KR20050083106A - 인간 배아줄기세포로부터 인간 신경전구세포주의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포주의 제조방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 인간 배아줄기세포를 각 세포 덩어리로 분리하는 단계; 상기 분리된 인간 배아줄기세포를 EB 배양액에서 배양하여 EB(embyoid body)를 제조하는 단계; 상기 EB를 N2 배양액에서 신경전구세포주(hNPST1 세포)로 분화시키는 단계; 및 상기 분화된 신경전구세포주를 냉동 보관 및 해동하는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 인간 신경전구세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 신경전구세포주는 난치성 뇌질환 및 당뇨병 치유를 위한 인슐린 분비성 세포의 제조 등 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝히는데 이용될 수 있다.

Description

인간 배아줄기세포로부터 인간 신경전구세포주의 제조방법{Production method of Human neural progenitor cell line from human embroyonic stem cells}

본 발명은 인간 배아줄기세포로부터 유래된 신경전구세포주의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음세대로 유전될 수 있다. 이에 반하여, 태아 발생과정이 진행되어 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.

인간 배아줄기세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000). 하지만, 성체줄기세포의 경우는 아직까지 배 세포를 제조할 수 있다는 보고가 없으며 분화를 유도할 수 있는 세포 유형에 있어서도 배아줄기세포보다 제한적이라는 차이가 있다.

배아줄기세포 연구의 역사적 배경을 보면 1981년 처음으로 생쥐의 배아줄기세포 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서의 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol. Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 따라서, 생쥐 배아줄기세포 연구에 비해 인간 배아줄기세포 연구는 아주 짧은 역사를 지니고 있다. 하지만, 인간 배아줄기세포 연구를 통해 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝힐 수 있으므로, 현재 그 연구가 활발히 진행되고 있다.

인간 배아줄기세포는 가장 잘 알려져 있는 생쥐배아 줄기세포와 유사한 특성을 가지기도 하지만, 확연한 차이를 보이는 부분 또한 많이 존재하고 있는 것으로 알려지고 있다. 먼저 대표적인 유사한 특징은 두 세포 모두 피더(Feeder)가 있는 상태에서 배양이 가능하다는 점이며, 또한 배아의 발생에서 초기분화에 관계된다고 알려진 Oct-4 유전자가 발현되고 있으며, 자가 증식이 가능한 세포에서 발현되고 있는 텔로머라제(telomerase)의 존재 및 생쥐 배아줄기세포에서 높게 발현하고 있는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)가 인간 배아줄기세포에서도 공통으로 발현되고 있다는 점이다. 그 외에도 배아줄기세포는 전분화능을 가지고 있는 세포이므로, 시험관 내(in vitro) 조건에서 배아체(embryoid body, EB)를 형성시켜 분화를 유도하였을 때 다양한 조직의 세포로 분화가 일어나게 된다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998).

생쥐 배아줄기세포와의 특성상의 차이점은 다음과 같다. 첫째, 생쥐 배아줄기세포는 하나의 세포로 배양이 가능하지만 인간 배아줄기세포는 하나의 세포로 만들었을 때 대부분이 죽어버리므로 하나의 세포로는 배양이 불가능하다는 사실이다. 둘째, 배아줄기세포에서 특성분석으로 이용되는 SSEA 항체에 대한 반응을 보았을 때 생쥐 배아줄기세포의 경우는 SSEA-1은 나타나고 SSEA-3와 SSEA-4는 나타나지 않지만, 인간배아 줄기세포는 이러한 양상이 생쥐배아 줄기세포와 반대로 나타난다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998).

현재까지 생쥐 배아줄기세포의 연구를 통해 세포의 자가 증식이나 분화에 있어서의 생물학적 연구와 동물의 발생 및 분화에 있어서의 신호전달과정에 대한 연구뿐만 아니라 넉아웃(knock-out), 넉인(knock-in) 등과 같은 기술을 이용하여 생물학적 연구와 세포-기반 치료 등의 분야에서 좋은 결과들을 얻어 왔다. 하지만, 인간 배아줄기세포의 경우는 앞에서 언급했듯이 아직은 짧은 연구기간과 각 개별 세포로의 분리 및 배양의 어려움, 통일된 배양법이 없음, 그리고 세포 증식속도가 느린 점 등으로 인하여 생물학적 연구수단으로의 사용이 용이하지 못할 뿐만 아니라 현재 미국 국립보건원(NIH)에 등록된 78 종류의 인간 배아줄기세포 중 단지 9종류만이 사용가능하다는 보고를 볼 때 인간 배아줄기세포 연구를 함에 있어 아직도 넘어야 할 장벽이 많음을 알 수 있다. 그럼에도 불구하고, 인간 배아줄기세포에 대한 연구는 첫째 인간의 초기 분화에 관한 연구에 있어서 중요한 단서를 제공할 수 있으며, 둘째 난치병 등에 대한 세포치료의 핵심기술을 마련하는 동력이 된다는 점에서 그 중요성은 매우 크다고 하겠다. 인간 배아줄기세포는 자가 재증식이 가능하고 모든 세포로 분화 할 수 있는 전분화능을 가지고 있으므로, 인간 배아줄기세포로부터 각조직의 줄기세포로 분화 유도할 수 있는 기술이 확립된다면 인간의 다양한 질환 치료에 응용이 가능할 것이다.

