KR20080056181A - 전구세포주의 유도 방법 - Google Patents

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사이 키앙 림
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에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
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Abstract

본 발명자들은 (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 확립시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 이때 상기 전구세포주가 그의 자가 재생능에 기초하여 선별되는 것인 방법을 개시한다. 바람직하게는, 본 방법은 체세포의 자가 재생불능에 기초하여 체세포로부터 선별한다. 바람직하게는, 전구세포주는 바람직하게는 배아 줄기세포로부터 선별되게 하는 공-배양의 부재 하에, 바람직하게는 영양세포의 부재 하에 유도되거나 확립된다. 경우에 따라, 본 방법은 (d) 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함한다.

Description

전구세포주의 유도 방법{METHOD OF DERIVING PROGENITOR CELL LINE}
2005년 9월 2일자로 출원된 미국 가출원 제60/713,992호를 참고한다.
상기 출원, 본원 및 상기 출원 각각의 권리요구 과정 동안에 인용되었거나 언급된 것을 비롯한 본원 및 상기 출원 각각에서 인용되었거나 언급된 각각의 문헌 ("출원 및 인용된 논문"), 상기 출원 및 논문 각각 및 상기 출원 및 인용된 논문 중 임의의 것에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다. 나아가, 본문에서 인용된 모든 문헌, 및 본문에서 인용된 문헌에서 인용되었거나 참조된 모든 문헌, 및 본문 또는 본문에 도입된 임의의 문헌에서 인용되었거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자의 설명서 또는 카달로그는 참고로 본 명세서에 도입된다. 본문에 참고로 도입된 문헌 및 이 문헌의 임의의 교시는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 본문에 참고로 도입된 문헌들을 선행기술로 인정하는 것은 아니다.
본 발명은 발생학, 세포생물학, 분자생물학 및 유전학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 배아 줄기세포로부터 전구세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
분화된 세포와 달리 줄기세포는 분열하는 능력, 및 표현형적으로 및 기능적으로 상이한 딸세포로 재생되거나 분화하는 능력을 가진다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993; 225:900-918; Choi et al., Methods Mol. Med. 2005; 105:359-368).
마우스 배아 줄기세포(ESC)는 그들의 다능성(pluripotency) 및 모든 3개 배엽층으로부터 유래된 세포로 분화하는 그들의 능력으로 인해 많은 질환 및 조직 손상에 대한 재생 요법을 위한 세포의 이상적인 공급원이 된다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678). 그러나, 배아 줄기세포의 이러한 성질은 독특한 도전, 즉 치료 효능을 보장하는 충분한 양 및 균질도로 특정한 병든 또는 손상된 조직의 치료에 적합한 세포 유형을 발생시키고 조직 회복 및 재생에 대한 유해한 효과를 가질 수 있는 다른 세포 유형의 발생을 억제하는 것을 가능하게 한다. 현재, 특정한 계통(lineage)을 향한 배아 줄기세포의 분화를 증강시키고/시키거나 특정한 조직 세포 유형을 풍부하게 하는 프로토콜은 너무 비효율적이며 통상적으로 종양형성능을 가지질 수 있는 불균질한 세포 집단을 발생시킨다(Keller, Genes Dev. 2005; 19:1129-1155; Wobus andBoheler, Physiol Rev. 2005; 85:635-678).
본 발명은 당업계에서 이 문제점 및 다른 문제점을 해결하는 방법을 찾고자 한다.
발명의 개요
본 발명의 제1 양태에 따라, 본 발명자들은 (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 확립하는 단계를 포함하는 방법으로서, 이때 전구세포주가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 방법은 체세포의 자가 재생불능에 기초하여 체세포로부터 선별한다.
바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 공동배양물의 부재 하에, 바람직하게는 영양세포의 부재 하에 유도되거나 확립된다. 바람직하게는, 공동배양물의 부재는 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 선별한다.
바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 형질전환 없이 확립된다. 바람직하게는, 전구세포주는 배아 줄기세포 또는 이의 후손세포들을 추정상의 전구세포의 자가-재생을 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 확립될 수 있다. 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 배아 줄기세포의 증식을 저해한다.
바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 풍부 배지 중에서의 생장을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 LIF의 부재 하에 세포를 생장시키는 것을 포함한다.
바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 연속적 계대배양을 포함한다. 바람직하게는, 자가-재생 촉진 조건은 12회 이상의 연속적 계대배양을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 배아 줄기세포에 비해 감소된 잠재력을 가진다. 바람직하게는, 전구세포주는 계통 한정적이며, 바람직하게는 비-다능성 이다. 바람직하게는, 전구세포주는 비종양형성성이다.
바람직하게는, 전구세포주를 유도하는 단계는 배아 줄기세포를 특정한 계통으로의 분화를 향상시키는 조건에 노출시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 분화 향상 조건은 배아 줄기세포로부터 배상체를 발생시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 다능성이 상실된 후 분화 향상 조건으로부터 제거된다.
바람직하게는, 계통 한정-촉진 조건으로부터 상기 세포를 제거하는 단계는 배상체를 분리시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 방법은 약 3 내지 6일 동안 생장한 배상체를 분리시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다의 감소된 발현을 나타내거나 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다를 실질적으로 발현하지 않는다.
바람직하게는, 전구세포주는 그가 유래한 배아 줄기세포에 비해 다능성 마커의 감소된 발현을 나타내고, 이때 상기 다능성 마커는 바람직하게는 Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox-2 및 Utfl로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 나타낸다: (a) 40 초과의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지될 수 있는 특성; (b) 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 실질적으로 안정한 핵형 또는 염색체 수를 가지는 특성; 및 (c) 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 가지는 특성.
바람직하게는, 전구세포주는 수용자 동물, 바람직하게는 면역 손상 수용자 동물에 이식된 경우 바람직하게는 3주 후, 보다 바람직하게는 2 내지 9개월 후 기형종의 형성을 실질적으로 유도하지 않는다.
바람직하게는, 배아 줄기세포 또는 전구세포주는 포유동물, 바람직하게는 마우스 또는 인간 배아 줄기세포 또는 전구세포주이다.
바람직하게는, 전구세포주는 내피 전구세포주, 바람직하게는 E-RoSH 세포주를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 전구세포주는 간엽 전구세포주, 바람직하게는 huES9.E1 세포주를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 (d) 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 전구세포주는 분화 전에 5 이상의 세대 동안 증식된다.
본 발명의 제2 양태에 따라, 배아 줄기(ES)세포로부터 분화된 세포를 발생시키기 위한, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 분화된 세포는 내피세포 또는 간엽세포이다. 보다 바람직하게는, 상기 분화된 세포는 지방세포 또는 골세포이다.
본 발명의 제3 양태에 따라, 본 발명자들은 세포의 간엽 또는 내피 마커의 발현을 상향조절하기 위한, 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 양태로서, 세포의 줄기세포 마커 또는 다능성 마커의 발현을 하향조절하기 위한, 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법을 제공한다.
본 발명의 제5 양태에 따라, 본 발명자들은 줄기세포의 자가-재생 또는 분화를 촉진하거나 지연시킬 수 있는 물질을 확인하는 방법으로서, 후보 분자의 존재 하에 본 발명의 임의의 상기 양태에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 그에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명은 하기 질환들 중 어느 한 질환의 치료를 위한 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 전구세포주 또는 분화된 세포를 생성하기 위한, 본 발명의 임의의 상기 양태에 따른 방법을 제공한다: 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환, 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명의 임의의 상기 양태에 따른 방법에 의해 생성된 전구세포주를 제공한다.
본 발명의 제8 양태에 따라, 본 발명자들은 본 발명의 임의의 상기 양태에 따른 방법에 의해 생성된 분화된 세포를 제공한다.
본 발명의 제9 양태에 따라, 본 발명자들은 배아 줄기(ES)세포로부터 분화된 세포를 발생시키는 방법으로서, (a) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 유도하는 단계; (b) 상기 전구세포주를 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제10 양태에 따라, (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포를 유도하는 단계; 및 (c) 상기 전구세포로부터 전구세포주를 확립시키는 단계로서, 상기 전구세포가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
도 1: E-RoSH 세포주의 유도
도 1A: 배아 줄기세포가 메틸셀룰로스 기재 배지 상에서 단독으로 도말되어 배상체(EB)를 형성한다. 3 내지 6일째에서, 배상체는 수거되고, 콜라게나제에 의해 분산되고, 젤라틴처리 영양세포 플레이트 상에서 단일층으로서 배양된다. 부착된 섬유모세포-유사 세포 및 고리-유사 구조를 가진 RoSH-유사 콜로니는 선별되어 젤라틴처리 플레이트 상에서 증식됨으로써 E-RoSH1, E-RoSH2, E-RoSH3, ... 등을 발생시킨다. 그 다음, 배양물 각각은 10 cm 플레이트 당 10 내지 100개 세포의 낮은 밀도로 도말되고, 단일 RoSH-유사 콜로니가 확립된 하위세포주, 즉 E-RoSH2.1, E-RoSH2.2, E-RoSH2.3, ... 등으로 선발된다.
도 1B: 시간에 따라 증폭되는 특징적인 고리-유사 세포(삽입도)와 함께 부착된 짧은 섬유모세포-유사 세포로 구성된 추정상의 RoSH-유사 콜로니.
도 1C: 서브-전면생장 배양물 중의 E-RoSH2.1 세포와 RoSH2 세포 사이의 형태적 유사성.
도 1D: E-RoSH2.1 및 그의 모 E14 배아 줄기세포의 알칼리성 포스파타제 염색.
도 1E: 계대배양 3 및 13회에서 E-RoSH2.1 및 E-RoSH3.2 세포주 내에서 20개의 중기 핵으로부터의 평균 염색체 수.
도 2: 정량 RT-PCR 분석에 의한 상대적 유전자 발현 분석. 발현 수준을 배아 줄기세포의 발현 수준에 대해 표준화하고, 대수 함수로서 표시한다.
도 2A: 3회의 상이한 계대배양에서 E-RoSH2.1 세포의 유전자 발현 프로파일.
도 2B: E-RoSH2.1, E-RoSH3.2 및 RoSH2 세포에서 유전자 발현 프로파일의 비교.
도 2C 및 도 2D: 정량 RT-PCR 분석에 의해 측정된 경우, 모 E14 배아 줄기세포 및 E-RoSH2.1 세포에서 다능성 및 내피 잠재력과 관련된 유전자의 상대적 발현.
도 3: E-RoSH 세포의 특징규명.
도 3A: 매트리겔 피복 플레이트 상에서 RoSH2.1 세포의 시험관 내 분화. 2주 동안에, RoSH2.1 세포는 분화하여, 전체 조직 디쉬의 표면을 덮는 관형 구조체의 네트워크를 형성한다.
도 3B: E-RoSH 유래의 관형 구조체는 선명한 루멘(lumen) 및 내부이입된 아세틸화 LDL을 가진다. 상기 구조체를 CFDA, 세포질 녹색 형광 염료(Molecular Probe, Eugene, OR) 및 요오드화프로피듐으로 표지하고, 공초점(confocal) 현미경으로 가시화된다(좌측 패널). 상기 관형 구조체를 아세틸화 적색 형광 diI-표지 LDL(Molecular Probe, Eugene, OR)과 함께 24시간 동안 항온처리하고, 녹색 형광 핵 염료인 SYTOX Green™(Molecular Probe, Eugene, OR)으로 대조염색한 후, 공초점 현미경으로 분석한다.
도 3C: E-RoSH2.1 유래의 관형 구조체의 파라핀-포매 절편 상의 vWF에 대한 면역반응성을 HRP-기재 검출 시스템을 사용하여 검출한다. 갈색 침전물은 양성 염색을 나타낸다. 핵은 메이어스 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 염색한다.
도 3D: 정량 RT-PCR 분석에 의해 측정된 경우, E-RoSH2.1 세포의 내피 분화 동안의 유전자 발현. 상대적인 유전자 발현을 0시간에서의 유전자 발현에 대하여 표준화하고 대수 함수로서 표시한다.
도 3E: 7일째에서 배아 줄기세포 및 E-RoSH의 현탁 배양물.
도 3F: 0, 2, 3 및 7일 동안 현탁 배양물 중에서 배양된 경우 배아 줄기세포 및 E-RoSH2.1 세포에 의한 유전자 발현의 정량 RT-PCR 프로파일링. 상대적인 유전자 발현을 0시간에서의 배아 줄기세포의 유전자 발현에 대하여 표준화하고 대수 함수로서 표시한다.
