KR101778953B1 - 비신경 세포를 이용한 유도신경줄기세포의 제조방법 - Google Patents

비신경 세포를 이용한 유도신경줄기세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 키트, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 방법을 사용하면, 유전자의 변형 없이도, 정상적인 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있으므로, 자가신경줄기세포를 이용한 다양한 신경질환의 치료방법에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

비신경 세포를 이용한 유도신경줄기세포의 제조방법{Process for generating induced Neural Stem Cell using non-neural cell}
본 발명은 비신경 세포를 이용한 유도신경줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 키트, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포에 관한 것이다.
줄기세포는 일반적으로 전능 또는 만능으로 분류된다. 전능줄기세포는 전체로 분화능을 갖는다: 이는 신체에서 상이한 세포 유형 모두를 생성시킨다. 수정란 세포는 전능줄기세포의 일례이다. 만능줄기세포는 3개의 주요 배엽 또는 배아 그 자체로부터 유래하는 신체에서 임의의 세포 유형을 생성시킨다. 배아줄기세포(ESC)와 같은 만능줄기세포는 만능성, 즉 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지하면서 신속히 증식한다. 배아줄기세포는 세포 이식 치료에 대한 유망한 공여 공급원이다.
지금까지 만능줄기세포는 주로 핵 이식 및 세포 융합에 의해 생성되었다(Shinya Yamanaka, Pluripotency and Nuclear Reprogramming, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500): 2079-2087(2008.06.27)). 그러나, 상기 두 방법 모두는 배아줄기세포를 사용하기 때문에 연구 및 치료용 모두에 있어서 윤리적 딜레마(ethical dilemma)가 제기된다. 최근에 들어, 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 발견함에 따라 배아줄기세포를 사용함에 따른 이러한 문제점을 극복할 수 있게 되었다. "유도 만능줄기세포(iPSC)"은 배아줄기세포(ESC)와 비슷한 특성을 나타내는 세포이다. 유도 만능줄기세포는 2006년에 마우스 섬유아세포(Takahashi, Y. 및 S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126: 663-676 (2006)) 및 2007년에는 인간 섬유아세포(Yu Junying, 등, Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318: 1917-1920 (2007), Takahashi, K. 등, Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131: 861-872 (2007))로부터 지정 인자(defined factor)들의 발현을 증대시킴으로써 최초로 생성되었다.
이들 연구에서는 성숙한 체세포의 iPSC로의 리프로그래밍을 개시하기 위해 Oct-3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함하고(Takahashi, Cell 126: 663-676; Takahashi, Cell 131:861-872); Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용하였다(Junying, Cell 318: 1917-1920). 그러나, iPSC는 배아줄기세포에서처럼 테라토마(teratoma)라는 암이 발생함과 동시에 생체에 이식시 분화조절이 잘 되질 않아, 원하는 세포로의 생체 내 전환이 안된다는 한계를 가지고 있다. 따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 직접적인 유도법 또는 직접 리프로그래밍법(Direct Conversion/ reprograming) 을 통해 특정 lineage의 세포로 분화시키는 기술이 주목받고 있다. 해당 기술은 완전히 분화가 끝난 세포, 즉, 섬유아세포에 특정 lineage 특이 유전자 등을 도입하여 전분화능(pluripotent) 상태를 거치지 않고 직접 특정세포를 유도하는 기술로 전분화능 세포의 종양 형성(teratoma) 위험을 배제할 수 있는 기술이다. 특히, 한번 손상되면 영구적인 데미지를 받을 수 있는 신경세포의 경우 세계 여러 연구진들이 활발하게 직접유도를 시도하였다. 그 결과 2010년 미국 Marius Wernig 교수팀에 의해 섬유아세포로부터 기능을 할 수 있는 신경세포를 직접 유도하는데 성공하였다(Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463(7284):1035-1041. doi:10.1038/nature08797). 그러나, 자기재생능 없는 유도 신경세포(induced neurons)는 체외에서 일정기간 이상 배양이 어렵고 따라서 충분한 양의 세포를 확보할 수 없기 때문에 직접 리프로그래밍에 관여하는 분자 세포학적 메커니즘을 비롯하여 세포치료에 필요한 충분한 양의 세포를 얻어내는 것이 현실적으로 불가능하다는 단점이 있었다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 다양한 연구가 수행되었으며, 그 결과, 독일의 두 연구팀은 마우스 섬유아세포에 유전자 도입을 통해 유도 신경줄기세포(iNSC; induced neural stem cell)를 생성하였고, 인간의 섬유아세포에 SOX2 유전자 1개를 도입하여 iNSC 유도를 성공하였다(Thier M., et al.,(2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10(4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003). 