현재 줄기세포를 이용한 세포치료의 핵심은 인간과 동물에서의 줄기세포의 분리, 줄기세포의 배양기술 확립, 시험관내 조건(in vitro)에서의 특정 기능세포로의 분화유도 및 분리기술, 인체실험 전에 동물에서 효능과 안전성 확립, 그리고 인체 이식에서의 면역거부반응 억제기술 등이 있으며 그 중 가장 핵심기술은 다양한 기능성 세포로의 분화 유도이다. 현재까지 생쥐 배아줄기세포 연구에서는 조혈모세포(hematopoietic cells)(Wiles et al., Development, 111: 259-267, 1991), 심장근육세포(cardiomyocytes)(Klug et al., J. Clin. Invest., 98: 216-224, 1996), 인슐린-분비 세포(insulin-secreting cells)(Soria et al., Diabetes, 49: 157-162, 2000), 신경세포(neurons)와 신경아교세포(glia)(Bain et al., Dev. Biol., 168: 342-357, 1995; Okabe et al., Mech. Dev., 59: 89-102, 1996; Mujtaba et al., Dev. Biol., 214: 113-127, 1999; Brustle et al., Science, 285 : 754-756, 1999; Brustle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14809-14814, 1997)로의 분화방법이 확립되어 있으며 인간 배아줄기세포를 이용한 연구는 현재 이미 확립되어 있는 생쥐 배아줄기세포의 배양방법을 응용하여 특정한 기능성 세포로의 분화를 유도, 확립하는 과정에 있다(Xu et al., Nat. Biotechnol., 20: 1261-1264, 2002; Xu et al., Circ. Res., 91: 501-508, 2002; Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19: 1129 - 1133; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 19: 1134 - 1140, 2001; Chadwick et al., Blood, 102: 906-915, 2003).

배아줄기세포 연구를 통한 세포치료(Cell therapy) 가능성은 생쥐 배아줄기세포로부터 유래된 기능성 전구세포와 동물 질환모델을 이용한 연구를 통하여 그 가능성이 입증된 바 있다. 퇴행성 뇌신경질환인 파킨슨병(Parkinson's disease)은 중뇌(midbrain)의 흑질(substantia nigra)에 위치한 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)이 점차적으로 죽거나 손상되면서 야기되는 질환으로 다른 뇌질환들에 비해 그 원인이 분명하기 때문에 이미 여러 방법(레보도파(levodopa)나 도파민 수용기 항진제(dopamine receptor agonist)의 사용이나 뇌조직의 일부를 제거하는 수술 또는 도파민성 신경세포의 전구체를 이식하는 등)을 통해 치료의 길을 모색하고 있다. 하지만, 약물 사용 시에 일어나는 무도병과 같은 부작용이나 부담이 큰 수술비용 그리고 다량의 전구세포 확보의 어려움(환자 한 사람당 발생 6-10주된 낙태아 6-10명 정도의 뇌 조직에서 분리한 전구세포가 필요(Kordower et al., J. Comp. Neurobiol., 370: 203-230, 1996)) 등의 이유로 완전한 치료법의 확립은 아직도 힘든 실정이다. 하지만, 줄기세포로부터 다수의 도파민성 신경세포의 전구세포(dopaminergic neuronal precursor cells)를 배양해 낼 수 있다면 그 치유의 길은 아주 밝은 편이다. 실제로 생쥐 배아줄기세포 연구에서 밝혀진 결과에 의하면 줄기세포로부터 얻어진 동일한 네스틴(Nestin)-양성의 줄기세포는 적당한 분화조건에 따라 신경세포 또는 인슐린 분비성 세포로도 분화될 수 있으며, 질환동물모델 생쥐에다 이식하였을 때 그 병세가 호전될 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Kim et al., Nature, 418: 50-56, 2002; Lumelsky et al., Science, 292: 1389-1394, 2001). 따라서, 이러한 연구결과는 인간 배아줄기세포에서 얻어진 네스틴-양성 세포로부터 기능성 신경세포와 더불어 인슐린 분비성 세포 또한 배양해 낼 수 있음을 시사해 주며, 향후 난치성 뇌질환뿐만 아니라 국내에도 수많은 환자가 있는 당뇨병 치유에도 획기적인 기여를 하리라 여겨진다.

따라서, 인간 배아줄기세포로부터 유래한 네스틴-양성 세포는 그 중요성이 매우 크다고 하겠다. 하지만, 이들 네스틴-양성 세포의 배양은, 필요로 할 때마다 배아줄기세포로부터 다시 배양하여 얻어야 한다는 점과 -80℃에 보관하였다가 필요로 할 때 다시 녹여서 재배양할 수 있는 기술이 부족하다는 점이 현재 극복해야 할 난제로 남아있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 극복할 수 있는 인간 배아줄기세포로부터 인간 신경줄기세포(전구세포)를 개발하고 이들 신경줄기세포의 특성(전구세포마커들의 발현, 다량배양, 농축) 및 다분화능을 입증함으로써 정상적인 인간 신경전구세포를 다량으로 쉽게 배양할 수 있는 방법을 개발함으로써 본발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 배아줄기세포로부터 인간 신경전구세포주를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 신경전구세포주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 배아줄기세포를 각 세포 덩어리로 분리하는 단계; 상기 분리된 인간 배아줄기세포를 EB 배양액에서 배양하여 EB(embyoid body)를 제조하는 단계; 및 상기 EB를 N2 배양액에서 신경전구세포주(hNPST1 세포)로 분화시키는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포주의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 생성된 hNPST1 세포를 피더 세포 배양액에 부유시킨 후, 최종 동결보존액을 처리하여 액체 질소에 보관하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 보관방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 생성된 hNPST1 세포를 냉동 및 해동한 후, N2 배양액에서 계대배양하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 재배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인간 신경전구세포를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 인간 배아줄기세포를 각 세포 덩어리로 분리하는 단계; 상기 분리된 인간 배아줄기세포를 EB 배양액에서 배양하여 EB(embyoid body)를 제조하는 단계; 및 상기 EB를 N2 배양액에서 신경전구세포주(hNPST1 세포)로 분화시키는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포주의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 EB 배양액은 DMEM/F12, FBS, β-머캅토에탄올, 글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신, bFGF의 조성을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, N2 배양액은 DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, 푸트레신, 프로게스테론, 소듐셀레나이트, 헤파린, bFGF의 조성을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 신경전구세포주의 제조방법의 최종단계 이후에, 추가적으로 분화된 신경전구세포주를 냉동 보관 및 해동하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 EB를 hNPST1 세포로 분화시키는 단계는 오르니틴과 피브로넥틴으로 코팅한 플레이트로 옮겨 계대배양하는 것이 바람직하고, 상기 계대배양으로 생성된 세포중 부유배양으로 구(sphere) 형태를 이루는 신경구(neurosphere)를 트립신 처리 후, 단일세포로 처리하여 배양하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기에서 신경전구세포는 부착 세포 또는 신경구(neurosphere)로부터 제조되는 것이 바람직하다.

