CN114127264A - 包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的干细胞增殖促进用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含环植物鞘氨醇‑1‑磷酸酯(cP1P)或其药学上可接受的盐作为有效成分的多能干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养液添加用组合物，当使用本发明的干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养基添加用组合物培养干细胞时，可加强干细胞干性(stemness)、促进增殖、抑制细胞凋亡。

Description

包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有 效成分的干细胞增殖促进用组合物
技术领域
本发明涉及包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(cP1P)或其药学上可接受的盐作为有效成分的促进增值功能加强用组合物及干细胞培养液添加用组合物。
背景技术
多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSCs)不仅可以无限增殖，而且具有可分化成构成人体的所有种类的细胞及组织的特性，可通过将其诱导分化为功能性细胞来应用于培养皿内疾病模型制作及疑难疾病的治疗等。
迄今为止，虽然全球范围内已构建1000多种的人类胚胎干细胞(hESC，humanEmbryonic Stem Cells)和1200多种的诱导性多能干细胞(iPSC，induced PluripotentStem Cells)，但是从多能干细胞(PSCs)的构建到维持培养、储存、诱导分化为特定细胞的等大多数基于干细胞的研究在实验室环境中通过利用添加有动物来源的培养液的培养方法来实现，在各个实验室中，由于原本多能干细胞的人原始态(naivestate)标准各不相同，因此，其标准不明确。
为了将已建立的研究级多能干细胞转换为临床级，世界各国都在努力确保xeno-非依赖及GMP级的干细胞，在国外已经开始进行用于开发临床级多能细胞治疗剂的前期工作，已经开发并销售各种临床用研究阶段培养液。虽然世界各国都在开发xeno-非依赖及GMP级的无血清培养液，但大多数研究集中在抗体等生物制剂生产用培养液。目前销售的临床用研究阶段培养液的细胞增殖效果比血清培养液低，因此，当前能够完全替代血清的添加物质几乎没有。并且，由于目前销售的临床用研究阶段培养液含有价格非常昂贵而工业上难以使用的生长因子，因此，存在生产成本过高的问题，所以当前还没有商业化的临床级多能干细胞培养用培养液。
最近，以美国、日本为中心的国家正积极开发可用于临床的干细胞无血清培养液。虽然韩国的以下企业及研究所也正积极开发多能干细胞培养用培养液，但是，因未成功制作原型及实现商业化而100％依赖进口，并且，进口的研究用干细胞培养用无血清培养液的价格非常昂贵，以500mL为基准的价格为40万韩元至150万韩元。随着人类多能干细胞朝向定义(defined)为无血清培养(serum-free)、无饲养层培养(feeder-free)的培养系统发展，维持并增殖人原始态(
Figure BDA0003454987200000021
state)干细胞的难度正逐渐增加。当前，虽然可通过向小鼠模型的2i(GSK3b抑制剂和MEK抑制剂)系统添加多种生长因子和抑制剂来培养并维持人类多能干细胞，但无法构建完全原始态的多能干细胞。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种干细胞增殖促进用组合物，包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(cP1P，o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)或其药学上可接受的盐作为有效成分。
本发明的再一目的在于，提供一种干细胞培养液添加用组合物，包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
本发明的另一目的在于，提供一种干细胞培养方法，包括用上述干细胞增殖促进用组合物处理干细胞并培养的步骤。
本发明的又一目的在于，提供一种用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒，包含上述干细胞增殖促进用组合物。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供的干细胞增殖促进用组合物包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
并且，本发明提供的干细胞培养液添加用组合物包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
并且，本发明提供的干细胞培养方法包括用上述干细胞增殖促进用组合物处理干细胞并培养的步骤。
并且，本发明提供的用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒包含上述干细胞增殖促进用组合物。
并且，本发明提供的干细胞增殖促进方法包括向干细胞培养液添加环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐来培养干细胞的步骤。
发明的效果
本发明涉及包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的多能干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养液添加用组合物，当使用本发明的干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养基添加用组合物培养干细胞时，可加强干细胞干性(stemness)、促进增殖、抑制细胞凋亡。
附图说明