그러나, 이같은 유전자 도입에 의하여 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법은 성공율이 낮고, 증식이 어렵다는 단점이 있다고 알려져 있으나, 이러한 단점이 해결되지 않고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 임상에서 사용가능하도록 유전자를 도입하지 않으며 비신경세포 특이적 유전자가 발현되지 않는 보다 안전하고 안정적인 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 분화가 완료된 비신경 세포를 특정 성분이 포함된 배지에서 배양할 경우, 상기 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 유도 신경줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 안전하고 안정적인 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 5-AZA(5-Azacytidine)를 포함하는 배지에 분화가 완료된 비신경 세포를 접종하고 배양하면, 상기 비신경 세포가 리프로그래밍되어 유도 신경줄기세포로 전환됨을 확인하였다. 아울러, 상기 5-AZA의 전환 효율을 향상시킬 수 있는 보조성분을 검색한 결과, CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 상기 배지에 모두 추가할 경우, 유도 신경줄기세포가 안정적으로 제조됨을 확인하였다. 그러나, 상기 3가지 추가성분을 부분적으로 배지에 추가할 경우에는 비신경 세포의 일부가 유도 신경줄기세포로 전환되지 않음을 확인하였다.
따라서, 비신경 세포를 리프로그래밍하여 유도 신경줄기세포를 제조할 경우, 5-AZA가 필수적인 역할을 수행하며, 이를 보조하는 성분으로는 CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 상기 5-AZA가 포함된 배지를 사용하여 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환하는 기술은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자들에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 5-AZA(5-Azacytidine)를 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "5-AZA(5-Azacytidine)"란, 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 시티딘의 유도체 화합물을 의미한다. 상기 5-AZA는 골수이형성 증후군(Myelodysplastic syndrome)의 치료제로서 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 5-AZA는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 유효성분으로 사용될 수 있는데, 일 예로서, 비신경 세포 배양용 배지에 5-AZA를 첨가하여 사용할 수 있고, 이때, 배지에 첨가되는 양은 특별히 제한되지 않는다.
Figure 112016050453738-pat00001
본 발명의 용어 "비신경 세포"란, 신경세포가 아닌 모든 분화 또는 미분화된 세포를 의미하며, 본 발명의 조성물 또는 방법이 적용될 수 있는 표적세포 역할을 한다. 본 발명의 비신경 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 및 토끼 등의 다양한 동물로부터 유래한 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 세포일 수 있으나, 이에 의하여 유도 신경줄기세포로 리프로그래밍시킬 수 있는 세포가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비신경세포는 체세포 등이 될 수 있다.
본 발명에서 "체세포"는 분화능 및 자가재생능이 제한된 성체를 구성하는 세포를 의미하는데, 구체적으로는 상기 체세포는 인간의 피부, 모발, 지방, 혈액 등을 구성하는 체세포일 수 있고, 바람직하게는 인간 섬유아세포 또는 인간 제대혈 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "유도 신경줄기세포"란, 분화된 세포에 리프로그래밍 기술을 이용하여 신경줄기세포와 유사 또는 동일한 다분화능(pluripotency)을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 세포를 의미한다. 상기 유도 신경줄기세포는 신경줄기세포와 동일 또는 유사한 특성을 가지고 있는데, 구체적으로는 비슷한 세포형태를 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유도 신경줄기세포는 신경세포(뉴런), 별아교세포, 희소돌기아교세포, GABA성 신경 세포 또는 도파민성 신경 세포 등으로 분화가능한 미분화 세포일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 전환유도용 조성물은 섬유아세포 등과 같은 다양한 비신경 세포에 작용하여 상기 비신경 세포 전체를 유도 신경줄기세포로 전환시키는데 사용될 수 있는데, 상기 조성물은 유효성분인 5-AZA 이외에도 CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 추가로 포함할 수 있다. 상기 5-AZA와 CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 모두 포함하는 배지를 사용할 경우에는, 비신경 세포를 모두 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있으나, 상기 상기 5-AZA와, CHIR99021, Forskolin 및 SB431542 중의 한가지 또는 두가지 성분을 포함하는 배지를 사용할 경우에는, 비신경 세포의 일부가 유도 신경줄기세포로 전환되지 않기 때문에, 가급적 상기 5-AZA와 CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 모두 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "CHIR99021"이란, C22H18Cl2N8의 화학식으로 표시되고, 하기 화학식 2의 구조식을 갖는 화합물을 의미한다. 상기 CHIR99021은 GSK3 저해제 및 Wnt 신호전달 경로의 활성화제로서 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 CHIR99021는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 보조성분으로 사용될 수 있는데, 일 예로서, 비신경 세포 배양용 배지에 CHIR99021을 첨가하여 사용할 수 있고, 이때, 배지에 첨가되는 양은 특별히 제한되지 않는다.