EB 배양액에서 인간 배아줄기세포는 EB(embyoid body)로 전환되는데, 상기 EB를 플레이트에 부착하여 N2 배양액에서 배양한다. 이 경우 8 내지 10일 이후에 일부의 세포에서 로제트형의 신경세포(neural rosettes) 형태를 관측할 수 있다. 본원발명에서는 기존 방법처럼 상기 로제트형의 신경세포를 하나씩 분리하거나 디스파제 효소(dispase)를 처리하여 로제트형의 클럼프(clumps)만을 분리하지는 않는다.

본원발명에서는 생성된 EB를 플레이트에 부착하고 20 내지 30일 이후 자라난 다양한 형태의 세포들을 모두 이용할 수 있다. 구체적으로, 로제트형의 신경세포를 포함한 상기 세포들 모두를 스크래퍼(scraper)로 긁어모아 0.1%의 오르니틴(ornithine)과 1 ㎍/㎖의 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅시킨 플레이트에 옮겨 배양한다. 그리고, 일정한 간격으로 플레이트를 옮겨주면서 계속 배양해 나가면 신경전구세포모양의 특성(양극성)을 갖는 세포들로 바뀌거나 그러한 세포들만이 선택되어 남게 된다. 또한, 상기 세포들은 코팅된 바닥에서 자라다가 4-5일 정도 지나면 일부 세포는 구(sphere) 형태를 형성하기 시작한다. 파이페팅(pipetting)으로 상기 구(sphere)형의 세포를 바닥에서 떼어 따로 부유배양을 유도하고, 파이페팅 후에도 바닥에 계속 부착된 세포들은 배지를 교체하며 배양을 계속하면 또다시 구 형태를 형성한다. 상기 부유배양 중인 구형태의 세포는 일반적인 신경줄기세포의 신경구(neurosphere)를 형성하면서 생장한다. 그리고, 상기 신경구들을 모아 트립신(trypsin) 처리한 뒤, 코팅된 플레이트에 단일세포로 처리하여 배양하면 바닥에 부착하여 성장하다가 일정 기간 후, 일부 세포들은 다시 구 형태를 형성한다.

상기와 같은 방식으로 배양을 계속하면 바닥에 부착하여 생장하는 세포에서 뿐만 아니라 신경구 세포로부터도 무제한의 신경전구세포의 제조가 가능하다.

상기 생성된 신경구의 특성을 분석한 결과, 상기 세포는 신경줄기세포 마커인 네스틴(Nestin), 비메틴(vimentin), Pax6 유전자를 발현하고 있으며, 아울러 줄기세포의 다분화능(pluripotency)의 마커로 알려져 있는 Oct-4, Sox2의 발현도 높게 유지된다. 그런데, 현재까지 보고된 인간 배아줄기세포로부터 유도된 인간 신경줄기세포에서는 Oct-4의 발현이 없는 것으로 알려져 있어 본 발명의 방법으로 제조된 신경전구세포는 종래의 세포와는 다르다고 판단된다.

또한, 인간 배아줄기세포의 마커인 SSEA-4의 발현이 상기 신경전구세포에서는 나타나지 않았으므로, 인간 배아줄기세포와는 완전히 다른 세포임을 알 수 있다. 그리고, 신경세포로의 분화유도에서는 신경세포뿐만 아니라 성상세포로도 분화가 유도된다.

따라서, 본 발명의 제조방법으로 얻어진 신경전구세포는 일반적인 신경전구세포의 특성을 가질 뿐 아니라 배아줄기세포의 특성 중 일부도 함께 가지고 있는 세포로 추정된다. 또한, 이들 신경전구세포를 적절한 조건하에서 냉동보관할 수 있으므로, 본 발명의 방법으로 다량의 신경전구세포를 배양한 뒤 필요시까지 냉동보관할 수 있으며, 다시 녹여서 재배양할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인간 신경전구세포주의 제조방법으로 생성된 hNPST1 세포를 피더 세포 배양액에 부유시킨 후, 최종 동결보존액을 처리하여 액체 질소에 보관하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 보관방법을 제공한다.

이때, 피더 세포 배양액은 DMEM, FBS, β-머캅토에탄올, 글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린 G, 스트렙토마이신의 조성을 포함하는 것이 바람직하고, 최종 동결보존액은 DMSO, 우태아 혈청, 피더 세포 배양액의 조성을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 최종 동결보존액은 10%의 DMSO, 40%의 우태아혈청, 50% 피더 세포배양액을 포함하고, 액체질소는 -186℃ 이하인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 인간 신경전구세포주의 제조방법으로 생성된 hNPST1 세포를 냉동 및 해동한 후, N2 배양액에서 계대배양하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 재배양 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인간 신경전구세포(hNPST1)를 제공한다.

본 발명의 인간 신경전구세포주의 제조방법은 제 1단계에서 인간 줄기세포의 마커인 SSEA-4 및 생쥐 줄기세포의 마커인 SSEA-1 항체를 이용한 FACS 조사를 수행하여, 본 발명자들은 인간 배아줄기세포를 분리하고 배양한다(도 1a 및 도 1b 참조).

