中的化合物可以在水密或气密容器中提供，在一些实施方案中，该容器基本上不含药盒中的其他成分。化合物可以在多于一个容器中供应，例如，它可以在具有用于预定数目的反应(例如1、2、3或更多数量的单独反应)以将不成熟和/或衰老心肌细胞或其前体诱导为成熟和/或静止心肌细胞的足够试剂的容器中供应。成熟因子可以以任何形式(例如，液体、经干燥或经冻干的形式)提供。优选本文所述的一种或多种化合物(例如，成熟因子)是基本上纯的和/或无菌的。当本文所述的一种或多种化合物以液体溶液形式提供时，该液体溶液优选为水溶液，无菌水溶液是优选的。当本文所述的一种或多种化合物以经干燥的形式提供时，一般通过添加合适的溶剂来进行重构。溶剂(例如，无菌水或缓冲液)可任选地提供于药盒中。
在一些实施方案中，药盒进一步任选地包含信息材料。信息材料可以是与本文所述的方法和/或一种或多种本文所述的化合物在本文所述的方法中的使用有关的描述性资料、指导性资料、市场营销资料或其它资料。
药盒的信息材料不限于其说明书或信息性材料。在一个实施方案中，信息材料可以包括关于以下的信息：化合物的生产、化合物的分子量、浓度、有效日期、批次或生产地点信息等等。在一个实施方案中，信息材料涉及施用该化合物的方法。另外地，药盒的信息材料在其形式上不受限制。在许多情况下，信息材料例如说明书以印刷品，例如印刷的文字、图画和/或照片，例如标签或印刷单(printed sheet)的形式提供。然而，信息材料也可以其它格式，如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录来提供。在另一个实施方案中，药盒的信息材料是联系信息，例如物理地址、电子邮箱地址、网站或电话号码，从这里药盒的用户可获得有关本文所述的化合物和/或其在本文所述的方法中的使用的大量信息。当然，信息材料也可以任何格式组合来提供。
在一个实施方案中，信息材料可以包括以对于执行本文所述的方法合适的方式，例如，以合适的剂量、剂型或施用方式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用方式)(例如，对体外细胞或体内细胞)施用一种或多种如本文所述的化合物(例如，成熟因子)的说明。在另一个实施方案中，信息材料可以包括将一种或多种本文所述的化合物施用给合适受试者(例如，人，例如，患有或处于本文所述病症的风险中的人)或体外细胞的说明。
除一种或多种本文所述的化合物外，药盒的组合物还可以包括其他成分，诸如溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如，苦味拮抗剂或甜味剂)、香料或其他化妆品成分，和/或用于治疗本文所述的疾患或病症的另外的剂。替代地，该其它成分可以包括在药盒中，但是在与本文所述的化合物不同的组合物或容器中。在此类实施方案中，药盒可以包括将一种或多种本文所述的化合物与其他成分混合的说明，或将一种或多种本文所述的化合物与其他成分一起使用的说明，例如，在施用前将两种剂混合的说明。
药盒可以包括供含有至少一种如本文所述的成熟因子的组合物用的一个或多个容器。在一些实施方案中，药盒含有供一种或多种组合物和信息材料用的分开的容器(例如，供两种剂用的两个分开的容器)、分隔器或隔室。例如，组合物可容纳在瓶、小瓶或注射器中，并且信息材料可容纳在塑料套或包装中。在其他实施方案中，药盒的分开的元件容纳在单个未分隔的容器中。例如，组合物容纳在其上附有呈标签形式的信息材料的瓶、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，药盒包括多个(例如，一套)单个容器，其各自容纳本文所述的化合物的一种或多种单位剂型(例如，本文所述的剂型)。例如，药盒包括多个注射器、安瓿、箔包，或泡罩包装，其各自容纳单一单位剂量的本文所述的化合物。药盒的容器可以是气密的、防水的(例如，湿气或蒸发的变化为不可渗透的)和/或避光的。
药盒任选地包括适合于施用组合物的装置，例如注射器、吸入器、吸管、镊子、量勺、滴管(例如，滴眼管)、拭子(例如，棉拭子或木制拭子)或任何此类递送装置。在优选的实施方案中，该装置是例如被包装用于手术插入的医疗植入装置。
药盒还可以包括用于检测心肌细胞标志物，例如用于本文所述的标志物的组分，例如用于检测成熟心肌细胞的试剂。或者在一些实施方案中，药盒还可包括用于检测心肌细胞的阴性标志物以用于成熟心肌细胞的阴性选择或用于鉴定不表达这些阴性标志物的细胞(例如，心肌细胞)的目的的试剂。该试剂可以是例如针对标志物的抗体或用于RT-PCR或PCR反应(例如，半定量或定量RT-PCR或PCR反应)的引物。此类标志物可以用于评估iPS细胞是否已经产生。如果检测试剂是抗体，则它可以以干制剂(例如，经冻干)或以溶液形式供应。抗体或其他检测试剂可以与标签，例如用于检测中的放射性标签、荧光标签(例如，GFP)或比色标签连接。如果检测试剂是引物，则它可以以干制剂(例如，冻干)或溶液形式供应。
药盒包括心肌细胞，例如，衍生自相同类型的不成熟和/或衰老心肌细胞或其前体的成熟和/或静止心肌细胞，例如用作阳性细胞类型对照。
施用细胞的方法
在一个实施方案中，本文所述的细胞，例如成熟心肌细胞群体是可移植的，例如，心肌细胞群体可被施用给受试者。在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如成熟静止心肌细胞群体是可移植的，例如，心肌细胞群体可被施用给受试者。在一些实施方案中，被施用了心肌细胞群体的受试者与用来分化成心肌细胞的多能干细胞所获自的受试者是同一受试者(例如用于自体细胞疗法)。在一些实施方案中，受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，受试者患有慢性心力衰竭，或者是正常受试者。例如，用于移植的细胞(例如包含心肌细胞群体的组合物)可以是适合于移植的形式。
该方法可以进一步包括将细胞施用给有此需要的受试者，例如哺乳动物受试者，例如人受试者。细胞的来源可以是哺乳动物，优选人。细胞的来源或接受者也可以是非人受试者，例如动物模型。术语“哺乳动物”包括生物体，其包括小鼠、大鼠、母牛、绵羊、猪、兔子、山羊、马、猴、狗、猫，并且优选人。同样，可移植细胞可以从这些生物体中的任何生物体(包括非人转基因生物体)获得。在一个实施方案中，可移植细胞是经遗传工程化的，例如，该细胞包括外源基因或已被遗传工程化以使内源基因失活或改变。
包含心肌细胞群体的组合物可以使用可植入装置施用给受试者。可植入装置和相关技术在本领域是已知的，并且可用作需要本文所述的化合物或组合物的连续或定时释放递送的递送系统。此外，可植入装置递送系统可用于靶向化合物或组合物递送的特定点(例如，局部部位、器官)。Negrin等人，Biomaterials,22(6):563(2001)。在本发明中也可使用涉及替代递送方法的定时释放技术。例如，基于聚合物技术、持续释放技术和囊封技术的定时释放制剂(例如聚合物、脂质体)也可被用于递送本文所述的化合物和组合物。
药物组合物
对于向受试者施用，通过如本文公开的方法生产的细胞群体，例如心肌细胞群体(通过使至少一种不成熟心肌细胞与至少一种成熟因子(例如，如本文所述的任一种、两种、三种或更多种成熟因子)接触来生产)可例如以药学上可接受的组合物施用于受试者。这些药学上可接受的组合物包含治疗有效量的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的如上所述的成熟心肌细胞群体。在一些方面，药学上可接受的组合物包含治疗有效量的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的如上所述的成熟、静止心肌细胞群体。
如下文中详细描述，本发明的药物组合物可被特别配制来以固体或液体形式施用，该形式包括适合于以下的那些：(1)口服施用，例如灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣丸、胶囊、丸剂、片剂(例如以经颊、舌下和全身性吸收为目标的那些)、大丸剂、粉末、颗粒剂、用于向舌施加的糊剂；(2)胃肠外施用，例如通过以例如无菌溶液或悬浮液、或持续释放制剂形式进行皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部施用，例如以乳膏、软膏或受控释放贴剂或向皮肤施加的喷雾剂的形式；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏或泡沫的形式；(5)舌下；(6)眼部；(7)经皮；(8)经粘膜；或(9)经鼻。此外，化合物可被植入患者中或使用药物递送系统来注射。参见，例如，Urquhart等人，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis,编著“Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press,New York,1981)；美国专利第3,773,919号；和美国专利第35 3,270,960号。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指参与将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂，滑石，硬脂酸镁、钙或锌，或硬脂酸)或溶剂囊封材料。每种载体在可与制剂的其它成分相容并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素以及乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer's solution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清成分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，诸如乙醇；和(25)药物制剂中采用的其他无毒的相容物质。制剂中还可以存在润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、香料、防腐剂和抗氧化剂。术语诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可以互换使用。