图1为示出环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(cP1P，o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P，Sphingosine-1-phosphate)及植物鞘氨醇-1-磷酸酯(P1P，Phytosphingosine-1-phosphate)的化学结构的图。
图2为示出向用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、植物鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘氨醇-1-磷酸处理人类多能干细胞后利用显微镜确认细胞增殖能力变化的图。
图3为示出用1nM～500nM浓度的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、植物鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘氨醇-1-磷酸处理人类多能干细胞后测定细胞的增殖比例的结果的图。
图4为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后利用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining)试剂盒进行染色后利用光学显微镜观察的结果的图。
图5为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认菌落数及大小变化的结果的图。
图6为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认传代培养导致的总细胞数变化的结果的图。
图7为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认细胞周期变化的结果的图。
图8为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认细胞凋亡变化的结果的图。
图9为示出用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认分化全能性变化的结果的图。
图10为示出长期用对照组(vehicle，DMSO)或环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞后确认基因表达变化的结果的图。
图11为示出通过用包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的培养添加剂或培养液处理人类多能干细胞来大量生成加强分化全能性的干细胞的图。
具体实施方式
最佳实施方式
以下，结合参考例及实施例详细说明本发明。但是，以下参考例及实施例仅为本发明的示例，不应解释为限定本发明。
实施例1.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度对于人类多能干细胞的细胞增殖能力的影响
为了确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(cP1P，o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)的浓度对于人类多能干细胞(hPSCs)的细胞增殖能力变化，培养人类多能干细胞并按照不同环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度进行处理，随后，确认人类多能干细胞的增殖变化。
在培养人类多能干细胞之前，在常温条件下，使用10μg/ml的vitronectin XF(STEMCELL)将培养皿涂敷两个小时，随后，为了去除上述涂敷溶液并提高培养皿的细胞附着性，而放入包含10μM的Y27632(ROCK抑制剂，TOCRIS)的Essential 8培养液(E8，STEMCELL)。以2000cells/cm2的密度在培养皿接种人类多能干细胞(CHA-ESC15；CHA医科大学)并通过上下左右摇晃来均匀地分散细胞后，在37℃的温度条件下，通过二氧化碳培养箱培养24小时以下，将培养液更换为去除Y27632的E8培养液后，每天更换培养液培养细胞，直到下一次传代为止。
每隔2天对以上述方式传代培养的人类多能干细胞更换及处理50nM、100nM或500nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(韩国公开专利第10-2017-0129460号，Exeso Bio Co.，Ltd.制造)、鞘氨醇-1-磷酸(Sigma-Aldrich US，73914)或植物鞘氨醇-1-磷酸酯(ExesoBio Co.，Ltd.制造)并培养6天后，在第7天，利用光学显微镜以100倍率观察细胞。
并且，为了测定细胞数量，在培养的第7天，去除细胞的培养液并利用PBS缓冲液清洗一次后，针对利用细胞解离缓冲液(Cell dissociation buffer)(STEMCELL)在去除PBS缓冲液的细胞中通过单细胞化分离的细胞以1000rpm的转速离心分离2分钟来去除缓冲液后，悬浮在E8培养基中，并使用EVETMAutomated Cell Counter(NanoEnTek)测定细胞数量。
另一方面，除了用DMSO(AppliChem GE，A3672，0100)处理人类多能干细胞之外，以相同方式针对对照组进行了实验。
结果如图2所示，相比于处理植物鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘氨醇-1-磷酸，在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，可确认到细胞增殖能力显著增加。并且，在用作为阳性对照组的植物鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘氨醇-1-磷酸处理的情况下，可通过显微镜照片确认到细胞凋亡。
实施例2.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞的增殖能力的影响
为了确定表现出人类多能干细胞增殖能力的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的最佳浓度，在1nM～500nM的浓度条件下确认细胞增殖能力。
