CN104130975B - 人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的方法，所述方法包括：利用wnt通路抑制剂，例如DKK1预孵育人源脂肪干细胞；诱导经预孵育的人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化；和利用神经营养因子，例如BDNF、NGF和NT3促进所得的神经元样细胞成熟。本发明方法得到的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞高度成熟，能够表达成熟的神经元标记物以及离子通道，还可观察到复杂的突触结构，从而可用于治疗神经退行性疾病和神经损伤性疾病以及制备相应的药物。

Description

人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细 胞(Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)来源的神经元样细胞(neuron-like cell，NLC)及其制备方法和在预防或治疗神经退行性疾病中的应用。

背景技术

胚胎干细胞(ESC)因其特有的自我更新和分化全能性而成为治疗各种变性 类疾病的提供充足的细胞来源。但同时，ESC的这些特性，也成为其在临床治 疗中的主要困难。已有报道，尽管即便移植经过预分化或预分选的ESC来源的 细胞，也仍有肿瘤形成。这为ESC来源的细胞在人类中应用提出了安全性的担 忧。此外，应用胚胎干细胞在伦理上也极具争议。

目前，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾很好的 细胞来源，如脊髓损伤、脑卒中等。

人源脂肪干细胞(hADSC)易于取材，对病人损伤性小，脂肪组织足够多， 体外扩增快，生物安全性高，无免疫排斥等，已成为最有前景的细胞来源之一。 Zuk等人首先发现，由人体抽脂得来的脂肪干细胞具有向脂肪细胞，成骨细胞， 软骨细胞和肌纤维细胞分化的潜能(Zuk,P.A,et al.,Tissue Eng7,211,2001)。此 外，Gronthos等人也证实hADSC表达类似人源骨髓间充质干细胞(hBMSC)的CD 表面标志物(Gronthos,S.,et al.,J CellPhysiol189,54,2001)，提示hADSC是 hBMSC的一种替代物(Zhu,Y.,et al.,Cell BiochemFunct26,664,2008)。因此， hADSCs向脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞多系谱分化为人类疾病提供了一个 新的解决办法(Denker,A.E.,et al.,Differentiation59,25,1995；Sanchez-Ramos, J.,et al.,Exp Neurol164,247,2000)。在过去5年，hADSC向神经元细胞分化引 起了转化医学科学家和临床医生的广大关注，原因在于其在帕金森、阿尔茨海 默病等神经退行性疾病的临床应用中具有巨大潜力。

然而，之前的研究更多涉及hADSC或hBMSC体外神经元分化的评价和机 制，而较少考虑临床转化应用。而由于胚胎干细胞本身具有强大的增殖能力和 分化潜能，目前应用于胚胎干细胞的方法无法应用于脂肪干细胞。此外，现有 技术中hADSC诱导所用的诱导剂往往对人体有毒性，分化后获得的神经元样细 胞存活率低，同时分化得到的神经元样细胞也存在成熟度不高，例如不表达标 志神经元成熟的一些神经元标记物，如NeuN、Synapsin和vGAT，分化效率低， 均一性差和稳定性低等等缺陷，从而阻碍了其进一步的临床应用。

综上所述，本领域急需能将hADSC诱导分化成高度成熟的神经元样细胞的 方法以及由此得到的神经元样细胞群，从而能进一步应用于临床。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能将hADSC诱导分化成高度成熟的神经元样 细胞的方法以及由此得到的神经元样细胞群。

在第一方面，本发明提供一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的神经元 样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

1)诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化；和

2)利用神经营养因子促进1)所得的神经元样细胞成熟。

在一优选例中，所述神经营养因子选自下组：BDNF、NGF、NT3、CNTF、 GDNF或IGF。

在另一优选例中，所述神经营养因子是BDNF、NGF或NT3；更优选BDNF、 NGF和NT3的组合。

在另一优选例中，在1)诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化之前，还 利用wnt通路抑制剂对人源脂肪干细胞作预孵育。

在另一优选例中，所述wnt通路抑制剂选自：Dkk家族、分泌型卷曲相关蛋白。

在另一优选例中，Dkk家族选自：DKK-1/DKK1、DKK-2/DKK2、或DKK-3 /DKK3；分泌型卷曲相关蛋白选自：SFRP1、SFRP3或SFRP5。