如本文关于细胞群体所用的短语“治疗有效量”意指细胞群体中相关细胞(例如成熟心肌细胞)，或包含本发明的成熟心肌细胞的组合物的量，该量对于以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比在动物中的细胞的至少一个亚群中产生一些所需的治疗效果是有效的。例如，给受试者施用的成熟心肌细胞群体的量足以使慢性心力衰竭的至少一种症状(如心脏收缩功能或室性心律失常的发生率等)产生统计学上显著的、可测量的变化。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。一般来说，治疗有效量会随着受试者的病史、年龄、状况、性别，以及医学疾患的严重程度和类型，以及其他药物活性剂的施用而变化。
疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”意指延迟或预防此种疾病或病症的发作，逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与此种疾病或病症相关的疾患的进展或严重程度。在一个实施方案中，疾病或病症的症状被减轻了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。
如本文所用，术语“施用”是指通过导致组合物至少部分定位在所需部位从而产生所需效果的方法或途径将组合物置于受试者中。适用于本发明方法的施用途径包括局部施用和全身施用。一般来说，如与受试者的整个身体相比，局部施用导致更多的施用的心肌细胞被递送到特定位置，而全身施用则会导致心肌细胞基本上被递送到受试者的整个身体。
在施用经化合物处理的细胞的背景下，术语“施用”还包括将此种细胞移植在受试者中。如本文所用，术语“移植”是指将将至少一种细胞植入或转移至受试者的过程。术语“移植”包括，例如，自体移植(将一种或多种细胞从患者身上的一个位置移除并转移到同一患者身上的相同或另一个位置)、同种异体移植(同一物种成员之间的移植)和异种移植(不同物种成员之间的移植)。
成熟心肌细胞或包含成熟心肌细胞的组合物可以通过本领域已知的任何适当途径施用，该途径包括但不限于口服或胃肠外途径，包括静脉内、肌肉内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、肺部、鼻腔、直肠和局部(包括经颊和舌下)施用。
示例性施用方式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入、摄入或局部施加。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、脑室内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊髓内以及胸骨内注射和输注。在优选的实施方案中，组合物是通过静脉内输注或注射施用的。在其他优选的实施方案中，组合物是经由细胞贴剂施用的。在一些实施方案中，组合物是经由三维结构(例如，基质或支架)施用的。在一些实施方案中，组合物是经由微组织施用的。
如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常，动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拔鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括母牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种例如家猫，犬科物种例如狗、狐狸、狼，鸟类物种例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。患者或受试者包括前述各者的任何子组，例如以上全部，但排除一个或多个群组或物种诸如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文所述的方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可为雄性或雌性。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或母牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表与心脏收缩功能降低或室性心律失常相关的病症的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法和组合物可以用于治疗驯养的动物和/或宠物。
受试者可以是先前已被诊断患有或鉴定为罹患或患有以心脏收缩功能降低或室性心律失常为特征的病症的受试者。受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有心力衰竭(例如，慢性心力衰竭)的受试者。在一些方面，受试者可以是先前已被诊断患有或被鉴定为患有心脏相关疾病或病症的受试者。在一些方面，受试者可以是先前已被诊断患有先天性心脏病(例如，收缩性心脏病或由于组织工程化导致的心脏病)的受试者。
在本文所述的方面的一些实施方案中，该方法进一步包括在治疗受试者之前针对心脏收缩功能降低或室性心律失常对受试者进行诊断和/或选择。在一些方面，该方法进一步包括在治疗受试者之前针对心脏相关疾病或病症对受试者进行诊断和/或选择。在一些方面，该方法进一步包括在治疗受试者之前针对先天性心脏病对受试者进行诊断和/或选择。
本文所述的心肌细胞组合物可与机械支持装置(例如，用于支持心室恢复的心室辅助装置(VAD)或体外膜氧合(ECMO)系统)组合施用，或者与用于使心脏血运重建的心脏导管插入程序(例如，冠状动脉支架置入或球囊血管成形术，或外科旁路移植术)组合施用。本文所述的心肌细胞组合物可与药物活性剂组合共同施用于受试者。示例性药物活性化合物包括但不限于在以下文献中找到的那些：Harrison’s Principles of InternalMedicine,第13版，T.R.Harrison等人编著，McGraw-Hill N.Y.,NY；Physicians’DeskReference,第50版,1997,Oradell New Jersey,Medical Economics Co.；Pharmacological Basis of Therapeutics,第8版,Goodman and Gilman,1990；美国药典，国家处方集，USP XII NF XVII,1990；当前版本的Goodman and Oilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics；以及当前版本的The Merck Index，这些文献的全部的完整内容以其整体并入本文。
包含心肌细胞和/或药学活性剂的组合物可以以相同的药物组合物或者以不同的药物组合物(同时或在不同时间)施用给受试者。当在不同时间施用时，包含心肌细胞和/或药物活性剂的组合物可以在施用另一者的5分钟、10分钟、20分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、8小时、12小时、24小时内施用。当包含心肌细胞和/或药物活性剂的组合物以不同的药物组合物施用时，施用途径也可以不同。在一些实施方案中，给受试者施用包含心肌细胞的组合物。在其他实施方案中，给受试者施用包含药物活性剂的组合物。在另一个实施方案中，给受试者施用包含与药物活性剂混合的心肌细胞群体的组合物。在另一个实施方案中，给受试者施用包含心肌细胞群体的组合物和包含药物活性剂的组合物，其中施用基本上是同时进行的，或者是彼此相继进行的。
包含心肌细胞群体的组合物的施用的毒性和治疗功效可以通过例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中标准药物程序来确定。优选包含表现出较大治疗指数的心肌细胞群体的组合物。
包含心肌细胞群体的组合物的量可以使用几种完善的动物模型进行测试。
在一些实施方案中，从细胞培养测定和在动物研究中获得的数据可被用于配制供人使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包括ED50、同时具有极小或无毒性的循环浓度范围内。剂量可在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。
包含心肌细胞群体的组合物的治疗有效剂量也可以从细胞培养测定初步估算。替代地，也可以通过适当的生物测定来监测任何特定剂量的效果。
关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常对受试者进行监测以确定治疗提供治疗益处的时间，并决定是否增加或减少剂量、增加或减少施用频率、中止治疗、恢复治疗或对治疗方案做出其他修改。给药时间表可从每周一次到每天一次变化，这取决于许多临床因素。所需的剂量可以一次性施用，也可以分成若干亚剂量，例如2-4个亚剂量，并且在一段时间内，例如在全天以适当的间隔或以其他适当的时间表施用。此类亚剂量可以作为单位剂型施用。在一些实施方案中，施用是长期的，例如在数周或数月的时段内每天施用一剂或多剂。给药时间表的实例包括在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时段内每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或每天施用四次或更多次。
