TWI486447B - 人類間質幹細胞體外快速增生之佐劑、體外快速擴增人類間質幹細胞之方法、體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子的方法及其用途 - Google Patents

Description

人類間質幹細胞體外快速增生佐劑、體外快速擴增人類間 質幹細胞之方法、體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子的方法及其用途

本發明係有關於一種人類間質幹細胞體外快速增生佐劑，尤指一種包含抗氧化劑與生長因子的佐劑以添加於人類間質幹細胞之培養基中，用以使人類間質幹細胞於初代或繼代培養可快速增生並獲取生長因子者。

按，目前科學界對於幹細胞下了一些基本定義與具有特性為：指一群具有細胞自我更新(Self-renewal)、增生(Proliferation)能力，同時能長期維持在未分化(Undifferentiation)狀態的細胞，並且在受到適當誘導刺激後可以分化成不同世系的細胞群及特定功能的組織的多重分化(multi-differentation)特性。

依據幹細胞來源及其分化潛能的不同，可以將其分類為：

1．全能性幹細胞(Totipotent stem cell)：其具有可發展成完整獨立生物體的能力，如受精卵(Zygote)或胚胎發育到約八細胞時期的細胞群。

2．多功能性幹細胞(Pluripotent stem cell)：受精卵(Zygote)受精約4天後，全功能性幹細胞開始分化進入囊胚體期，囊胚體可分為兩部分：外滋養層細胞(outer layer of cells)與內細胞團(inner cell mass)，在胚胎發育過程中，外滋養層細胞會形成胎盤與胎兒依附在子宮中所需的支持組織，而內細胞團則會形成外胚層、中胚層與內胚層，各個胚層再往下分化成各種不同的系統與器官。雖然內細胞團有形成人體各部份的能力，但若單獨將內細胞團放入人類成熟女性健康的子宮內，因為缺乏外滋養層細胞，無法形成胎盤及胎兒生長所需的外在支持系統與環境，所以無法發展成一完整個體，故其多功能性仍存有部分限制的。

3．多潛能性幹細胞(Multipotent stem cell)：是目前研究最多的幹細胞，自上述多功能性幹細胞再往下分化，可特化成特定組織的幹細胞，如造血幹細胞(hematopoietic stem cell)、間葉幹細胞(mesenchymal stem cells)等，其中，造血幹細胞來自於周邊血、臍帶血、骨髓等，可分化為各種血球及淋巴，而間葉幹細胞可來自於脂肪、骨膜(periosteum)、關節膜(synovial membrane)、骨髓及某些臟器的間質組織(mesenchymal tissue)，如胎盤等。以造血幹細胞為例，造血幹細胞可再往下分化成淋巴幹細胞與骨髓幹細胞，其中淋巴幹細胞可分化成淋巴球、殺手細胞等，而骨髓幹細胞可分化成紅血球、白血球與血小板等；成人與小孩體內都可找到多潛能性幹細胞，藉由幹細胞「自行再生」的能力，多潛能 性幹細胞主要扮演著補充與更新我們體內正常所消耗掉的細胞。目前已被分離出來的多潛能性幹細胞包括腦、視網膜、骨髓、肝、骨骼肌、皮膚、臍帶、臍帶血及脂肪組織等。

4．專一/單一型幹細胞(Unipotent stem cell)：泛指有能力分化成特定的某一種組織之幹細胞或稱之為前驅細胞(progenitor cell)，這類的細胞普遍存在於各部分的組織，是最容易被發現的幹細胞，如肝前驅細胞、神經前驅細胞...等。

間葉幹細胞首度在學術上被定義為可形成聚落單元的纖微母細胞(colony-forming unit of fibroblast-CFU-Fs)。在培養的過程中，會單層貼附在塑膠培養皿表面，形態類似纖微母細胞，呈現紡鎚狀，在體外會快速增生形成聚落，並保有分化為骨母細胞(osteoblast)、脂肪細胞(adipocyte)、軟骨細胞(chondrocyte)的潛能。近年來也有研究指出可分化為肝細胞、心肌細胞、神經細胞、胰島細胞等(Minguell et al.,2001)。

間葉幹細胞的來源可自人體許多不同組織分離出來，例如由手術直接切除或經由抽脂手術取得的脂肪組織即為一幹細胞豐富的來源，可分離出脂肪幹細胞(Adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)，其具有的優點有：取得方式侵入性低，對人體傷害小、且一次取得的量較多、可於體外增生培養等；加上脂肪幹細胞亦擁有可分化成硬骨、軟骨、肌肉以及脂肪細胞的潛力(Zuk et al.,2002)，因此，脂肪幹細胞被認為是最具研究發展潛力的幹細胞之一。

幹細胞的研究與應用，無論在基礎醫學研究上或是臨床治療上，都需要足夠的細胞數，且須培養在一適當的的環境下，包含合適的微環境、生 長因子等刺激，以避免幹細胞在培養、增生過程中提前老化、失去活性或是分化成其他細胞。然而，由於細胞分離技術、生長培養基以及培養條件的差異導致幹細胞於增生與分化能力上有顯著不同(Pittenger et al.,2008)。此外，許多文獻報導皆一致注意到間質幹細胞在培養增生過程中的老化傾向問題(Bonab et al.,2006；Shibata et al.,2007；Wagner et al.,2008)。因此，幹細胞增生過程中所遇到細胞性能和老化上的差異，亟可能阻礙了間質幹細胞的臨床用途。因此，如何能有效且快速的將取得不易的幹細胞培養並放大數目，同時又能保持未分化狀態與減少老化的現象，且仍具有多功能性特色，一直是科學家們所極力追求的。

而近年來，研究報導亦指出，培養過骨髓間質幹細胞(BMMSC)的條件培養基中，被發現有大量可促使傷口癒合的旁分泌因子存在，例如：血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子1(IGF-I)、表皮生長因子(EGF)、角質細胞生長因子(KGF)、血管生成素(angiopoietin-1)、基質衍生因子(stromal-derived factor-1)、巨噬細胞發炎性蛋白(macrophage inflammatory protein-1 α、macrophage inflammatory protein-1 β)、和促紅細胞生成素(erythropoietin)等(Martin et al.,1997)。而脂肪間質幹細胞(ADSC)已經被證實與骨髓間質幹細胞、臍帶血間質幹細胞、骨膜間質幹細胞、滑膜間質幹細胞及肌肉間質幹細胞在基因表現及表型上，並無顯著差異(Sheehy et al.,2012；Hung et al.,2012；Hung et al.,2007)。鑒於脂肪間質幹細胞相較於骨髓間質幹細胞具有更佳的分離及體外增生條件，目前大有希望應用於傷口修復與再生。目前已知，在條件培養基中，脂肪間質幹細胞分泌了以下生長因子，如：第二型纖維細胞生 長因子(bFGF)、角質細胞(KGF)、轉型生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等，而這些生長因子都可能與傷口癒合有關。因此如何使間質幹細胞快速增生並產生大量生長因子，實為一值得努力研究的課題。