通过与实施例1相同方法进行实验，每隔两天对传代培养的人类多能干细胞更换及处理1nM、10nM、50nM、100nM或500nM的植物鞘氨醇-1-磷酸酯、环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或鞘氨醇-1-磷酸，或者，每隔两天更换及处理对照组(vehicle，DMSO)培养6天后，在第7天观察人类多能干细胞。增殖比例可通过以下公式计算：{(P1P、cP1P或S1P处理组的总细胞数)/(对照组的总细胞数)}×100。
结果如图3所示，当处理10nM的鞘氨醇-1-磷酸时，细胞增殖率相比于对照组增加了1.25倍，当处理10nM的植物鞘氨醇-1-磷酸酯时，细胞增殖率相比于对照组仅增加了1.55倍，但是，当处理10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯时，细胞增殖率相比于对照组增加了1.78倍。
因此，即使在10nM的低浓度条件下，相比于作为阳性对照组使用的药物，在对人类多能干细胞处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的情况下，细胞增殖率显著提高。
实施例3.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于分化全能性产生的变化的影响
为了确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理是否对于分化全能性产生变化，通过与上述实施例2相同方法对人类多能干细胞处理10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或处理对照组(vehicle，DMSO)后，利用碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining)试剂盒(Sigma-Aldrich US，SCR004)进行染色后，使用光学显微镜观察。
结果如图4所示，可确认到相比于对照组，在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，未分化全能性维持得较好。
实施例4.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于菌落数及菌落大小产生的变化的影响
环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于菌落数及菌落大小产生的变化通过以下方法确认。
具体地，通过与实施例1相同方法用1nM、10nM、100nM、1000nM或10000nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞并培养6天，在第7天，利用光学显微镜观察菌落(colony)数及菌落大小。
结果如图5所示，相比于对照组，在用10nM以上的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，大小为150mm以上的菌落数显著增加(P＜0.01)。
实施例5.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞的增殖能力产生的变化在传代培养时是否持续的影响
为了确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞的增殖能力产生的变化是否在传代培养时持续，通过与实施例1相同方法持续用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞并经过三次传代培养后，确认人类多能干细胞的增殖变化。
结果如图6所示，可确认到相比于对照组，在用10nM以上的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，总细胞数量随着传代次数显著增加(P＜0.01)。
实施例6.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞产生的细胞周期变化的影响
为了确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞产生的细胞周期变化，进行流式细胞分析(flow cytometer)、细胞凋亡分析及细胞周期调节基因的表达分析。
为了进行流式细胞分析，通过与实施例1相同方法用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞并将利用细胞解离缓冲液(cell dissociation buffer)(ThermoFisher Scientific US，A1110501)对人类多能干细胞进行细胞分离，获得的细胞用DPBS溶液(pH7.4)中清洗(washing)3次来去除上清液，在清洗过程中，向细胞团滴加70％(v/v)的冷(cold)乙醇并在4℃的温度条件下固定1小时后，在DPBS溶液(pH7.4)中清洗(washing)3次，随后，以2000rpm的转速离心分离5分钟并添加50uL的100μg/ml核糖核酸酶(RNase)(Sigma-Aldrich US，P4170)混合均匀后，通过添加200μl的碘化丙啶(PI，propidiumiodide)(Sigma-Aldrich US，P4170)(50μg/ml))对DNA进行染色后，利用流式细胞仪(flowcytometry)测定DNA含量(content)。
为了确认细胞凋亡，通过与实施例1相同方法对人类多能干细胞处理10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯并利用细胞解离缓冲液(cell dissociation buffer)(Thermo FisherScientific US，A1110501)对人类多能干细胞进行细胞分离，获得的细胞用DPBS溶液(pH7.4)中清洗(washing)2次后，以2000rpm的转速离心分离5分钟，将10×结合缓冲液(binding buffer)(0.1M HEPES，1.4M NaCl，25mM CaCl2，pH7.4)稀释1×结合缓冲液的每100ul再悬浮(resuspension)1×105细胞，将其向Annexin V(BD bioscience US，556422)和7-AAD(BD bioscience US，1559925)分别放入5ul并缓慢搅拌后，在常温条件下避光培养15分钟并添加400u1的1×结合缓冲液，随后，利用Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(BDPharmingen US，556547)进行分析。