在本发明的另一个方面，该方法提供了如本文所公开的心肌细胞的经分离的群体的用途。在本发明的一个实施方案中，如本文所公开的心肌细胞的经分离的群体可用于生产药物组合物、用于移植到需要治疗的受试者，例如患有室性心律失常或心脏收缩功能降低(例如，慢性心力衰竭)或者处于患上这些疾病的风险中的受试者中。在一个实施方案中，心肌细胞的经分离的群体通常可以是经遗传修饰的。在另一个方面，受试者可能患有心律失常或心脏收缩功能降低或者处于患上室性心律失常或心脏收缩功能降低的风险中。在一些实施方案中，如本文所公开的心肌细胞的经分离的群体可以是自体和/或同种异体的。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在其他实施方案中，哺乳动物是人。
本发明的一个实施方案涉及治疗受试者的慢性心力衰竭的方法，该方法包括向患有慢性心力衰竭的患者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。其他实施方案涉及治疗受试者的室性心律失常的方法，该方法包括向患有室性心律失常的受试者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供了治疗心脏收缩功能降低的方法，该方法包括向患有心脏收缩功能降低的受试者施用包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗先天性心脏疾病的方法，该方法包括向患有先天性心脏疾病的受试者施用有效量的包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物。
在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可在任何生理上可接受的赋形剂中施用，其中该心肌细胞可找到用于复制、增殖和/或植入的适当位点。在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可以通过注射、导管等引入。在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可在液氮温度下冷冻并储存长时间段，并且能够在解冻后使用。如被冷冻，心肌细胞群体将通常储存在10％ DMSO、50％ FCS、40％RPMI 1640培养基或其他低温保护溶液中。一旦解冻，就可通过使用与如本文公开的培养心肌细胞相关的生长因子和/或饲养细胞来扩增细胞。
在一些实施方案中，如本文公开的心肌细胞群体可以药物组合物的形式供应，该组合物包含在充分无菌条件下制备用于人体施用的等渗赋形剂。关于医药制剂的一般原则，读者可参考Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy和CellularImmunotherapy,G.Morstyn和W.Sheridan编著,Cambridge University Press,1996；以及Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.D.Ball,J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。细胞赋形剂和包含如本文公开的心肌细胞群体的组合物的任何附带要素(element)的选择将根据用于施用的途径和装置进行调整。在一些实施方案中，包含心肌细胞群体的组合物还可以包含或附带有一种或多种促进心肌细胞的植入或功能动员的其他成分。合适的成分包括支持或促进心肌细胞或互补细胞类型粘附的基质蛋白。在另一个实施方案中，组合物可包含可再吸收或可生物降解的基质支架。
基因疗法可用于修饰细胞以替换基因产物、促进组织再生、治疗疾病或提高细胞在植入受试者中之后的存活率(即防止排斥反应)。
在本发明的一个方面，如本文公开的心肌细胞群体适合于全身施用或施用至目标解剖部位。心肌细胞群体可以例如移植到受试者的心脏中或心脏附近，或者可以全身施用，诸如但不限于动脉内或静脉内施用。在替代的实施方案中，本发明的心肌细胞群体可以通过各种适合植入心脏系统的方式施用，该方式包括但不限于肠胃外，包括静脉内和动脉内施用、鞘内施用、心室内施用、实质内施用、颅内、脑池内、纹状体内和黑质内施用。任选地，心肌细胞群体与免疫压制剂结合施用。
在一些实施方案中，可以根据良好医学实践，考虑到各个患者的临床状况、施用部位和方法、施用时间表、患者年龄、性别、体重和医疗从业者已知的其它因素对心肌细胞群体进行施用和给药。因此，出于本文目的的药学“有效量”是通过此类如本领域已知的考虑因素确定的。该量必须有效以达到改善，该改善包括但不限于如由本领域技术人员选择作为适当的量度的存活率的提高或恢复得更快，或症状的改善或消除以及其它指标。心肌细胞群体可以在以下地点施用于受试者：诊所、临床诊室、急诊科、医院病房、重症监护病房、手术室、导管套间(catheterization suites)和放射学套间(radiologic suites)。
在其他实施方案中，心肌细胞群体被存储用于日后植入/输注。心肌细胞群体可被分成多于一个等分部分或单位，以使得心肌细胞群体的一部分被保留用于日后应用，而另一部分则立即应用于受试者。细胞库中全部或部分细胞的中期至长期储存也在本发明的范围内，如美国专利申请第2003/0054331号和专利申请第WO 03/024215号中所公开的，并且通过引用方式以其整体并入。处理结束时，可将经浓缩的细胞加载到递送装置诸如注射器中，以用于通过本领域普通技术人员已知的任何手段置入到接受者中。
在一些实施方案中，心肌细胞群体可单独应用，也可与其他细胞，组织，组织碎片，生长因子(诸如VEGF和其他已知的血管生成或动脉生成生长因子)，生物活性或惰性化合物，可再吸收塑料支架，或旨在增强细胞群体的递送、功效、耐受性或功能的其他添加剂组合使用。在一些实施方案中，也可通过将DNA插入或通过放置在细胞培养物中以改变、增强或补充细胞功能的方式修饰心肌细胞群体，以达到结构或治疗目的。例如，用于干细胞的基因转移技术为本领域普通技术人员所已知，如(Morizono等人,2003；Mosca等人,2000)所公开，并且可以包括病毒转染技术，并且更具体地说，腺相关病毒基因转移技术，如(Walther和Stein,2000)和(Athanasopoulos等人,2000)所公开。也可以如(Murarnatsu等人,1998)中所公开执行基于非病毒的技术。
在另一个方面，在一些实施方案中，心肌细胞群体可与编码促血管生成生长因子的基因组合。还可以应用编码抗凋亡的因子或剂的基因。可通过本领域已知的任何技术添加基因(或基因的组合)，该技术包括但不限于腺病毒转导、“基因枪”、脂质体介导的转导和逆转录病毒或慢病毒介导的转导、质粒腺相关病毒。细胞可与携带基因递送媒介物的载体材料一起植入，该基因递送媒介物能够随时间推移释放和/或呈递基因给细胞从而使得可继续或启动转导。特别是当将细胞和/或含有该细胞的组织被施用于除细胞和/或组织所获自的患者以外的患者时，可将一种或多种免疫压制剂施用于接受该细胞和/或组织的患者以减轻且优选预防移植排斥。如本文所用，术语“免疫压制药物或剂”意图包括抑制或干扰正常免疫功能的药剂。适用于本文公开的方法的免疫压制剂的实例包括抑制T细胞/B细胞共刺激途径的剂，如经由CTLA4和B7途径干扰T细胞和B细胞的偶联的剂，如在美国专利公布号2002/0182211中所公开，该专利公布以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，免疫压制剂是环孢菌素A。其他实例包括吗替麦考酚酯(myophenylate mofetil)、雷帕霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方案中，免疫抑制药物与至少一种其他治疗剂一起施用。免疫压制药物以与施用途径相容的制剂施用，并且以足以实现所需治疗效果的剂量施用于受试者。在另一个实施方案中，将免疫压制药物瞬时施用足够长的时间以诱导对本发明的心肌细胞的耐受性。
本发明还考虑了包含有效量的心肌细胞群体的药物组合物。这些组合物包含有效数量的心肌细胞，其任选地与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合。在本发明的某些方面，心肌细胞群体在无菌盐水中被施用给需要移植的受试者。在本发明的其他方面，心肌细胞群体在汉克氏平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution,HBSS)或Isolyte S(pH7.4)中施用。也可使用其他方法，包括使用无血清细胞培养基。在一个实施方案中，在血浆或胎牛血清和DMSO中施用心肌细胞群体。在某些适应症中，向受试者全身施用心肌细胞群体可能是优选的，而在其他适应症中，在患病和/或受损组织的部位处或附近直接施用可能是优选的。
在一些实施方案中，心肌细胞群体可任选地包装在具有针对所需目的(如在施用于受试者之前重构或解冻(如果冷冻)心肌细胞群体)的书面说明的合适容器中。
鉴定增加成熟心肌细胞的产生的心肌细胞成熟因子的方法
本文描述了鉴定增加心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的产生的心肌细胞成熟因子或剂的方法。在某些实例中，提供了高含量且/或高通量的筛查方法。该方法包括使至少一种不成熟心肌细胞或其前体暴露于至少一种化合物(例如文库化合物或本文所述的化合物)并确定该化合物是否增加来自该至少一种不成熟心肌细胞或其前体的心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的产生。可使用本文所述的标志物中的一种或多种将细胞鉴定为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实例中，该至少一种不成熟心肌细胞或其前体可在暴露于文库之前分化。在其他实例中，两种或更多种化合物可单独或一起用于筛选测定中。在另外的实例中，可将该至少一种不成熟心肌细胞或其前体置于多孔板中，并且可通过将文库的各种成员置于多孔板的不同孔中来筛选化合物文库。此种文库筛选可快速鉴定能够由该至少一种不成熟心肌细胞或其前体产生心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的化合物。