在另一优选例中，所述wnt通路抑制剂是DKK1。

在另一优选例中，步骤1)的处理时间为2-4天，优选3天。

在另一优选例中，步骤2)的处理时间为2-4天，优选3天。

在另一优选例中，所述预孵育时间为12-36小时，优选24小时。

在第二方面，本发明提供一种人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群，所 述细胞群具有选自下组的任一或多种特征：

(1)有50%以上，优选60%以上，最优选80%以上的细胞表达神经元标记物；

(2)有40%以上，优选50%以上，最优选60%以上的细胞可观察到复杂的突 触结构

(3)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达离子通道蛋白， 具备神经电生理特性

在一优选例中，所述离子通道蛋白包括但不限于钠、钾和钙离子通道。

在另一优选例中，所述细胞群采用权利要求1-4中任一项所述的方法制备。

在另一优选例中，所述神经元标记物选自NeuN、Synapsin或vGAT。

在第三方面，本发明提供本发明第二方面的人源脂肪干细胞来源的神经元样 细胞群的用途，所述神经元样细胞群用于制备治疗神经退行性疾病或神经损伤 性疾病药物。

在一优选例中，所述神经退行性疾病选自：帕金森病、阿尔茨海默病、肌 肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、 亨廷顿病、小脑萎缩症、多发性硬化症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症； 和

所述神经损伤性疾病选自脊髓损伤、脑卒中或新生儿缺氧缺血脑病。

在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(1)有效量的如权利要求5或6所述的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞 群；和

(2)药学上可接受的载体。

在第五方面，本发明提供一种预防和/或治疗神经退行性疾病或神经损伤性 疾病的方法，所述方法包括给需要的对象施用本发明第二方面的人源脂肪干细 胞来源的神经元样细胞群、或本发明第三方面的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示通过细胞形态和CD表面标记物表征hADSC。hADSC显示涡旋式生 长并具有纺锤体形态。(A)显示超过85%的第三代hADSC表达CD29、CD44和 CD105，不到5%的hADSC表达CD45；第三代hADSC涂布在塑料培养皿上补充 了10%FBS的DMEM/F12培养基中，(B)显示了白色视野(WF)下取像，苏木精和 伊红(HE)染色来观察hADSC形态和核；(C)显示了通过取至少5个显微镜视野的 平均值来定量测定细胞的CD阳性率。基准尺=100um。

图2显示了人ADSC的多分化潜能。A.通过ES细胞标记物Sox2、Oct4、c-Myc 和Nanog染色人ADSC。B.ES细胞标记物阳性染色的人ADSC百分比。C.RT-PCR 证明人ADSC表达ES细胞基因标记物。D和E，“未处理(untreated)”表示hADSC 在普通培养基中培养，随后用相应的分化标记物进行平行染色。每2天更换培 养基。取至少5个显微镜视野的平均值来收集三系分化的阳性率。基准尺=100 um。图中：Actin：肌动蛋白；Untreated：未处理；Adipocyte：脂肪细胞；Osteoblast： 成骨细胞；Chondrocyte：软骨细胞。

图3显示了hADSC分化成神经元样细胞(hADSC-NLC)。A.亮视野图像显示 了从第0天(D0)到第6天(D6)的hADSC-NLC形态；B.不作任何处理，hADSC表 达Tuj1和MAP2，不表达NeuN、Synapsin1/2和vGAT；C，用神经元混合培养基 孵育3天后，大多数hADSC-NLC表达Tuj1、MAP2，但不表达Synapsin1/2；D， 用补充了神经营养因子的混合培养基再孵育3天后，大多数细胞开始表达成熟 神经元标记物，NeuN、Synapsin1/2和vGAT；E和F，qRT-PCR数据证明与未处 理的细胞相比，神经元标记物，例如NFL、NFM以及离子通道相关标记物，例 如MaxiK、Kv4.2、NE-Na和CACNA1G在第6天均上调。A的基准尺=25um， C-D的基准尺=50um。图中：Factor：因子；Merged：合并；Enlarged：放大。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过用wnt途径抑制剂预 处理hADSC，然后将其诱导分化为神经元样细胞(NLC)，最后利用神经营养因 子后处理分化的细胞可以得到高度成熟的神经元样细胞(hADSC-NLC)，该细胞 表达成熟而且有功能的神经元标记物并且可以观察到复杂的突触结构，从而可 应用于临床。在此基础上完成了本发明。