도 3G: 생체 내 분화. Qdot® 나노크리스탈(655 nm 방출)로 표지된 1 x 105 E-RoSH 세포를 SCID 마우스에서 유도된 배아 줄기세포-유래의 기형종 내로 주입한다. 3일 후, 상기 마우스를 안락사시키고, 종양을 제거한다. 상기 종양을 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 20 ㎛ 두께로 냉동절단한다. 절편을 래트 항-페캄(pecam)-1에 이어 FITC-접합 토끼 항-래트 항체를 사용하여 페캄-1 면역반응성에 대해 분석한 후, DAPI로 대조염색한다. 상기 절편을 광학 현미경에 이어 공초점 현미경으로 가시화한다.
도 4: HuES9.E1 세포의 특징규명.
도 4A: 증식하는 섬유모세포 기질 세포(화살표)에 의해 둘러싸인, 유사분열 활성을 갖지 않은 MEF 상에서 생장된 HuES9 콜로니.
도 4B: HuES9.E1 MSC-유사 세포 및 BM-유래의 MSC의 대표적인 전면생장 배양물.
도 4C: 인간 배아 줄기세포주인 HuES9, 마우스 배아 줄기세포주인 E14, 마우 스 배아 섬유모세포(MEF) 및 HuES9.E1 간엽 줄기세포(MSC)-유사 세포를 알칼리성 포스파타제 활성의 존재에 대해 염색한다.
도 4D: HuES9 및 HuES9.E1 MSC-유사 세포를 택만(TaqMan)® 프라이머를 사용한 정량 RT-PCR 분석으로 Pou5f1의 발현에 대해 시험한다. HuES9 인간 배아 줄기세포에서의 Pou5f1 전사체 수준을 하나로 표준화한다.
도 4E: HuES9.E1 MSC-유사 세포에서 인간-특이적 Alu 반복 서열 및 마우스-특이적 c- mos 반복 서열의 존재에 대한 게놈 PCR 분석.
도 4F: 계대배양 4회 및 계대배양 8회째에서 HuES9.E1의 핵형분석.
도 4G: FACS 분석에 의한 표면 항원의 프로파일. HuES9.E1 세포를 CD29, CD44, CD105, CD166, CD34 및 CD45에 대한 면역반응성에 대해 시험한다.
도 4H: 지방세포 및 골세포로의 HuES9.E1의 분화. 지방형성 또는 골형성을 유도하기 위해 전면생장 HuES9.E1 세포를 표준 배양 배지 중에서 배양한다. 12일 후, 지방형성을 일으키도록 유도된 세포는 오일 레드에 의해 오일 소적에 대해 염색되고 정량 RT-PCR에 의해 PPARγ의 발현에 대해 분석되는 반면(상부 패널), 골형성을 일으키도록 유도된 세포는 본 코사(von Kossa) 염색에 의해 칼슘 침착물에 대해 염색되고, 정량 RT-PCR에 의해 골-특이적 알칼리성 포스파타제인 ALP의 발현에 대해 분석된다(하부 패널).
본 발명자들은 자가-재생하는 전구세포의 능력에 기초하여 배아 줄기(ES)세포로부터 전구세포주를 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 최종적으로 분화하는 세포와 달리, 자가-재생 성질을 가진 추정상의 전구세포는 형질전환 없이 선별되어 증식될 수 있다.
따라서, 본 발명자들의 방법은 일반적으로 시험관 내에서 다능성 세포를 배양함으로써 배아 줄기세포로부터 한정된 잠재력을 가진 전구세포주를 유도하는 단계를 포함한다. 이것은 분화 시 감소되거나 상실된 종양형성력을 가진 특정한 세포 유형으로 구성된 고도로 농축된 집단을 발생시킬 고도로 한정된 분화력을 가진 전구세포의 증폭을 가능하게 한다.
그러므로, 본 발명자들은 배아 줄기세포로부터 계통 한정된 전구세포주를 발생시키기 위한 자가-선별의 기초 원리로서 전구세포의 이러한 자가-재생 성질을 이용한다.
공동배양물의 부재
그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 방법은 전구세포의 생장을 촉진하고 경우에 따라 배아 줄기세포의 생장 또는 증식을 지연시키거나 저해하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명자들의 방법은 단일층으로서 공동배양물의 부재 하에 또는 영양세포의 부재 하에 추정상의 전구세포를 배양하는 단계를 포함한다. 용어 "공동배양물"은 예를 들면, 기질 영양세포와 함께 생장하는 하나 이상의 상이한 종류의 세포로 구성된 혼합물을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 본 방법의 바람직한 실시양태에 따라, 배아 줄기세포는 영양세포의 부재 하에 배양되어 전구세포주를 확립시킨다.
편향 분화
바람직한 실시양태에서, 특정한 계통의 배아 줄기세포-유래의 전구세포주를 발생시키는 방법은 바람직하게는 특정한 소정의 계통 또는 관심있는 계통을 향하여 배아 줄기세포를 편향 분화시키는 제1 단계를 추가로 포함한다. 본 발명자들의 방법은 추정상의 전구세포의 자가-재생을 촉진하고 배아 줄기세포의 증식을 저해하는 제2 단계도 포함할 수 있다.
상기 제1 단계는 관심있는 특정한 계통의 생장 또는 증식을 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 관심있는 특정한 계통의 상이한 전구세포주는 세포를 관심있는 계통의 분화를 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 배아 줄기세포는 성장 인자 또는 소분자 예컨대, 분화를 촉진하거나 가능하게 하는 리간드에 노출될 수 있다.
따라서, 특정한 계통의 배아 줄기세포-유래의 세포주를 확립하기 위한, 본 명세서에 기재된 본 방법은 바람직하게는 그 특정한 계통을 향하여 배아 줄기세포의 분화를 향상시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 분화 향상 단계는 예정된 기간 동안 수행된다. 따라서, 바람직하게는, 배아 줄기세포 또는 이의 후손세포는 분화 향상 환경에 일시적으로 노출된다.
분화를 향상시키거나 편향시키는 방법의 선택은 전구세포를 생성하도록 요구되는 관심있는 특정한 세포 계통에 달려 있을 것이다. 당업자라면 상이한 세포들에 대해 이용될 수 있는 다양한 방법을 알 것이다.
내배엽 전구세포
조직의 내배엽 유형을 향하여 배아 줄기세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 예를 들면, 배상체를 형성하여 분산시킬 수 있다(하기 참조). 분산된 배상체를 내배엽 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 액티빈 A, FGF4, 덱사메타손 및 레티노산이 있다.
조혈 및 내피 전구세포
다른 한편으로, 조혈 또는 내피 계통을 향하여 배아 줄기세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 분리된 배상체를 조혈 또는 내피 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 GM-CSF, G-CSF, SCF, PDGF, IL-3, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, TNFα 및 라파마이신이 있다.
심장 중배엽 및 골격 근모세포 전구세포
다른 한편으로, 심장 중배엽 및 골격 근모세포 계통을 향하여 배아 줄기세포를 편향 분화시키고자 하는 경우, 분리된 배상체를 심장 중배엽 또는 골격 근모세포 분화를 유도하는 성장 인자 또는 약물, 또는 이들의 조합물에 노출시킬 수 있다. 상기 성장 인자 및 약물의 예로는 덱사메타손, PPARγ 억제제 및 테스토스테론 또는 이의 유사체가 있다.
상기 제2 단계는 풍부한 배지 중에서 분화 세포를 도말하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 계속된 증식은 전구세포를 선별적으로 풍부하게 할 것이고, 그 후, 상기 전구세포는 클로닝될 수 있다.
배상체의 형성
일부 실시양태에서, 분화 향상 단계는 배아 줄기세포로부터의 배상체의 형성을 포함한다. 배상체 및 이의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "배상체"는 현탁액 중에서의 배아 줄기세포의 생장에 의해 생성된 배양물 중에서 관찰되는 타원형 콜로니를 말한다. 배상체는 혼합된 세포 유형들로 이루어져 있고, 특정한 세포 유형의 분포 및 출현 시기는 배아 내에서 관찰된 분포 및 출현 시기에 상응한다. 바람직하게는, 배상체는 배아 줄기세포를 반-고체 배지, 바람직하게는 문헌(Lim et al., Blood. 1997; 90:1291-1299)에 기재된 바와 같은 메틸셀룰로스 배지 상에 도말함으로써 발생된다. 바람직하게는, 배상체는 3 내지 6일 된 것이다.
이러한 실시양태에서, 세포들이 계통 한정-촉진 조건으로부터 제거되도록 하기 위해, 배상체를 예를 들면, 콜라게나제 또는 트립신 처리로 분산시킨다. 즉, 구성 세포들을 서로 분리시킨다.
바람직한 실시양태에서, 본 방법은 원하는 특정한 계통에 대한 추정상의 전구세포를 선택하는 단계를 포함한다. 상기 선택은 세포의 형태에 기초하여 수행될 수 있거나, 발현 또는 마커 등에 의해 수행될 수 있다. 유전자 발현 프로파일링 또는 항원 프로파일링은 원하는 계통인 특정한 전구세포를 선택하는 데 사용될 수도 있다. 그 다음, 원하는 특정한 계통에 대해 선택된 추정상의 전구세포는 배양될 수 있거나, 상기 추정상의 전구세포에 대해 추가 선택 단계를 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 분화 향상 단계 후, 분화하는 세포는 추정상의 전구세포의 자가-재생을 촉진하고 배아 줄기세포의 증식을 저해하는 조건에 노출된다. 이러한 조건은 바람직하게는 공동배양물 또는 영양세포의 부재 하에서의 배양을 포함할 수 있다(상기 참조).
풍부 배지
별법으로 또는 추가로, 이러한 조건은 풍부 배지 중에서의 도말을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "풍부 배지"는 영양분이 풍부한 배지를 지칭한다. 바람직하게는 이러한 배지는 관련 세포의 생장에 필요한 필수 영양분을 포함한다. 바람직하게는, 풍부 배지는 혈청을 함유한다. 보다 바람직하게는, 풍부 배지는 이러한 생장에 필요한 실질적으로 모든 영양분을 포함한다. 가장 바람직하게는, 풍부 배지는 관련 세포의 생장을 지지하고, 촉진하고 향상시킨다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 관련 세포는 관심있는 전구세포 또는 추정상의 전구세포이다. 풍부 배지의 예는 20% 태아 소 혈청, 비 필수 아미노산, L-글루타민 및 β-머캡토에탄올로 보충된, 4500 mg/ℓ D-글루코스를 함유하는 DMEM이다.
바람직한 실시양태에서, 이러한 풍부 배지는 배아 줄기세포의 생장을 허용하거나, 촉진하거나 향상시키는 추가 성장 조절자 또는 호르몬, 예컨대, 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하지 않는다.
이러한 실시양태에 따르면, 계속된 증식은 전구세포를 선택적으로 풍부하게 할 것이고, 그 후, 상기 전구세포는 클로닝될 수 있다.
배양물 중에서의 장기간 유지
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 방법은 1 이상의 세대 동안 배아 줄기세포 또는 이의 후손세포를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상 또는 800 이상의 세대 동안 배양된다. 특히, 세포주는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 500 또는 그 이상의 세대 동안 유지될 수 있다.
배양물 중의 세포는 일반적으로 접촉 억제가 세포 분열 및 성장의 중단을 야기할 경우 전면생장까지 계속 생장할 것이다. 그 다음, 이러한 세포는 기판 또는 플라스크로부터 분리될 수 있고, 조직 배양 배지로의 희석 및 재도말에 의해 "분할" 또는 계대배양될 수 있다. 그러므로, 전구세포는 배양 과정 동안에 계대배양되거나 분할될 수 있고; 바람직하게는, 전구세포는 1:2 이상, 바람직하게는 1:3, 보다 바람직하게는 1:4, 1:5 또는 그 이상의 비율로 분할된다. 용어 "계대배양"은 세포주의 전면생장 배양물의 분취액을 얻는 단계, 이를 새로운 배지 내로 접종하는 단계, 및 전면생장 또는 포화가 달성될 때까지 상기 세포주를 배양하는 단계로 구성된 과정을 의미한다.
그러나, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 유도된 전구세포는 그의 자가-재생능에 기초하여 다수의 세대 동안 유지될 수 있다. 다른 한편으로, 유기체로부터 직접 유래한 "정상" 세포(즉, 형질전환되지 않은 체세포)는 불멸 세포가 아니라는 것이 확립되어 있다. 다시 말해, 이러한 체세포는 배양 시 유한한 수명을 가진다(이들은 사멸하게 된다). 이들은 무한히 계속 생장하지 않을 것이고, 궁극적으로 일정한 수의 세대 후에 증식하거나 분열하는 능력을 상실할 것이다. "위기 주기(crisis phase)"에 도달할 때, 이러한 세포는 약 50세대 후에 사멸한다. 따라서, 이러한 체세포는 유한한 회수로 계대배양될 수 있을 뿐이다.