Figure 112016050453738-pat00002
본 발명의 용어 "포스콜린(Forskolin)"이란, "coleonol"이라고도 호칭되고, C22H34O7의 화학식으로 표시되며, 하기 화학식 3의 구조식을 갖는 랍데인 디테르펜(labdane diterpene)류 화합물을 의미한다. 상기 포스콜린은 cAMP의 수준을 증가시키는 제제로서 사용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Forskolin은 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 보조성분으로 사용될 수 있는데, 일 예로서, 비신경 세포 배양용 배지에 포스콜린을 첨가하여 사용할 수 있고, 이때, 배지에 첨가되는 양은 특별히 제한되지 않는다.
Figure 112016050453738-pat00003
본 발명의 용어 "SB431542"란, C22H16N4O3의 화학식으로 표시되고, 하기 화학식 4의 구조식을 갖는 화합물을 의미한다. 상기 SB431542는 TGF-β, ALK5, ALK4, ALK7 등의 다양한 성분의 억제제로서 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 SB431542는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 보조성분으로 사용될 수 있는데, 일 예로서, 비신경 세포 배양용 배지에 SB431542를 첨가하여 사용할 수 있고, 이때, 배지에 첨가되는 양은 특별히 제한되지 않는다.
Figure 112016050453738-pat00004
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 전환유도용 조성물을 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 비신경 세포를 5-AZA를 포함하는 배지에서 배양하여, 유도 신경줄기세포로 전환시키는 방법에 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 비신경 세포를 배양하기 위한 배지, 상기 비신경 세포를 배양하기 위한 배양용기, 비신경 세포의 배양에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있고, 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 (a) 5-AZA를 포함하는 조성물; 및 (b) 비신경 세포 배양용 배지 조성물이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장된 형태가 될 수 있다.
다른 일 예로서, 본 발명의 키트는 (a) 상기 5-AZA를 포함하는 제1 조성물; (b) CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 포함하는 제2 조성물; 및 (c) 비신경 세포 배양용 배지 조성물이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장된 형태가 될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 유도 신경줄기세포를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법은 (a) 비신경 세포를 5-AZA를 포함하는 배지에서 7 내지 14일 동안 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 비신경 세포를 5-AZA를 포함하지 않는 배지에서 구상체(Sphere)가 형성될 때까지 배양하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 세포에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　
일 예로서, 상기 비신경 세포의 종류는 상술한 바와 동일하고, 상기 5-AZA를 포함하는 배지에서 배양하기 전에 일반적인 배지에서 배양하여 배양에 최적화된 상태를 갖추도록 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예로서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 배지에는 CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배지에 5-AZA를 2일 간격으로 첨가할 수 있다.
또 다른 예로서, 상기 (b) 단계에서 사용되는 배지는 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양용 배지를 사용할 수 있고, 상기 성장인자는 특별히 이에 제한되지 않으나, bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor) 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
또 다른 예로서, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 사용되는 배양용기는 PLO(Poly-L-Ornithin)와 FN(Fibronectin)이 코팅된 배양용기를 사용할 수 있는데, 상기 (b) 단계에서 배양하여 구상체(Sphere)가 형성된 후에는 상기 코팅된 배양용기와 아무것도 코팅되지 않은 배양용기를 번갈아 사용하여 계대배양을 수행할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 방법을 사용하면, 유전자의 변형 없이도, 정상적인 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있으므로, 자가신경줄기세포를 이용한 다양한 신경질환의 치료방법에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시키는 방법의 진행과정을 나타내는 개략도이다.