神经退行性疾病

神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是大脑和脊髓的细胞神经元 丧失的疾病状态。大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运 动，处理感觉信息，并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般不会再生，所以过度 的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的 丧失所致，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍。神经退行性疾病按表型 分为两组：一类影响运动，如小脑共济失调；一类影响记忆以及相关的痴呆症， 如阿尔茨海默病。

人源脂肪干细胞

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSC)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞， 可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够 在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细 胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大， 适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

近年来，多潜能人源脂肪干细胞(hADSC)已成为治疗人类一些严重疾病， 如脊髓损伤、脑卒中等的很好的细胞来源。

本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞

本发明的“人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞”是指通过诱导人源脂肪 干细胞(hADSC)分化得到的神经元样细胞。

对体内分离得到的hADSC进行免疫荧光染色，发现其可表达间充质干细胞 表面标记物CD29、CD44、和CD105，同时在mRNA水平和蛋白水平都可表达干 细胞标志物Sox-2、Oct-4、c-Myc、Nanog和Klf-4。而且hADSC向脂肪细胞、成 骨细胞和软骨细胞三种系谱分化已经证实了其多向分化潜能的性质。此外本发 明还发现，在体外，hADSCs向神经细胞分化，并通过Tuj1、MAP2、NeuN和Synapsin免疫染色证实。除此之外，hADSC-NLC在塑料培养皿上培养后与未分 化的hADSC相比，均高表达神经元和离子通道相关的蛋白标志物。表明体内移 植hADSC，为神经退行性疾病的治疗应用提供了一个很好的前景。

本发明所用的“人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群”是指本发明方法 所得的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的群体，而非指单个神经元样细 胞。

在本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群中，

有50%以上，优选60%以上，最优选80%以上的细胞表达神经元标记物： NeuN、Synapsin和vGAT；

有40%以上，优选50%以上，最优选60%以上的细胞可观察到复杂的突触 结构；

有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达离子通道蛋白， 具备神经电生理特性，所述离子通道蛋白包括但不限于钠、钾和钙离子通道。

鉴于现有知识，本领域技术人员还应知道，表达神经元标记物、复杂的突 触结构和表达离子通道不是在同一水平上表征神经元样细胞成熟程度的特征， 它们标志着神经元样细胞的成熟程度逐渐升高，即，表达神经元标记物表示神 经元样细胞成熟，可观察到突触结构表示该神经元样细胞进一步成熟，而表达 离子通道蛋白，具备电生理特性，则表示该神经元样细胞高度成熟。

制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的方法

现有技术得到的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的成熟度不高，发明 人经过研究，开发了一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞 的方法，所述方法包括：

1)诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化；和

2)利用神经营养因子促进1)所得的神经元样细胞成熟。

在优选的实施方式中，所述神经营养因子选自下组：BDNF、NGF、NT3、 CNTF、GDNF或IGF。

在优选的实施方式中，所述神经营养因子是BDNF、NGF或NT3；更优选 BDNF、NGF和NT3的组合。

本发明方法得到的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞(hADSC-NLC)成熟 度高，表达成熟且有功能的神经元标记物：例如NeuN、Synapsin和vGAT；本 发明的hADSC-NLC可观察到复杂的突触结构；本发明的hADSC-NLC可表达离 子通道。

鉴于现有技术的教导，本领域技术人员可以利用任何已知的诱导培养基诱 导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化，例如但不限于Safford,K.M等 (Biochem Biophys ResCommun294,371,2002)描述的混合培养基。

发明人还发现，在1)诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化之前，利用 wnt通路抑制剂对人源脂肪干细胞作预孵育能够进一步提高人源脂肪干细胞来源 的神经元样细胞的分化效率(达到80%以上)及其均一性和稳定性。