为了进行细胞周期调节基因的表达分析，通过与实施例1相同方法用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞并利用PBS缓冲液清洗人类多能干细胞后，在4％(w/v)的可溶性聚四氟乙烯(Santa Cruz Biotechnology US，30525-89-4)中固定5分钟或回收人类多能干细胞的蛋白质后进行电泳，随后，利用anti-REX1(Abcam UK，ab50828)、anti-OCT4(Santa Cruz Biotechnology US，sc-5279)、anti-SOX2(Abcam UK，ab97959)、anti-NANOG(Cell signaling US，4893s)、anti-E-cadherin(Cell signaling US，24E10)或anti-SSEA4(Merck millipore US，90231)抗体分析分化全能性基因的表达(免疫荧光分析或蛋白质印迹分析)。另一方面，除了用DMSO(AppliChem GE，A3672，0100)处理人类多能干细胞之外，以相同方式针对对照组进行了实验。
结果如图7的A部分所示，当用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞时，细胞增殖相比于对照组增加了约12％以上(对照组为48％，实验组为60％)，如图7的B部分所示，当用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞时，细胞增殖活性较高的属于G2/M phase的细胞数量相比于对照组显著增加(P＜0.01)，当对人类多能干细胞处理10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯时，相当于细胞凋亡(apoptosis)的细胞所属的sub-G0phase的细胞数量相比于对照组显著减少(P＞0.05)。
并且，如图7的C部分至图7的E部分所示，相比于对照组，在用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，调节细胞周期的基因(CDK1，Cyclin B)的表达有所增加。
实施例7.分析细胞凋亡及细胞毒性
为了确认在用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下是否诱发细胞凋亡及细胞毒性，通过与实施例6相同方法用10nM或100nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞5天后，使用Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen US，556547)进行分析。
结果如图8所示，相比于对照组(DMSO：0.5％/6.2％)，在通过作为细胞凋亡的初始标记的annexin V和作为最终标记的7-AAD用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下(cP1P 10nM：0.9％/3.9％，100nM：1.9％/5.3％)，细胞凋亡、细胞毒性度显著减少。
实施例8.确认环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞的分化全能性增加特性的影响
环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理对于人类多能干细胞的分化全能性是否具有增加特性通过以下方法确认。
具体地，通过与实施例1相同方法用100nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞并利用与实施例6相同方法进行免疫荧光分析，利用多功能阵列试剂盒(pluripotent array kit)(R&D System US，ARY101)分析与分化全能性相关基因的表达，通过与实施例6相同方法进行流式细胞分析。
结果如图9的A部分所示，在处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的实验组中，作为分化全能性标记基因的REX1、E-Cadherin、OCT4及SOX2的表达相比于对照组有所增加，如图9的B部分所示，相比于对照组，在处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的情况下，所检测的作为分化全能性相关基因的OCT4、NANOG、SOX2及E-Cadherin的spot较高，如图9的D部分所示，所检测的作为分化全能性相关基因的OCT4及E-Cadherin的蛋白质表达相比于对照组有所增加，如图9的C部分所示，相比于对照组，在处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的实验组中，作为分化全能性相关基因的REX1(86.8％→95.7％)、E-Cadherin(81.8％→85.6％)、OCT4(95.2％→96.5％)及SSEA-4(68.8％→82.2％)的蛋白质表达有所增加。
实施例9.分析长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞产生的影响
当长期培养人类多能干细胞时，由于有可能导致增殖速度降低或干细胞的性质产生细微变化等，因此，在长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，确认人类多能干细胞的特性是否产生变化。