중요하게는, 전구세포는 형질전환을 필요로 하지 않으면서 자가-재생을 유지할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 공지된 형질전환 처리, 예컨대, 종양 세포 또는 종양 세포주와 같은 불멸화된 세포와의 융합; SV40, EBV, HBV 또는 HTLV-1과 같은 형질전환 바이러스를 사용한 세포주의 바이러스 감염; 특별히 개조된 벡터 예컨대, 큰 T 항원(R. D. Berry et al., Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988) 또는 텔로머라제(Bodnar-A-G. et.al, Science (1998) 279: p. 349-52)의 서열을 포함하는 SV40 벡터, 또는 인간 파필로마바이러스(미국 특허 제5,376,542호)의 DNA 서열을 포함하는 벡터를 사용한 형질감염; 우성 종양유전자의 도입; 또는 돌연변이유발은 본 명세서에 기재된 전구세포주의 제조 방법에서 요구되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방법의 바람직한 실시양태에 따르면, 전구세포는 50 이상의 세대 동안 형질전환 없이 증식될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 전구세포는 형질전환 없이도 전구세포주로서 무한히 증식될 수 있다. 전구세포 및 전구세포주는 바람직하게는 이들의 모 배아 줄기세포에 비해 한정된 계통이다. 특히, 이들은 모든 3개의 배엽층을 발생시킬 수 없다. 특히 바람직한 실시양태에서, 전구세포주는 바람직하게는 비-다능성 세포이다.
전구세포의 특성
바람직한 실시양태에서, 전구세포 및 세포주(또는 이들로부터 유래한 분화된 세포)는 배아 줄기세포의 하나 이상의 특성을 나타내지 않는다. 바람직한 이러한 특성에는 OCT4 유전자 및 알칼리성 포스파타제 활성의 발현이 포함된다. 바람직하게는, 전구세포주는 하나 이상의 특징적인 다능성 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 이러한 다능성 마커는 하기에 더 자세히 기재되어 있으나, Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox -2 및 Utfl을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 전구세포는 바람직하게는 종양을 형성하지 않는다. 바람직하게는, 전구세포는 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물 내로 이식된 경우 종양 형성을 야기하는 모 배아 줄기세포의 이식에 비해 종양을 야기하지 않는다. 바람직하게는, 상기 면역 손상 또는 면역결핍 숙주 동물은 SCID 마우스 또는 Rag1 -/- 마우스이다. 바람직하게는, 전구세포는 이식으로부터 장기간 경과 후, 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 가장 바람직하게는 9개월 후 종양을 형성하지 않는다. 종양형성 시험에 대한 상세한 프로토콜은 실시예에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 전구세포는 바람직하게는 하기 특성들 중 하나 이상의 특성도 나타낸다. 이들은 바람직하게는 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 염색체 수에 의한 평가 시 실질적으로 안정한 핵형을 가진다. 또한, 이들은 바람직하게는 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이를 통해 본 발명자들은 선택된 유전자 세트의 하나 이상, 바람직하게는 선택된 유전자 세트의 실질적으로 모든 유전자들의 발현 수준이 한 세대에서의 전구세포와 다음 세포에서의 전구세포 사이에 유의하게 달라지지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 상기 유전자 세트는 하기 유전자들 중 하나 이상, 하기 유전자들로 구성된 하위세트 또는 하기 유전자들 전부를 포함한다: cerberus(진뱅크 검색 번호: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP(진뱅크 검색 번호: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2(진뱅크 검색 번호: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1(진뱅크 검색 번호: NM_008089, X15763, BC052653), Gata-4(진뱅크 검색 번호: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesx1(진뱅크 검색 번호: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a(진뱅크 검색 번호: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit(진뱅크 검색 번호: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα(NM_011058, M57683, M84607, BC053036), Oct4(진뱅크 검색 번호: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runx1(진뱅크 검색 번호: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Sox17(진뱅크 검색 번호: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2(진뱅크 검색 번호: NM_011443, U31967, AB 108673), Brachyury(NM_009309, X51683), TDGF1(진뱅크 검색 번호: NM_011562, M87321) 및 Tie-2(진뱅크 검색 번호: NM_013690, X67553, X71426, D13738, BC050824).
본 명세서에 기재된 방법은 전구세포 및 전구세포주뿐만 아니라 전구세포의 클론 후손세포들을 포함하는 분화된 세포의 생성을 가능하게 한다. 용어 세포의 "클론 후손세포"는 실질적으로 어떠한 형질전환 처리 또는 유전적 변이를 받지 않은 세포의 후손세포를 지칭한다. 이러한 클론 후손세포는 실질적인 게놈 변화를 받지 않아 모세포 또는 전구세포, 바람직하게는 배아 줄기세포(감소된 효능을 가짐)와 실질적으로 유전적으로 동일하다. 용어 "전구세포"는 바람직하게는 전구세포로부터 유래한 세포주, 즉 전구세포주를 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 이와 반대로 용어 "전구세포주"는 전구세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
자가-재생 및 분화의 조절자
본 발명자들의 방법은 자가-재생 또는 분화의 추정상의 조절자를 확인하는 데 사용될 수도 있다. 본 방법은 후보 분자의 존재 및 부재 하에서 전구세포주 또는 분화된 세포의 생성에 대해 기재된 과정을 수행하는 단계, 및 상기 분자의 존재가 상기 과정에 임의의 영향을 주는지를 확인하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 전구세포 또는 분화된 세포의 생성을 가속화시키는 분자는 분화의 양성 조절자로서 (또는 별법으로 자가-재생의 억제자로서) 사용될 수 있다. 반대로, 상기 과정을 지연시키는 분자는 분화의 억제자 또는 자가-재생의 촉진자로서 간주될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명자들은 본 방법에 따라 얻어질 수 있는, 선별된 계통의 세포, 바람직하게는 전구세포 또한 제공한다. 지금까지, 전구세포 제제는 임의의 선택된 세포가 전구세포인지에 대해 확신하기에는 너무 불순하였다. 실질적으로 100% 순수한 전구세포 제제를 생성할 수 있는 본 발명에 따른 배양을 이용하면 단일 전구세포의 단리가 달성된다.
본 발명자들은 바람직한 실시양태에서 복수개의 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포의 대다수가 선별된 계통의 전구세포인 조성물을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 60% 이상의 세포가 선별된 계통의 전구세포이다. 보다 바람직하게는, 60% 이상의 세포가 전구세포이다. 또한, 본 발명은 단리된 전구세포를 제공한다. 용어 "세포주"는 바람직하게는 배양물 중에서 유지되고 생장될 수 있으며 불멸의 또는 무한한 수명을 나타내는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허출원 제60/609,216호에 기재된 바와 같이 분화를 촉진하는 mTOR의 활성을 감소시키는 데 병용될 수 있다.
전구세포 및 줄기세포
본 명세서에 기재된 방법은 전구세포 및 이의 세포주를 생성할 수 있다.
배아 줄기세포가 분화하는 경우, 이들은 일반적으로 초기 포유동물 발달의 복잡한 과정을 반복하는데, 상기 과정에서 배아 줄기세포는 일련의 계통 한정을 거쳐 감소하는 계통 잠재력을 가진 전구세포를 발생시킨 후, 궁극적으로 모든 3개의 배엽층을 대표하는 최종적으로 분화된 세포를 발생시킨다(Wiles, Methods in Enzymology. 1993; 225:900-918). 이것은 조혈 과정에 의해 예시되는데, 상기 조혈 과정에서 마우스 배아 내에서 발견된 방식과 유사한 순차적 방식으로 나타나는 점차적으로 계통-한정된 조혈 전구세포가 배상체 내에서 확인될 수 있다(Choi et al., Methods Mol. Med. 2005; 105:359-368).
전형적으로, 줄기세포는 전구세포 또는 전구세포로서 지칭되는 이들의 완전히 분화된 상태를 달성하기 전에 중간체 세포 유형 또는 유형들을 발생시킨다. 태아 또는 성체 조직에서 전구세포 또는 전구세포는 분열되어 분화된 세포를 발생시키는 부분적으로 분화된 세포이다. 이러한 세포는 통상적으로 특정한 세포 발달 경로를 따라 분화에 "구속된(commitment)" 것으로 간주된다. 그러므로, 전구세포는 종종 "구속된 줄기세포"로서 지칭된다.
본 발명자들의 방법은 다양한 유형의 전구세포 및 세포주를 생성할 수 있다.
예를 들면, 본 발명자들은 말초 혈액 전구세포(PBPC), 신경 전구세포, 조혈 전구세포, 골수 전구세포, 상피 전구세포, 골수 기질세포, 골격근 전구세포, 이자섬(pancreatic islet) 전구세포, 간엽 전구세포, 심장 중배엽 줄기세포, 폐 상피 전구세포, 간 전구세포, 및 내배엽 전구세포의 제조 방법을 개시한다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 전구세포는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다. 이들 용도는 당업계에 일반적으로 잘 공지되어 있으나, 본 명세서에서 간략하게 기재될 것이다.
예를 들면, 줄기세포는 재생 요법을 위한 전구세포 집단을 발생시키는 데 사용될 수 있다. 전구세포들은 생체 외 팽창에 의해 제조될 수 있거나 환자 내로 직접 투여될 수 있다. 이들은 외상 후 손상된 조직의 재생을 위해서도 사용될 수 있다.
따라서, 조혈 전구세포는 골수 교체를 위해 사용될 수 있지만, 심장 전구세포는 심부전 환자를 위해 사용될 수 있다. 피부 전구세포는 환자를 위한 피부 이식편을 생장시키는 데 사용될 수 있고, 내피 전구세포는 부목 또는 인공 심장과 같은 인공 보철의 내피화(endothelization)를 위해 사용될 수 있다.
배아 줄기세포 및 이의 조직 줄기세포 유도체는 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 치료를 위한 전구세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 줄기세포는 암에 대한 면역요법을 위한 NK 또는 수상 세포에 대한 전구세포의 공급원으로서 사용될 수 있고, 이때 상기 전구세포는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분화시킬 수 있는 전구세포의 생성을 가능하게 한다는 것은 분명할 것이다. 따라서, 분화된 세포의 임의의 용도는 이들의 공급원인 전구세포와 동등하게 중요할 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 전구세포는 질환의 치료에 사용될 수 있거나 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암을 비롯한, 재생요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 확립시키는 단계로서, 이때 상기 전구세포주가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 단계; (d) 경우에 따라 상기 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계; 및 (e) 전구세포주 또는 분화된 세포를 환자 내로 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 개시한다.
분화된 세포
분화된 세포 예컨대, 최종적으로 분화된 세포는 기재된 본 방법에 따라 제조된 전구세포 또는 전구세포주로부터 유도될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 분화된 세포를 발생시키는 방법으로서, 전술한 바와 같이 전구세포 또는 전구세포주를 발생시키는 단계, 및 이들로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 분화된 세포는 하기 세포들 중 임의의 세포 또는 하기 세포들 전부를 포함할 수 있다:
i) 지방세포: 신체 전체, 특히 피부 밑에서 발견되는 지방 또는 지방조직의 기능성 세포 유형. 지방세포는 에너지, 체온 조절, 및 물리적 충격에 대한 쿠션 역할을 위한 지방을 합성하고 저장한다.
ii) 심근세포: 심장이 연속적 및 규칙적으로 박동하게 하는 심장의 기능성 근육 세포 유형.
iii) 연골세포: 관절, 외이도, 기관, 후두덮개, 후두, 척추골과 늑골 단부 사이의 디스크를 위한 연골을 만드는 기능성 세포 유형.
iv) 섬유모세포: 신체의 대부분의 조직 내에서 발견되는 결합 또는 지지 세포. 섬유모세포는 특정한 기관의 기능성 세포 유형이 정확하게 수행하도록 돕는 유익한 지지 골격을 제공한다.
v) 간세포: 대사 폐기물을 해독시키고 적혈구 세포를 파괴하고 이들의 성분들을 재활용하며, 혈장용 단백질을 합성하기 위한 효소를 제조하는 간의 기능성 세포 유형.
vi) 조혈 세포: 혈액을 만드는 기능성 세포 유형. 조혈 세포는 성체의 골수 내에서 발견된다. 태아에서, 조혈 세포는 간, 비장, 골수, 및 자궁 내에서 태아를 둘러싸는 지지 조직 내에서 발견된다.
vii) 근세포: 근육의 기능성 세포 유형.
viii) 신경: 흥분을 전달하는 데 있어서 전문화된 뇌의 기능성 세포 유형.
ix) 조골세포: 골을 만드는 것을 담당하는 기능성 세포 유형.
x) 섬 세포: 인슐린, 글루카곤, 가스트린 및 소마토스타틴의 분비를 담당하는 췌장의 기능성 세포. 이들 분자들은 함께 탄수화물 및 지방 대사, 혈당 수준 및 위 내로의 산 분비를 비롯한 다수의 과정을 조절한다.