在具体的实施方式中，所述wnt通路抑制剂包括但不限于：Dkk家族、分泌型 卷曲相关蛋白。

在优选的实施方式中，所述Dkk家族选自：DKK-1/DKK1、DKK-2/DKK2、 或DKK-3/DKK3；所述分泌型卷曲相关蛋白选自：SFRP1、SFRP3或SFRP5。

在进一步优选的实施方式中，所述wnt通路抑制剂是DKK1。

在优选的实施方式中，步骤1)的处理时间为2-4天，优选3天。

在优选的实施方式中，步骤2)的处理时间为2-4天，优选3天。

在优选的实施方式中，所述预孵育时间为12-36小时，优选24小时。

本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群的用途

本领域技术人员鉴于本发明的教导可以明白，本发明所得的hADSC-NLC 可用于治疗神经退行性疾病，包括但不限于：帕金森病、阿尔茨海默病、肌肉 萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨 廷顿病、小脑萎缩症、多发性硬化症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症等等。

鉴于本发明的教导和现有技术的知识，本领域技术人员还应明白，本发明 所得的hADSC-NLC还可用于治疗神经损伤性疾病，例如脊髓损伤、脑卒中或新 生儿缺氧缺血脑病等。

药物组合物及其应用

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的本发明人源脂肪干细胞 来源的神经元样细胞，以及药学上可接受的载体。

通常，可将本发明人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞配制于无毒的、惰 性的和药学上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8， 较佳地，pH约为7-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或 活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度 不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。 术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释 剂。

本发明的药物组合物含有的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄 糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明 的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂 的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活 性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的有效量可随给药的模式 和待治疗疾病的严重程度等具体选择。例如，可以由本领域普通技术人员根据 各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药代动 力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、 患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂与及静脉注射试剂同时使用。在 另一优选例中，所述皮下注射试剂的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的浓 度为10⁷个/ml，较佳地为10⁸个/ml，更佳地为10⁹个/ml。

在本发明中，给所需要的对象施用人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的 施用部位是在所述对象的损伤区作原位注射或者进行静脉注射。

本发明的主要优点包括：

1.本发明开发了一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的神经元样细 胞的方法，从而能得到成熟程度高于现有技术所得的人源脂肪干细胞来源的神 经元样细胞；

2.本发明方法操作简便易行；

3.本发明的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的成熟度更高，从而更易 用于临床治疗神经退行性疾病和损伤性疾病；和

4.本发明方法促使人源脂肪干细胞的分化效率更高，所得神经元样细胞的 也具备更高的均一性和稳定性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的 条件。

实施例

材料与方法

hADSC的分离

根据已发表的文献分离hADSC(Zuk,P.A,et al.,Tissue Eng7,211,2001；和Gronthos,S.,et al.,J Cell Physiol189,54,2001)。将临床抽脂手术获得的新鲜脂 肪悬浮液用乳酸林格液(LR)溶液冲洗，去除受污染的碎片和红细胞。然后用无 菌手术剪剪碎组织，加入0.075%的Ⅰ型胶原酶(Roche Diagnostics,Japan)，37℃ 恒温水浴消化40分钟，并在消化过程中摇动。消化后用100um的尼龙网过滤， 去除细胞碎片，收集到新的管子里。然后用含10%血清的培养基中和胶原酶。 之后取400克在室温下离心5分钟,然后将细胞悬浮在培养基中，将此铺到培养 皿，置于37℃、含5%CO₂湿度饱和的培养箱。培养24小时后，用PBS冲洗去除 残存的未贴壁的红细胞。为了使hADSC扩增，加入含20%血清(JRHBioscience, USA)、100单位青霉素和100mg/ml链霉素(Invitrogen,Japan)的 DMEM/F12(Invitrogen,Japan)培养基，接种在T-75flasks(Falcon,Becton Dickinson,Japan)，浓度为6×10⁴个细胞/cm²，置于37℃、含5%CO₂湿度饱和的 培养箱中培养