本文还描述了鉴定增加心肌细胞(例如，静止心肌细胞)的产生的心肌细胞成熟因子或剂的方法。在某些实例中，提供了高含量且/或高通量的筛查方法。该方法包括使至少一种衰老心肌细胞暴露于至少一种化合物(例如文库化合物或本文所述的化合物)并确定该化合物是否增加来自该至少一种衰老心肌细胞的心肌细胞(例如静止心肌细胞)的产生。可使用本文所述的标志物中的一种或多种将细胞鉴定为心肌细胞(例如，静止心肌细胞)。在其他实例中，两种或更多种化合物可单独或一起用于筛选测定中。在另外的实例中，可将该至少一种衰老心肌细胞置于多孔板中，并且可通过将文库的各种成员置于多孔板的不同孔中来筛选化合物文库。此种文库筛选可快速鉴定能够由该至少一种衰老心肌细胞产生心肌细胞(例如静止心肌细胞)的化合物。
在一些实施方案中，该方法进一步包括分离心肌细胞(例如成熟心肌细胞)的群体(例如，其中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、50％、75％或更多细胞是主题细胞类型)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括将通过如本文公开的方法生产的心肌细胞植入受试者(例如，患有慢性心力衰竭的受试者)中。在一些实施方案中，心肌细胞衍生自从受试者获得的干细胞。在一些实施方案中，心肌细胞衍生自不同于受试者的供体(例如，受试者的亲属)的干细胞。
在一方面，本发明的特征是通过本文所述的方法制备的心肌细胞，例如成熟心肌细胞。在另一个方面，本发明的特征是包含通过本文所述的方法制备的心肌细胞的组合物。
在另一个方面，本发明的特征是药盒，其包括：不成熟心肌细胞或其前体；至少一种本文所述的心肌细胞成熟因子；以及使用该不成熟心肌细胞或其前体和该至少一种心肌细胞成熟因子来生产心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)的说明书。在一些实施方案中，药盒进一步包括：用于检测成熟心肌细胞标志物(例如本文所述的标志物)的组分，例如用于检测心肌细胞成熟标志物的试剂，例如针对标志物的抗体；以及成熟心肌细胞，例如用作对照的成熟心肌细胞。
在一个方面，本发明的特征是促进不成熟心肌细胞或其前体分化为心肌细胞的方法，其包括提供至少一种不成熟心肌细胞或其前体，以及提供至少一种心肌细胞成熟因子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种本文所述的心肌细胞成熟因子)以在干细胞暴露于该至少一种成熟因子后使该至少一种不成熟心肌细胞或其前体成熟或分化为心肌细胞(例如，成熟心肌细胞)。在一些实施方案中，该至少一种不成熟心肌细胞或其前体来自哺乳动物。在一些实施方案中，该至少一种不成熟心肌细胞或其前体来自小鼠或人。在一些实施方案中，该至少一种不成熟心肌细胞或其前体衍生自培养胚胎干细胞(例如，哺乳动物胚胎干细胞，诸如小鼠或人胚胎干细胞)。在一些实施方案中，该至少一种不成熟心肌细胞或其前体是从培养诱导型多能干细胞(例如，哺乳动物iPs细胞，诸如小鼠或人iPs细胞)而衍生得到。
在一些实施方案中，例如，通过使多个不成熟心肌细胞或其前体与如本文所述的心肌细胞成熟因子中的至少一种、至少两种、至少三种或更多种接触，使该多个不成熟心肌细胞或其前体分化或成熟为多个成熟心肌细胞。
在一些实施方案中，例如，通过使多个衰老心肌细胞与如本文所述的心肌细胞成熟因子中的至少一种、至少两种、至少三种或更多种接触，使该多个衰老心肌细胞成熟为多个静止心肌细胞。
在一些实施方案中，将多个不成熟心肌细胞或其前体暴露于心肌细胞成熟因子约1、2、4、6、8、10、12、14、16天或更多天。在一些实施方案中，将多个不成熟心肌细胞或其前体暴露于浓度约为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM或10μM的心肌细胞成熟因子。在一些实施方案中，将多个不成熟心肌细胞或其前体暴露于浓度为约250nM、400nM、500nM、600nM、700nM或800nM的心肌细胞成熟因子。在一些实施方案中，大于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的不成熟心肌细胞或其前体分化或成熟为成熟心肌细胞。
应当理解，前面的详细描述和下面的实施例仅为说明性的，并且不应被视为对本发明范围的限制。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行对本领域技术人员而言显而易见的对公开的实施方案的各种改变和修改。进一步地，出于描述和公开的目的，所有标识的专利、专利公布和出版物均明确地以引用的方式并入本文，例如，此类出版物中描述的方法可与本公开结合使用。这些出版物仅仅由于其在本申请的提交日期之前公开而提供。就此而言，任何事物都不应解释为认可由于先前发明或因为任何其他原因而使发明者无权先于此种公开。所有关于这些文件的日期的说明或内容的陈述均是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
实施例：
实施例1：针对干细胞衍生的心肌细胞的成熟的衰老压制
背景：
治疗慢性心力衰竭的干细胞方法将需要生产心室心肌细胞，以改善心脏收缩功能并降低室性心律失常的发生率。然而，使用目前的分化方案，从胚胎或诱导型多能干细胞(分别为ESC或iPSC)衍生的心肌细胞在功能上仍不成熟。这些不成熟心肌细胞展示出自律性或起搏器样活动，这导致当被递送至成体动物模型时可能出现危及生命的室性心律失常并且还具有组织性较差的肌节结构，从而无法产生足够的收缩力。(1,2)。成功转化干细胞衍生疗法治疗心血管疾病将需要开发改进的干细胞衍生心肌细胞成熟方法。
在出生时，哺乳动物经历显著的生理变化，因为新生儿要适应从胎盘获取所有氧气和营养到经由自主呼吸获取氧气和经由肠道喂养获取营养的过程。这些生理变化调控心脏表型的潜在分子机制仍不清楚。在小鼠中，心肌细胞在出生后前几天内保留心肌损伤后再生的能力。(3)然而，超过此时段后，心肌细胞退出细胞周期并变为静止。(4)最近鉴定了，抑制雷帕霉素机制靶点(mTOR)途径经由诱导细胞静止和压制细胞衰老改善iPSC-CM在二维(2D)培养中的成熟(5)。
细胞静止是由营养匮乏触发的静息状态，并且特征在于能够响应于适当的刺激而重新进入细胞周期(6)。相反，细胞衰老是与衰老或患病表型相关的不可逆细胞周期停滞状态，其特征在于DNA损伤、活性氧类物质水平升高以及表达衰老相关分泌表型(SASP)，SASP可导致附近细胞的促炎表型(7)。研究发现，具有衰老表型的iPSC-CM不太成熟，在更成熟的心肌细胞中观察到较低的肌节或离子通道蛋白表达。由于SASP蛋白诸如白细胞介素-6(IL-6)因旁分泌效应对附近的细胞产生有害影响，因此将测试使用衰老清除剂(诱导衰老细胞凋亡的化合物)去除衰老细胞是否能促进存活细胞的成熟。
发明概述：
之前已经表明，在分化后期用Torin1抑制mTOR信号既可诱导细胞静止，又可增强心肌细胞的成熟。此外，有观点认为，静止深度可以促进成熟，而经由p53上调诱导静止可促进iPSC-CM成熟。
初步数据表明，从3D悬浮培养中去除衰老细胞也可促进iPSC-CM的成熟。衰老清除剂槲皮素是存在于诸如苹果的食物中的黄酮醇，其可诱导衰老肿瘤细胞凋亡(8)。初步数据表明，用槲皮素处理iPSC-CM可增强iPSC-CM的成熟。
方法：
使用UCSD142i-86-1细胞系生成初步数据。根据先前发表的方案(9)使UCSD142i-86-1细胞分化成心肌细胞，并在实验室中使该心肌细胞适应至三维培养。在搏动开始后两天(约分化第9天)，用媒介物(DMSO)或不同浓度的槲皮素处理心肌细胞不同的时间段。在不同的时间点收获细胞进行qPCR、蛋白质印迹或流式细胞术。
初步结果：
槲皮素降低活细胞的百分比，但增加心肌细胞的百分比。
如由流式细胞术所定量的，槲皮素处理(200μM)用2天或5天的处理降低了活细胞的百分比(图4A)。然而，用20μM或200μM的槲皮素处理2天增加了心肌肌钙蛋白T(TNNT2)阳性心肌细胞的百分比(图4B)，这可能表明心肌细胞纯化是由非心肌细胞的细胞死亡引起。
槲皮素增加了Kir2.1和p53在3D培养中的表达。
iPSC-CM的槲皮素处理增加了Kir2.1的表达(图3A至图3D)，Kir2.1是主要负责经由内向整流电流(IK1)维持静息膜电位的离子通道；在较低水平下，异常膜去极化可增加室性心律失常的风险(10,11)。此外，槲皮素增加了p53的表达，这可能支持静止的诱导。
槲皮素增加了PPARGC1a的表达。
用200μM槲皮素处理3天显著增加了过氧化物酶体增殖剂激活受体γ共激活剂1A(PPARGC1a)(其是一种线粒体生物生成调控因子)的mRNA表达(图5)。PPARGC1a激活可以刺激心肌细胞成熟(10)，表明经槲皮素处理的细胞可能具有更成熟的代谢表型。
概述
总之，在3D悬浮培养中使用衰老清除剂槲皮素去除衰老细胞增加了PSC-CM成熟的选定标志物(包括Kir2.1和PPARGC1a)的表达。这些结果表明，槲皮素可改善存活的iPSC-CM的成熟。使用衰老清除剂去除衰老细胞可促进iPSC-CM在移植前的培养中成熟。
参考文献：
1.Chong JJ，Yang X，Don CW,Minami E，Liu YW，Weyers JJ，Mahoney WM，VanBiber B，Cook SM，Palpant NJ，Gantz JA，Fugate JA，Muskheli V，Gough GM，Vogel KW，Astley CA，Hotchkiss CE，Baldessafi A，Pabon L，Reinecke H，Gill EA，Nelson V，KiemHP，Laflamme MA，Murry CE.Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytesregenerate non-human primate hearts.Nature.2014；510(7504):273-7.doi:10.1038/nature13233.PubMed PMID:24776797；PMCID:PMC4154594.