有如中華民國專利201331366號一種「體外無血清成體幹細胞放大培養技術」，提供一種體外無血清成體幹細胞放大培養之方法，其方法利用添加自體生長因子(PRGF)於無血清幹細胞培養液中進行人類成體幹細胞之初代培養及繼代培養，以此方法所培養的人類成體幹細胞經過多次的繼代培養後，人類成體幹細胞仍保持在實質未分化的狀態。惟，經其培養方法所獲得的幹細胞數目在繼代培養至第三代(P3)前才達到約55,000細胞數/每平方公分，若要獲取更多的幹細胞數量，可能得提高培養天數以及繼代培養的代數來滿足需求，相對的，也必須承擔多次繼代培養可能受到汙染的風險。

又有如中華民國專利201118172號一種「低密度合併低氧培養擴增間質幹細胞的方法」，該方法可在不影響細胞增殖和幹細胞特性之下快速和有效率地擴增人類間質幹細胞，包括於體外或體內增加增殖、減少老化及增加分化潛力。惟由於大部分研究單位用來培養細胞之培養箱多為僅提供二氧化碳分壓以及濕度調整功能，若需於低氧環境下培養，則需零型購置具氧分壓調整功能之培養箱；對於研究經費不甚充足之研究單位實為一大負擔。

另如中華民國專利201231087號「一種含有多種生長因子之保養品製程」，首先取出健康脂肪；再將一預定容量的溶劑混入脂肪組織，以對脂肪 組織進行清洗；按預定劑量的試劑加入預定容量之脂肪組織，並進行離心分離；經分離後產生的脂肪組織則混入預定劑量的酵素於一離心管，並對該離心管進行震盪；將產生的沉澱物進行細胞培養以產生體細胞；及取得該體細胞後，透過培養上述方式所取得的細胞培養液富含細胞分泌之生長因子(如：VEGF、HGF、b-FGF、TGF、IGF)，以完成高效保養品原料。惟其揭示之培養方法係將體細胞置入一包含百分之10胎牛血清(10%FBS)的基礎培養基DMEM(Dulbecco`s Modified Eagle Medium)中培養，該體細胞增生速度慢，其所分泌之生長因子相對較少，若要獲取大量的生長因子，就必須提高培養天數以及繼代培養的代數來達成，因此，也具有因多次繼代培養可能受到汙染的風險存在。

綜合上述，為了使體外人類間質幹細胞可快速增生，並仍可保有幹細胞多功能性之特徵，且同時可大量獲取人類間質幹細胞分泌之生長因子，我們亟需要一人類間質幹細胞培養佐劑以及培養方法，以快速又有效率地擴增細胞數目並獲取大量生長因子。

今，本發明人有鑑於現有對於人類間質幹細胞培養以擴增細胞數目及獲取人類間質幹細胞分泌之生長因子之缺失再予以研究，提供一種人類間質幹細胞體外快速增生佐劑及其培養方法與一種體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子的方法及其用途，以期達到更快速和有效率地擴增人類間質幹細胞並獲取生長因子之目的。

爰此，本發明提供一種人類間質幹細胞體外快速增生佐劑，其包括至少一種抗氧化劑以及一第二型纖維母細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,FGF-2)。

進一步，前述人類間質幹細胞體係選自：脂肪間質幹細胞、骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞所構成群組之一。

進一步，前述抗氧化劑係包括一長效型抗壞血酸衍生物(Long-acting ascorbic acid derivative)及一N-乙醯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)之組合。

進一步，前述長效型抗壞血酸衍生物係一左旋抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbic acid-2-phosphate,AsA2P)。

進一步，前述第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1毫微克/毫升(ng/mL)至20毫微克/毫升(ng/mL)。

進一步，其係藉由抑制前述人類間質幹細胞之細胞內細胞週期蛋白依賴性激酶抑制物：p21及p27蛋白之表現以提高細胞週期蛋白依賴性激酶-2(CDK-2)、細胞週期蛋白依賴性激酶-4(CDK-4)及細胞分裂週期蛋白(CDC2)之表現。

本發明提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞之方法，包括將前述之佐劑加入一包含人類間質幹細胞之培養基中，以擴增人類間質幹細胞，並獲取實質未分化之一人類間質幹細胞。

本發明再提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞之方法，包括將 前述之佐劑加入包含一血清添加物及一人類間質幹細胞之一培養基中，以擴增前述人類間質幹細胞，並獲取實質未分化之一人類間質幹細胞。

進一步，前述血清添加物為人類血清或胎牛血清，所使用之體積百分濃度為百分之2至百分之10。

進一步，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法更包括一冷凍保存前述擴增之人類間質幹細胞步驟，用於更進一步的使用。

進一步，利用前述方法所冷凍保存之擴增之人類間質幹細胞以建立一細胞庫。

進一步，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法包括執行一萃取步驟以獲得一人類間質幹細胞之細胞萃取物。

進一步，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法更包括執行一誘導分化步驟，以獲取一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。

進一步，前述自人類間質幹細胞所分化的細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。

本發明另提供一種醫藥組合物，其包含由前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法所獲取實質未分化之一人類間質幹細胞或一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。

進一步，前述醫藥組合物結合一生物相容性材料以應用於再生醫學或組織工程。

本發明再提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因 子的方法，經前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法培養後，以於前述培養基中獲取一生長因子。

進一步，前述生長因子係包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF R α、PDGF-R β、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β 3、VEGF、VEGF R2。

本發明提供一種生長因子，係根據前述體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子之方法所獲得。

本發明提供一種醫藥組合物，包含有前述體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子之方法所獲得之生長因子。

本發明提供一種包含有如前述生長因子在製備促傷口癒合之藥物的用途。

本發明提供一種包含有如前述生長因子作為皮膚保養品之用途。

本發明的功效在於：

(一)細胞快速增生：藉由添加本發明之人類間質幹細胞體外快速增生佐劑於培養基中，使人類間質幹細胞體在初代或繼代培養時出現細胞週期合成期(S phase)比例提高，而促使細胞快速分裂增生之現象，且仍可保有幹細胞多功能性分化之潛能。

(二)減少細胞老化：藉由添加本發明之人類間質幹細胞體外快速增生佐劑於培養基中，可使前述人類間質幹細胞體中端粒酶反轉錄酵素(Telomerase Reverse Transcriptase,TERT)提高，可以延長細胞端粒(Telomere)縮短的時間，以減緩細胞老化並延長細胞的壽命。

(三)快速獲取大量生長因子：藉由添加本發明之人類間質幹細胞體外快速增生佐劑於培養基中，可較習知培養於一包含體積百分濃度為百分之10%胎牛血清的培養基中，獲取至少2至3倍以上的生長因子[如類胰島素生長因子-1(IGF-1)、肝細胞生長因子(HGF)及表皮生長因子(EGF)]含量。

(四)降低病源汙染：本發明之人類間質幹細胞體外快速增生佐劑於搭配人類血清進行培養時，可避免因使用異體或異種之血清進行培養而存在有異體或異種間之病源交互汙染之風險。

[第一A-C圖]係為本發明中人類間質幹細胞於不同培養條件下之天數與細胞密度關係圖。

[第二A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後對細胞週期的影響分析圖。

[第二B圖]係說明本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，對於負責調控細胞周期之蛋白的表現影響。