具体地，通过与实施例1相同方法用10nM的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞或作为对照组用DMSO处理并培养，将第一次处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的传代作为0，直到总培养15代为止进行培养，回收细胞并提取RNA后，委托DGIST(大邱庆北科学技术学院)利用基因测序分析仪(Illumina HiSeq 2500)实施RNA测序分析(RNA sequencing)。
结果如图10所示，相比于第一次传代(0代)的基因表达，在处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的情况下，确认有197个基因表达变化(全基因组表达谱分析方法(DGE))，当未处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯时，确认有575个基因表达变化。
将上述基因表达变化组培养15代后，分为表达增加的组C2和表达减少的组C5并分析其基因本体(gene ontology)(图10的B部分和C部分)。在未处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的对照组中，虽然作为对于细胞凋亡过程(apoptotic process)及氧化应激(oxidativestress)产生反应的基因组的C2(cluster 2)基因表达有所增加，但是，在长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理的情况下，可判断具有抑制细胞凋亡并减少长度培养时增加的氧化应激的效果。并且，在未处理环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的对照组中，因作为细胞生长(celldevelopment)、胚胎生长(embryo development)及细胞增殖(cell proliferation)相关基因组的C5(cluster 5)基因表达有所减少而被判断为生长功能缺陷，但是，在长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理的情况下，因C5基因表达没有减少且稳定维持而被判断为具有能够维持可开始正常的生长过程的基因组表达的效果。
即，若用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞，则可获得抑制细胞凋亡、减少长期培养时增加的氧化应激、加强分化全能性、维持增殖能力等显著效果。
在本发明的具体实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于处理植物鞘氨醇-1-磷酸酯(P1P，Phytosphingosine-1-phosphate)或鞘氨醇-1-磷酸(S1P，Sphingosine-1-phosphate)，细胞增殖能力显著增加。
在再一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，未分化全能性维持得较好。
在还有一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，菌落数及菌落大小有所增加。
在另一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，总细胞数量随着传代次数显著增加。
在又一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，调节细胞周期的基因(CDK1，Cyclin B)的表达有所增加。
在又一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，细胞凋亡有所减少且细胞毒性度显著减少。
在又一实施例中，确认到在用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，细胞的分化全能性有所增加。
在又一实施例中，确认到在长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，细胞的分化全能性有所增加。
在又一实施例中，确认到在长期用环植物鞘氨醇-1-磷酸酯处理人类多能干细胞的情况下，相比于对照组，细胞的分化全能性有所增加。
以下，进一步详细说明本发明。
除非另有定义，否则本发明中所使用的所有技术术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明的一实施方式涉及包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的干细胞增殖促进用组合物。
在本说明书中所记载的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、鞘氨醇-1-磷酸(S1P，Sphingosine-1-phosphate)及植物鞘氨醇-1-磷酸酯(P1P，Phytosphingosine-1-phosphate)是已公知的物质，其化学结构如图1所示。
本申请的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、其药学上可接受的盐或其溶剂化物无法利用所属于有机化学领域的普通技术制备，例如，虽然可通过(S.Li，W.K.Wilson，G.J.Schroepfer，Chemical synthesis of D-ribo-phytosphingosine-1-phosphate，potential modulator of cellular processes.J.Lipid Res.40：117-125，1999)所公开的方法制备植物鞘氨醇-1-磷酸酯，但是，这不同于本申请的合成环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的技术，本申请的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯仅可通过在本发明人的授权专利“新型植物鞘氨醇-1-磷酸衍生物、其制备方法及包含其用于预防脱发、治疗或生发的组合物”(韩国授权专利第10-1340556号)中所公开的方法合成。