2.Yang X，Pabon L，Murry CE.Engineering adolescence:maturation of humanpluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.Circ Res.2014；114(3):511-23.doi:10.1161/CIRCRESAHA.114.300558.PubMed PMID:24481842；PMCID:PMC3955370.
3.Porrello ER，Mahmoud AI，Simpson E，Hill JA，Richardson JA，Olson EN，Sadek HA.Transient regenerative potential of the neonatal mouseheart.Science.2011；331(6020):1078-80.Epub 2011/02/26.doi:10.1126/science.1200708.PubMed PMID:21350179；PMCID:PMC3099478.
4.Yuan X，Braun T.Multimodal Regulation of Cardiac MyocyteProliferation.Circ Res.2017；121(3):293-309.Epub 2017/07/22.doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.308428.PubMed PMID:28729454.
5.Garbern JC，Helman A，Sereda R，Sarikhani M，Ahmed A，Escalante GO，Oguflu R,Kim SL，Zimmerman JF，Cho A，MacQueen L，Bezzefides VJ，Parker KK，MeltonDA，Lee RT.Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of CardiomyocytcsDerived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells via p53-InducedQuiescence.Circulation.2020；141(4):285-300.Epub 2019/11/12.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044205.PubMed PMID:31707831；PMCID:PMC7009740.
6.Yao G.Modelling mammalian cellular quiescence.Interface Focus.2014；4(3):20130074.Epub 2014/06/07.doi:10.1098/rsfs.2013.0074.PubMed PMID:24904737；PMCID:PMC3996586.
7.Di Micco R，Krizhanovsky V，Baker D，d′Adda di Fagagna F.Cellularsenescence in ageing:from mechanisms to therapeutic opportunities.Nat Rev MolCell Biol.2021；22(2):75-95.Epub 2020/12/18.doi:10.1038/s41580-020-00314-w.PubMed PMID:33328614.
8.Zhu Y,Tchkonia T,Pirtskhalava T,Gower AC,Ding H,Giorgadze N,PalmerAK.Ikeno Y,Hubbard GB,Lenburg M,O′Hara SP,LaRusso NF,Miller JD,Roos CM,Verzosa GC,LeBrasseur NK,Wren JD,Farr JN,Khosla S,Stout MB，McGowan SJ,Fuhrmann-Stroissnigg H,Gurkar AU,Zhao J,Colangelo D,Dorronsoro A，Ling YY，Barghouthy AS，Navarro DC，Sano T，Robbins PD,Niedernhofer LJ,Kirkland JL.TheAchilles’heel of senescent cells:from transcriptome to senolytic drugs.AgingCell.2015；14(4):644-58.doi:10.1111/acel.12344.
9.Lian X，Zhang J，Azarin SM，Zhu K，Hazeltine LB，Bao X，Hsiao C，Kamp TJ，Palecek SP.Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stemcells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully definedconditions.Nat Protoc.2013；8(1):162-75.Epub 2012/12/22.doi:10.1038/nprot.2012.150.PubMed PMID:23257984；PMCID:PMC3612968.
10.Liu Y，Bai H，Guo F，Thai PN，Luo X，Zhang P，Yang C，Feng X,Zhu D,Guo J,Liang P，Xu Z,Yang H,Lu X.PGC-1 alpha activator ZLN005 promotes maturation ofcardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.Aging(Albany NY).2020；12(8):7411-30.Epub 2020/04/29.doi:10.18632/aging.103088.PubMed PMID:32343674:PMCID:PMC7202542.
实施例2：干细胞衍生的心肌细胞的电成熟
执行概述
心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因。同种异体多能干细胞PSC衍生的心肌细胞(PSC-CM)为治疗心力衰竭提供了现成的再生方法。然而，分化人PSC-CM的当前方案产生不成熟心肌细胞，其可能因高静息膜电位(RMP)而增加发生危及生命的室性心动过速(VT)的风险。此外，必须将2D方案调整为三维(3D)悬浮培养方案以促进扩大规模，并且这一转变并非易事。当前项目的目标是将2D方案调整为能够产生RMP≤-70mV的电成熟PSC衍生心肌细胞的3D悬浮培养方案。必须实现这一基准连同3D产生的心肌细胞的完整表型表征以继续进行大型动物试验和随后这种再生技术的临床转化和商业化。
背景
急性心肌梗死后，人心脏失去大约10亿个或更多的心肌细胞(1)。同种异体人多能干细胞衍生的心肌细胞(PSC-CM)可为治疗心肌梗死后收缩性心力衰竭患者提供现成的再生方法。然而，PSC-CM的不充分成熟可能是临床转化的主要障碍，因为不成熟的心肌细胞的递送增加室性心动过速(VT)的风险，而室性心动过速是可能危及生命的心律失常(2-4)。据认为，VT风险增加的原因是用大多数方案产生的PSC-CM都太不成熟，而PSC-CM具有约-50至-60mV的相对较高的静息膜电位(RMP)(相比之下，成人心室心肌细胞的RMP为约-90mV)(5)。PSC-CM的电成熟不足极大地阻碍了在开发用于临床使用的PSC-CM方面的进度，因为必须首先制定策略以避免VT风险。
已研究出多种策略来增强成熟，诸如在不同硬度的基质上培养、长期培养(数月)、电刺激或与小分子一起温育(6-9)。在3D悬浮培养中实现PSC-CM的RMP≤-70mV将克服临床转化的主要障碍。最近有研究鉴定出，用单一小分子Torin1经由抑制雷帕霉素机制靶点(mTOR)途径诱导细胞静止能够在仅2周内在二维(2D)培养中产生具有相似的RMP的PSC-CM(10)，与其他需要2个月才能产生成熟PSC-CM的方案相比大大简化了制造工艺(9)。
意义
为了开发使用同种异体人PSC-CM的替代疗法作为可行治疗选项，必须开发出采用药品生产质量管理规范培养大量PSC-CM用于现成用途的方法。2D培养物的维护是劳动密集型的且具有显著的批间变异性(11)。因此，许多研究小组正转向PSC在三维(3D)生物反应器系统中的维持和分化，这些系统更适于扩大规模、减少劳动时间且小体积取样可提高质量控制(12)。然而，从2D向3D培养的这种转变因各种信号传导途径在不同培养几何结构(包括mTOR)中的差异调控而改变了细胞的表型(13)。该领域尚未设计出能在3D中高效生产成熟PSC-CM的统一方案。在此种疗法的临床转化和商业化之前，必须克服这一挑战。最近的初步数据表明，mTOR抑制在3D培养中对成熟影响极小。另外的初步数据表明，在3D培养中，其他能上调p53和/或消除衰老细胞的小分子可能会对PSC-CM成熟产生更明显的影响。
此项目的目标是：
1.确定使用nutlin-3a激活p53是否增强iPSC衍生心肌细胞在3D体外培养中的电成熟。