제 2단계에서 상기 분리된 인간 배아줄기세포를 EB 배양액(Dulbecco's modified Eagle`s medium(DMEM)/F12, FBS(Fetal bovine serum), β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 글루타민(glutamine), 비필수 아미노산, 페니실린 G, 스트렙토마이신(streptomycin), bFGF)에서 배양함으로써 EB(embroid body)를 제조한다.

제 3단계에서 상기 EB를 조직 플레이트에 결합시킨 뒤, N2 배양액(DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린(transferrin),푸트레신(putrescine), 프로게스테론(progesterone),소듐셀레나이트(sodium selenite) 헤파린(heparin), bFGF)에서 배양한다. 이때, 다양한 형태의 세포가 형성된다. 또한, 상기 세포를 오르니틴(ornithine)과 피브로넥틴(fibronectin, BD)으로 코팅된 플레이트에 옮겨서 N2 배양액에서 배양한다. 추가적으로, 상기 배양된 세포가 일정한 형태를 형성할 때까지 반복 배양으로 같은 형태의 세포가 되었을 때, 피더(feeder) 배양액을 처리하고 오르니틴/피브로텍틴이 코팅된 플레이트에 상기 세포를 결합시켜 배양한다.

그 결과, 인간 배아줄기세포가 신경전구세포주로 분화하였다(도 2a 및 도 2b). 본 발명자들은 상기 인간 배아줄기세포로부터 분화시킨 인간 신경전구세포주를 hNPST1이라 명명하였다.

본 발명자들은 Oct-4 유전자의 증폭은 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를, Sox2 유전자의 증폭은 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를, Nestin 유전자의 증폭은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를, Pax6 유전자의 증폭은 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를, 대조군으로 사용한 β-액틴(actin)의 증폭은 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 이용함으로써, STO 세포, hES 세포 및 hNPST1 세포로부터 분리해 낸 전체 RNA을 주형으로 사용하여 원스텝(one-step) RT-PCR을 실시하였다. 상기 RT-PCR 산물을 전기영동함으로써 줄기세포의 마커인 Oct-4, Sox2, 네스틴, Pax6 및 대조군 β-액틴의 발현 여부를 확인하였다(도 3 참조).

그 결과, Oct-4, Sox2는 세포의 전분화능(pluripotency)을 나타내는 분자마커로 사용되며, 네스틴(Nestin), Pax6는 신경줄기세포(세포의 종류에 따라 hES에서도 발현됨)의 분자마커로 사용되고 있다. 본 발명의 인간 신경줄기세포(hBPST1)에서의 이들 분자마커 발현을 RT-PCR로 조사한 결과, 네스틴과 Pax6의 발현이 높았고, 특이하게도 현재까지 배아줄기세포에서만 특이적으로 발현된다고 알려져 있던 Oct-4 및 Sox2도 hNPST1 세포에서 상당량이 발현되고 있다(도 3 참조).

아울러, 상기 결과를 통하여 본 발명의 방법으로 제조된 신경줄기세포와 유래세포인 배아줄기세포가 서로 상당히 유사한 발현패턴을 보이는 것을 시사하므로, 두 세포군의 차이을 조사하기 위하여 배아줄기세포 특이적 표면 표식인자인 SSEA-4, SSEA-1으로 FACS를 실시하였다(도 4b 참조). 그 결과, hNPST1에서는 인간 배아줄기세포와는 달리 적은 양이나마 SSEA-1의 발현이 이루어지고 있으나, SSEA-4의 발현은 전혀 일어나지 않는 것으로 보아 유래세포인 인간 배아줄기세포와는 완전히 다른 세포임을 알 수 있다.

또한, 폴리-L-오르니틴과 피브로텍으로 코팅된 커버글라스 위에 본 발명의 방법으로 제조된 hNP-ST1의 신경세포구(neurosphere)를 가라앉혀 N2 배지에서 배양하고, 파라포름알데히드/PBS로 세포를 고정시킨 뒤, 투과(permeabilization) 및 블럭킹(blocking)을 실시한다. 이후 항-네스틴 항체, 항-비멘티(Vimentin) 항체로 일차항체 반응을 시키고, 추가적으로 적당한 이차항체를 세포에 처리한다. 상기 세포를 형광현미경으로 염색하고 관찰한 결과, 거의 모든 세포에서 신경줄기세포 마커인 네스틴과 비메틴의 발현을 관측하였다(도 4a 참조).

아울러, N2 배양액에서 자란 신경전구세포의 구(sphere)를 단일세포로 분리하고 플로우 사이토미트리(Flow cytometry)에 사용하여 표면 표식인자(CD133 및 NCAM의 발현)를 인지할 수 있는 항체인 항-CD133 항체(R&D, cat# MAB1133), 항-N-CAM(Sigma, C-9672)를 처리하고, 이차항체인 항-생쥐 Ig-FITC를 처리하여 FACS 칼리버(caliber)로 신경전구세포에 대한 결합능을 분석한 결과, 본 발명에서 제조한 hNPST1 세포는 신경줄기세포 마커인 N-CAM과 CD-133의 발현이 일어나고 있음을 알 수 있었다(도 4b 참조).

또한, hNPST1 세포에 피더(feeder) 배양액을 처리하고 오르니틴/라미닌(laminin)으로 코팅된 플레이트에 접종하고, N2 배양액에서 bFGF를 제거하여 배양하여 신경세포로의 분화를 유도하였다. 그리고, 상기 세포에 산양혈청 용액을 처리하고 신경세포를 인지하는 표식인자인 Tuj-1 항체와 성상세포(Astrocyte)를 인지하는 GFAP 항체를 처리한 뒤, 형광현미경으로 신경세포로의 분화를 확인한 결과, 분화된 신경세포의 세포질에 존재하는 클래스 Ⅲ β-튜블린(tubulin)의 발현을 일부 세포에서 관측할 수 있었으며, 또한 분화된 성상세포의 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 단백질의 발현을 일부 세포에서 확인되었다(도 5 참조).