전구세포 및 분화된 세포의 용도
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다.
예를 들면, 분화된 세포로 구성된 집단은 분화된 표현형에 특이적인 항체 및 cDNA 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 항체를 발생시키고, 정제하고 변형시키는 데 사용되는 일반적인 기법, 및 면역분석법 및 면역단리법에서의 이들의 용도는 문헌(Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, eds.)); 문헌(Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds.)); 및 문헌 (Methods of Immunological Analysis (Masseyeff et al., eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH))에 기재되어 있다. mRNA 및 cDNA 라이브러리의 제조에 이용되는 일반적인 기법은 문헌(RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (R. E. Farrell, Academic Press, 1998)); 문헌(cDNA Library Protocols (Cowell & Austin, eds., Humana Press)); 및 문헌(Functional Genomis (Hunt & Livesey, eds., 2000))에 기재되어 있다. 비교적 균질한 세포 집단은 약물 검색 및 치료 용도에서 사용하기에 특히 적합하다.
전구세포주 및 분화된 세포의 이들 및 다른 용도는 하기 및 이 명세서의 다른 곳에 더 상세히 기재되어 있다. 전구세포주 및 분화된 세포는 특히 질환의 치료를 위한 약학 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 퇴행성 질환 예컨대, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병 등, 및 암을 비롯한 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환을 포함할 수 있다.
약물 검색
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 전구세포주 또는 분화된 세포의 특성에 영향을 주는 인자(예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 환경 조건(예컨대, 배양 조건 또는 조작)을 검색하는 데 사용될 수도 있다.
일부 적용분야에서, 전구세포주 및 분화된 세포는 장기간의 배양 시 상기 세포들의 성숙 또는 증식 및 유지를 촉진하는 인자들을 검색하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 후보 성숙 인자 또는 성장 인자는 이들을 상이한 웰 내의 전구세포주 또는 분화된 세포에 첨가한 후, 발생된 임의의 표현형적 변화를 상기 세포의 추가 배양 및 사용에 대한 바람직한 기준에 따라 측정함으로써 시험한다.
더욱이, 간엽 줄기세포 및 분화된 세포의 유전자 발현 프로파일링은 이 세포들에서 유일하거나 고도로 발현되는 수용체, 전사 인자 및 신호전달 분자를 확인하는 데 사용될 수 있다. 상기 수용체, 전사 인자 및 신호전달 분자에 대한 특이적 리간드, 소분자 억제제 또는 활성화제는 전구세포주 및 분화된 세포의 분화 및 성질을 조절하는 데 사용될 수 있다.
구체적인 검색 분야는 약물 연구에서 약학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 본 명세서를 읽는 자는 본 명세서의 다른 곳에 있는 약물 검색에 대한 일반적인 설명뿐만 아니라 일반적으로 표준 교재("In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997) 및 미국 특허 제5,030,015호도 참조할 것이다. 후보 약학적 화합물의 활성 평가는 일반적으로 분화된 세포와 후보 화합물을 조합시키는 단계, 형태, 마커 표현형, 또는 (미처리된 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교할 때) 상기 화합물에 기인하는 세포의 대사 활성에서의 임의의 변화를 측정하는 단계, 및 상기 화합물의 효과와 관찰된 변화를 상호관련시키는 단계를 포함한다.
검색은 예를 들면, 상기 화합물이 특정한 세포 유형에 대한 약리학적 효과를 가지도록 디자인되기 때문에, 또는 다른 경우 효과를 가지도록 디자인된 화합물이 의도하지 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행될 수 있다. 가능한 약물--약물 상호작용 효과를 검출하기 위해 2개 이상의 약물을 (동시에 또는 순차적으로 세포와 조합함으로써) 조합하여 시험할 수 있다. 일부 분야에서, 화합물은 잠재적 독성에 대해 먼저 검색된다(Castell et al., pp. 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997). 우선, 세포독성은 세포 생존가능성, 생존, 형태, 및 특정한 마커, 수용체 또는 효소의 발현 또는 방출에 대한 효과에 의해 결정될 수 있다. 염색체 DNA에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 복구를 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히, 세포 주기에서 예정되지 않은 회수의 [3H]티미딘 또는 BrdU 혼입 또는 세포 복제에 필요한 수준을 초과한 [3H]티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치 않은 효과는 중기 퍼짐에 의해 결정되는, 시스터 염색분체 교환의 비정상적인 속도를 포함할 수도 있다. 본 명세서를 읽은 자는 추가 상세한 설명을 위해 문헌(A. Vickers (PP 375-410 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997))을 참조할 수 있다.
조직 재생
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 조직 재구성 또는 재생을 필요로 하는 인간 환자 내에서 조직 재구성 또는 재생을 위해 사용될 수도 있다. 상기 세포들은 이들이 의도된 조직 부위로 이식되어 기능적으로 결핍된 영역을 재구성하거나 재생시키는 방식으로 투여된다.
예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 줄기세포의 분화를 조절하는 데 사용될 수 있다. 전구세포주 및 분화된 세포는 조직 개조 예컨대, 피부 이식편의 성장을 위해 사용될 수 있다. 줄기세포 분화의 조절은 인공 기관 및 조직의 생체공학, 또는 부목과 같은 보철을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 신경 전구세포는 치료될 질환에 따라 중추신경계의 실질(parenchymal) 또는 수막강내 부위로 직접 이식된다. 이식은 ㎕ 당 25,000 내지 500,000개 세포의 밀도로 단일 세포 현탁액 또는 작은 응집체를 사용하여 수행한다(미국 특허 제5,968,829호). 신경 세포 이식의 효능은 문헌(McDonald et al., Nat. Med. 5:1410, 1999)에 기재된 바와 같이 급성 손상된 척수에 대한 래트 모델에서 평가될 수 있다. 성공적인 이식은 2 내지 5주 후 병소 내에 존재하며 성상세포, 희소돌기아교세포 및/또는 신경으로 분화되어 병소 말단으로부터 척수를 따라 이동하는 이식-유래의 세포를 보여줄 것이고, 게이트(gate), 조정(coordination) 및 체중-증가에서의 개선도 보여줄 것이다.
일부 신경 전구세포는 신경계에 대한 급성 또는 만성 손상의 치료를 위해 디자인된다. 예를 들면, 흥분독성은 간질, 졸증, 허혈, 헌팅톤병, 파킨슨병 및 알츠하이머병을 비롯한 다양한 병태와 관련되어 있다. 본 명세서에 기재된 본 방법에 따라 제조된 일부 분화된 세포는 탈수초화 장애(dysmyelinating disorder), 예컨대, 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 다발성 경화증, 백색질이영양증, 신경염 및 신경병증을 치료하는 데 적합할 수도 있다. 재수초화를 촉진하는 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포의 전구세포가 풍부한 세포 배양물이 상기 목적에 적합하다.
본 발명의 방법을 이용하여 제조한 간세포 및 간세포의 전구세포는 동물 모델에서 간 손상을 회복하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 이러한 한 예는 D-갈락토스아민의 복강내 주사에 의해 야기된 손상이다(Dabeva et al., Am. J. Pathol. 143:1606, 1993). 치료 효능은 간 세포 마커에 대한 면역조직화학적 염색, 세관 구조가 성장하는 조직에서 형성되는지에 대한 현미경에 의한 확인, 및 간-특이적 단백질의 합성을 회복하는 치료의 능력에 의해 결정될 수 있다. 간 세포는 직접 투여에 의해 또는 일시적인 간 기능을 제공하는 생체보조 장치의 일부로서 치료법에서 사용될 수 있는 한편, 대상체의 간 조직은 전격성 간부전 후 스스로 재생된다.
본 명세서에 기재된 본 방법에 따라 제조된 심근세포의 효능은 좌측 심실 벽 조직의 55%가 치료받지 않은 흉터 조직이 되게 하는 심장 냉동손상에 대한 동물 모델에서 평가될 수 있다(Li et al., Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai et al., Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999, Sakai et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999). 성공적인 치료는 흉터 면적을 감소시킬 것이고, 흉터 확장을 한정할 것이며, 심장수축, 심장이완 및 내압에 의해 측정된 심장 기능을 개선시킬 것이다. 심장 손상은 좌측 전방 하행 동맥의 원위 부위에서 색전형성 코일을 사용하여 모델링할 수도 있고(Watanabe et al., Cell Transplant. 7:239, 1998), 치료의 효능은 조직학 및 심장 기능에 의해 평가될 수 있다. 심근세포 제제는 심근을 재생시키고 불충분한 심장 기능을 치료하기 위한 요법에서 사용될 수 있다(미국 특허 제5,919,449호 및 국제특허출원 공보 제WO 99/03973호).
암
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 생장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 말하거나 지칭한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평 세포암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 아교세포 종양 예컨대, 아교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포 암종, 및 다양한 유형의 두경부암이 있다. 추가 예는 결장암, 유방암, 폐암 및 전립선암을 비롯한 고형 종양 암, 백혈병 및 림프종을 비롯한 조혈 악성 종양, 호치킨병, 재생불량성 빈혈, 피부암 및 가족성 선종성 폴립증(familial adenomatous polyposis)이 있다. 추가 예로는 뇌 신생물, 결장직장 신생물, 유방 신생물, 자궁 신생물, 눈 신생물, 간 신생물, 폐 신생물, 췌장 신생물, 난소 신생물, 전립선 신생물, 피부 신생물, 정소 신생물, 신생물, 골 신생물, 영양막 신생물, 자궁관 신생물, 직장 신생물, 결장 신생물, 신장 신생물, 위 신생물 및 부갑상선 신생물이 있다. 유방암, 전립선암, 췌장암, 결장직장암, 폐암, 악성 흑색종, 백혈병, 림프종, 난소암, 자궁암 및 담관암종도 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 T 세포 림프종, 흑색종 또는 폐암을 치료하는 데 사용된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 전구세포주 및 분화된 세포는 엔도스타틴 및 엔지오스타틴과 같은 항암제 또는 화학독성제 또는 화학요법제와 함께 사용될 수도 있다. 예를 들면, 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플라티늄, 에토포사이드, 탁솔, 탁소테르 및 알칼로이드 예컨대, 빈크리스틴, 및 항대사물질 예컨대, 메토트렉세이트와 같은 약물이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소(예를 들면, I, Y, Pr), 화학요법제, 및 독소 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편을 포함하는 것이다.
또한, 상기 용어는 국제특허출원 공보 제WO 94/22867호에 개시된 이환 안사마이신; 유럽 특허 제600832호에 개시된 1,2-비스(아릴아미노) 벤조산 유도체; 유럽 특허 제600831호에 개시된 6,7-디아미노-프탈라진-1-온 유도체; 유럽 특허 제516598호에 개시된 4,5-비스(아릴아미노)-프탈이미드 유도체; 또는 SH2-함유 기질 단백질과 티로신 키나제의 결합을 억제하는 펩티드(예컨대, 국제특허출원 공보 제WO 94/07913호 참조)와 같은 종양유전자 생성물/티로신 키나제 억제제를 포함한다. "화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학물질이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노사이드(Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 부설판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 마이토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, VP-16, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 니코틴아미드, 에스퍼라미신(예컨대, 미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드, 및 내분비 요법(예컨대, 디에틸스틸베스트롤(DES), 타목시펜, LHRH 길항 약물, 프로게스틴, 항-프로게스틴 등)이 있다.
줄기세포
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기세포"는 분열 시 하기 2가지 발달 선택안에 직면하는 세포를 말한다: 딸세포가 모세포와 동일할 수 있거나(자가-재생), 딸세포가 더 전문화된 세포 유형의 전구세포일 수 있다(분화). 그러므로, 줄기세포는 한 경로 또는 다른 경로(각각의 세포 유형 중 하나가 형성될 수 있는 추가 경로가 존재함)를 채택할 수 있다. 따라서, 줄기세포는 최종적으로 분화되지 않으며 다른 유형의 세포를 생성할 수 있는 세포이다.
본 명세서에서 지칭되는 줄기세포는 전능성 줄기세포, 다능성 줄기세포 및 다중능성 줄기세포를 포함할 수 있다.
전능성 줄기세포
용어 "전능성" 세포는 성체 내에서 임의의 세포 유형이 될 수 있거나 배아외 막(예컨대, 태반)의 임의의 세포가 될 수 있는 잠재력을 가진 세포를 지칭한다. 따라서, 전능성 세포만이 수정란, 및 이의 분할에 의해 생성된 처음 4개 정도의 세포이다.