[第三圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，對於細胞相對端粒長度的影響。

[第四A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，培養天 數與細胞總數的關係圖。

[第四B圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，對於負責調控細胞周期之蛋白的表現影響。

[第五A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，細胞數量與型態示意圖。

[第五B-D圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，細胞培養天數與細胞數量關係圖。

[第六A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，其細胞表面抗原分析結果圖。

[第六B圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，其幹細胞基因相對表現分析圖。

[第七A-B圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化為硬骨細胞後，經化學染色結果圖。

[第七C圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化為硬骨細胞後，其硬骨細胞分子標誌相對表現分析圖。

[第八A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化為軟骨細胞後，經化學染色結果圖。

[第八B圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化為軟骨細胞後，其軟骨細胞分子標誌相對表現分析圖。

[第八C圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化 為脂肪細胞後，經化學染色結果圖。

[第八D圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養並誘導分化為脂肪細胞後，其脂肪細胞分子標誌相對表現分析圖。

[第九A圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，細胞因子陣列分析圖。

[第九B圖]係為本發明中第九A圖之細胞因子陣列分析結果比較圖。

[第九C-D圖]係為第九B圖中細胞因子的相對表現量化分析圖。

[第九E圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，其細胞中細胞因子的相對表現分析圖。

[第九F圖]係為本發明中脂肪幹細胞經不同條件培養後，細胞因子陣列分析圖。

[第九G圖]係為本發明中第九F圖之細胞因子陣列分析結果比較圖。

[第十A圖]係為本發明中脂肪間質幹細胞培養於一微載體之光學顯微鏡影像圖。

[第十B圖]係為本發明中第十A圖之螢光影像圖。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂， 下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

本發明係提供一種人類間質幹細胞體外快速增生佐劑，其包括至少一種抗氧化劑以及一第二型纖維母細胞生長因子(FGF-2)；其中前述抗氧化劑係包括一長效型抗壞血酸衍生物及一N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC)之組合。較佳的是，該長效型抗壞血酸衍生物係一L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(Asc 2-P)，而第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1至20毫微克/毫升。

較佳的是，前述人類間質幹細胞體係選自：脂肪間質幹細胞、骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞所構成群組之一。

較佳的是，本發明之人類間質幹細胞體外快速增生佐劑係藉由抑制前述人類間質幹細胞之細胞內細胞週期蛋白依賴性激酶抑制物：p21及p27蛋白之表現以提高細胞週期蛋白依賴性激酶-2(CDK-2)、細胞週期蛋白依賴性激酶-4(CDK-4)及細胞分裂週期蛋白(CDC2)之表現，進而促進細胞週期進入合成期(S phase)的比例提高，從而使細胞快速分裂增生。

本發明同時提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞之方法，包括將前述之佐劑加入一包含人類間質幹細胞之培養基中進行培養，以擴增人類間質幹細胞，並獲取實質未分化之一人類間質幹細胞。

本發明再提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞之方法，包括將前述之佐劑加入包含一血清添加物及一人類間質幹細胞之一培養基中，以擴增前述人類間質幹細胞，並獲取實質未分化之一人類間質幹細胞。

較佳的是，前述血清添加物為人類血清或胎牛血清，所使用之體 積百分濃度為百分之2至百分之10。

較佳的是，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法進一步包括執行一萃取步驟以獲得一人類間質幹細胞之細胞萃取物。

較佳的是，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法更包括一冷凍保存前述擴增之人類間質幹細胞步驟，用於更進一步的使用。

較佳的是，此處所使用的「冷凍保存」一詞通常是指將細胞加入冷凍保護劑如二甲亞碸(DMSO)或是甘油後冷卻至零下的溫度保存的方法，例如為負80℃或是負196℃(液態氮的沸點)。冷凍保存可如熟知此技藝之人士所進行的方法與流程，惟非本發明訴求重點因此不予贅述(參閱1997年HummaPress公司所出版第2版Pollard，J.W.與Walker，J.M.．所著基礎細胞培養流程；2000年Wiley-Liss公司所出版第4版Freshney,R.I.，所著動物細胞的培養)。

本發明提供一種細胞庫，其包含由前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法所冷凍保存之擴增之人類間質幹細胞。

較佳的是，前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法更包括執行一誘導分化步驟，以獲取一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。

較佳的是，前述自人類間質幹細胞所分化的細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。

本發明再提供一種醫藥組合物，其包含由前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法所獲取實質未分化之一人類間質幹細胞或一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。

較佳的是，該醫藥組合物包含前述人類間質幹細胞、自其所分化的細胞、細胞分泌物或是細胞萃取物之一或其組合與合適的治療上可接受之一載體/賦形劑。其中，細胞分泌物在一些實施例中可於細胞培養基中純化及濃縮後取得。

進一步，前述醫藥組合物結合一生物相容性材料以應用於再生醫學或組織工程。

本發明再提供一種體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子的方法，係經由前述體外快速擴增人類間質幹細胞之方法培養後，細胞在快速增生的同時，亦分泌多種細胞生長因子於培養基中，藉此可於前述培養基中獲取前述生長因子。其中，前述生長因子係包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF R α、PDGF-R β、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β 3、VEGF、VEGF R2。

本發明提供一種生長因子，係根據前述體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子之方法所獲得。

本發明提供一種一種醫藥組合物，包含有前述體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子之方法所獲得生長因子，可用於但不限定治療皮膚創傷。

本發明提供一種包含有如前述生長因子在製備促傷口癒合之藥物的用途。

本發明提供一種包含有前述生長因子之皮膚保養品，用以修復皮膚曬傷或延緩皮膚細胞老化。

本發明提供一種包含有如前述生長因子作為皮膚保養品之用途。

本發明所稱「人類間質幹細胞」一詞是指任何得自於人類間質組織的細胞且具有無限自行更新的能力並且可分化為多種細胞或是組織形式，例如但不限於脂肪間質幹細胞、骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞、臍帶血間質幹細胞、骨膜間質幹細胞、滑膜間質幹細胞及肌肉間質幹細胞所構成群組之一。本發明之實施例係以人類脂肪間質幹細胞的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

「實驗一」本發明之佐劑對於不同人類間質幹細胞在常氧及低氧環境下培養對細胞生長之影響。

1.人類間質幹細胞之分離及體外培養

本實驗係由佛教慈濟綜合醫院的內部審查委員會(IRB100-102)批准進行，分別以人類脂肪組織、臍帶及骨髓組織為幹細胞取得來源，惟此處人類間質幹細胞之分離方法為習知技術且非本案訴求重點因此不予贅述，主要目的皆在獲取人類間質幹細胞以進行初代培養；本實驗之細胞培養條件分為三組：基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組、基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組以及基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組；其中所稱常氧環境係指約百分之21氧分壓下，而低氧環境係指約百分之5氧分壓下；該基礎培養基係IMDM(Iscove`s modified Dulbecco`s medium,GIBCO-Invitrogen)再加 入10%胎牛血清(FBS,MSC-Qualified,GIBCO-Invitrogen)及2毫莫爾濃度(mM)左旋麩醯胺酸(L-glutamine,GIBCO-Invitrogen)所組成；而前述生長因子FGF-2所使用之濃度為10ng/mL(R&D Systems)，且前述本發明之佐劑係包含2毫莫爾濃度(mM)N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC,Sigma)以及0.2毫莫爾濃度(mM)左旋抗壞血酸-2-磷酸鹽(AsA2P,Sigma)。每組幹細胞以每平方公分3000顆細胞(3000 cells/cm2)的細胞密度培養於6孔細胞培養盤中(6-well plates,Becton Dickinson)，且所有細胞皆培養於攝氏37度、百分之5二氧化碳分壓及百分之95濕度環境下之培養箱(Forma Series II Model 3110,Thermo)，並每3天更換一次培養基；另低氧培養環境之培養實驗則是於另一培養箱(MCO-18M,Sanyo)中進行。藉此觀察7天內不同人類間質幹細胞於不同培養條件下，對細胞增生的影響。