2.确定用衰老清除剂槲皮素消除衰老细胞是否增强iPSC衍生的心肌细胞在3D体外培养中的电成熟。
初步研究
Nutlin-3a而不是Torin1增加了Kir2.1和p53在3D培养中的表达。
Kir2.1是主要负责经由内向整流电流(IK1)维持静息膜电位的离子通道；在较低水平下，异常膜去极化可增加室性心律失常的风险(10,11)。iPSC-CM的Nutlin-3a处理增加了Kir2.1的表达，但Torin1处理则不会(图2A至图2H)。此外，Nutlin-3a而不是Torin1增加了p53的表达，这可能支持静止状态的诱导(图2A至图2H)。初步数据表明，mTOR抑制与2D培养相比在3D培养中不产生有益影响，这可能由于接触抑制降低了mTOR活性(13)。
槲皮素增加了Kir2.1和p53在3D培养中的表达。
iPSC-CM的槲皮素处理增加了Kir2.1和p53二者的表达(图3A至图3D)，从而提供了槲皮素可促进iPSC-CM的电成熟和静止的证据。
研究计划
建议开发能够通过激活p53或消除衰老细胞在3D悬浮培养中产生电成熟的人PSC-CM的符合现行药品生产质量管理规范(cGMP)的方案。将使用RMP≤-70mV的基准，这将证明对当前方案的适当改进可以进行大型动物研究以评估心律失常的可能性。将进行全面的表型表征，包括评估肌节、离子通道和代谢基因的RNA和蛋白质表达，定量收缩性、电生理特性和耗氧率。已在摇床平台上使用Erlenmeyer烧瓶优化了3D悬浮培养方案。本文描述的方案可作为其他分化方案的辅助，能够利用在PSC-CM搏动开始后开始的处理促进超出其他方案的进一步成熟。
目标1的理由
细胞静止是由营养匮乏触发的静息状态，并且特征在于能够作为对适当刺激的响应重新进入细胞周期(14)。相反，细胞衰老是与衰老或患病表型相关的不可逆细胞周期停滞状态，其特征在于DNA损伤、升高的活性氧类物质水平以及表达衰老相关分泌表型(SASP)，SASP可导致附近细胞的促炎表型(15)。研究发现，具有衰老表型的iPSC-CM不太成熟，在更成熟的心肌细胞中观察到较低的肌节或离子通道蛋白表达。p53的上调可通过支持静止提高表达的成熟。建议在3D悬浮培养中使用p53激活剂nutlin-3a产生电成熟的人多能干细胞衍生的心肌细胞(PSC-CM)。
目标2的理由
由于SASP蛋白诸如白细胞介素-6(IL-6)因旁分泌效应而可对附近的细胞产生有害影响，因此将测试使用衰老清除剂去除衰老细胞是否能增强存活细胞的成熟。衰老清除剂槲皮素是存在于诸如苹果的食物中的黄酮醇，其可诱导衰老肿瘤细胞凋亡(16)。将评估槲皮素是否可以通过在3D悬浮培养中压制衰老表型来改善iPSC-CM的电成熟。
目标1和2的实验设计和方法
将在3D培养中用nutlin-3a(目标1)或槲皮素(目标2)处理PSC-CM。将对iPSC-CM的收缩、代谢和电特性进行表征，以确定拟定的干预措施是否改善成熟。细胞电特性的完整表征将是重点。如果在未来的工作中将这些iPSC-CM植入到大型动物体内模型中，对于了解拟定的干预措施是否可能降低室性心律失常的风险将非常重要。
细胞系、分化和处理。每次实验将使用至少2个不同起源的细胞类型(例如成纤维细胞衍生或外周血单核细胞衍生的iPSC)和来自男性及女性供体的至少3个人诱导型PSC(iPSC)系(DiPS1016SevA,Gibco,UCSD142i-86-1)。这将使我们确信，我们的发现在细胞系之间是稳健的。细胞系将从哈佛干细胞研究所(Harvard Stem Cell Institute)iPSC核心设施(DiPS1016SevA)、其他学术细胞经销商、已建立的干细胞库(诸如UCSD142i-86-1系的WiCell)或商业供应商(Gibco)获得。将使用Lian等人概述的分化方案(11)，并且已成功地将该分化方案调整用于2D和3D培养。将在心肌细胞搏动开始后(分化后约7-9天)在不同的时间点和浓度下使用Nutlin-3a(目标1)或槲皮素(目标2)处理iPSC-CM。
心肌细胞表征。为了评估拟定的干预措施是否影响iPSC-CM成熟，将对iPSC-CM的代谢、收缩和电生理特性进行定量。将经由单细胞RNAseq评估mRNA表达，并经由蛋白质印迹分析分析评估选定的代谢蛋白(GLUT1-4、FATP1-6、PPARa、PPARg、PGC1a)、收缩蛋白(TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7)和离子通道蛋白(KCNJ2、CACNA1c、SERCA2a、RYR2和HCN4)的蛋白表达。将用MitoTracker Red CMXRos(Thermo)对线粒体膜极化进行定量。Seahorse XFe96分析仪将用于评估耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。将通过基于视频的分析和配套的MATLAB脚本对2D培养中的收缩性进行定量(17)。将使用Fluo-4对钙离子瞬态进行分析(18)，并将使用FluoVolt技术(19)使用Vala动感图像细胞仪(KIC)(20)对动作电位持续时间进行分析。将进行膜片钳分析，以定量静息膜电位和IK1。
参考文献列表
1.Laflamme MA，Murry CE.Regenerating the heart.Nat Biotechnol.2005；23(7):845-56.Epub 2005/07/09.doi:10.1038/nbt1117.PubMed PMID:16003373.
2.Chong JJ，Yang X，Don CW，Minami E，Liu YW，Weyers JJ，Mahoney WM，VanBiber B，Cook SM，Palpant NJ，Gantz JA，Fugate JA，Muskheli V，Gough GM,Vogel KW，Astley CA，Hotchkiss CE，Baldessari A，Pabon L，Reinecke H，Gill EA，Nelson V，KiemHP，Laflamme MA，Murry CE.Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytesregenerate non-human primate hearts.Nature.2014；510(7504):273-7.doi:10.1038/nature13233.PubMed PMID:24776797；PMCID:PMC4154594.
3.Liu YW，Chen B，Yang X，Fugate JA，Kalucki FA，Futakuchi-Tsuchida A，Couture L，Vogel KW，Astley CA,Baldessari A,Ogle J,Don CW,Steinberg ZL,SeslarSP,Tuck SA,Tsuchida H，Naumova AV，Dupras SK，Lyu MS，Lee J，Hailey DW，Reinecke H,Pabon L,Fryer BH，MacLellan WR，Thies RS，Murry CE.Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-humanprimates.Nat Biotechnol.2018；36(7):597-605.Epub 2018/07/04.doi:10.1038/nbt.4162.PubMed PMID:29969440；PMCID:PMC6329375.
4.Romagnuolo R,Masoudpour H，Porta-Sanchez A,Qiang B,Barry J,LaskaryA,Qi X，Masse S,Magtibay K,Kawajiri H,Wu J,Valdman Sadikov T,Rothberg J,Panchalingam KM,Titus E，Li RK,Zandstra PW,Wright GA,Nanthakumar K,Ghugre NR,Keller G,Laflamme MA.Human Embryonic Stem Cell-Derived CardiomyocytesRegenerate the Infarcted Pig Heart but Induce VentricularTachyarrhythnfias.Stem Cell Reports.2019；12:967-81.Epub 2019/05/06.doi:10.1016/j.stcmcr.2019.04.005.PubMed PMID:31056479.
5.Karbassi E，Fenix A，Marchiano S，Muraoka N，Nakamura K，Yang X，MurryCE.Cardiomyocyte maturation:advances in knowledge and implications forregenerative medicine.Nat Rev Cardiol.2020；17(6):341-59.Epub 2020/02/06.doi:10.1038/s41569-019-0331-x.PubMed PMID:32015528；PMCID:PMC7239749.