上述盐是指在生物学上可接受且施用于人时通常不会引起过敏反应或与此类似反应的盐，优选地，上述盐为通过游离酸(free acid)形成的酸加成盐。上述游离酸可使用有机酸和无机酸。上述有机酸可包括但不限于：柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸及天门冬氨酸。并且，虽然上述无机酸可包含盐酸、溴酸、硫酸及磷酸。在本申请的一实例中，药学上可接受的盐可以为上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、鞘氨醇-1-磷酸或植物鞘氨醇-1-磷酸酯的化合物与游离酸一同形成盐的酸加成盐。并且，除药学上可接受的盐之外，本申请的上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、鞘氨醇-1-磷酸或植物鞘氨醇-1-磷酸酯的化合物可包含能够通过通常使用的方法制备的所有盐、水合物、溶剂化物。
本申请的术语“干细胞”是具有多分化全能性的细胞，使得一个细胞能够生成多种其他细胞，是指能够使身体受损部位的细胞再生的细胞。干细胞具有能够持续生成与自身相同细胞的再生能力、在特定环境中能够分化成功能性特定细胞的分化能力及通过与免疫细胞反应来调节免疫反应的免疫调节能力。干细胞的种类可分为多能干细胞(pluripotentstem cell)及组织特异性干细胞(tissue-specific stem cell)，上述多能干细胞具有基于分化的细胞领域能够分化成所有构成人体的200多种细胞的能力，上述组织特异性干细胞能够分化成特定种类的细胞。并且，根据获得干细胞的来源，可分为从受精卵生成的胚胎或胚盘细胞(blastocyte)中获得的胚胎干细胞(embryonic stem cell)和在完成生长过程的新生儿或成人身体的各个组织中获得的成体干细胞(adult stem cell)。
在本申请中，上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cell)，上述干细胞可通过所属领域中通常使用的任何方法获得。
本申请的术语“胚胎干细胞(embryonic stem cell)”是指能够分化成个体的所有组织的细胞，具有多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)的细胞，可通过在体外培养从受精卵着床于母体子宫之前的囊胚中提取的内细胞群(inner cell mass)来获取，在广义层面上还包括来源于胚胎干细胞的拟胚体(embryoid bodies)。拟胚体为在胚胎干细胞自发性地分化成多种组织形态的过程中通过干细胞形成的中间结构，在胚胎干细胞的培养过程中形成的聚集物(aggregate)。另一方面，本发明的胚胎干细胞可来源于包括人在内的哺乳动物，优选为人类的胚胎干细胞。
胚胎干细胞可被分化成外胚叶、中胚叶和内胚叶性干细胞。
本申请的术语“分化(differentiatio)”是指在细胞的分裂增殖生长的过程中细胞的结构或功能被特化的现象。多能胚胎干细胞在分化成限定谱系的前驱细胞(例如，外胚叶细胞、中胚叶细胞或内胚叶细胞等)后，可进一步分化成其他形态的前驱细胞(例如，血管母细胞等)，随后，可分化成在特定组织(例如，血管等)中发挥特定作用的终末分化细胞(例如，血管内皮细胞及血管平滑肌细胞等)。
本申请的术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指通过处理体细胞或已分化的细胞来获得多能分化性的细胞。其中，处理方法可包括但不限于：在化合物、遗传转化或特定条件下培养的方法等。“人诱导性多能干细胞”或“hiPSC”是指通过处理人的体细胞或人的分化细胞来获得多能分化性的细胞。虽然上述人诱导性多能干细胞可来源于纤维细胞，但不限定于此，可来源于血液等多种起源。并且，上述人诱导性多能干细胞可通过向人纤维细胞表达Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc等细胞重编程相关基因来制备。在此情况下，Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc基因等的表达可来源于逆转录病毒感染或附加体系统(episomal system)。
本申请的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、其衍生化合物或其盐是为了实现促进干细胞的增殖或促进生长或实现本申请公开的效果而包含上述物质的干细胞增殖促进用组合物或细胞培养用培养基组合物，可添加在用于培养干细胞的普通培养基使用。
在本申请中，若向干细胞增殖促进用组合物添加环植物鞘氨醇-1-磷酸酯、其衍生化合物或其盐，则促进干细胞的增殖、抑制干细胞凋亡、增加干细胞菌落数及大小、加强干细胞的分化全能性，优选地，可促进胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的增殖、抑制细胞凋亡、增加菌落数及大小、加强分化全能性(stemness，naive state)。
上述干细胞增殖促进用组合物所包含的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度范围为10nM至10000nM，优选地，可以为0.5nM至200nM，上述浓度范围的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯可添加于干细胞培养用培养基。
只要能够实现本申请的目的，本发明可基于所期望的具体细胞的种类包含适当浓度的上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
在向细胞培养容器添加包含上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯作为有效成分的组合物并培养干细胞的情况下，可使得干细胞在细胞培养容器中从单细胞顺利生长成多个菌落(colony，形成细胞集群)，优选地，可使得胚胎干细胞或诱导性多能干细胞生长形成菌落。
在干细胞以形成菌落的方式生长的情况下，由于干细胞与在活体内生长的形态类似，因此，若利用包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯作为有效成分的组合物培养干细胞，则可获得具有与在活体内生长的类似特性的干细胞。