도 2는 비신경 세포를 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542가 첨가된 배지와 이들이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 과정에서 시간의 경과에 따라 발생하는 세포형태의 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3은 신경줄기세포의 특이적 형태(morphology)를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포(ciNSC)와 종래의 H9 배아줄기세포로부터 분화된신경줄기세포(H9-NSC)에서 발현된 SOX2, NESTIN 및 PAX6의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포에서 발현되는 핵내 마커 단백질(SOX2, PAX6 및 HMGA2), 세포질내 마커 단백질(NESTIN) 및 신경줄기세포의 자가재생 능력을 나타내는 마커 단백질(Ki67)의 발현수준을 확인한 면역형광염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 6a는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 신경세포를 대상으로 NF와 alpha-internexin을 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 6b는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 별아교세포를 대상으로 GFAP를 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 6c는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 희소돌기아교세포를 대상으로 O4를 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 7a는 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 다양한 조합으로 처리하여 배양된 세포에서 측정된 섬유아세포의 마커인 aSMA의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 다양한 조합으로 처리하여 배양된 세포에서 측정된 유도 신경줄기세포의 마커인 SOX2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유도 신경줄기세포의 제조
우선, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양배지가 담겨진 Poly-L-Ornithin(PLO)와 Fibronectin(FN)이 코팅된 세포배양 디쉬(cell culture dish)에 비신경 세포인 인간의 섬유아세포를 1 x 104/㎠의 농도로 접종하고, 하루동안 배양하였다. 이어, 상기 배지를, N2 supplement가 포함된 DMEM/F12 배양배지와 B27 supplement가 포함된 Neurobasal 배양배지가 1:1(v/v)로 혼합된 배지로 교체하고, 상기 교체된 배지에 DMSO에 용해시킨 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 첨가하고 배양하면서, 2일 간격으로 상기 첨가물을 첨가하여 총 7일 동안 1차 배양하였다.
상기 1차 배양이 종료된 후, 배양된 세포에 Accutase를 처리하여 배양된 세포를 회수하고, 상기 회수된 세포를 ReNcell NSC maintenance 배양배지와 StemPro NSC SFM 배양배지가 1:1(v/v)로 혼합되고, bFGF(basic fibroblast growth factor)와 EGF(epidermal growth factor)가 첨가된 배지가 담겨진 PLO/FN 코팅 배양용기에 접종하여, 1주일 동안 2차 배양하였다. 상기 2차 배양이 종료된 후, 배양된 세포를 회수하고, 회수된 세포를 상기 2차 배양에 사용된 배지가 담겨진 코팅되지 않은 배양용기에 접종하여 3차 배양하였다. 3차 배양을 수행하면서, 구상체(Sphere)가 형성되면, 안정적인 신경줄기세포 주 확립을 위해 PLO/FN 코팅된 배양용기와 코팅되지 않은 배양용기에 반복적으로 계대배양하였다(도 2)
도 2는 비신경 세포를 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542가 첨가된 배지와 이들이 첨가되지 않은 배지에서 배양하는 과정에서 시간의 경과에 따라 발생하는 세포형태의 변화를 나타내는 현미경 사진이다. 도 2에서 보듯이, 최초 배양시에는 섬유세포의 형태를 나타내었으나, 28일이 경과된 후에는 줄기세포의 특징인 구상체를 형성함을 확인하였다.
상기 계대배양이 종료된 후, 형성된 유도 신경줄기세포는 신경줄기세포의 특이적 형태(morphology)를 나타냄을 확인하였다(도 3).
도 3은 신경줄기세포의 특이적 형태(morphology)를 나타내는 현미경 사진이다.
실시예 2: 신경줄기세포 특이적 마커분석
상기 실시예 1에서 제조된 유도 신경줄기세포가 종래에 알려진 신경줄기세포와 동일한 것인지를 확인하기 위하여, 신경줄기세포 마커분석을 수행하였다.
실시예 2-1: 마커 유전자 분석
상기 실시예 1에서 제조된 유도 신경줄기세포(ciNSC)와 기존에 잘 알려진 H9 배아줄기세포로부터 분화된신경줄기세포(H9-NSC)에서 신경줄기세포 특이적 마커 유전자인 SOX2, NESTIN 및 PAX6의 발현수준을 RT-PCR 기법을 이용하여 비교하였다(도 4). 이때, 대조군으로는 hDF를 사용하고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포(ciNSC)와 종래의 H9 배아줄기세포로부터 분화된신경줄기세포(H9-NSC)에서 발현된 SOX2, NESTIN 및 PAX6의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, 신경줄기세포의 대표적 특이적 유전자인 SOX2, NESTIN 및 PAX6가 본 발명의 방법으로 제조된 유도 신경줄기세포(ciNSC)에서는 H9-NSC와 유사하게 발현됨을 확인하였다.