또한, hNPST1 세포를 DMSO와 FBS(Fetal bovine serum)에 피더(Feeder) 세포 배양액(DMEM, FBS, β-머캅토에탄올, 글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린 G, 스트렙토마이신)을 혼합한 용액에서 -72 내지 -186℃에서 보관한다.

그리고, 상기 냉동보관 중인 hNPST1를 해동시킨 후, 피더 배양액을 첨가하여 hNPST1 세포를 얻은 뒤, N2 배양액에서 오르니틴/피브로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용하여 배양한다(도 6 참조). 그 결과, 신경전구세포를 동결 및 해동의 반복을 통하여 계속적으로 계대배양할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포주의 제조

인간 배아줄기세포 Miz-hES1를 성삼의료재단 미즈메디병원으로부터 분양 받아서, DMEM(Dulbecco's modified Eagle`s medium)/F12(Gibco, Rockville, MD, USA), 20%의 넉아웃(Knockout) SR(Gibco), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)(Sigma, St Luis, MO, USA), 2 mM의 글루타민(glutamine)(Gibco), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린(penicillin) G(Sigma), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin) (Sigma), 4 ng/㎖의 bFGF(Gibco Invitrogen) 배지에서 인간 배아줄기세포를 배양시킨 뒤, 6일 간격으로 2차 배양(subculture)을 수행하였다. 구체적으로, 0.1%의 겔라틴(gelatin) 용액으로 37℃에서 10분 동안 12-웰(well)의 조직배양용 플레이트(Nunclon)를 코팅한 후, 3000 rad 감마 방사선을 조사한 MEF(mouse embryonic fibroblast)를 웰당 6.5 × 10⁴ 세포 수로 접종하였다. 상기 방사선이 조사된 MEF는 자라지는 않지만 인간배아줄기세포의 성장을 지지하는 세포이다. 24시간 후에 5-7일 된 인간 배아줄기세포 조직에 37℃에서 1시간 동안 1 ㎎/㎖의 콜라겐 분해효소(collagenase) Ⅳ(Gibco)를 처리한 뒤 상기 줄기세포를 적당한 크기로 자른 후 상기에서 준비한 MEF 조직배양용 플레이트에 옮기고, 48시간 후부터 매일 배양액을 교체하며 배양하였다. 이렇게 7일간 배양된 인간 배아줄기세포에 1 ㎎/㎖ 농도의 콜라게나제(collagenase)를 100 ㎜ 디쉬에 3 ㎖씩 넣어 1시간 내지 1시간 30분 정도 처리하여 각 세포 덩어리로 분리하였다(도 1a).

상기 세포가 인간 배아줄기세포인 것을 확인하기 위하여, 인간 줄기세포의 마커인 SSEA-4 및 생쥐 줄기세포의 마커인 SSEA-1 항체를 이용한 FACS 조사를 수행한 결과, 본 발명의 배양중인 세포가 인간 배아주기세포임을 확인하였다(도 1b). 상기 도 1b에 있어서, 실선은 단일클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다.

분리된 인간 배아줄기세포 덩어리를 깨어지지 않게 조심하여 박테리아 플레이트(bacteria plate)에 잘 옮겨 EB 배양액(Dulbecco's modified Eagle`s medium(DMEM)/F12(Gibco), 20%의 FBS(Fetal bovine serum, hyclone), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol, Sigma), 2 mM의 글루타민(glutamine, Gibco), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린 G(Sigma), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin, Sigma), 4 ng/㎖의 bFGF(Gibco, Invitrogen))에서 EB(embryoid body)를 형성할 수 있도록 4일간 배양하였다. 이때, 매일 배양액과 플레이트를 교체하여 주었다.

잘 배양된 EB를 조직 플레이트(tissue plate)에 24시간 배양하여 플레이트에 결합시켰다. 그리고, N2 배양액(DMEM/F12, 25 ㎍/㎖의 인슐린(Sigma), 100 ㎍/㎖의 트랜스페린(transferrin, Sigma), 60 μM의 푸트레신(putrescine, Sigma), 20 nM의 프로게스테론(progesterone, Sigma), 30 nM의 소듐셀레나이트(sodium selenite, Sigma), 2 ㎍/㎖의 헤파린(heparin, Sigma), 20 ng/㎖의 bFGF(Invitrogen))으로 교체하여 20일에서 30일정도 배양하여 분화시키고 충분히 자라도록 한다(3-5일에 한번씩 배양액 교체). 이때, 다양한 형태의 세포가 형성되었다.

그 다음단계로, 0.1%의 오르니틴(ornithine, Sigma)과 1 ㎍/㎖의 피브로넥틴(fibronectin, BD)으로 하룻밤 동안 코팅시킨 플레이트를 준비하였다. 상기 형성된 세포를 스크레이퍼(scraper)를 사용하여 떼어 상기 코팅된 플레이트에 옮겨서 N2 배양액에서 1주일 정도 배양하였다.

배양된 세포가 일정한 형태를 형성할 때까지 반복 배양하고, 같은 형태의 세포가 되었을 때, 0.25% 트립신(trypsin)/0.1 mM의 EDTA을 2 ㎖ 처리하여 37℃에서 3분간 둔 후, 8 ㎖에 피더(feeder) 배양액을 처리하고 1200 rpm에서 3분 동안 원심분리로 세포만을 분리한 후 떼어낸 후, 0.1%의 오르니틴/1 ㎍/㎖의 피브로텍틴이 코팅된 100 ㎜ 플레이트에 5 × 10⁶ 세포를 결합시킨 후 배양하였다(2-3일에 한번씩 배지 교체, 2주일 동안 배양).