1.1細胞生長密度分析

將各組幹細胞以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗過一次後，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液於攝氏37度作用5分鐘後再以細胞刮勺小心移除未被作用完全的細胞，加入等比例含胎牛血清之培養基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有細胞數目皆以細胞計數機(Vi-CELL AS,Beckman Coulter)計算。存活的細胞以0.4%台盼藍(Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen)來與死細胞作區別，計算時判定活的間質幹細胞的參數設定為：100 images,Size 10-30微米，75%現場亮度，5%現場區域。結果的呈現以每組實驗數據測量三重複，以平均值±標準差表示之。

1.2實驗結果

以上實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖。首先，參第一A圖，係脂肪幹細胞於上述3種不同培養條件下之生長情形，其中基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組與基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組兩組比較，發現幹細胞在低氧環境下增生較為快速，尤其在第三天時已有顯著差異，第四天開始更是明顯，如此顯示脂肪間質幹細胞之增生速度於低氧環境下較常氧環境下來得好；另基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組兩組比較，發現常氧環境下加入本發明之佐劑培養，可以達到與低氧環境下培養相近的增生速度，甚至第五天起，是超越低氧環境下培養的增生速度，由此可知，本發明之佐劑之添加，可使脂肪間質幹細胞在常氧環境培養下，達到快速增生的效果。再參第一B圖及第一C圖，相同的結果亦可見於骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞的培養實驗中；藉由本實驗可知，本發明之佐劑之添加對於脂肪間質幹細胞、骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞在常氧環境培養下，皆可達到快速增生的效果。

2.細胞週期分析

將藉由上述脂肪間質幹細胞培養於不同培養條件下之各實驗組，再加上一僅包含10%胎牛血清之基礎培養基作為對照組，以流式細胞儀及其軟體(Phoenix Flow Systems)偵測分析其細胞周期的變化情形，各組培養三天後取樣，每組實驗三重複，以酒精固定後，使用碘化丙啶(propidium iodide,Sigma)染劑染細胞之DNA來分析細胞周期的變化。

2.1實驗結果

參第二A圖，係對照組與上述三組不同培養條件下，對脂肪間質幹細胞之細胞週期影響，其中* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.005。由實驗結果發現，基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組等兩組，其脂肪間質幹細胞處在細胞週期中之合成期(S phase)的百分比相較該對照組與該基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組，明顯提高不少，且基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組等兩組之G0/G1期(停止分裂期/生長期)的百分比較該對照組與該基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組來得低許多，由此可知，於低氧環境下或添加本發明之佐劑於常氧環境下培養，皆能使細胞週期處於合成期，促進細胞DNA不斷合成，進而使細胞快速分裂增生。其中，添加本發明之佐劑於常氧環境下培養之脂肪間質幹細胞，其細胞週期處於合成期之百分比更是超出於低氧環境下培養組，具有顯著差異；因此，添加本發明之佐劑於常氧環境培養下，不僅能達到快速增生效果，且甚至能超越於低氧環境下培養所能提高細胞增生速度之效果。

3.以西方點墨法分析調控細胞週期之相關蛋白的表現情形

習知西方點墨法係利用抗體、抗原專一性結合之特性，配合SDS-PAGE膠體電泳來偵測特定蛋白表現之定性與定量分析，惟該方法係廣為知悉之技術，其細節在此便不再贅述。本實驗針對已被文獻報導對於調控細胞週期有關的蛋白，諸如：Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin D3、CDK2、CDK4、CDK6、 CDC2、p21及p27等蛋白，利用上述各蛋白與其抗體間之專一性結合，透過上述西方點墨法來分析觀察經由不同培養條件培養之脂肪間質幹細胞中，其對於調控細胞週期有關的蛋白表現的影響；其中以一β-actin蛋白表現量為對照，作為上述各蛋白表現量化為數據之標準化的基準依據；因為β-actin蛋白是一種管家基因(Housekeeping gene)所轉錄、轉譯而出的蛋白質，為細胞維持正常生理現象所必須，且不因各種實驗條件而有太大的變化，故適合作為量化數據標準化的基準依據。

3.1實驗結果

續參第二B圖，係上述第二圖A四組實驗組，其調控細胞週期之相關蛋白表現分析，由圖中各蛋白質於不同實驗組中的表現情形，發現已被文獻報導認為是抑制細胞週期進行的細胞週期蛋白依賴性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表現量，相較於上述對照組與基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組，該基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組，明顯呈減低狀態，甚至該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組，其p21及p27蛋白的表現量呈現相近或低於該基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組之狀況；另細胞週期蛋白依賴性激酶-2(CDK-2)、細胞週期蛋白依賴性激酶-4(CDK-4)及細胞分裂週期蛋白(CDC2)之表現量，相較於上述對照組與基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組，該基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組，明顯呈提高狀態，甚至該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧 環境培養組，其CDK-2、CDK-4及CDC2蛋白的表現量呈現相近或高於該基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組之狀況。由此可知，添加本發明之佐劑於常氧環境下培養脂肪間質幹細胞以達到快速增生之效果，係藉由抑制細胞週期蛋白依賴性激酶抑制物：p21及p27蛋白的表現，以提高CDK-2、CDK-4及CDC2蛋白之表現量，進而促進細胞快速複製、分裂，以達快速增生之效果。

4.細胞相對端粒(Telomere)長度分析

在細胞內，染色體結構是由DNA組織成，而「端粒」是染色體末端的DNA重複序列，作用是保護染色體的完整性。染色體在細胞分裂之前會先複製，DNA每次複製，端粒就會縮短一點，當端粒縮短到一定程度時，便無法維持染色體的穩定，細胞最終會走向死亡，所以可以根據端粒的長度來預測細胞的年齡。將包含前述三組不同培養條件以及上述對照組(包含10%胎牛血清之基礎培養基)之四組脂肪間質幹細胞培養14天後，利用已被文獻報導可用來測量細胞相對端粒長度(T/S ratio)的技術方法(Cawthon,2002)，來觀察不同培養條件下，對於脂肪間質幹細胞之端粒的影響。

4.1實驗結果

參第三圖所示，經由上述習知測量細胞相對端粒長度(T/S ratio)的方法，以獲得於前述四組實驗組培養條件下，其細胞端粒之T/S ratio，其中* P<0.05。由結果發現，以該對照組為基準時，該基礎培養基加上FGF-2於低氧環境培養組與該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組相較於該基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組較為提高，且具顯著差異；由此可知，於低 氧環境下培養或添加本發明之佐劑於常氧環境下培養，皆可提高相對端粒長度的比值，進而達到延緩細胞的老化效果。