在本申请中，针对用于培养干细胞的培养基并无特别限制，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员已知的培养基即可。上述培养基可通过人工合成制备，也可使用商业制备的培养基。例如，作为商业制备的培养基有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle′sMedium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-Minimal essential Medium)、G-MEM(Glasgow’s Minimal EssentialMedium)、IMDM(Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium)或MEF，但并不限定于此。
只要实现本申请的目的，本发明可基于所期望的具体细胞的种类包含适当浓度的上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
另一方面，在向培养基(或培养液)添加本申请的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物的情况下，即使在没有血清成分的无血清培养基或血清成分低下的低血清培养基的状态下也可实现干细胞的增殖。
本申请的上述干细胞增殖促进用组合物可包含0.1重量百分比至3重量百分比的无血清或血清成分。
上述无血清培养基是指未包含规定含量以上的来源于包括人在内的动物的血清(动物源血清)的任意培养基。例如，相对于组合物的总重量，无血清培养基可包含0.1重量百分比以下或0.01重量百分比以下的动物源血清，具体地，可不包含动物源血清。
本申请提供干细胞培养基添加用组合物或无血清培养基组合物，包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯化合物、其药学上可接受的盐或其溶剂化物。因此，本发明可稳定增殖并培养干细胞，替代增殖并培养干细胞所需的物源血清，以达到可替代动物源血清的程度，从而能够构建可重复的实验及生产工序。
在低血清培养基中，通常用于细胞培养的血清添加有0.1重量百分比至3重量百分比的胎牛血清(FBS)，可使用具有与动物源血清类似成分的化合物，例如，可使用牛垂体提取物(BPE，bovine pituitary extract)等。
如上所述，优选地，本申请的上述“干细胞”来源于骨髓、脂肪组织、脐带血(cordBlood)、外周血、新生儿组织(neonatal organizations)、胎盘等多种成体组织及骨髓源细胞，但并不限定于此。
根据一实施方式，本发明涉及的干细胞培养液添加用组合物包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
只要不脱离干细胞培养液添加用组合物的本质，有关上述干细胞增殖促进用组合物的事项也可同样适用于干细胞培养液添加用组合物。
上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cel1)。
上述干细胞培养液添加用组合物所包含的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度范围为0.1nM至10000nM，优选地，可以为0.5nM至200nM，上述浓度范围的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯可添加于干细胞培养用培养基。
根据再一实施方式，本发明涉及的干细胞培养方法包括用上述干细胞增殖促进用组合物处理干细胞并培养的步骤。
只要不脱离干细胞培养方法的本质，有关上述干细胞增殖促进用组合物的事项也可同样适用于干细胞培养基添加用组合物。
上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cell)。
若用上述干细胞增殖促进用组合物处理干细胞并培养，则促进干细胞的增殖、抑制干细胞凋亡、增加干细胞菌落数及大小、加强干细胞的分化全能性，优选地，可促进胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的增殖、抑制细胞凋亡、增加菌落数及大小、加强分化全能性(stemness，naive state)。
并且，在用上述干细胞增殖促进用组合物处理干细胞并培养的情况下，可使得干细胞在细胞培养容器中生长形成菌落(colony，形成细胞集群)，优选地，可使得胚胎干细胞或诱导性多能干细胞生长形成菌落。
根据另一实施方式，本发明涉及的用于在体外培养环境(in vitro)中抑制干细胞凋亡的试剂盒包含上述干细胞增殖促进用组合物。
只要不脱离用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒的本质，有关上述干细胞增殖促进用组合物的事项也可同样适用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒。
本申请的试剂盒所包含的有效成分可参照以上提及的内容，可包含额外成分及使用方法等，以便在体外培养环境中实现上述期望效果。
上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cell)。
上述用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒所包含的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度可以为0.1nM至10000nM，优选地，可以为0.5nM至200nM，虽然上述浓度的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯可添加在用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒中，但并不限定于此。
在包含上述干细胞增殖促进用组合物的用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒培养干细胞的情况下，可阻碍并抑制干细胞凋亡、增加干细胞菌落数及大小、加强干细胞的分化全能性(stemness，naive state)。