다능성 줄기세포
"다능성 줄기세포"는 체내에서 임의의 분화된 세포를 만드는 잠재력을 가진 진정한 줄기세포이다. 그러나, 이들은 영양막으로부터 유래한 배아외 막을 만드는 데 기여할 수 없다. 다능성 줄기세포의 여러 유형이 발견되었다.
배아 줄기세포
배아 줄기(ES) 세포는 이식이 일어날 때 배아 발달의 단계인 배반포의 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 단리될 수 있다.
배아 생식 세포
배아 생식(EG) 세포는 유산된 태아의 성선(gonad)에 대한 전구세포로부터 단리될 수 있다.
배아 암종 세포
배아 암종(EC) 세포는 태아의 성선에서 종종 발생하는 종양인 기형암종으로부터 단리될 수 있다. 처음 2개와 달리, 상기 세포는 통상적으로 홀배수체이다. 이러한 유형의 모든 3가지 다능성 줄기세포들은 배아 또는 태아 조직으로부터만 단리될 수 있고 배양물 중에서 생장될 수 있다. 이 다능성 세포들이 분화하는 것을 방지하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
성체 줄기세포
성체 줄기세포는 골수 이식에 있어서 활성 성분인 신경, 피부 및 조혈 줄기세포를 비롯한 매우 다양한 유형을 포함한다. 상기 조혈 줄기세포 유형은 제대-유래의 줄기세포의 주요 특징이기도 하다. 성체 줄기세포는 세포 유형의 정확한 수가 선택된 줄기세포의 유형에 의해 한정된다 하더라도 실험실 및 체내 둘다에서 보다 전문화된 기능성 세포 유형으로 성숙할 수 있다.
다중능성 줄기세포
다중능성 줄기세포는 한정된 수의 유형으로만 분화될 수 있는 진정한 줄기세포이다. 예를 들면, 골수는 모든 혈액 세포를 발생시키지만 다른 유형의 세포를 발생시키지 못하는 다중능성 줄기세포를 함유한다. 다중능성 줄기세포는 성체 동물에서 발견된다. 체내의 모든 기관(뇌, 간)은 상기 다중능성 줄기세포가 사멸한 세포 또는 손상된 세포를 대체할 수 있는 곳에 상기 다중능성 줄기세포를 함유한다고 추측된다.
줄기세포의 특징을 규명하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 클론 분석, 유세포분류, 장기간 배양 및 분자생물학적 기법 예컨대, PCR, RT-PCR 및 써던 블롯팅과 같은 표준 분석법의 사용을 포함한다.
형태학적 차이점 이외에, 인간 및 뮤린 다능성 줄기세포는 다수의 세포 표면 항원(줄기세포 마커)의 발현에 있어서 상이하다. 단계-특이적 배아 항원 1 및 4(SSEA-1 및 SSEA-4) 및 종양 거부 항원 1-60 및 1-81(TRA-1-60, TRA-1-81)을 비롯한 줄기세포 마커의 확인을 위한 항체는 예를 들면, 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)로부터 구입될 수 있다. 단일클론 항체를 사용한 이들 항원의 면역학적 검출은 다능성 줄기세포를 특징규명하는 데 널리 사용되어 왔다(Shamblott M.J. et al., (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et al., (2000). PNAS 97: 11307-11312; Thomson J.A. et al., (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et al., (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et al., (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et al., (2000). J. Cell Science 113: 5-10).
줄기세포의 공급원
하기 비-제한적 실시예를 포함할 수 있는 다양한 유형의 줄기세포는 전구세포, 전구세포주 및 분화된 세포를 생성하기 위한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
미국 특허 제5,851,832호는 뇌 조직으로부터 수득된 다중능성 신경 줄기세포를 보고한다. 미국 특허 제5,766,948호는 신생아의 대뇌 반구로부터 신경모세포를 생성하는 것을 보고한다. 미국 특허 제5,654,183호 및 제5,849,553호는 포유동물 신경 능선 세포의 사용을 보고한다. 미국 특허 제6,040,180호는 포유동물 다중능성 CNS 줄기세포의 배양물로부터 분화된 신경의 시험관 내 발생을 보고한다. 국제특허출원 공보 제WO 98/50526호 및 제99/01159호는 신경상피 줄기세포, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)-성상세포(astrocyte) 전구세포, 및 계통-한정된 신경 전구세포의 발생 및 단리를 보고한다. 미국 특허 제5,968,829호는 배아 전뇌로부터 수득하여, 글루코스, 트랜스페린, 인슐린, 셀레늄, 프로게스테론 및 여러 다른 성장 인자를 포함하는 배지로 배양시킨 신경 줄기세포를 보고한다.
일차 간 세포 배양물은 콜라게나제와 히알루로니다제의 적절한 조합물을 사용한 관류에 의해 인간 생검 또는 수술로 절개한 조직으로부터 수득될 수 있다. 별법으로, 유럽 특허출원 제0 953 633 A1호는 잘게 썬 인간 간 조직을 준비하고, 농축된 조직 세포를 생장 배지 중에 재현탁시키고 상기 세포를 배양물 중에서 증폭시킴으로써 간 세포를 단리하는 것을 보고한다. 상기 생장 배지는 글루코스, 인슐린, 트랜스페린, T3, FCS, 및 간세포가 악성 형질전환 없이 생장될 수 있게 하는 다양한 조직 추출물을 포함한다. 간 내의 세포는 간 실질세포, 쿱퍼(Kupffer) 세포, 동굴모양 내피세포(sinusoidal endothelium) 및 담관 상피세포를 비롯한 전문화된 세포뿐만 아니라, 성숙 간세포 또는 담 상피세포 둘다로 분화하는 능력을 가진 전구세포("간모세포" 또는 "타원 세포"로 지칭됨) 또한 포함하는 것으로 생각된다(L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998).
미국 특허 제5,192,553호는 인간 신생아 또는 태아 조혈 줄기 또는 전구세포를 단리하는 방법을 보고한다. 미국 특허 제5,716,827호는 Thy-1 양성 전구세포인 인간 조혈 세포, 및 이를 시험관 내에서 재생시키기에 적합한 생장 배지를 보고한다. 미국 특허 제5,635,387호는 인간 조혈 세포 및 이의 전구세포를 배양하는 방법 및 장치를 보고한다. 미국 특허 제6,015,554호는 인간 림프계 세포 및 수지상 세포를 재구성하는 방법을 개시한다.
미국 특허 제5,486,359호는 하나 이상의 결합 조직 유형 예컨대, 골, 연골, 힘줄, 인대 및 진피의 세포로 분화할 수 있는 인간 간엽 줄기세포로 구성된 균질한 집단을 보고한다. 이 집단은 골수 또는 골막으로부터 수득된다. 또한, 간엽 줄기세포를 증폭시키는 데 사용되는 배양 조건도 보고되어 있다. 국제특허출원 공보 제WO 99/01145호는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 성장 인자로 처리된 개체의 말초 혈액으로부터 단리된 인간 간엽 줄기세포를 보고한다. 국제특허출원 공보 제WO 00/53795호는 지방세포 및 적혈구 세포가 실질적으로 존재하지 않는, 지방-유래의 줄기세포 및 격자를 보고한다. 보고에 의하면, 이 세포는 호르몬 및 컨디셔닝된 배양 배지를 생성하도록 증폭되고 배양될 수 있다.
임의의 척추동물 종의 줄기세포가 사용될 수 있다. 인간뿐만 아니라 비-인간 영장류, 애완 동물, 가축, 및 다른 비-인간 포유동물로부터 유래한 줄기세포가 포함된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 줄기세포 중에는 잉태 후 형성된 조직 예컨대, 배반포, 또는 잉태 기간 동안 임의의 시기에 채취된 태아 또는 배아 조직으로부터 유래한 영장류 다능성 줄기(pPS) 세포이다. 비-제한적 예는 배아 줄기세포의 일차 배양물 또는 확립된 세포주이다.
배지 및 영양세포
pPS 세포를 단리하고 증식시키기 위한 배지는 수득된 상기 세포가 원하는 특성을 갖고 더 증식될 수 있는 한 여러 상이한 조성 중 임의의 조성을 가질 수 있다. 적합한 공급원은 다음과 같다: 둘베코스 변형 이글스 배지(DMEM), Gibco#11965-092; 넉아웃 둘베코스 변형 이글스 배지(KO DMEM), Gibco#10829-018; 200 mM L-글루타민, Gibco#15039-027; 비-필수 아미노산 용액, Gibco 11140-050; 베타-머캡토에탄올, Sigma#M7522; 및 인간 재조합 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF), Gibco#13256-029. 예시적 혈청-함유 배아 줄기(ES) 배지는 80% DMEM(전형적으로 KO DMEM), 열 불활성화되지 않은 정의된 20% 태아 소 혈청(FBS), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 베타-머캡토에탄올로 만들어진다. 상기 배지는 여과되어 2주 이하의 기간 동안 4℃에서 저장된다. 혈청 무함유 배아 줄기(ES) 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM 베타-머캡토에탄올로 만들어진다. 효과적인 혈청 대체물은 Gibco#10828-028이다. 상기 배지는 여과되어 2주 이하의 기간 동안 4℃에서 저장된다. 사용 직전, 인간 bFGF는 4 ng/㎖의 최종 농도로 첨가된다(Bodnar et al., Geron Corp, 국제특허출원 공보 제WO 99/20741호).
영양세포(사용된 경우)는 90% DMEM(Gibco#11965-092), 10% FBS(Hyclone#30071-03) 및 2 mM 글루타민을 함유하는 mEF 배지 중에서 증식된다. mEF를 T150 플라스크(Coming#430825) 내에서 증식시키고, 트립신을 사용하여 2일마다 1:2로 상기 세포를 분할하고, 상기 세포를 서브-전면생장(sub-confluent) 상태로 유지시킨다. 영양세포 층을 준비하기 위해, 증식을 억제하지만 인간 배아 줄기세포를 지지하는 중요한 인자들의 합성을 허용하는 양(약 4000 라드(rad)의 감마 방사선조사)으로 세포를 방사선조사한다. 6개-웰 배양 플레이트(예컨대, Falcon#304)는 웰 당 1 ㎖의 0.5% 젤라틴과 함께 37℃에서 밤새 항온처리함으로써 피복하고, 웰 당 375,000의 양으로 방사선조사된 mEF로 도말한다. 영양세포 층은 전형적으로 도말 후 5시간 내지 4일 동안 사용된다. pPS 세포를 시딩하기 직전에 배지를 새로운 인간 배아 줄기(hES) 배지로 교체한다.
다른 줄기세포를 배양하기 위한 조건은 공지되어 있고, 세포 유형에 따라 적절하게 최적화될 수 있다. 전 단락에서 언급된 특정한 세포 유형을 위한 배지 및 배양 기법은 인용된 참고문헌에 제공되어 있다.
배아 줄기세포
배아 줄기세포는 영장류 종의 구성원의 배반포로부터 단리될 수 있다(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기(hES) 세포는 문헌(Thomson et al., 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 문헌(Reubinoff et al., Nature Biotech. 18:399, 2000)에 기재된 기법을 이용하여 인간 배반포 세포로부터 제조될 수 있다.
요약하면, 인간 배반포를 인간 생체 내 이식전 배아로부터 수득한다. 별법으로, 시험관 내에서 수정된 (IVF) 배아를 사용할 수 있거나, 단일 세포 인간 배아를 배반포 단계까지 증식시킬 수 있다(Bongso et al., Hum Reprod 4:706, 1989). 인간 배아를 G1.2 및 G2.2 배지 중에서 배반포 단계까지 배양한다(Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998). 발달 중인 배반포를 배아 줄기세포 단리에 대해 선별한다. 투명대는 프로나제(pronase)(Sigma)에의 짧은 노출에 의해 배반포로부터 제거된다. 내부 세포 덩어리를 면역외과적 기법으로 단리하는데, 이때 배반포를 토끼 항-인간 비장 세포 항혈청의 1:50 희석물에 30분 동안 노출시킨 후, DMEM 중에서 5분 동안 3회 세척하고, 기니아 피그 보체(Gibco)의 1:5 희석물에 3분 동안 노출시킨다(문헌(Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975) 참조). DMEM 중에서 2회 더 세척한 후, 용해된 영양막배엽 세포를 약한 피펫팅으로 온전한 내부 세포 덩어리(ICM)로부터 제거하고, ICM을 mEF 영양세포 층 상에 도말한다.