提取RNA和qRT-PCR

按照Qiagen RNeasy Mini Kit(#74104)的标准操作指南从～10⁶个hADSCs、 胚胎干细胞(ESCs)和hADSC-NLCs中提取总的RNA。只有当OD260/280值高于 1.8时，提取的RNA才有效。用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit(#K1621)反转录以上提取的总RNA。RT-PCR包括在70℃加热5分钟 使反应终止，之后在42℃放置60分钟。这些引物应用于用引物设计软件设计5 种干细胞转录因子。顺序在表1中列出。半定量RT-PCR使用上述准备的第一股 cDNA作为模板，根据下列步骤进行：模板500～1000ng，引物1μL，2×Pfu PCR Master Mix(TIANGEN,KP201)6.25μL，加不含DNA酶-RNA酶的水使总体积为 12.5μL。在Bio-Rad(S1000TM Thermal Cycler)进行的PCR反应为半定量 RT-PCR，在AB应用生物系统7500进行的反应为定量RT-PCR。用2.0%的琼脂糖 凝胶电泳对PCR产物进行图谱分析。用ABI7500软件处理数据。

表1.相关基因的引物序列

免疫细胞化学谱系特定的染色

Zuk等人和Gronthos等人报道(Zuk,P.A,et al.,Tissue Eng7,211,2001；和Gronthos,S.,et al.,J Cell Physiol189,54,2001)，分离的hADSC的特性可以用特 异性CD表面标记物来检测，如CD44(eBioscience,47-0441-80)、CD29 (eBioscience,11-0299-41)、CD105(eBioscience,12-1057-41)、CD45(eBioscience, 11-9459-41)。免疫细胞化学染色方法如下：hADSCs用4%多聚甲醛(PFA)在室温 下固定15-20分钟，0.25%Triton X-100在室温下透膜10分钟，3%BSA或驴血清 封闭30分钟，之后给上述溶液加入一抗室温下孵育1小时或在4℃过夜，IgG同 型对照对应的一抗将排除假阳性检测；之后加入携带荧光染料的二抗在室温孵 育1小时，最后加入DAPI染核10分钟，最后用封片剂封闭载玻片。用共聚焦显微镜(Leica SP5)在适当波长下可以检测到荧光信号。为了研究中胚层，如脂肪 细胞、成骨细胞和软骨细胞向多系谱分化的潜能，用油红O(Sigma, O0625-25G)，茜素(HGB,3381-60)，甲苯胺蓝(BIO BASIC INC.TB0962-1G)分 别染色确定。具体步骤参考已发表的文献(Zuk,P.A,et al.,Tissue Eng7,211, 2001)。

hADSC诱导的神经样细胞(hADSC-NLC)的分化和表征

已经证明hADSC在特定的神经元诱导混合培养基中可以分化为神经元样 细胞(hADSC-NLC)(Safford,K.M.,et al.,Biochem Biophys Res Commun294, 371,2002；Safford,K.M.,et al.,Exp Neurol187,319,2004；Case,J.,et al.,Ann NY AcadSci1044,183,2005；Woodbury,D.,et al.,J Neurosci Res69,908,2002； Woodbury,D.,etal.,J Neurosci Res61,364,2000；Yaghoobi,M.M.,et al., Neurosci Lett390,81,2005；Guilak,F.,et al.,J Cell Physiol206,229,2006；Deng, W.,et al.,Biochem BiophysRes Commun282,148,2001；Ashjian,P.H.,et al., Plast Reconstr Surg111,1922,2003；Yang,L.Q.,et al.,Neuroreport22,370, 2011)。本发明改进了现有的诱导步骤(Safford,K.M.,et al.,Biochem Biophys Res Commun294,371,2002)，hADSC在神经元诱导混合培养基生长之前用DKK1 (Sigma,SRP3258,10ng/mL)预孵育24小时；为促进hADSC-NLC的成熟，在神经 元诱导混合培养基中处理3天后，给混合培养基中加入BDNF(10ng/ml),NT3 (10ng/ml)和NGF(10ng/ml)。然后用免疫细胞化学染色和半定量RT-PCR来检测 hADSC-NLC的特性。