그 결과, 처음에는 다양한 형태를 지니던 세포들(도 2a)이 차츰 한 가지 형태, 즉 양극성 형태의 세포들로 변해갔으며, 최종적으로는 양극성 형태의 세포들만이 남게되었다(도 2b). 양극성 형태는 신경줄기세포의 특징적 형태이며, 상기 세포들은 신경구(neurosphere)를 형성할 수 있으므로(도 2b), 본 발명의 방법에 의하여 인간 배아줄기세포로부터 유도된 상기 세포는 신경전구세포임을 알 수 있다.

본 발명자들은 상기 인간 배아줄기세포로부터 분화시킨 인간 신경전구세포주를 hNPST1이라 명명하였다.

<실시예 2> 인간 배아줄기세포에서 분화된 신경전구세포의 특성분석

<2-1> 전사인자, 세포내부 단백질 및 세포표면 단백질 발현의 RT-PCR 분석

줄기세포 마커 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 피더(feeder) 세포로 사용되는 생쥐의 STO 세포주(embryonic fibroblast cell line), hES 세포(human embryonic stem cell, 인간 배아줄기세포), hNP 세포(human neural progenitor, 인간 신경줄기 또는 신경전구세포) 및 hNPST-1 세포(hNP와 STO가 결합된 세포)로부터 분리해 낸 전체 RNA 100 ng을 주형으로 사용하여 원스텝(one-step) RT-PCR을 실시하였다.

구체적으로, 로케(Roche)사에서 판매중인 C. 뎀 폴리머라제 원스텝 RT-PCR 시스템 키트(C. Therm. Polymerase One-Step RT-PCR System kit; cat.# 2.016.338)를 사용하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 세트의 염기서열은 Oct-4 유전자의 증폭은 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를, Sox2 유전자의 증폭은 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를, Nestin 유전자의 증폭은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를, Pax6 유전자의 증폭은 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 프라이머를, 대조군으로 사용한 β-액틴(actin)의 증폭은 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 프라이머를 이용하였다. 본 증폭에 사용한 RT-PCR 반응조건은 60℃에서 30분간 역전사(reverse transcription)에 이어 94℃에서 2분간 변성(denaturation)을 한 뒤 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 PCR 반응을 35번 반복하고, 72℃에서 10분간 중합(polymerization) 반응을 수행하였다. 그 결과, 상기 RT-PCR 산물을 1.3%의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동하여 Oct-4, Sox2, 네스틴, Pax6 및 대조군 β-액틴의 발현 여부를 확인하였다(도 3).

Oct-4, Sox2는 세포의 전분화능(pluripotency)를 나타내는 분자마커로 사용되며, 네스틴(Nestin), Pax6는 신경줄기세포(세포의 종류에 따라 hES에서도 발현됨)의 분자마커로 사용되고 있다. 본 발명의 방법으로 제조된 세포에서의 상기 분자마커의 발현을 RT-PCR로 조사한 결과, 네스틴과 Pax6의 발현이 높았고, 특이하게도 현재까지 배아줄기세포에서만 특이적으로 발현된다고 알려져 있던 Oct-4와 Sox2도 본 발명의 방법으로 제조된 신경줄기세포에 상당량 발현되고 있음을 확인하였다.

<2-2> 신경전구세포의 내부 표식인자 발현의 면역화학(immunocytochemistry) 분석

폴리-L-오르니틴과 피브로텍으로 코팅된 커버글라스(cover glass) 위에 본 발명에서 확립된 hNP-ST1의 신경세포구(neurosphere)를 가라앉혀 N2 배지에서 20시간 정도 배양한다. 배지를 제거한 후 남아있는 배지 잔여물을 PBS로 세척하고 상온에서 30분간 4%의 파라포름알데히드/PBS로 세포를 고정시켰다. 반응 종료후, PBS로 다시 세척한 뒤 0.3% 트리톤(Triton)-X-100/PBS/0.1%의 BSA/10%의 NGS를 세포에 처리하여 상온에서 1시간 동안 투과(permeabilization) 및 블럭킹(blocking)을 실시한다. 이후 PBS/0.1%의 BSA/5%의 NGS에 다음과 같은 농도의 항체를 섞어 세포에 처리하고 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 항-네스틴 항체(Chemicon, 생쥐 단일클론 IgG)는 1/300로, 항-비멘티(Vimentin) 항체(RDI, cat#RDI-PRO61013, 단일클론 IgG)는 1/10로, 항-CD133 항체(R＆D, cat# MAB1133, 단일클론 IgG)는 1/20으로, 항-N-CAM 항체(Sigma, C-9672, 단일클론 IgG)는 1/100의 농도를 사용하였다. 일차항체 반응이 끝나면 PBS로 세척하고 적당한 이차항체를 세포에 처리하여 상온에서 한 시간 동안 처리하였다. 핵은 DAPI를 사용하여 염색하였다. 모든 반응이 끝나면 마운팅(mounting)하여 형광현미경으로 염색을 확인하고 사진을 찍었다(도 4a). 그 결과, 거의 모든 세포에서 신경줄기세포 마커인 네스틴과 비멘틴이 발현되고 있음을 확인하였다.