5.脂肪間質幹細胞於常氧或高氧環境下培養之影響

本實驗係將培養條件分為四組，其分別為：基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組、基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組、基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組及基礎培養基加上本發明之佐劑於高氧環境培養組等，其中高氧環境係指約百分之37.5氧分壓下，而其它培養條件參數(如基礎培養基、培養箱及細胞培養密度)皆與前述「實驗一」之1.內容相同。

5.1脂肪間質幹細胞之細胞生長密度分析

將細胞以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗過一次後，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液於攝氏37度作用5分鐘後再以細胞刮勺小心移除未被作用完全的細胞，加入等比例含胎牛血清之培養基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有細胞數目皆以細胞計數機(Vi-CELL AS,Beckman Coulter)計算。存活的細胞以0.4%台盼藍(Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen)來與死細胞作區別，計算時判定活的間質幹細胞的參數設定為：100 images,Size 10-30微米，75%現場亮度，5%現場區域。結果的呈現以每組實驗數據測量三重複，以平均值±標準差表示之。

5.1.1實驗結果

參第四A圖所示，係脂肪間質幹細胞於不同培養條件下，培養天數與總細胞數之關係，由結果發現，隨著培養天數增加，該基礎培養基加上 本發明之佐劑於常氧環境培養組之細胞數目自第二天後就急速上升，於第五天已達到1.5×106以上的數量，相較該基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組明顯提高且快速；而該基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組織細胞數目則呈現非常緩慢之增加，甚至第七天之細胞總數仍未達2.5×105數量，可知高氧環境對於細胞之增生有著不利的影響；而該基礎培養基加上本發明之佐劑於高氧環境培養組織細胞總數於第二天後相較該基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組呈現快速提高之趨勢，至第六天時，其細胞總數已達到1.0×106以上的數量，相較該基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組織細胞總數明顯提高且快速。由此可知，添加本發明之佐劑於常氧環境下培養可較未添加本發明之佐劑者，其細胞增生速度較為快速且數目多，而該基礎培養基加上本發明之佐劑於高氧環境培養組，雖處於高氧環境下培養，對於細胞增生有不利的影響，但本發明之佐劑確實能減緩因高氧環境對細胞增生造成的不利影響，從而使得部分細胞能繼續維持增生的現象。

5.2.脂肪間質幹細胞於不同培養條件下對p21蛋白及CDK2蛋白表現之影響

脂肪間質幹細胞之培養條件同前述5.中所述分為四組，並利用前述西方點墨法來分析觀察經由不同培養條件培養之脂肪間質幹細胞中，其對於調控細胞週期有關的蛋白(如p21、CDK2)表現的影響，同樣以β-actin蛋白表現量為對照，作為上述各蛋白表現量化為數據之標準化的基準依據。

5.2.1實驗結果

參第四B圖，結果可發現，該基礎培養基加上FGF-2於常氧環境培養組與該基礎培養基加上本發明之佐劑於常氧環境培養組之p21蛋白表現量有減低的現象，而該CDK2蛋白的表現量有增加的現象；而該基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組則因高氧環境使其p21蛋白表現量明顯提高許多，從而抑制掉其CDK2蛋白的表現，對細胞增生產生不利影響；值得注意的是，該基礎培養基加上本發明之佐劑於高氧環境培養組，雖處於高氧環境下培養，但由於添加了本發明之佐劑，所以對p21蛋白表現量相較於該基礎培養基加上FGF-2於高氧環境培養組已有明顯降低的效果，從而使其CDK2蛋白的表現亦明顯提高。因此，再次證實添加本發明之佐劑不論於常氧環境下或高氧環境下，皆能較無添加本發明之佐劑者，明顯提高間質幹細胞之增生速度。

「實驗二」脂肪間質幹細胞於不同血清添加物培養下對細胞增生之影響

本實驗之細胞培養條件分為四組，其分別為：基礎培養基加上10%胎牛血清組、基礎培養基加上10%人類血清組、基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組及基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組等四組；該基礎培養基係IMDM(Iscove`s modified Dulbecco`s medium,GIBCO-Invitrogen)培養基再加入2毫莫爾濃度(mM)左旋麩醯胺酸(L-glutamine,GIBCO-Invitrogen)所組成，而前述本發明之佐劑係包含2毫莫爾濃度(mM)N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC,Sigma)以及0.2毫莫爾濃度(mM)左旋抗壞血酸-2-磷酸鹽(AsA2P,Sigma)。每組幹細胞以每平方公分3000顆細胞(3000 cells/cm2)的細 胞密度培養於6孔細胞培養盤中(6-well plates,Becton Dickinson)，且所有細胞皆培養於攝氏37度、百分之5二氧化碳分壓及百分之95濕度環境下之培養箱(Forma Series II Model 3110,Thermo)中，培養一週並每3天更換一次培養基；藉此觀察7天內不同脂肪間質幹細胞於不同培養條件下，對細胞增生的影響。

1.細胞生長密度分析

將各組幹細胞以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗過一次後，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液於攝氏37度作用5分鐘後再以細胞刮勺小心移除未被作用完全的細胞，加入等比例含胎牛血清之培養基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。所有細胞數目皆以細胞計數機(Vi-CELL AS,Beckman Coulter)計算。存活的細胞以0.4%台盼藍(Trypan-blue,GIBCO-Invitrogen)來與死細胞作區別，計算時判定活的間質幹細胞的參數設定為：100 images,Size 10-30微米，百分之75現場亮度，百分之5現場區域。結果的呈現以每組實驗數據測量三重複，以平均值±標準差表示之。

1.1實驗結果

以上實驗數據經微軟Excel軟體t測試(t-test)統計分析，以p<0.05為顯著水準，並將結果量化為統計圖，其中* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.005。首先，參第五A圖，係脂肪間質幹細胞於不同培養條件下，於顯微鏡下織細胞型態，比例尺為500微米(μm)。觀察中發現，各組織細胞型態頗為類似，皆具有梭狀之細胞型態。參第五B圖，係該基礎培養基加上10%胎牛血清組與該基礎培養基加上10%人類血清組之培養天數與細胞密度關係圖，自培養後四 天起該基礎培養基加上10%人類血清組織細胞密度已較該基礎培養基加上10%胎牛血清組明顯提高約百分之28至百分之74的細胞數目，且具有顯著差異；由此得知，以人類血清做為細胞培養時之血清添加物，可較添加胎牛血清更能使脂肪間質幹細胞快速增生。參第五C圖，係該基礎培養基加上10%人類血清組與該基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組之細胞密度比較圖，由結果發現，該基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組於培養後一天之細胞密度已較該基礎培養基加上10%人類血清組明顯提高約百分之155至百分之324的細胞數目，且具有顯著差異；由此得知，於添加本發明之佐劑培養下，更能提高脂肪間質幹細胞增生之速度，以於相同培養天數下，獲取更為大量之細胞數目。再參第五D圖，係該基礎培養基加上10%人類血清組與該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組之比較，由結果發現，雖該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組只有2%人類血清，但藉由添加本發明之佐劑培養後，仍可使脂肪間質幹細胞於前五天的培養下，細胞增生之速度仍與該基礎培養基加上10%人類血清組相近似；由此得知，本發明之佐劑的添加，不僅可減少人類血清的使用量，同時亦能保有促進脂肪間質幹細胞快速增生之功效。