9 내지 15일 후, 내부 세포 덩어리-유래의 부산물을 1 mM EDTA가 함유된 칼슘 및 마그네슘 무함유 인산염-완충 식염수(PBS)에 노출시키거나, 디스파제(dispase) 또는 트립신에 노출시키거나, 마이크로피펫을 사용하여 물리적으로 분리함으로써 덩어리로 분리한 후, 새로운 배지 중의 mEF 상에 재도말한다. 분리된 세포를 새로운 배아 줄기(ES) 배지 중의 mEF 영양세포 층 상에 재도말하고, 콜로니 형성에 대해 관찰한다. 분화되지 않은 형태를 나타내는 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선별하고, 덩어리로 물리적으로 분리하고, 재도말한다. 배아 줄기세포-유사 형태는 명백히 높은 핵 대 세포질 비 및 현저한 핵소체(nucleoli)를 가진 압축된 콜로니인 것을 특징으로 한다. 그 다음, 생성된 배아 줄기세포는 짧은 트립신처리, 둘베코스 PBS(칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않고 2 mM EDTA를 함유함)에의 노출, 타입 IV 콜라게나제에의 노출(약 200 U/㎖; Gibco) 또는 마이크로피펫에 의한 개별 콜로니의 선별에 의해 1-2주 마다 정기적으로 분할한다. 약 50 내지 100개의 세포로 이루어진 크기의 덩어리가 최적이다.
배아 생식 세포
인간 배아 생식(hEG) 세포는 마지막 월경 기간 후 약 8 내지 11주째에서 채취된 인간 태아 물질에 존재하는 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 적절한 제조 방법은 문헌(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998) 및 미국 특허 제6,090,622호에 기재되어 있다.
요약하면, 생식능선을 등장성 완충제로 린싱한 후, 0.1 ㎖의 0.05% 트립신/0.53 mM 나트륨 EDTA 용액(BRL) 내에 넣고 1 ㎣ 미만의 덩어리로 절단한다. 그 후, 상기 조직을 100/㎕ 팁을 통해 피펫팅하여 세포를 더 분리시킨다. 이를 37℃에서 약 5분 동안 항온처리한 후, 약 3.5 ㎖의 EG 생장 배지를 첨가한다. EG 생장 배지는 4500 mg/ℓ D-글루코스, 2200 mg/ℓ mM 중탄산나트륨; 15% 배아 줄기(ES) 정성화 태아 소 혈청(BRL); 2 mM 글루타민(BRL); 1 mM 피루브산나트륨(BRL); 1000 내지 2000 U/㎖ 인간 재조합 백혈병 억제 인자(LIF, Genzyme); 1-2 ng/㎖ 인간 재조합 기본 섬유모세포 성장 인자(bFGF, Genzyme); 및 (10% DMSO 중의) 10 μM 포르스콜린을 함유하는 DMEM이다. 별법에서, EG 세포를 히알루로니다제/콜라게나제/DNAase를 사용하여 단리한다. 격막을 가진 생식원기 또는 생식능선을 태아 물질로부터 절개하고, 생식능선을 PBS로 린싱한 후, 0.1 ㎖ HCD 분해 용액(모두 시그마로부터 구입된, EG 생장 배지 중에서 제조된 0.01% 히알루로니다제 타입 V, 0.002% DNAse I, 0.1% 콜라게나제 타입 IV) 중에 넣어 둔다. 조직을 잘게 절단하고 37℃에서 1시간 동안 또는 밤새 항온처리하고, 1 내지 3 ㎖의 EG 생장 배지 중에 재현탁시키고, 영양세포 층 상에 도말한다.
5000 라드 y-방사선조사로 불활성화된, LIF, bFGF 또는 포르스콜린 무함유 변형 EG 생장 배지 중에서 3일 동안 배양된 영양세포로 이루어진 서브-전면생장 층을 가진 96-웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 적합한 영양세포는 STO 세포(ATCC 기탁번호 CRL 1503)이다. 0.2 ㎖의 일차 생식 세포(PGC) 현탁액을 상기 웰 각각에 첨가한다. EG 생장 배지 중에서 7 내지 10일 동안 배양한 후 제1 계대배양을 수행하고, 각각의 웰의 배양물을 방사선조사된 ST0 마우스 섬유모세포로 미리 준비한 24-웰 배양 디쉬의 한 웰로 옮긴다. EG 세포와 일치하는 세포 형태가 전형적으로 7 내지 30일 또는 1 내지 4회 계대배양 후 관찰될 때까지 배지를 매일 교체하면서 세포를 배양한다.
자가-재생 및 분화
자가-재생
자가-재생 줄기세포는 당업계에서 공지된 다양한 수단, 예를 들면, 형태학적, 면역조직화학적, 분자생물학적 수단 등에 의해 확인될 수 있다.
이러한 줄기세포는 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-1의 증가된 발현을 나타낸다. 바람직하게는, Flk-1, Tie-2 및 c-kit 중 임의의 하나 이상의 발현이 감소된다. 자가-재생하는 줄기세포는 바람직하게는 자가-재생하지 않는 줄기세포에 비해 단축된 세포 주기를 나타낸다.
예를 들면, 표준 현미경 이미지의 2차원에서, 인간 배아 줄기세포는 이미지의 평면에서 높은 핵/세포질 비율, 현저한 핵소체, 및 약간 분리된 세포 접합부를 가진 압축 콜로니 형성을 나타낸다. 세포주는 표준 G-밴딩 기법(통상의 핵형분석 서비스를 제공하는 많은 임상적 진단 실험실 예컨대, 캘리포니아 오클랜드에 소재하는 사이토제네틱스 랩(Cytogenetics Lab)에서 이용가능함)을 이용하여 핵형분석되고 공개된 인간 핵형에 비교될 수 있다.
인간 배아 줄기세포 및 인간 배아 생식 세포는 발현된 세포 마커를 특징으로 할 수도 있다. 일반적으로, 본 개시내용에서 논의된 조직-특이적 마커는 적절한 면역학적 기법 예컨대, 막-결합 마커에 대한 유세포분류, 세포내 마커에 대한 면역조직화학적 기법, 및 배지 내로 분비된 마커에 대한 효소-결합 면역분석법을 이용하여 검출할 수 있다. 단백질 마커의 발현은 마커-특이적 프라이머를 사용한 역전사-PCR에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수도 있다. 예를 들면, 더 상세한 설명에 대해서는 미국 특허 제5,843,780호를 참조한다.
단계-특이적 배아 항원(SSEA)은 일부 배아 세포 유형의 특징이다. SSEA 마커에 대한 항체는 발달 연구 하이브리도마 은행(the Developmental Studies Hybridoma Bank; Bethesda Md.)으로부터 입수가능하다. 다른 유용한 마커는 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 명명된 항체를 사용하여 검출될 수 있다(Andrews et al., Cell Lines from Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra). 인간 배아 줄기세포는 전형적으로 SSEA-1 음성 및 SSEA-4 양성을 나타낸다. hEG 세포는 전형적으로 SSEA-1 양성을 나타낸다. 시험관 내에서의 pPS 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 상실 및 SSEA-1의 증가된 발현을 초래한다. pPS 세포는 제조자(Vector Laboratories, Burlingame Calif.)에 의해 기재된 바와 같이 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 사용하여 현상시킴으로써 검출할 수 있는 알칼리성 포스파타제 활성의 존재를 특징으로 할 수도 있다.
배아 줄기세포는 전형적으로 텔로머라제 양성 및 OCT-4 양성을 나타낸다. 텔로머라제 활성은 시판되는 키트(TRAPeze.RTM. XK Telomerase Detection Kit, Cat. s7707; Intergen Co., Purchase N. Y.; or TeloTAGGG.TM. Telomerase PCR ELISA plus, Cat. 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis)를 사용하여 TRAP 활성 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. hTERT 발현은 RT-PCR에 의해 mRNA 수준에서 평가될 수도 있다. 라이트사이클러(LightCycler) TeloTAGGG.TM. hTERT 정량화 키트(Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics)를 연구 목적으로 구입할 수 있다.
분화
전구세포주 및 이로부터 유래한 분화된 세포를 비롯한 분화하는 세포는 바람직하게는 4E-BP1 및/또는 S6K1의 향상된 탈인산화를 나타낸다. 상기 세포는 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-1의 감소된 발현을 나타낸다. 바람직하게는, Flk-1, Tie-2 및 c-kit 중 임의의 하나 이상의 발현이 증가된다. 바람직하게는, Brachyury, AFP, nestin 및 nurr1 발현 중 어느 하나 이상의 발현이 증가된다. 자가-재생하는 줄기세포는 바람직하게는 자가-재생하지 않는 줄기세포에 비해 길어진 세포 주기를 나타낸다.
분화하는 줄기세포, 즉 분화 경로를 시작하거나 분화 경로에 구속된(committed) 세포는 특히 전사체 변화를 비롯한 다수의 표현형적 기준에 따라 특징규명될 수 있다. 상기 기준은 형태학적 특징의 특징규명, 발현된 세포 마커 및 효소적 활성의 검출 또는 정량화, 유전자 발현 및 생체 내 세포의 기능적 성질의 결정을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 일반적으로, 분화하는 줄기세포는 분화 과정의 최종 생성물인 세포 유형, 즉 분화된 세포의 하나 이상의 특징을 가질 것이다. 예를 들면, 표적 세포 유형이 근세포인 경우, 이러한 세포로 분화하는 과정에 있는 줄기세포는 예를 들면, 미요신 발현이라는 특징을 가질 것이다.
그러므로, 많은 측면에서, 상기 기준은 분화하는 줄기세포의 운명에 달려 있을 것이고, 다양한 세포 유형의 일반적인 설명은 하기에 제공되어 있다.
분화된 또는 분화하는 신경 세포에 대한 관심있는 마커에는 신경의 특징인 베타-튜불린 EⅢ 또는 신경필라멘트; 성상세포에 존재하는 신경교원섬유 산성 단백질(GFAP); 희소돌기아교세포의 특징인 갈락토세레브로사이드(GaIC) 또는 미엘린 염기성 단백질(MBP); 비분화된 인간 배아 줄기세포의 특징인 OCT-4; 및 신경 전구세포 및 다른 세포의 특징인 nestin이 포함된다. A2B5 및 NCAM은 신경교 전구세포 및 신경 전구세포 각각의 특징이다. 세포는 특징적인 생물학적 활성 물질의 분비에 대해 시험될 수도 있다. 예를 들면, GABA-분비 신경은 글루탐산 데카르복실라제 또는 GABA의 생성에 의해 확인될 수 있다. 도파민성 신경은 도파 데카르복실라제, 도파민 또는 티로신 히드록실라제의 생성에 의해 확인될 수 있다.
분화된 또는 분화하는 간세포에 대한 관심있는 마커에는 알파-태아단백질(간 전구세포); 알부민, α1-항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 사이토크롬 p450 활성, 트랜스페린, 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체, 및 글리코겐 저장물(간세포); CK7, CK19, 및 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(담 상피)가 포함된다. 간세포 분화가 전사 인자 BNF-4 알파를 필요로 한다는 것이 보고되어 있다(Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000). HNF-4 알파 발현과 관계없는 마커에는 α1-항트립신, 알파-태아단백질, apoE, 글루코키나제, 인슐린 성장 인자 1 및 2, IGF-1 수용체, 인슐린 수용체, 및 렙틴이 포함된다. HNF-4 알파 발현에 의존하는 마커에는 알부민, apoAI, apoAⅡ, apoB, apoCⅢ, apoCⅡ, 알돌레이즈 B, 페닐알라닌 히드록실라제, L-타입 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질 및 에리쓰로포이에틴(EPO)이 포함된다.
pPS 세포로부터 유래한 혼합된 세포 집단 중의 세포 유형은 특징적인 형태 및 이들이 발현하는 마커에 의해 인식될 수 있다. 골격근의 경우: myoD, 미오게닌, 및 myf-5. 내피세포의 경우, 페캄(혈소판 내피세포 부착 분자), Flk-1, tie-1, tie-2, 혈관 내피(VE) 캐드린, MECA-32 및 MEC-14.7. 평활근 세포의 경우, 특이적 미요신 중쇄. 심근세포의 경우, GATA-4, Nkx2.5, 심장 트로포닌 I, 알파-미요신 중쇄 및 ANF. 췌장 세포의 경우, pdx 및 인슐린 분비. 조혈 세포 및 이의 전구세포의 경우, GATA-1, CD34, AC133, β-주요 글로불린, 및 β-주요 글로불린 유사 유전자 PH1.