<2-3> 인간 신경전구세포의 표면 표식인자 발현조사를 위한 FACS 분석

N2 배양액에서 자란 신경전구세포의 구(sphere)를 세포분리 완충액(cell dissociation buffer, GIBCO)로 20분 동안 37℃에서 처리하여 단일세포로 분리하고 40 ㎛의 스트레인너(strainer)를 통과시켜 2 × 10⁵ 세포를 플로우 사이토미트리(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일세포화 된 신경전구세포를 PBA(1%의 BSA를 PBS에 용해)에 부유시키고 표면 표식인자(CD133과 NCAM의 발현)를 인지할 수 있는 항체를 항-CD133 항체(R&D, cat# MAB1133, 단일클론 IgG)는 1/20으로, 항-N-CAM 항체(Sigma, C-9672, 단일클론 IgG)는 1/100의 농도를 사용하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 1200 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액 100 ㎕을 제거하고, 여기에 항-생쥐 Ig-FITC(BD)를 200배 희석하여 4℃에서 30분 반응시킨 다음 2회 PBA로 세척하고, FACS 칼리버(caliber)로 신경전구세포에 대한 결합능을 분석하였다(도 4b). 그 결과, 30% 정도의 hNPST-1에서 신경줄기세포 마커인 N-CAM과 CD-1333의 발현이 양성인 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, hNPST-1 세포는 두 종류의 세포 그룹으로 구성되어 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 신경전구세포로부터 신경세포로의 분화 유도 및 분화 확인

<3-1> 신경세포로의 분화유도 방법

hNPST1 세포를 0.25%의 트립신/0.1 mM의 EDTA를 2 ㎖ 처리하여 37℃에서 3분간 반응시킨 후 8 ㎖에 피더(feeder) 배양액을 처리하고 1200 rpm 3분 동안 원심분리기를 사용하여 세포만을 분리한 후, 하룻밤 동안 오르니틴/라미닌(laminin)으로 코팅된 24 웰(well) 커버 슬라이드가 들어 있는 플레이트에 웰당 1 × 10⁵ 세포를 접종하였다. N2 배양액에서 bFGF를 제거하여 7일에서 10일간 배양하였다.

<3-2> 신경세포로의 분화확인

7일에서 10일간 분화된 hNPST1 세포가 신경계세포로 분화가 되는지를 알아보기 위하여, 먼저 배양액을 제거하고 4%의 파라포름알데히드를 실온에서 20분간 처리, PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 0.3%의 트리톤 X-100, 0.1%의 BSA, 0.9%의 산양혈청(goat serum)의 용액을 실온에서 1시간 처리하고 PBS로 3회 세척한 후 10% 산양혈청 용액을 실온에서 1시간 처리, 신경세포를 인지하는 대표적인 표식인자로 Tuj-1 항체와 성상세포(Astrocyte)를 인지하는 GFAP 항체를 각각 4℃에서 24시간 동안 처리하였다.

항체가 처리된 플레이트를 PBS로 3회 세척하고 각 항체에 맞는 형광이 표지된 이차항체를 실온에서 1시간 처리, PBS로 3회간 세척한 후, DAPI 용액을 10분 처리하여 세포핵을 염색하고 형광현미경으로 관찰하여 Tuj-1과 GFAP가 발현하고 있는지 확인하였다(도 5). 그 결과, 분화된 신경세포의 세포질에 존재하는 클래스 Ⅲ β-튜블린(tubulin)의 발현을 일부 세포에서 볼 수 있었으며, 또한 분화된 성상세포의 마커인 GFAP 단백질의 발현도 일부 세포에서 확인되었다.

<실시예 4> 인간 배아줄기세포에서 분화된 신경전구세포의 냉동보관 및 재 배양

<4-1> 냉동보관

hNPST1 세포를 0.25%의 트립신/0.1 mM의 EDTA를 처리하여 분리한 뒤 약 2 × 10⁶ 세포를 10%의 DMSO(Sigma)와 40%의 FBS(Fetal bovine serum)에 50%의 피더(Feeder) 세포 배양액(DMEM(Gibco), 10% FBS(Hyclone, Utah, USA), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올, 2 mM의 글루타민, 0.1 mM의 비필수 아미노산, 100 U/㎖의 페니실린 G, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신)을 혼합한 용액 1 ㎖을 넣어 저장용기에 넣고 -72℃에서 24시간 놓아둔 후 -186℃에 보관하였다.

<4-2> 재 배양

냉동보관 중인 hNPST1를 37℃ 중탕 냄비(water bath)에서 3분간 용해시킨 후 9 ㎖의 피더 배양액을 첨가, 잘 혼합하여 실온에서 1200 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 얻어진 세포를 N2 배양액에서 오르니틴/피브로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용하여 배양하였다(도 6). 도 6의 상단은 동결(freezing)전의 신경전구세포이고, 하단은 해동(thawing)후의 신경전구세포로 이와같은 동결 및 해동의 반복을 통하여 계속적으로 계대배양할 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 신경전구세포는 난치성 뇌질환 및 당뇨병 치유를 위한 인슐린 분비성 세포의 제조 등 인간의 난치성 질병을 치유하거나 인간의 초기발생 기전을 밝히는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 배양중인 인간 배아줄기세포의 형태를 나타낸 사진이고,

도 1b는 본 발명에서 사용한 세포가 인간 배아줄기세포임을 확인하기 위하여, 인간 줄기세포의 마커인 SSEA-4 및 생쥐 줄기세포의 마커인 SSEA-1 항체를 이용한 FACS 조사 결과를 나타낸 그래프이고(이때, 실선은 단일클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다),

도 2a는 인간 배아줄기세포로부터 유래된 EB를 조직 플레이트(tissue plate)에 배양하여 플레이트에 결합시키고 24시간 이후 N2 배양액으로 교체하여 20 내지 30일 정도 배양(3-5일에 한번씩 배양액 교체)하여, 배아줄기세포의 신경줄기세포로의 변화 과정에서 다양한 형태의 세포가 형성됨을 나타내는 사진이고,

도 2b는 다양한 형태의 인간 배아줄기세포가 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine)과 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 배양 플레이트에서 분열시에 첫날(상단, 왼쪽)에는 줄기세포의 특징적 형태인 양극성(bipolar) 형태가 나타나지만, N2 배지에서 배양 3일째부터 신경구(neurosphere)의 생성으로 신경줄기세포의 생성 및 추가적 배양으로 계속적으로 한가지 형태인 인간 신경전구세포(hNPST1)로 선택되어져 분화됨을 나타내는 사진이고,