6.Montessuit C,Palma T，Viglino C，Pellieux C，Lerch R.Effects ofinsulin-like growth factor-I on the maturation of metabolism in neonatalratcardiomyocytes.Pflugers Arch.2006；452(4):380-6.doi:10.1007/s00424-006-0059-4.PubMed PMID:16586094.
7.Yang X，Rodriguez M，Pabon L，Fischer KA，Reinecke H,Regnier M,Sniadecki NJ，Ruohola-Baker H，Murry CE.Tri-iodo-l-thyronine promotes thematuration of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stemcells.J Mol Cell Cardiol.2014；72:296-304.doi:10.1016/j.yjmcc.2014.04.005.PubMed PMID:24735830；PMCID:PMC4041732.
8.Yang X，Pabon L，Murry CE.Engineering adolescence:maturation of humanpluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.Circ Res.2014；114(3):511-23.doi:10.1161/CIRCRESAHA.114.300558.PubMed PMID:24481842；PMCID:PMC3955370.
9.Feyen DAM，McKeithan WL，Bruyneel AAN，Spiering S，Hormann L，Ulmer B，Zhang H，Briganti F，Schweizer M，Hegyi B，Liao Z，Polonen RP，Ginsburg KS，Lam CK，Serrano R，Wahlquist C，Kreymerman A，Vu M,Amatya PL,Behrens CS,Ranjbarvaziri S，Maas RGC,Greenhaw M,Bernstein D,Wu JC,Bers DM,Eschenhagen T,Metallo CM,Mercola M.Metabolic Maturation Media Improve Physiological Function of HumaniPSC-Derived Cardiomyocytes.Cell Rep.2020；32(3):107925.Epub 2020/07/23.dot:10.1016/j.celrep.2020.107925.PubMed PMID:32697997.
10.Garbern JC，Helman A，Sereda R，Sarikhani M，Ahmed A,Escalante GO，Ogurlu R，Kim SL，Zimmerman JF，Cho A，MacQueen L，Bezzerides VJ，Parker KK，MeltonDA，Lee RT.Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of CardiomyocytesDerived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells via p53-InducedQuiescence.Circulation.2020；141(4):285-300.Epub 2019/11/12.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044205.PubMed PMID:31707831；PMCID:PMC7009740.
11.Lian X,Zhang J,Azarin SM,Zhu K,Hazeltine LB,Bao X,Hsiao C，Kamp TJ，Palecek SP.Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stemcells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully definedconditions.Nat Protoc.2013:8(1):162-75.Epub 2012/12/22.doi:10.1038/nprot.2012.150.PubMed PMID:23257984；PMCID:PMC3612968.
12.Kempf H，Kropp C，Olner R，Martin U，Zweigerdt R.Cardiacdifferentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspensionculture.Nat Protoc.2015；10(9):1345-61.doi:10.1038/nprot.2015.089.PubMed PMID:26270394.
13.Riedl A,Schlederer M,Pudelko K,Stadler M,Walter S,Unterleuthner D,Unger C,Kramer N,Hengstschlager M，Kenner L，Pfeiffer D，Krupitza G，DolznigH.Comparison of cancer cells in 2D vs 3D culture reveals differences in AKT-mTOR-S6K signaling and drug responses.J Cell Sci.2017；130(1):203-18.Epub2016/09/25.doi:10.1242/jcs.188102.PubMed PMID:27663511.
14.Yao G.Modelling mammalian cellular quiescence.InterfaceFocus.2014；4(3):20130074.Epub 2014/06/07.doi:10.1098/rsfs.2013.0074.PubMedPMID:24904737；PMCID:PMC3996586.
15.Di Micco R，Krizhanovsky V，Baker D，d′Adda di Fagagna F.Cellularsenescence in ageing:from mechanisms to therapeutic opportunities.Nat Rev MolCell Biol.2021；22(2):75-95.Epub 2020/12/18.doi:10.1038/s41580-020-00314-w.PubMed PMID:33328614.
16.Zhu Y，Tchkonia T,Pirtskhalava T,Gower AC,Ding H,Giorgadze N,PalmerAK,Ikeno Y,Hubbard GB,Lenburg M,O′Hara SP,LaRusso NF,Miller JD,Roos CM,Verzosa GC,LeBrasseur NK,Wren JD,Farr JN,Khosla S,Stout MB，McGowan SJ,Fuhrmann-Stroissnigg H，Gurkar AU，Zhao J，Colangelo D，Dorronsoro A，Ling YY，Barghouthy AS，Navarro DC，Sano T，Robbins PD，Niedernhofer LJ，Kirkland JL.TheAchilles’heel of senescent cells:from transcriptome to senolytic drugs.AgingCell.2015；14(4):644-58.doi:10.1111/acel.12344.
17.Huebsch N,Loskill P,Mandegar MA,Marks NC,Sheehan AS,Ma Z,Mathur A,Nguyen TN,Yoo JC,Judge LM,Spencer CI，Chukka AC,Russell CR,So PL,Conklin BR，Healy KE.Automated Video-Based Analysis of Contractility and Calcium Flux inHuman-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Cultured overDifferent Spatial Scales.Tissue Eng PartC Methods.2015；21(5):467-79.Epub2014/10/22.doi:10.1089/ten.TEC.2014.0283.PubMed PMID:25333967；PMCID:PMC4410286.
18.Ahola A，Polonen RP，Aalto-Setala K，Hyttinen J.SimultaneousMeasurement of Contraction and Calcium Transients in Stem Cell DerivedCardiomyocytes.Ann Biomed Eng.2018；46(1):148-58.Epub 2017/10/05.doi:10.1007/s10439-017-1933-2.PubMed PMID:28975460；PMCID:PMC5754453.
19.Bedut S，Seminatore-Nole C，Lamamy V，Caignard S，Boutin JA，Nosjean O，Stephan JP，Coge F.Highthroughput drug profiling with voltage-and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes.Am JPhysiol Heart Circ Physiol.2016；311(1):H44-53.Epub 2016/05/21.doi:10.1152/ajpheart.00793.2015.PubMed PMID:27199128.
20.Lu HR,Whittaker R，Price JH,Vega R,Pfeiffer ER,Cefignoli F,TowartR,Gallacher DJ.High Throughput Measurement of Ca++Dynamics in Human StemCell-Derived Cardiomyocytes by Kinetic Image Cytometery:A Cardiac RiskAssessment Characterization Using a Large Panel of Cardioactive and InactiveCompounds.Toxicol Sci.2015；148(2):503-16.Epub 2015/09/12.doi:10.1093/toxsci/kfv201.PubMcd PMID:26358003.
21.Tisato V,Voltan R,Gonelli A,Secchiero P,Zauli G.MDM2/X inhibitorsunder clinical evaluation:perspectives for the management of hematologicalmalignancies and pediatric cancer.J Hematol Oncol.2017；10(1):133.Epub 2017/07/05.doi:10.1186/s13045-017-0500-5.PubMed PMID:28673313；PMCID:PMC5496368.
22.Han MK，Barreto TA，Martinez FJ，Comstock AT，Sajjan US.Randomisedclinical trial to determine the safety of quercetin supplementation inpatients with chronic obstructive pulmonary disease.BMJ Open Respir Res.2020；7(1).Epub 2020/02/20.doi:10.1136/bmjresp-2018-000392.PubMed PMID:32071149；PMCID:PMC7047491.
23.Dehghani F,Sezavar Seyedi Jandaghi SH，Janani L,SarebanhassanabadiM,Emamat H,Vafa M.Effects of quercetin supplementation on inflammatoryfactors and quality of life in post-myocardial infarction patients:A doubleblind,placebo-controlled,randomized clinical trial.Phytother Res.2020.Epub2020/11/21.doi:10.1002/ptr.6955.PubMed PMID:33216421.
24.Aucoin M,Cooley K，Saunders PR，Cardozo V，Remy D，Cramer H，Neyre AbadC，Hannan N.The effect of quercetin on the prevention or treatment of COVID-19and other respiratory tract infections in humans:A rapid review.Adv IntegrMed.2020；7(4):247-51.Epub 2020/08/25.doi:10.1016/j.aimed.2020.07.007.PubMedPMID:32837891；PMCID:PMC7392107.
25.Admfinistration USFaD.Cellular&Gene Therapy Products 2021.可从以下获取:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products.