2.典型間葉幹細胞之細胞表面抗原分析

本實驗係以流式細胞儀(FACSCalibur,Becton Dickinson)進行細胞表面抗原之測定。將分別培養於前述四組不同培養條件下之脂肪間質幹細胞去附著並以磷酸緩衝液清洗後，回溶於適量之磷酸緩衝液中，分別對不同的抗 原以相對應的免疫螢光一級抗體進行染色，包括CD13、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、β 2微球蛋白(B2M)以及HLA-DR等抗體(Becton Dickinson)。避光於室溫下染色15分鐘後，加入適量磷酸緩衝液後上機分析，經流式細胞儀收集數據後，以流式細胞儀分析軟體(FACSCalibur,Becton Dickinson)進行分析。其中負控制組係為省略上述一級抗體之染色步驟者。

2.1實驗結果

參第六A圖，由結果可以發現前述四組不同培養條件下之脂肪間質幹細胞，其細胞族群為CD13+、CD34-、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+，為類似間質幹細胞的細胞族群，亦即表示說，前述四組不同培養條件下之脂肪間質幹細胞仍保有類似間質幹細胞的表面抗原特徵。其中，有添加人類血清的三組實驗，其CD44及CD73的表現量係高於該基礎培養基加上10%胎牛血清組，此結果亦說明有添加人類血清培養的三組實驗，其保有類似間質幹細胞的表面抗原特徵的效果較添加胎牛血清培養的效果來得更好。

3.幹細胞基因表現分析

本實驗將分別培養於前述四組不同培養條件下所得之脂肪間質幹細胞，以即時聚合酶鏈鎖反應儀(Real-Time PCR System)來分析未分化幹細胞之相關基因的表現。將培養出之細胞以磷酸緩衝液清洗後，收集在1.5ml eppendorf中，加入1ml TriZol(10296-010,Invitrogen)試劑，於室溫放置五分鐘，加入100μl BCP(BP.151,MRC)溶液，以Vortex混勻至成粉紅色溶液後，室溫放置15分鐘，再以15,000g離心15分鐘在4℃。離心完後，eppendorf內會分三 層，下層是紅色層，中間一層薄薄的白色層，上層是透明層，將上層吸出放入新的1.5毫升離心管(eppendorf)中，吸取過程中要小心不要吸到另外兩層。於新的離心管中加入0.5毫升異丙醇(isopropanol)，搖勻後，室溫放置30分鐘，之後再以15,000g離心10分鐘在4℃，將上清液抽出，不要吸到團塊(pellet)，加入1毫升75%酒精(ethanol)清洗，再以15,000g離心10分鐘在4℃，抽掉酒精後，空氣乾燥10分鐘，以含有抑制RNase(DEPC)的水回溶後即完成RNA萃取。吸取約10微克(μg)RNA，加入反轉錄試劑組(RT-for-PCR kit,Clontech)，以聚合酶連鎖反應器(PCR machine)完成反轉錄後加入聚合酶(GoTaq Green Master Mix,M7122,Promega)進行聚合酶鏈鎖反應，P其反應之設定條件因不同引子(Primer)之不同Tm值而略有調整。分析跟幹細胞相關未分化之相關基因，像是Nanog,SOX2,CXCR4,TERT等，本實驗分析Nanog,SOX2,CXCR4,TERT和控制組β-actin基因。分析各基因所使用之引子如下表所列：

3.1實驗結果

參第六B圖，經由結果我們發現，有添加人類血清的三組實驗(10%人類血清、10%人類血清+佐劑、2%人類血清+佐劑)，其幹細胞基因(Nanog,SOX2,CXCR4,TERT)之表現皆明顯高於該基礎培養基加上10%胎牛血清組，且同樣可以觀察到，該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組雖只有2%人類血清，但藉由添加本發明之佐劑培養後，其仍可如添加10%人類血清培養般，保持上述幹細胞基因的表現，因此可知，添加本發明之佐劑進行細胞培養，確實可減少人類血清的使用量。

4.脂肪間質幹細胞之分化

文獻報導指出，脂肪間質幹細胞具有分化成中胚層細胞的能力，像是脂肪和骨頭細胞。本實驗同如「實驗二」將脂肪間質幹細胞經四組不同培養條件下培養六天後，將其誘導分化成硬骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞，以確認經上述四組不同培養條件下培養六天後，是否仍具有幹細胞多功能性分化能力。本發明中的誘導分化實驗係依據習知文獻中已被普遍使用的幹細胞誘導分化系統(Kanda et al.,2011；Song et al.,2010)，因非本案訴求重點因此不予贅述，其主要目的係於確認本發明中經上述四組不同培養條件下培養後，是否仍具有幹細胞多功能性分化能力。

4.1細胞之化學染色及分子標記分析

分化之硬骨細胞以鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)進行染色，該鹼性磷酸酶為成熟骨母細胞分化的重要指標，而其染色方法係依照習 知染色技術進行(Yoshimura et al.,2011)，在此不再贅述；另再進行一習知的Von-kossa染色，以確認有磷酸鈣之存在。分化之軟骨細胞係以阿爾辛藍染色法(Alcian blue)來確認軟骨組織中擁有的蛋白多醣(Proteoglycan)之存在(Song et al.,2010)。分化之脂肪細胞以油紅O染色(Oil red O staining)，以確認是否有脂質空泡(Lipid vacuoles)的存在(Kanda et al.,2011)。另本實驗針對硬骨細胞所擁有之分子標記[核結合因子(cbfa1)、骨鈣蛋白(Osteocalcin,OC)及第一型膠原蛋白(COL IA1)等基因]、軟骨細胞所擁有之分子標記[軟骨聚醣蛋白(ACAN)、第二型膠原蛋白(COL IIA1)等基因]以及脂肪細胞之脂肪合成相關基因[過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、脂肪結合蛋白(aP2)]的表現，並以β-actin基因為控制組，進行即時聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)來分析其相對表現量。分析各基因所使用之引子如下表所列：

4.2實驗結果

參第七A圖，係鹼性磷酸酶染色結果，比例尺為500微米(μm)，脂肪間質幹細胞於前述四組不同培養條件下，經誘導分化為硬骨細胞，經鹼性磷酸酶染色後，皆有呈現黑色結晶的部分，亦即代表鹼性磷酸酶的存在，更說明了該四組，皆能使脂肪間質幹細胞保有幹細胞分化之能力；續參第七B圖，係馮庫薩(Von-kossa)染色結果，比例尺為500微米(μm)，可發現前述四組皆呈現有黑色或茶褐色的磷酸鈣結晶，再次說明了該四組，皆能使脂肪間質幹細胞保有幹細胞分化之能力；再參第七C圖，係硬骨細胞之分子標誌表現分析結果，可發現在骨鈣蛋白(OC)相對表現量中，該基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組與該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組等二組，其 硬骨細胞之分子標誌表現皆比該基礎培養基加上10%胎牛血清組與該基礎培養基加上10%人類血清組明顯提高，其中* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.005；尤其該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組，其cbfa1、OC及COL IA1三者相對表現量更是明顯高於該基礎培養基加上10%胎牛血清組。由此可知，添加本發明之佐劑加上人類血清進行脂肪間質幹細胞培養，能保有幹細胞原來的分化能力，且經誘導分化為硬骨細胞之效果更佳。