实施例1.通过细胞形态和CD表面标记物表征hADSC

抽脂手术获得的组织细胞处理过后用含20%胎牛血清(JRH Bioscience, USA)的基础培养基DMEM/F-12(Invitrogen,Japan)稀释，接种在T-75flasks (Falcon,BectonDickinson,Japan)，使其浓度为6×10⁷个细胞/cm²。每两周换一 次培养基。培养15天后，hADSC贴壁生长，呈典型的纺锤体形态，并以涡旋式 的方式扩增。苏木精和伊红(HE)染色表明hADSC是单核细胞，如图1B所示。用 CD表面标志物进行免疫组织化学染色鉴别hADSC，如图1A。CD表面标记物阳 性率的定量如图1C。

这些结果表明：85%以上的hADSC高表达间充质干细胞标记物CD29、CD44 和CD105，然而少于5%的hADSC表达造血干细胞标志物CD45。这些结果与 Gronthos等人之前的报道一致。

实施例2.干细胞转录因子和向三系分化表明hADSCs的多潜能性

经典的干细胞转录标记物，如Sox2、Oct4、c-Myc、Nanog和KLF4已被广 泛用于描述诱导性多潜能干细胞(iPSCs)的特性。为了描述hADSCs的干性特征， 该研究应用免疫组织化学染色和设计的转录因子标记物引物及半定量RT-PCR 检测这些因子的表达，与ESC相比较。结果表明：用免疫组织化学染色，hADSC 在蛋白水平表达Sox2、Oct4、c-Myc和Nanog(图2A)。以人胚胎干细胞(hESC) 系H9作为阳性对照，半定量RT-PCR表达Sox2、Oct4、c-Myc、Nanog和KLF4， hESC显著高表达Oct4、Nanog和KLF4。阳性表达干细胞转录标记的数量表明80%以上第三代的hADSC阳性表达这四种标记物(图2B)，这与RT-PCR结果一致 (图2C)。此外，在体内，hADSC通过各系统特殊分化培养基向三系谱分化的能 力体现了其多潜能性。用油红O染色，可见分离的hADSCs诱导为脂肪细胞，茜 素染色诱导为成骨细胞，甲苯胺蓝染色诱导为软骨细胞(图2C)。用显微镜下5 个视野里染色阳性的hADSCs细胞的均值计算其百分比，结果如图(图2D)。这些 结果表明分离的hADSC具有多潜能能力，与之前的报道一致。

实施例3.在塑料培养皿中hADSC向神经元分化为hADSC-NLC

发明人在塑料培养皿中对hADSC进行诱导使之向神经元分化为 hADSC-NLC，所述神经元诱导的步骤包括：首先用DKK1孵育hADSC24小时， 然后用Safford,K.M等(BiochemBiophys Res Commun294,371,2002)描述的 混合培养基培养3天。在诱导过程中，hADSC形态改变，胞质向胞核回缩，胞 体变成球形，如图3A和B所示。

为了证实神经元标记物的表达真正是由于混合诱导液的诱导，首先将 hADSC不经过任何处理，用Tuj1、MAP2、NeuN、Synapsin1/2和vGAT进行免 疫组织化学染色。hADSC基础表达Tuj1和MAP2而不是NeuN、Synapsin1/2和 vGAT，如图3C所示。hADSC基础表达一些神经元标记物，如Tuj1和MAP2表明： hADSC可能优先选择向神经系统分化。诱导3天后，用神经元标记物Tuj1、MAP2 和Synapsin1/2进行免疫组织化学染色，结果为hADSC表达Tuj1和MAP2，而不 表达Synapsin1/2、NeuN和Synapsin，如图3D所示。为了促进这些神经元成熟， 在接下来3天，给混合培养基中加入神经营养因子，如BDNF、NGF和NT3。用 成熟的神经元标记物NeuN、Synapsin和vGAT进行免疫组织化学染色，结果表 明在神经营养因子孵育后，有60%的hADSC-NLC开始表达这些成熟而且有功能 的神经元标记物，如图3E所示。