실시예 2-2: 면역형광염색을 이용한 마커 단백질 분석
상기 실시예 1에서 제조된 유도 신경줄기세포를 대상으로, 핵에서 발현되는 마커 단백질인 SOX2, PAX6 및 HMGA2; 세포질에서 발현되는 마커 단백질인 NESTIN; 및 신경줄기세포의 자가재생 능력을 나타내는 마커 단백질인 Ki67의 면역염색을 수행하였다(도 5).
도 5는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포에서 발현되는 핵내 마커 단백질(SOX2, PAX6 및 HMGA2), 세포질내 마커 단백질(NESTIN) 및 신경줄기세포의 자가재생 능력을 나타내는 마커 단백질(Ki67)의 발현수준을 확인한 면역형광염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 5에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 공지된 신경줄기세포의 핵내 및 세포질내 마커를 발현하였고, 자가재생 능력을 나타냄을 확인하였다.
상기 도 4 및 5의 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 정상적인 신경줄기세포와 동일한 마커를 발현함을 알 수 있었다.
실시예 3: 유도 신경줄기세포의 분화능 분석
상기 실시예 1에서 제조된 유도 신경줄기세포가 다른 신경줄기세포와 마찬가지로 다양한 신경세포로 분화될 수 있는지의 여부를 확인하고자, 상기 유도 신경줄기세포를 공지된 방법으로, 신경세포(Neuron), 별아교세포(Astocyte) 또는 희소돌기아교세포(Oligodendrocyte)로 각각 분화시키고, 신경세포의 마커인 NF(Neurofilament)와 alpha-internexin, 별아교세포의 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 및 희소돌기아교세포의 마커인 O4를 면역형광염색을 통해 확인하였다(도 6a 내지 6c).
도 6a는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 신경세포를 대상으로 NF와 alpha-internexin을 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 6a에서 보듯이, 상기 분화된 신경세포에서 NF와 alpha-internexin이 발현됨을 확인하였으므로, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 신경세포로 분화될 수 있는 능력을 나타냄을 확인하였다.
도 6b는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 별아교세포를 대상으로 GFAP를 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 6b에서 보듯이, 상기 분화된 별아교세포세포에서 GFAP가 발현됨을 확인하였으므로, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 별아교세포로 분화될 수 있는 능력을 나타냄을 확인하였다.
도 6c는 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포로 부터 분화된 희소돌기아교세포를 대상으로 O4를 면역형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 6a에서 보듯이, 상기 분화된 희소돌기아교세포에서 O4가 발현됨을 확인하였으므로, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 희소돌기아교세포로 분화될 수 있는 능력을 나타냄을 확인하였다.
상기 도 6a 내지 6c의 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하여 제조된 유도 신경줄기세포는 정상적인 신경줄기세포와 동일한 분화능을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: 전환인자의 역할 분석
상기 실시예 1에 개시된 유도 신경줄기세포의 제조방법에서 보듯이, 비신경 세포를 4가지 화합물이 포함된 배지에서 배양하여, 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있는데, 이때, 사용되는 4가지 화합물 중에서 가장 중요한 역할을 수행하는 화합물이 무엇인지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542 대신에, 5-AZA 단독(5), CHIR99021/포스콜린(CF), 5-AZA/CHIR99021(C5), 포스콜린/SB431542(FS), 5-AZA/포스콜린(F5), 5-AZA/SB431542(S5), CHIR99021/포스콜린/SB431542(CFS), 5-AZA/CHIR99021/포스콜린(CF5), 5-AZA/CHIR99021/SB431542(CS5), 5-AZA/포스콜린/SB431542(FS5), 5-AZA/CHIR99021/포스콜린/SB431542(4Fs)를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 각각의 2차 배양된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 각각의 2차 배양된 세포를 대상으로 섬유아세포의 마커인 aSMA의 발현수준과 신경줄기세포의 마커인 SOX2의 발현수준을 측정하고 비교하였다(도 7a 및 7b). 이때, 음성 대조군으로는 DMSO만을 처리하여 배양한 세포를 사용하였고, 양성 대조군으로는 4가지 화합물을 모두 사용하여 실시예 1의 방법으로 최종 제조된 유도 신경줄기세포(ciNSC)를 사용하였다.