본 명세서에 나열되어 있거나 당업계에 공지되어 있는 일부 조직-특이적 마커는 면역학적 기법 예컨대, 세포-표면 마커의 경우 유동 면역세포화학적(flow immunocytochemistry) 기법, 세포내 또는 세포-표면 마커의 경우 (예컨대, 고정된 세포 또는 조직 절편의) 면역조직화학적 기법, 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석, 및 세포 추출물 또는 배지 내로 분비된 생성물의 경우 효소-결합 면역분석법에 의해 검출될 수 있다. 조직-특이적 유전자 생성물의 발현은 노던 블롯 분석, 도트-블롯 혼성화 분석, 또는 표준 증폭 방법에서 서열-특이적 프라이머를 사용한 역전사효소-개시 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수도 있다. 본 명세서에 나열된 특정한 마커에 대한 서열 데이타는 진뱅크(URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)와 같은 공개된 데이타베이스로부터 입수할 수 있다.
실시예 1. 방법: E- RoSH 세포주의 유도
문헌(Lim et al., Blood. 1997; 90:1291-1299)에 기재된 메틸셀룰로스-기재 방법을 이용하여 배아 줄기세포(ESC)의 분화를 유도하여 배상체(Eb)를 형성하였다.
3 내지 6일째 날, 배상체를 수거하고, 콜라게나제 분해를 이용하여 단일 세포 현탁액으로 분산시키고(Robertson EJ. Embryo-derived stem cell lines. In: Robertson EJ, ed. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach. Oxford: IRL Press Limited; 1987:71-112), 10 cm 영양세포 플레이트 당 1 내지 5 x 105 세포의 밀도로 도말하였다. 약 1주일 후, 세포를 증식시키고 세포 유형들로 구성된 복합 혼합물로 분화시켰다.
배아-유래의 RoSH 세포와 유사한 급속히 분열하는 세포의 콜로니를 선발하고 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트 및 이어서 10 cm 플레이트에서 순차적으로 증폭시켰다. 각각의 콜로니로부터의 배양물을 각각의 배양물이 확립된 순서에 따라 E-RoSH1, E-RoSH2, E-RoSH3, ... 등으로 명명하였다.
그 다음, 이 세포 배양물 각각을 10 cm 플레이트 당 10 내지 100개 세포의 밀도로 재도말하였다. 이어서, 콜로니를 선별하고 팽창시켜 그의 모 세포주에 기초하여 명명된 하위세포주 예컨대, E-RoSH1.1, 1.2, 1.3 등을 확립하였다. 현탁 배양물의 경우, 1 x 106 세포를 진탕기 상에 배치된 10 cm 박테리아 페트리 디쉬 상에 도말하였다.
알칼리성 포스파타제 분석 및 MTT 분석을 케미콘(Chemicon)(Temecula, California) 및 바이오어세이 시스템스(Bioassay Systems)(Hayward, California)로부터 구입한 분석 키트를 사용하여 수행하였다. 염색체 카운팅은 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(상기 로버트손(Robertson)의 문헌).
실시예 2. 방법: HuES9 .E 간엽 줄기세포( MSC )-유사 세포주의 유도
HuES9 세포를 문헌(Cowan et al., N Engl J Med. 2004;350:1353-1356)에 이미 기재된 바와 같이 배양하였다.
HuES9.E MSC-유사 세포를 유도하기 위해, HuES9 세포를 HuES9 배양 배지를 사용하여 젤라틴처리 영양세포-무함유 플레이트 상에 1:4로 분할하였다. 전면생장 배양물을 트립신처리하고 1:4로 분할하였다. 지방세포 및 골세포로의 분화는 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(Barberi et al., PLoS Med. 2005; 2:e161).
BM-MSC는 문헌(Pittenger et al., Science. 1999; 284:143-147)에 이미 기재된 바와 같이 준비하였다.
마우스-특이적 및 인간-특이적 반복 서열에 대한 게놈 PCR은 문헌(Que et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2004; 40:143-149)에 이미 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 3. 방법: RT - PCR 분석
전체 RNA는 표준 프로토콜을 이용하여 준비하고 리보그린(RiboGreen) RNA 정량 키트 및 피코그린(PicoGreen) dsDNA 정량 키트(Molecular Probes, Eugene, Oregon) 각각을 이용하여 정량하였다.
정량 RT-PCR은 택만® 프라이머(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 수행하였다.
실시예 4. 방법: 시험관 내 내피 분화
E-RoSH 세포의 내피 분화, 및 분화된 E-RoSH 세포에 의한 아세틸화 LDL 섭취를 이미 보고된 바와 같이 수행하였다(Yin et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24:691-696).
시험관 내에서 분화된 E-RoSH 혈관 구조체를 포르말린 중에서 고정시키고, 파라핀 중에 포매하고, 4 ㎛로 절단하고, 토끼에서 발생된 다중클론 항체 및 엔비젼(Envision)+시스템-퍼록시다제(DakoCytomation, Gostrup, Denmark)를 사용하여 vWF에 대해 염색하였다. 절편을 메이어스 헤마톡실린으로 대조염색하였다.
실시예 5. 방법: 생체 내 내피 분화
1 x 106 배아 줄기세포를 SCID 마우스 내로 피하 이식하였다. 3주째에서, 배아 줄기세포-유래의 종양의 직경이 약 1 cm일 때, Qtracker® 세포 표지 키트(Quantum Dot Corp, Hayward, CA)를 사용하여 Qdot® 나노결정(655 nm 방출)으로 표지된 1 x 105 E-RoSH 세포를 배아 줄기세포-유래의 기형종 내로 주입하였다.
3일 후, 마우스를 과량의 마취제로 안락사키고 종양을 제거하였다. 종양을 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고 20 ㎛ 두께로 냉동절단하였다. 절편을 래트 항-페캄(pecam)-1(Pharmingen, San Diego, California)에 이어 FITC-접합 토끼 항-래트 항체(Chemicon, Temecula, California)를 사용하여 페캄-1 면역반응성에 대해 분석한 후, DAPI로 대조염색하였다. 상기 절편을 광학 현미경에 이어 공초점 현미경으로 가시화하였다.
실시예 6. 마우스 배아 줄기세포( mESC )로부터 계통-한정된 내피 전구세포주의 유도
마우스 배아 줄기세포(mESC)로부터 내피 전구세포주를 유도하기 위해, 본 발 명자들은 5.5 dpc 지연 배반포 및 이식 후 초기 마우스 배아로부터 RoSH 내피 전구세포주를 유도한 본 발명자들의 겸험에 의존하였다(Yin et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24:691-696).
본 발명자들은 배상체(EB)로의 배아 줄기세포(ESC)의 분화가 포유동물 발생에 있어서 초기 이벤트의 일부를 반복하기 때문에 5.5 dpc 지연 배반포 및 이식 후 초기 배아와 발생학적으로 유사한 3 내지 6일령의 배상체에 RoSH 전구세포를 발생시키는 세포가 풍부할 것이라고 추론하였다.
그러므로, 3 내지 6일령의 배상체를 반고체 메틸셀룰로스-기재 배지를 사용하여 발생시키고(Lim et al., Blood. 1997; 90:1291-1299), 콜라게나제 분해를 이용하여 세포 현탁액으로 분산시킴으로써 배상체의 분화 미세환경을 파괴하고, LIF 보충 없이 배아 줄기(ES) 배지 중에서 10 cm 플레이트 당 1 내지 5 x 105 세포의 밀도로 젤라틴처리 조직 배양 플레이트 상에 도말하여 마우스 배아 줄기세포의 증식을 저해하였다(도 1A).
분산된 세포들의 증식은 RoSH 전구세포의 유도에 대해 이미 공지된 바와 같이(Yin et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004;24:691-696) 상기 세포들이 배아 섬유모세포성 양양세포 상에 도말되는 경우 향상되었지만, 이는 배아 줄기세포의 생장을 촉진하는 경향을 보였다. 약 1주일 후, 상기 세포들의 대부분은 불균질 세포 배양물로 분화하였다.
그 다음, 상기 배양물을 세포질에 대한 핵의 비율이 큰 급속 분열 세포의 RoSH-유사 콜로니, 및 본 빌레브란트 인자(또는 vWF)에 대해 면역반응성을 나타내는 고리-유사 세포에 대해 검색하였다(Yin et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24:691-696)(도 1B).
세포 수가 2 내지 300개에 도달하였을 때, 일정한 증식 속도 및 안정한 형태를 유지한 콜로니들만을 선별하고, 배아 섬유모세포성 영양세포 또는 젤라틴-피복 플레이트 상에서 증폭시켜 세포주 E-RoSH1, E-RoSH2, ... 등을 발생시켰다.
그 다음, 세포를 10 cm 플레이트 당 10 내지 100개 세포의 낮은 밀도로 도말함으로써 상기 세포주들 각각을 서브클로닝한 후, 콜로니를 선발하여 하위세포주 E-RoSH1.1, 1.2 등을 유도하였다. 별법으로, 낮은 밀도로 도말하여 클로닝하기 전에 1:4로 약 2 또는 3회 계대배양함으로써 자가-재생 RoSH-유사 세포를 풍부하게 할 수 있었다. 1 내지 5 x 105 배상체 세포 당 약 1개의 RoSH-유사 콜로니의 가장 효율적인 수율은 배상체의 연령 및 모 배아 줄기세포주에 달려 있다. 예를 들어, E14 배아 줄기세포주로부터 유도된 D3 내지 D5 배상체, 및 CSL3 배아 줄기세포주(Bourc'his et al., Science. 2001; 294:2536-2539)로부터 유도된 D6 배상체가 RoSH-유사 세포주의 유도에 가장 효율적이었다.
다른 한편으로, LIF의 부재 하에 생장된 분화하는 배아 줄기세포 또는 배상체의 다른 발생 단계로부터의 RoSH-유사 세포주의 유도가 가능하였지만 훨씬 덜 효율적이었다. 본 발명자들은 독립적으로 유도된 9개 세포주, 즉 CSL3 배아 줄기세포주로부터 유도된 5개 세포주, 및 E14 배아 줄기세포주로부터 유도된 4개 세포주를 확립하였다.
실시예 7. E- RoSH 내피 전구세포의 특징규명
E-RoSH2.1로 예시되는 E-RoSH 세포는 배아-유래의 RoSH 세포주와 형태적으로 유사하였지만(도 1C), 이의 모 배아 줄기세포주와 달리 검출가능한 알칼리성 포스파타제 활성을 나타내지 않았다(도 1D).
집단 배가 시간(Population doubling time)은 MTT 분석에 의해 ~15시간인 것으로 추정되었다(데이타는 나타내지 않음). E-RoSH 세포를 1:4 내지 1:5 분할 비에서 2일마다 계대배양함으로써 40 초과의 세대 동안 연속 배양물 중에서 유지하였다(데이타는 나타내지 않음).
염색체 수에 의해 모니터링되는 E-RoSH2.1 및 E-RoSH3.2의 핵형은 40개의 정상 평균 염색체 수를 가지면서 10회 이상의 계대배양 동안 안정하였다(도 1E).
E-RoSH2.1에서의 유전자 발현은 15개 유전자의 정량 RT-PCR 분석으로 모니터링하였고 여러 계대배양에서 안정한 것으로 밝혀졌다(도 2A). 또한, 이 유전자 발현 프로파일은 다른 독립적으로 유도된 E-RoSH 세포주뿐만 아니라 마우스 배아로부터 유도된 RoSH 세포주에서의 유전자 발현 프로파일과 유사하였다(도 2B).
SCID 또는 Rag1 -/- 면역결핍 마우스로의 E-RoSH 세포의 피하 이식은 2 내지 9개월의 관찰 기간 동안 기형종 형성을 유도하지 않은 반면, 모 배아 줄기세포의 유사한 이식은 3주 내에 2 cm의 기형종을 변함없이 발생시켰는데, 이는 E-RoSH 세포에서의 다능성의 상실을 시사한다(데이타는 나타내지 않음).
이 다능성의 상실은 다능성 세포와 관련된 여러 유전자들 예컨대, BMP4, FGF5, Oct4, Sox -2 및 Utf1의 감소된 발현에 의해 더 입증되었다(도 2C)(Wei D, Xu GL, Lin CS, Bollman B, Bestor TH. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Stem Cells. 2005; 23:166-185; Rao M. Dev Biol. 2004; 275:269-286).
반대로, 그 발현이 내피 전구세포와 통상적으로 관련된 runx -1, flk -1, PDGFRα, Tie -2 및 c- kit로 구성된 유전자 세트(Jaffredo et al., Int J Dev Biol. 2005;49:269-277)는 고도로 발현되었다(도 2D).
이 관찰결과들은 E-RoSH 세포가 더 이상 다능성을 갖지 않으면서 내피 잠재력을 포함할 가능성이 있는 한정된 분화 잠재력을 가진 배아 줄기세포-유래의 세포임을 입증한다.