請參第八A圖，係阿爾辛藍染色結果，比例尺為500微米(μm)，可發現前述四組皆呈現出藍色的蛋白多醣染色結果，尤其是該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組的藍色蛋白多醣染色區域遠超過其他三組。續參第八B圖，係軟骨細胞之分子標記表現分析，可發現該基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組與該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組在ACAN及COL IIA1等基因之相對表現量上，皆明顯高於該基礎培養基加上10%胎牛血清組與該基礎培養基加上10%人類血清組，其中* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.005；尤其該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組，其軟骨細胞之分子標誌表現更是明顯提高許多。由此可知，添加本發明之佐劑加上人類血清進行脂肪間質幹細胞培養，能保有幹細胞原來的分化能力，且經誘導分化為軟骨細胞之效果更佳。再參第八C圖，係油紅O染色結果，比例尺為500微米(μm)，可發現前述四組皆呈現出紅色的脂質空泡染色結果。續參第八D圖，係脂肪合成相關基因PPAR γ及aP2之相對表現量，其中* P<0.05,** P<0.01。可發現該基礎培養基加上10%人類血清加上本發明之佐劑組，其 PPAR γ及aP2之相對表現量較該基礎培養基加上10%胎牛血清組與該基礎培養基加上10%人類血清組明顯提高。由此可知，添加本發明之佐劑加上人類血清進行脂肪間質幹細胞培養，能保有幹細胞原來的分化能力，且經誘導分化為脂肪細胞之效果較佳。

5.細胞因子陣列分析與相對基因表現分析

本分析實驗係於脂肪間質幹細胞之三種狀態(10%人類血清培養前、10%人類血清培養及10%人類血清加上佐劑培養)下，分別取其培養基上清液利用市售包含41種人類細胞因子陣列分析套組(Cat #AAH-GF-1,RayBiotech,Norcross,GA)進行分析，以觀察脂肪間質幹細胞於前述三種狀態下，對其分泌細胞因子及生長因子的影響；前述陣列分析套組之分析方法非本案訴求重點因此不予贅述，其詳細內容可參RayBiotech公司所提供Cat #AAH-GF-1之說明書。另本實驗亦將上述經四組不同培養條件下培養後之脂肪間質幹細胞以如「實驗二」之3.的分析方法針對特定生長因子如類胰島素生長因子(IGF-1)、肝細胞生長因子(HGF)及表皮生長因子(EGF)等基因，以β-actin基因為控制組，進行即時聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)來分析其相對表現量。分析各基因所使用之引子如下表所列：

此外，本實驗亦針對脂肪間質幹細胞在下列三種培養條件如：基礎培養基加上10%胎牛血清組、基礎培養基加上10%胎牛血清(5%氧分壓之低氧環境)組以及基礎培養基加上10%胎牛血清加上本發明之佐劑組等三組培養下，分別取其培養基上清液進行人類細胞因子陣列分析(Cat #AAH-GF-1,RayBiotech,Norcross,GA)，以觀察對脂肪間質幹細胞分泌細胞因子及生長因子的影響。

5.1實驗結果

一併參第九A圖及第九B圖，係細胞因子陣列分析結果與細胞因子陣列分析結果比較示意圖，其中POS表示正控制組，NEG表示負控制組，* P<0.05,*wP<0.01,*** P<0.005。由結果比較可發現，脂肪間質幹細胞於添加本發明之佐劑培養後，於條件培養基中分泌有如下細胞因子及生長因子：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF R α、PDGF-R β、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF- β 3、VEGF、VEGF R2。其中第九B圖所示10%人類血清培養前與10%人類血清培養之比較圖中呈向左下斜線的區塊如：第二型纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)，血小板衍生生長因子(PDGF-AA、AB、BB)和血管內皮生長因子(VEGF R3)等，是呈現被細胞吸收利用的情形；而圖中呈向右下斜線的區塊如：肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP-1、IGFBP-4、IGFBP-6)、類胰島素生長因子1(IGF-1)，血管內皮生長因子(VEGF)等，是呈現由細胞分泌至培養基中的情形。再參第九C圖及第九D圖，係前述10%人類血清培養及10%人類血清加上佐劑培養結果比較的量化示意圖，可發現血小板衍生生長因子(PDGF-AA、AB、BB)是持續呈現被細胞吸收利用的情形，而肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP-1)及血管內皮生長因子(VEGF)則不僅是持續呈現由細胞分泌至培養基中的情形，而且經10%人類血清加上佐劑培養的結果明顯提高。由此可知，藉由添加本發明之佐劑加上人類血清進行脂肪間質幹細胞培養，具有提高某些生長因子如HGF、IGFBP-1及VEGF的分泌產生效果。

續參第九E圖，係脂肪間質幹細胞經四組不同培養條件下培養後，其生長因子IGF-1、HGF及EGF的相對表現量結果，其中* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.005。由結果得知，有添加人類血清培養的三組(10%人類血清、10%人類血清+佐劑、2%人類血清+佐劑)其IGF-1、HGF及EGF的相對表現量皆較該基礎培養基加上10%胎牛血清組明顯提高，尤其以該基礎培養基加上2%人類血清加上本發明之佐劑組的相對表現量最高。由此可知，添加本發明之佐 劑加上人類血清進行脂肪間質幹細胞培養後，可提高生長因子如IGF-1、HGF及EGF的相對表現量。

再請一併參閱第九F圖及第九G圖，係細胞因子陣列分析結果圖及上述細胞因子陣列分析結果比較圖，其中第九G圖中，各細胞因子區塊中若顯示有中央空白圓形圖樣者，代表該基礎培養基加上10%胎牛血清組之脂肪間質幹細胞有分泌此細胞因子；同理，若顯示有全黑圓形圖樣者，代表該基礎培養基加上10%胎牛血清(5%氧分壓之低氧環境)組之脂肪間質幹細胞有分泌此細胞因子；而顯示有斜線圓形圖樣者，代表該基礎培養基加上10%胎牛血清加上本發明之佐劑組之脂肪間質幹細胞有分泌此細胞因子或生長因子。由第九G圖可發現，脂肪間質幹細胞培養於條件下，即會分泌bFGF、EGF、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-6、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、NT-4、PDGF R β、PIGF、TGF-β 3、VEGF等細胞因子或生長因子。值得注意的是，雖該基礎培養基加上10%胎牛血清(5%氧分壓之低氧環境)組以及基礎培養基加上10%胎牛血清加上本發明之佐劑組都可以多增加脂肪間質幹細胞分泌的細胞激素種類，但是該基礎培養基加上10%胎牛血清加上本發明之佐劑組所增加的種類及量皆更多，例如β-NGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、IGFBP-3、IGFBP-4、IGF-I、IGF-I SR、GCSF、GDNF、GM-CSF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、SCF、VEGF R2、VEGF R3、VEGF-D等細胞因子或生長因子。由此可知，添加本發明之佐劑進行脂肪間質幹細胞的培養可較於低氧環境培養下，更增加脂肪間質幹細胞所分泌之細胞因子或生長因子的種類及量。