26.Shiba Y，Fernandes S，Zhu WZ，Filice D，Muskheli V，Kim J，Palpant NJ，Gantz J，Moyes KW，Reinecke H，Van Biber B，Dardas T，Mignone JL，Izawa A，Hanna R，Viswanathan M，Gold JD,Kotlikoff MI,Sarvazyan N,Kay MW,Murry CE,LaflammeMA.Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppressarrhythmias in injured hearts.Nature.2012；489(7415):322-5.Epub 2012/08/07.doi:10.1038/nature11317.PubMed PMID:22864415；PMCID:PMC3443324.
27.Marin V，Cribioli E，Philip B，Tettamanti S，Pizzitola I，Biondi A，Biagi E，Pule M.Comparison of different suicide-gene strategies for the safetyimprovement of genetically manipulated T cells.Hum Gene Ther Methods.2012；23(6):376-86.Epub 2012/11/29.doi:10.1089/hgtb.2012.050.PubMed PMID:23186165；PMCID:PMC4015080.
28.Sulkowski M，Konieczny P,Chlebanowska P,Majka M.Introduction ofExogenous HSV-TK Suicide Gene Increases Safety of Keratinocyte-DerivedInduced Pluripotent Stem Cells by Providing Genetic″Emergency Exit″Switch.IntJ Mol Sci.2018；19(1).Epub 2018/01/10.doi:10.3390/ijms19010197.PubMed PMID:29315221；PMCID:PMC5796146.
29.Di Stasi A，Tey SK,Dotti G，Fujita Y，Kennedy-Nasser A,Martinez C，Straathof K，Liu E，Durett AG，Grilley B，Liu H，Cruz CR，Savoldo B，Gee AP，Schindler J，Krance RA，Heslop HE，Spencer DM，Rooney CM，Brenner MK.Inducibleapoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.N Engl J Med.2011；365(18):1673-83.Epub 2011/11/04.doi:10.1056/NEJMoa1106152.PubMed PMID:22047558；PMCID:PMC3236370.
30.Han X,Wang M,Duan S,France PJ,Kenty JH,Hedrick P,Xia Y，Allen A,Ferreira LMR,Strominger JL，Melton DA,Meissner TB，Cowan CA.Generation ofhypoimmunogenic human pluripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2019；116(21):10441-6.Epub 2019/05/02.doi:10.1073/pnas.1902566116.PubMed PMID:31040209；PMCID:PMC6535035.
31.Deuse T，Hu X,Gravina A，Wang D,Tediashvili G,De C，Thayer WO，Wahl A，Garcia JV，Reichenspurner H，Davis MM，Lanier LL,Schrepfer S.Hypoimmunogenicderivatives of induced pluripotent stem cells evade immune rejection in fullyimmunocompetent allogeneic recipients.Nat Biotechnol.2019；37(3):252-8.Epub2019/02/20.doi:10.1038/s41587-019-0016-3.PubMed PMID:30778232；PMCID:PMC6419516.

Claims (72)

1.一种从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法，其包括使所述不成熟心肌细胞与至少一种心肌细胞成熟因子在三维培养中接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子包括p53上调剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子选自由衰老清除剂、MDM2抑制剂、mTOR抑制剂以及它们的组合组成的组。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素、Torin1以及它们的组合组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子选自由nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种心肌细胞成熟因子包括槲皮素。
8.如权利要求1所述的方法，其中经由脉冲处理使所述至少一种心肌细胞成熟因子与所述不成熟心肌细胞接触。
9.如权利要求1所述的方法，其中经由连续处理使所述至少一种心肌细胞成熟因子与所述不成熟心肌细胞接触。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述不成熟心肌细胞衍生自iPS细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述不成熟心肌细胞衍生自ES细胞。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述不成熟心肌细胞衍生自T细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述不成熟心肌细胞衍生自成纤维细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述不成熟心肌细胞类似于胎儿心肌细胞。
15.如权利要求1所述的方法，其中在所述不成熟心肌细胞开始搏动后，使所述不成熟心肌细胞与所述至少一种心肌细胞成熟因子接触。
16.如权利要求1所述的方法，其中在所述不成熟心肌细胞开始搏动后，使所述不成熟心肌细胞与所述至少一种心肌细胞成熟因子接触1至3天。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出REST和/或GATA4的表达增加。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出降低的搏动率。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞表现出≤-70mV的静息膜电位。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞表现出<40次/分钟的自发搏动率。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞表现出>200伏/秒的上行速度。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电成熟心肌细胞。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是收缩性成熟心肌细胞。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是代谢成熟心肌细胞。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟心肌细胞。
32.一种由权利要求1-16中任一项所述方法生产的非天然存在的心肌细胞。
33.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种成熟基因的表达增加。
34.如权利要求33所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种成熟基因选自由以下组成的组：TNNI3、TNNT2、MYH6、MYH7、NPPB、HCN4、CACNA1c、SERCA2a、PPARGC1、KCNJ2、REST、RyR和SCN5a。
35.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种肌节蛋白的表达增加。
36.如权利要求35所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种肌节蛋白选自由以下组成的组：TNNT2、TNNI3、MYH6和MYH7。
37.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出一种或多种离子通道基因的表达增加。
38.如权利要求37所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述一种或多种离子通道基因选自由以下组成的组：KCNJ2、HCN4、SCN5a、RYR2、CACNA1c和SERCA2a。
39.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出TNNT2、TNNI3、KCNJ2和p53中一者或多者的表达增加。
40.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞如与不成熟心肌细胞相比表现出降低的搏动率。
41.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出≤-70mV的静息膜电位。
42.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出<40次/分钟的自发搏动率。
43.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞表现出>200伏/秒的上行速度。
44.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是电成熟心肌细胞。
45.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是收缩性成熟心肌细胞。
46.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是代谢成熟心肌细胞。
47.如权利要求32所述的非天然存在的心肌细胞，其中所述非天然存在的心肌细胞是电、收缩性和代谢成熟心肌细胞。
48.一种治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用包含根据权利要求32至47中任一项所述的非天然存在的心肌细胞的组合物。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏疾病或其他心脏疾病或者处于患上这些疾病的风险中。
50.一种治疗方法，其包括向有此需要的受试者施用使用一种或多种根据权利要求32至47中任一项所述的非天然存在的心肌细胞的经分离的群体生产的药物组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏疾病或其他心脏疾病或者处于患上这些疾病的风险中。
52.组合物在制造用于治疗心脏疾患的药物中的用途，其中所述治疗包括向有此需要的受试者施用所述药物，其中所述组合物包含至少一种根据权利要求32至47中任一项所述的非天然存在的心肌细胞。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述受试者患有室性心律失常、心脏收缩功能降低、慢性心力衰竭、先天性心脏疾病或其他心脏疾病或者处于患上这些疾病的风险中。
54.一种诱导心肌细胞静止的方法，其包括使衰老心肌细胞与心肌细胞成熟因子在三维培养中接触，从而诱导所述衰老心肌细胞转变为静止心肌细胞。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括p53上调剂。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括mTOR信号途径抑制剂。
57.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括p53上调剂和mTOR抑制剂。
58.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括衰老清除剂。
59.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括MDM2抑制剂。
60.如权利要求43所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子选自由Torin1、nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合组成的组。
61.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括Torin1。
62.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括Torin1和nutlin-3a的组合。
63.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a。
64.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括槲皮素。
65.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子包括nutlin-3a和槲皮素的组合。
66.如权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子不是Torin1。
67.一种从不成熟心肌细胞生产成熟心肌细胞的方法，其包括使所述不成熟心肌细胞与至少一种选自由以下组成的组的心肌细胞成熟因子接触：nutlin-3a、槲皮素、Torin1以及它们的组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述心肌细胞成熟因子选自由以下组成的组：nutlin-3a、槲皮素以及它们的组合。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是在三维培养中生产的。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述成熟心肌细胞是在二维培养中生产的。
71.如权利要求67所述的方法，其中经由脉冲处理使所述不成熟心肌细胞与所述至少一种心肌细胞成熟因子接触。
72.如权利要求67所述的方法，其中经由连续处理使所述不成熟心肌细胞与所述至少一种心肌细胞成熟因子接触。
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US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
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CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
CA2397292A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Bresagen Limited Cell production
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
US20030054331A1 (en) 2001-09-14 2003-03-20 Stemsource, Inc. Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues
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US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
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