도 7a는 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 다양한 조합으로 처리하여 배양된 세포에서 측정된 섬유아세포의 마커인 aSMA의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7a에서 보듯이, 3가지 조합 즉 5-AZA 단독(5), 5-AZA/포스콜린(F5) 및 5-AZA/CHIR99021/포스콜린/SB431542(4Fs)를 사용한 경우에는 aSMA가 발현되지 않았으나, 다른 조합을 사용한 경우에는 aSMA가 발현됨을 확인하였다. 상기 aSMA는 섬유아세포의 마커이므로, 상기 aSMA가 발현되었다는 것은 모든 섬유아세포가 유도 신경줄기세포로 전환되지 않고, 일부만이 전환되었다는 것을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
따라서, 5-AZA 단독(5), 5-AZA/포스콜린(F5) 또는 5-AZA/CHIR99021/포스콜린/SB431542(4Fs)를 사용한 경우에는, 2차 배양만을 수행한 수준에서도 최종적으로 제조된 경줄기세포(ciNSC)와 유사한 수준으로 모든 섬유아세포가 유도 신경줄기세포로 전환됨을 알 수 있었다.
도 7b는 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 다양한 조합으로 처리하여 배양된 세포에서 측정된 유도 신경줄기세포의 마커인 SOX2의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7b에서 보듯이, 5-AZA/포스콜린(F5)를 제외한 모든 조합을 사용한 경우에 SOX2가 발현됨을 확인하였다. 상기 SOX2는 유도 신경줄기세포의 마커이므로, 상기 SOX2가 발현되었다는 것은 섬유아세포가 유도 신경줄기세포로 전환되었다는 것을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 도 7a와 7b의 결과에서 보듯이, 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 다양한 조합으로 사용할 경우, 5-AZA/포스콜린(F5)을 제외한 대부분의 조합이 섬유아세포를 유도 신경줄기세포로 전환시킬 수 있음을 알 수 있었다. 그러나, 대부분의 조합에서는 섬유아세포와 유도 신경줄기세포가 함께 공존하는 형태이고, 5-AZA 단독(5) 및 5-AZA/CHIR99021/포스콜린/SB431542(4Fs)를 사용한 경우에만, 섬유아세포가 모두 유도 신경줄기세포로 전환되어, 섬유아세포가 존재하지 않음을 알 수 있었다.
특히, 5-AZA를 단독으로 사용할 경우(5) 보다는 4가지 화합물을 모두 사용할 경우에 보다 유도 신경줄기세포로의 전환효율이 우수한 것으로 확인되었다.
따라서, 비신경 세포를 유도 신경줄기세포로 전환시킴에 있어서, 가장 핵심적인 요소는 5-AZA이며, 나머지 CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542는 상기 5-AZA의 효과를 보조하는 역할을 수행하는 것으로 분석되었다.

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 5-AZA(5-Azacytidine), CHIR99021, Forskolin 및 SB431542를 포함하는 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유도 신경줄기세포는 SOX2, NESTIN 및 PAX6 유전자를 발현시키고, HMGA2, NESTIN 및 Ki67 단백질을 발현시키며, 신경세포, 별아교세포세포 또는 희소돌기아교세포로 분화될 수 있는 것인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 비신경 세포는 동물 유래 체세포인 것인, 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 비신경 세포의 유도 신경줄기세포로의 전환유도용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 (a) 상기 5-AZA를 포함하는 제1 조성물; (b) CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 포함하는 제2 조성물; 및 (c) 비신경 세포 배양용 배지 조성물이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장된 형태인 것인, 키트.
  8. 삭제
  9. (a) 비신경 세포를 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 포함하는 배지에서 7 내지 14일 동안 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 비신경 세포를 5-AZA, CHIR99021, 포스콜린 및 SB431542를 포함하지 않는 배지에서 구상체(Sphere)가 형성될 때까지 배양하는 단계를 포함하는, 비신경 세포로부터 전환된 유도 신경줄기세포를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 사용되는 배지는 성장인자를 포함하는 줄기세포 배양용 배지인 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 성장인자는 bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor) 또는 이들의 조합인 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (a) 및 (b) 단계는 PLO(Poly-L-Ornithin)와 FN(Fibronectin)이 코팅된 배양용기에서 수행되는 것인, 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 배양하여 구상체(Sphere)가 형성된 후에는, 상기 코팅된 배양용기와 아무것도 코팅되지 않은 배양용기를 번갈아 사용하여 계대배양을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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