綜合上述結果說明了脂肪間質幹細胞不論是培養於添加本發明之佐劑加上人類血清之基礎培養基或是僅添加本發明之佐劑於含10%胎牛血清之基礎培養基下，不僅皆可達到快速增生之效果，同時亦能獲取脂肪間質幹細胞培養期間所大量分泌之生長因子，其中又以培養於添加本發明之佐劑加上人類血清之基礎培養基條件下為最佳培養條件；藉此以作為後續用於製備促傷口癒合藥物及用於製備促傷口癒合藥物之用途，或是做為製備皮膚保養品及用於製備皮膚保養品之用途。

「實驗三」脂肪間質幹細胞微載體培養

在體外培養的人類間質幹細胞多以貼附式(Anchorage-dependent cells)的培養方式進行，所以使用一種符合貼附式的培養系統來產生大量且品質一致的細胞對於再生醫學與組織工程的應用上是需要的。本實驗利用攪拌式微載體培養反應器(Spinner Flasks,Bellco Glass,Inc.,Vineland,NJ,USA)進行脂肪間質幹細胞培養。接種細胞入反應器前，先將前述培養反應器內部表面以矽膠(Sigmacote,Sigma,St.Louis,MO,USA)處理過；而所使用的微載體(CultiSpher-G；HyClone,Logan,UT,USA)則依照操作手冊上的步驟依序秤重、加入水合之，以及使用滅菌釜15分鐘121℃處理；於混入細胞前先移除多餘磷酸鹽緩衝溶液，再加入欲培養細胞細胞之培養液使之平衡約24小時。將脂肪間質幹細胞加入含有預先平衡培養液及微載體共約50毫升之攪拌式培養反應器中，最初以間歇式的方式開啟外加式電磁攪拌系統，以每次25 r.p.m 30分鐘後休息10至20分鐘的頻率轉動2小時；於前述2小時後以25 r.p.m的轉速開始培 養，並每3天更換一次陪養液，每次更換約百分之50至70之培養液，並於更換前先停止攪拌約5分鐘，使細胞與微載體可以落至反應器底部。其中微載體培養過程在37℃、濕度95%及5%二氧化碳分壓的環境下培養7天，而前述培養基係包含IMDM再加入10%人類血清、2毫莫爾濃度(mM)左旋麩醯胺酸以及本發明之佐劑所組成；而前述佐劑包含10ng/mL FGF-2、2毫莫爾濃度N-乙醯基-L-半胱氨酸以及0.2毫莫爾濃度左旋抗壞血酸-2-磷酸鹽。

為觀察細胞在微載體上生長與分布情形，每天取出1毫升含有微載體的細胞液，並離心移除培養基且以磷酸緩衝溶液清洗一次；續以百分之十福馬林固定液於室溫固定10分鐘後，移除固定液並以磷酸緩衝溶液清洗；再以5毫克/毫升綠色螢光雙乙酸鈉(FDA)與2毫克/毫升碘化丙啶(PI)分別染活細胞與死細胞，於室溫避光5分鐘後，將染劑移除並以磷酸緩衝溶液清洗三次，再將細胞與微載體平均分布於玻片上，使用螢光顯微鏡觀察。

實驗結果

請參第十A圖與第十B圖，係脂肪間質幹細胞培養於微載體7天，於光學顯微鏡下影像以及螢光顯微鏡下之影像，其中綠色螢光代表活細胞，紅色螢光代表死細胞。由第十B圖之影像觀察得知，脂肪間質幹細胞較易貼附於微載體，並形成微組織狀態。藉此可知，將脂肪間質幹細胞培養於一生物相容性材料，如微載體，可以形成微組織狀態，以作為後續再生醫學或組織工程之用途。

綜合上述實驗結果可知，將本發明之人類間質幹細胞體外快速 增生佐劑加入包含人類間質幹細胞之培養基中，於常氧環境(約21%氧分壓)培養後，可如同於低氧環境(約5%氧分壓)下培養般出現細胞快速分裂、細胞週期合成期(S phase)比例提高、減少老化及提高分化潛能等現象，且搭配使用人類血清取代胎牛血清進行培養時，其細胞增生速度更佳，且細胞分泌之生長因子量提高、種類增加，使本發明不僅可快速和有效率地擴增人類間質幹細胞，且仍可保有幹細胞多功能性之特徵，用以達成人類間質幹細胞之快速擴增及獲取生長因子之功效。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (20)

1. 一種體外快速擴增人類間質幹細胞之方法，包括將人類間質幹細胞體外快速增生佐劑加入包含人類血清及人類間質幹細胞之培養基中，其中，該人類間質幹細胞體外快速增生佐劑包括至少一種抗氧化劑以及一第二型纖維母細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,FGF-2)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該人類間質幹細胞體係選自：脂肪間質幹細胞、骨髓間質幹細胞或臍帶間質幹細胞所構成群組之一。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗氧化劑係包括一長效型抗壞血酸衍生物(Long-acting ascorbic acid derivative)及一N-乙醯基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)之組合。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該長效型抗壞血酸衍生物係一L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(L-ascorbic acid-2-phosphate,AsA2P)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二型纖維母細胞生長因子的濃度為1至20毫微克/毫升。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該人類間質幹細胞體外快速增生佐劑係藉由抑制該人類間質幹細胞之細胞內細胞週期蛋白依賴性激酶抑制物p15、p21及p27蛋白之表現，用以提高細胞週期蛋白依賴性激酶-2(CDK-2)、細胞週期蛋白依賴性激酶-4(CDK-4)及細胞分裂週期蛋白(CDC2)之表現。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該人類血清的體積百分濃度為百分之2至百分之10。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項所述之方法，更包括一冷凍保存該快速擴增之人類間質幹細胞之步驟。
9. 如申請專利範圍第1項至第7項所述之方法，更包括執行一萃取步驟以獲得一人類間質幹細胞之細胞萃取物。
10. 如申請專利範圍第1項至第7項所述之方法，係進一步執行一誘導分化步驟，以獲取一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。
11. 一種細胞庫，其包含由如申請專利範圍第8項所述之方法所冷凍保存之擴增之人類間質幹細胞。
12. 一種醫藥組合物，其包含由如申請專利範圍第1項至第7項所述之方法所獲取實質未分化之一人類間質幹細胞或由如申請專利範圍第10項所述之方法所獲取之一自前述人類間質幹細胞所分化的細胞。
13. 如專利範圍第12項之醫藥組合物，其中自前述人類間質幹細胞所分化的細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞之一。
14. 一種體外快速擴增人類間質幹細胞以獲取生長因子之方法，經如申請專利範圍第1項至第7項之方法培養後，以於前述培養基中獲取一生長因子。
15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述生長因子係包括：FGF-2、EGF、FGF-4、FGF-6、FGF-7、HB-EGF、HGF、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFPB-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I SR、IGF-II、M-CSF、M-CSF R、PDGF R α、PDGF-R β、PDAF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PIGF、SCF、TGF-β 3、VEGF、VEGF R2。
16. 一種生長因子，係根據申請專利範圍第14項之方法所獲得。
17. 一種醫藥組合物，包含有如申請專利範圍第16項所述之生長因子。
18. 如申請專利範圍第17項所述之醫藥組合物，進一步結合一生物相容性材料以應用於再生醫學或組織工程。
19. 一種包含有如申請專利範圍第16項所述之生長因子在製備促傷口癒合之藥物的用途。
20. 一種包含有如申請專利範圍第16項所述之生長因子作為皮膚保養品之用途。