도 3은 인간 배아줄기세포와 상기 세포로부터 유래된 신경줄기세포를 비교하기 위하여, 줄기세포의 마커인 Oct-4, Sox2, 네스틴(Nestin), Pax6 및 대조군 β-액틴(actin)의 발현을 RT-PCR로 조사한 전기영동 사진이고

STO : 생쥐 배아섬유아세포주(embryonic fibroblast cell line)로 피더(feeder) 세포로 사용,

hES : 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell),

hNP : 인간 신경줄기세포 또는 신경전구세포(human neural progenitor),

도 4a는 신경줄기세포에서 신경줄기세포 특이적 단백질 발현을 면역화학 분석(immunocytochemistry)으로 나타낸 사진이고,

NP-sphere : 도 2b의 인간 배아줄기세포의 배양 5 내지 7일에 형성된 구 형태의 세포응집체 사진,

Nestin(Sphere) : NP-sphere를 사이토스핀(cytospin)으로 바닥에 가라앉힌 뒤, 즉시 네스틴(Nestin)의 발현을 면역조직화학(immunocytochemistry) 방법으로 염색한 사진,

Nestin(Dissociated NP) : NP-sphere를 파이펫팅(pipetting)하여 단일세포로 만든 뒤 네스틴의 발현을 면역조직화학 방법으로 염색한 사진,

DAPI : 핵염색에 사용되는 염료,

NP-plating : NP-sphere를 폴리-L-오르니틴과 피브로넥틴으로 코팅한 커버글라스 상에서 N2 배양액으로 20시간 동안 배양한 사진,

Nestin(Plated sphere) : NP-sphere를 폴리-L-오르니틴과 피브로넥틴으로 코팅한 커버글라스 상에서 N2 배양액으로 20시간 동안 배양한 뒤, 네스틴의 발현을 면역조직화학 방법으로 염색한 사진,

Vimentin : 신경줄기세포, 특히 방사아교세포(radial glial cell)의 표식마커로 사용되는 세포내 중간섬유(intermediate filament),

도 4b는 신경전구세포의 세포표면 표식인자인 CD133과 NCAM의 발현을 FACS로 조사한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 인간 배아줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 신경세포로의 다분화능을 시험관 내(in vitro) 조건에서 관찰한 사진이고,

TuJ-1 : 분화된 신경세포에서 발현되는 클래스 Ⅲ β-튜블린(tubulin)에 대한 항체,

GFAP : 성상세포(astrocyte)에서 발현되는 아교섬유 산성단백질(glial fibrillary acidic protein),

도 6은 인간 배아줄기세포로부터 유래된 신경전구세포의 동결(freezing) 및 해동(thawing)의 반복을 통하여 계속적으로 계대배양할 수 있음을 나타내는 사진이다.

상단 : 동결 전,

하단 : 해동 후

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology MidMedi HOSPITAL, SUNGSAM MEDICAL FOUNDATION <120> Production method of Human neuron precursor cell line from human embroyic stem cells <130> 4p-02-27 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Oct4 <400> 1 gacaacaatg agaaccttca ggaga 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for Oct4 <400> 2 ttctggcgcc ggttacagaa cca 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forwadr primer of Sox2 <400> 3 tacctcttcc tcccactcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of Sox2 <400> 4 actctcctct tttgcacccc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Nestin <400> 5 cagcgttgga acagaggttg g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of Nestin <400> 6 tggcacaggt gtctcaaggg tag 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Pax6 <400> 7 aacagacaca gccctcacaa aca 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer of Pax6 <400> 8 cgggaacttg aactggaact gac 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer beta-actin <400> 9 ccactggcat cgtgatggac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer beta-actin <400> 10 gcggatgtcc acgtcacact 20

Claims (8)

1. ⅰ) 인간 배아줄기세포를 각 세포 덩어리로 분리하는 단계;

   ⅱ) 상기 분리된 인간 배아줄기세포를 EB 배양액(DMEM/F12, FBS, β-머캅토에탄올, 글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신, bFGF)에서 배양하여 EB(embyoid body)를 제조하는 단계; 및

   ⅲ) 상기 EB를 N2 배양액(DMEM/F12, 인슐린, 트랜스페린, 푸트레신, 프로게스테론, 소듐셀레나이트, 헤파린, bFGF)에서 신경전구세포주(hNPST1 세포)로 분화시키는 단계를 포함하는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포주의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, ⅲ) 단계 이후에 추가적으로, 상기 분화된 신경전구세포주를 냉동 보관 및 해동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포주의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 EB를 hNPST1 세포로 분화시키는 단계는 오르니틴과 피브로넥틴으로 코팅한 플레이트로 옮겨 계대배양하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포주의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 계대배양으로 생성된 세포중 부유배양으로 구(sphere) 형태를 이루는 신경구(neurosphere)를 트립신 처리 후, 단일세포로 처리하여 배양하는 것을 특징으로 하는 신경전구세포주의 제조방법.
5. 제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 신경전구세포는 부착 세포 또는 신경구(neurosphere)로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 신경전구세포주의 제조방법.
6. 제 1항의 방법으로 생성된 hNPST1 세포를 피더 세포 배양액(DMEM, FBS, β-머캅토에탄올, 글루타민, 비필수 아미노산, 페니실린 G, 스트렙토마이신)에 부유시킨 후, 최종 동결보존액(DMSO, 우태아 혈청, 피더 세포 배양액)을 처리하여 액체 질소에 보관하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 보관방법.
7. 제 1항의 방법으로 생성된 hNPST1 세포를 냉동 및 해동한 후, N2 배양액에서 계대배양하는 것을 특징으로 하는 hNPST1 세포의 재배양 방법.
8. 제 1항의 방법으로 제조된 인간 신경전구세포(hNPST1).