根据又一实施方式，本发明涉及的用于在体外培养环境(in vitro)中促进干细胞增殖的试剂盒包含上述干细胞增殖促进用组合物。
只要不脱离用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒的本质，有关上述干细胞增殖促进用组合物的事项也可同样适用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒。
本申请的试剂盒所包含的有效成分可参照以上提及的内容，可包含额外成分及使用方法等，以便在体外培养环境中实现上述期望效果。
上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cell)。
上述用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒所包含的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度可以为0.1nM至10000nM，优选地，可以为0.5nM至200nM，上述浓度的环植物鞘氨醇-1-磷酸酯可添加在用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒中，但并不限定于此。
在包含上述干细胞增殖促进用组合物的用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒培养干细胞的情况下，可促进干细胞的增殖并加强分化全能性。
根据又一实施方式，本发明涉及的干细胞增殖促进方法包括向干细胞培养液添加环植物鞘氨醇-1-磷酸酯(cP1P，o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate)或其药学上可接受的盐来培养干细胞的步骤。
只要不脱离干细胞增殖促进方法的本质，有关上述干细胞增殖促进用组合物的事项也可同样适用于干细胞增殖促进方法。
上述干细胞可以为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)或诱导性多能干细胞(induced Pluripotent stem cell)。
若向干细胞培养液添加上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐来培养干细胞，则抑制干细胞凋亡、增加干细胞菌落数及大小、加强干细胞的分化全能性，优选地，可促进胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的增殖、抑制细胞凋亡、增加菌落数及大小、加强分化全能性(stemness，naive state)，由此，可显著促进干细胞的增殖。
产业上的可利用性
本发明涉及包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分的多能干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养液添加用组合物，当使用本发明的干细胞增殖促进用组合物及干细胞培养基添加用组合物培养干细胞时，可加强干细胞干性(stemness)、促进增殖、抑制细胞凋亡，因此，有利于医药产业。

Claims (18)

1.一种干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度为0.1nM至10000nM。
3.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
4.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述组合物促进干细胞的增殖并抑制细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述组合物增加干细胞菌落数并增加菌落大小。
6.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述组合物加强干细胞的分化全能性。
7.根据权利要求1所述的干细胞增殖促进用组合物，其特征在于，上述干细胞培养用组合物包含0.1重量百分比至3重量百分比的无血清成分或血清成分。
8.一种干细胞培养液添加用组合物，其特征在于，包含环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的干细胞培养液添加用组合物，其特征在于，上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度为0.1nM至10000nM。
10.根据权利要求8所述的干细胞培养液添加用组合物，其特征在于，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
11.一种干细胞培养方法，其特征在于，包括用权利要求1所述的组合物处理干细胞并培养的步骤。
12.根据权利要求11所述的干细胞培养方法，其特征在于，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
13.一种用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的用于在体外培养环境中抑制干细胞凋亡的试剂盒，其特征在于，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
15.一种用于在体外培养环境中促进干细胞增殖的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的组合物。
16.一种干细胞增殖促进方法，其特征在于，包括如下步骤，向干细胞培养液添加环植物鞘氨醇-1-磷酸酯或其药学上可接受的盐来培养干细胞。
17.根据权利要求16所述的干细胞增殖促进方法，其特征在于，上述环植物鞘氨醇-1-磷酸酯的浓度为0.1nM至10000nM。
18.根据权利要求16所述的干细胞增殖促进方法，其特征在于，上述干细胞为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
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