실시예 8. 시험관 내 및 생체 내에서 내피세포로의 E- RoSH 세포의 분화
E-RoSH 세포의 내피 잠재력을 확인하기 위해, E-RoSH 세포를 매트리겔 상에 도말하였다.
상기 세포는 2주 내에 전체 조직 배양 디쉬를 덮는 혈관-유사 관으로 구성된 네트워크를 형성하였다(도 3A). 이 관들은 선명하였고 루멘으로 내부이입된 아세틸화 LDL의 내층을 형성하는 세포들이었으며(도 3B), vWF에 대해 면역반응성을 나타내었다(도 3C).
Tie-2와 같은 내피 유전자들의 발현도 증가되었다(도 3D).
배아 줄기세포와 유사한 E-RoSH 세포는 현탁액 중에서 생장하는 경우 구형체를 형성하였다. 그러나, 조밀하게 채워진 배아 줄기세포-유래의 배상체와 달리, E- RoSH-유래의 구형체는 중공 중심을 가져 형태적으로 상이하였고(도 3E), 이는 배아 줄기세포와 E-RoSH 세포 사이의 또 다른 구별가능한 차이점을 제공한다.
배아 발생 동안 초기 계통 구속(lineage commitment)과 관련된 유전자의 발현은 배상체 형성 동안의 발현에 비해 E-RoSH-유래의 구형체의 형성 동안에 유의하게 감소되었다. 상기 유전자들에는 초기 장배형성 동안에 발현되는 cerberus(cer-1)(De Robertis et al., Int J Dev Biol. 2001;45:189-197), 축 중배엽 형태형성 및 패턴화에 중요한 mixl1(Hart et al., Development. 2002; 129:3597-3608; Mohn et al., Dev Dyn. 2003; 226:446-459), 및 신경내분비 조직에서 발현되는 PCSK1(Seidah et al., Mol. Endocrinol. 1991; 5:111-122; Benjannet et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1991; 88:3564-3568)이 포함된다(도 3F).
이 유전자들의 상대적으로 낮은 발현도는 E-RoSH의 감소된 효능과 일치하고, E-RoSH 세포가 모든 3개의 배엽층으로부터의 세포 유형들의 넓은 레파토리로 분화하는 배아 줄기세포의 능력을 더 이상 가지지 않는다는 것을 시사한다.
반대로, 내피 유전자 예컨대, c-kit 및 Tie-2의 발현에서의 10-배 증가(도 3F)는 E-RoSH 세포가 그의 모 배아 줄기세포에 비해 10-배 효능을 가진 내피세포로 우세하게 분화한다는 것을 시사한다. E-RoSH 세포의 유전자 발현이 상기 세포들이 조혈 세포로 분화하는 잠재력을 가진다는 것을 시사할지라도, 본 발명자들은 표준 조혈 분화 분석법을 이용하여 상기 세포들의 강한 조혈 분화를 유도할 수 없었다.
E-RoSH 세포가 장기 세포 투과성 형광 세포 표지인 Q-트랙커(Q-tracker)로 표지되고 분화하는 E-RoSH 세포에 적합한 미세환경을 제공할 모 배아 줄기세포-유 래의 기형종 내로 이식되는 경우, E-RoSH 세포는 기형종 내의 모세혈관 얼기(plexus) 내로 혼입되고 페캄-1에 대해 면역반응성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다(도 3G). 종양 혈관구조 내로 혼입되지 않은 이식된 세포들의 대부분은 페캄-1에 대해 면역반응성을 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 9. 인간 배아 줄기(hES)세포주로부터의 계통-한정된 전구세포주의 유도
본 발명자들의 방법의 일반적인 이용가능성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 huES9 인간 배아 줄기세포주로부터 MSC-유사 세포주를 유도하였다(Cowan et al., N Engl J Med. 2004; 350:1353-1356).
본 발명자들은 인간 배아 줄기세포 콜로니가 대부분의 인간 배아 줄기세포 배양물 중에서 증식하는 기질 섬유모세포와 평형 상태에서 생장하고(도 4A), 이는 상기 콜로니가 인간 배아 줄기세포-유래의 전구세포임을 시사한다는 것을 관찰하였다. 이 세포들의 증식을 촉진하고 인간 배아 줄기세포의 증식을 저해하기 위해, huES9 세포를 영양세포의 부재 하에 배양하고 계대배양하였다. 골수 유래의 MSC(BM-MSC) 배양물과 형태적으로 유사한 섬유모세포-유사 세포의 균질한 배양물이 발생되었다(도 4B).
huES9.E1 및 huES9.E3으로 명명된 2개의 다중클론 세포주는 독립적으로 발생되었다. huES9.E1 세포는 그의 모 huES9 세포와 달리 검출가능한 알칼리성 포스파타제 활성을 갖지 않았거나(도 4C) 또는 OCT4를 발현하지 않았다(도 4D).
본 발명자들의 과거 경험이 추정상의 줄기세포와 영양세포 사이의 융합이 일 어나 자가-재생 세포를 발생시킨다는 것을 시사하기 때문에(Que et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2004; 40:143-149), 이 배양물들을 시험하였고 마우스-특이적 c-mos 반복 서열에 대해 음성을 나타내지만 인간-특이적 alu 반복 서열에 대해서는 양성을 나타낸다는 것을 밝혔다(도 4E).
상기 세포들은 이들의 모 huES9 세포주와 유사한 46 XX 염색체를 가진다(Cowan et al., N Engl J Med. 2004; 350:1353-1356)(도 4F).
혈청 대체 배지로 보충된 배지 중에서 생장된 경우, 집단 배가 시간은 4 내지 5일이고, 10% 태아 소 혈청으로 보충된 배지 중에서 집단 배가 시간은 약 36시간이었다.
huES9.E1 및 huES9.E3이 BM-MSC와 매우 유사하다는 점에 기초하여, 본 발명자들은 huES9.E1의 표면 항원 프로파일을 BM-MSC의 표면 항원 프로파일과 비교함으로써 huES9.E1의 계통 잠재력을 추가로 추정하였다. 이 세포들은 전형적인 MSC 표면 마커인 CD29+, CD44+, CD105+ 및 CD166+을 나타내었으나(Barry and Murphy, Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36:568-584) CD34 및 CD45를 발현하지 않았다(도 4F).
HuES9.E1 세포는 표준 분화 조건을 이용하여 지방세포 및 골세포로 분화하도록 유도할 수 있었다(Barberi T et al., PLoS Med. 2005; 2:e161). 지방세포로의 분화는 분화된 세포 내의 오일 소적의 존재 및 PPAR γ mRNA의 발현에 의해 확인된 반면(도 4G), 골형성은 매트릭스 내의 칼슘 축적에 대한 본 코사 염색 및 골-특이적 알칼리성 포스파타제인 Alp1의 발현에 의해 측정되었다(도 4H).
실시예 9. 논의
요약하면, 본 발명자들의 연구는 자가-재생능이라는 독특한 능력을 가진 전구세포가 형질전환 없이 증식될 수 있다는 원리를 이용하여 계통-한정된 배아 줄기세포-유래의 전구세포주를 확립할 수 있다는 증거를 제공한다. 상기 세포주는 노화 없는 일정한 증식 속도에 의해 최종 분화 세포와 구별될 수 있다.
이 구별되는 특징에 기초하여, 이 전구세포는 분화하는 배양물을 낮은 밀도로 도말하여 일정하게 증식하는 콜로니를 선별함으로써 단리될 수 있거나 증식하는 세포를 선별하기 위한 배양물의 연속적인 계대배양에 의해 단리될 수 있는 반면, 최종 분화 세포는 노화할 것이고 상기 배양물로부터 사라질 것이다. 한 가지 요건은 배양 배지가 모 배아 줄기세포의 증식을 촉진하지 않아야 한다는 것이다.
참고문헌
Figure 112008023614840-PCT00001
Figure 112008023614840-PCT00002
Figure 112008023614840-PCT00003
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기재된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되어 있다 하더라도, 청구된 본 발명이 이러한 특정한 실시양태로 과도하게 한정되어서는 안 되며, 본 발명에 대한 많은 변형 및 부가가 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 사실상, 분자생물학 및 관련 분야에서 숙련된 자에게 자명한, 본 발명을 실시하기 위한 기 재된 방식의 다양한 변형은 청구범위 내에 포함된다. 더욱이, 독립항의 특징과 함께 하기 종속항의 특징의 다양한 조합이 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다.

Claims (39)

  1. (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 확립시키는 단계
    를 포함하는 방법으로서, 이때 상기 전구세포주가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 체세포의 자가-재생불능에 기초하여 체세포로부터 선별하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전구세포주가 공동배양물(co-culture)의 부재 하에, 바람직하게는 영양세포의 부재 하에 유도되거나 확립되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 공동배양물의 부재가 배아 줄기세포로부터 선별되게 하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 형질전환 없이 확립되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 배아 줄기세포 또 는 이의 후손세포를 추정상의 전구세포의 자가-재생을 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 확립되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 자가-재생 촉진 조건이 배아 줄기세포의 증식을 저해하는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 자가-재생 촉진 조건이 풍부 배지 중에서의 생장을 포함하는 것인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 자가-재생 촉진 조건이 LIF의 부재 하에서의 세포의 생장을 포함하는 것인 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 자가-재생 촉진 조건이 연속 계대배양을 포함하는 것인 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 자가-재생 촉진 조건이 12회 이상의 연속 계대배양을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 배아 줄기세포에 비해 잠재력이 감소된 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 계통(lineage) 한정된 것, 바람직하게는 비다능성인 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 종양형성능을 갖지 않는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주를 유도하는 단계가 특정한 계통으로의 분화를 향상시키는 조건에 배아 줄기세포를 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 분화 향상 조건이 배아 줄기세포로부터 배상체(embryoid body)를 형성시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 세포가 다능성을 상실한 후 분화 향상 조건으로부터 제거되는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 계통 한정 촉진 조건으로부터의 세포의 제거가 배상체를 분리하는(disaggregation) 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 3 내지 6일 동안 생장된 배상체를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다의 감소된 발현을 나타내거나 OCT4 및 알칼리성 포스파타제 활성 중 하나 또는 이들 둘다를 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 그가 유래한 배아 줄기세포에 비해 다능성 마커의 감소된 발현을 나타내고, 상기 다능성 마커가 바람직하게는 Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox-2 및 Utf1로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 하기 특성들 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법:
    (a) 40 초과의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지될 수 있는 특성;
    (b) 10 이상의 세대 동안 세포 배양물 중에서 유지된 경우 실질적으로 안정한 핵형(karyotype) 또는 염색체 수를 갖는 특성; 및
    (c) 세대와 세대 사이에 실질적으로 안정한 유전자 발현 패턴을 갖는 특성.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 수용체 동물, 바람직하게는 면역 손상된 수용체 동물에 이식된 경우 바람직하게는 3주 후, 보다 바람직하게는 2 내지 9개월 후 기형종의 형성을 실질적으로 유도하지 않는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배아 줄기세포 또는 전구세포주가 포유동물, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 배아 줄기세포 또는 전구세포주인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 내피 전구세포주, 바람직하게는 E-RoSH 세포주를 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 전구세포주가 간엽 전구세포주, 바람직하게는 huES9.E1 세포주를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 전구세포주가 분화 전에 5 이상의 세대 동안 증식되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 배아 줄기(ES)세포로부터 분화된 세포를 발생시키기 위한 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포가 내피세포 또는 간엽세포인 방법.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 분화된 세포가 지방세포 또는 골세포인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 간엽 또는 내피 마커의 발현을 상향조절하기 위한 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 줄기세포 마커 또는 다능성 마커의 발현을 하향조절하기 위한 방법.
  34. 줄기세포의 분화 또는 자가-재생을 촉진하거나 지연할 수 있는 제제를 확인하는 방법으로서, 후보 분자의 존재 하에 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 그에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 재생 요법에 의해 치료될 수 있는 질환; 심부전; 골수 질환; 피부 질환; 화상; 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 퇴행성 질환; 및 암 중 임의의 질환의 치료를 위한 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 전구세포주 또는 분화된 세포를 생성하기 위한 방법.
  36. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 전구세포주.
  37. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 분화된 세포.
  38. 배아 줄기(ES)세포로부터 분화된 세포를 발생시키는 방법으로서, (a) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포주를 유도하는 단계; (b) 상기 전구세포주를 증식시키는 단계; 및 (c) 상기 전구세포주로부터 분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  39. (a) 배아 줄기(ES)세포를 제공하는 단계; (b) 상기 배아 줄기세포로부터 전구세포를 유도하는 단계; 및 (c) 상기 전구세포로부터 전구세포주를 확립시키는 단계를 포함하는 방법으로서, 이때 상기 전구세포가 그의 자가-재생능에 기초하여 선별되는 것인 방법.
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