用神经营养因子处理后有50%的细胞可以观察到复杂的突触结构。为了评 估神经元分化的分子改变，第6天，应用qRT-PCR检测神经元的功能和离子通 道相关基因表达的不同。有40%的hADSC-NLC开始主要表达离子通道如钠,钾 和钙通道，确切地表明它们具有神经元特性并且功能成熟。引物如表1所示， PCR产物电泳和表达倍数差异如图3E和3F所示。

采用上述方法，人源脂肪干细胞的分化效率高，达到80%以上，而其均一 性和稳定性也很高。

实施例4

发明人重复了实施例3，区别在于在诱导hADSC向神经元样细胞分化之前， 不用DKK1进行预孵育。

结果，有30%的hADSC-NLC开始表达上述成熟而且有功能的神经元标记 物；有20%的细胞可以观察到复杂的突触结构；有15%的hADSC-NLC开始主要 表达离子通道。

发明人发现，单用神经营养因子就可以获得成熟度较高的神经元样细胞， 但在分化同步性和细胞得率方面比联用DKK1预孵育略差一些；从而提示DKK1 的作用主要是使得细胞更易于被诱导，进而可提高细胞分化的同步性以及细胞 得率。

实施例5

发明人重复了实施例3，区别在于利用其它wnt通路抑制剂，DKK3和其他 神经营养因子，BDNF、NGF、CNTF；

结果，有30%的hADSC-NLC开始表达上述成熟而且有功能的神经元标记 物；有20%的细胞可以观察到复杂的突触结构；有10%的hADSC-NLC开始主要 表达离子通道。因此，利用其它wnt通路抑制剂和其他神经营养因子也能获得 成熟度较高的神经元样细胞，但在分化效率、均一性、稳定性上略低于利用 DKK1和BDNF、NGF及NT3产生的效果。

讨论

在转化医学，hADSC作为细胞替代疗法最有希望的细胞资源之一已被普遍 接受，但是它们的治疗效果有待改进，具体机制需要阐明。

利用差速贴壁法从抽脂手术或外科手术获得的脂肪分离hADSC，分离纯化 的hADSC用CD表面标志物CD44、CD29、CD105和CD45进行鉴定，用干细胞 标志物Sox2、Oct4、c-Myc、Nanog和KLF4鉴定，结果表明本研究分离的hADSC 相对纯度大于80%，具有间充质干细胞的性质。这些结果与已发表的结果一致。 为了证实其多潜能分化的能力，用特定的诱导培养基诱导使之分化为三系谱， 如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。hADSC表现了它们的干细胞性，同样也按 照混合诱导说明诱导出神经元样细胞(NLC)，这些结果与已发表的结果同样一 致。为了促使NLC变得更加成熟，在预孵育诱导3天后加入神经营养因子，如 脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和NT3。提高NeuN、 Synapsin1/2和vGAT的表达可以证明这些因素在促进神经功能成熟的机制。

如果在诱导hADSC分化之前利用wnt通路抑制剂，例如DKK1对hADSC进 行预孵育，可以进一步提高分化的同步化，细胞得率也更高。

总之，本发明提供了一种新颖的方法，在塑料培养皿上，hADSC可以被诱 导分化成由特定神经元标记的NLC，这意味着hADSC为神经退行性疾病和损伤 性疾病治疗提供了细胞移植治疗的新方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种制备高度成熟的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) 诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化；和

2) 利用神经营养因子促进1)所得的神经元样细胞成熟；

其中，所述神经营养因子是BDNF、NGF和NT3的组合；

在1) 诱导人源脂肪干细胞向神经元样细胞分化之前，首先利用wnt通路抑制剂DKK1对人源脂肪干细胞作预孵育24小时，

然后，利用混合培养基培养人源脂肪干细胞3天，

接下来，利用神经营养因子BDNF、NGF和NT3的组合促进所得的神经元样细胞成熟3天；

所述方法制得的人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群具有下述特征：

(1) 有60%以上的细胞表达神经元标记物；

(2) 有50%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；

(3) 有40%以上的细胞表达离子通道蛋白，具备神经电生理特性。

2.采用权利要求1所述方法制备的一种人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞群，其特征在于，所述细胞群具有下述特征：

(1) 有60%以上的细胞表达神经元标记物；

(2) 有50%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；

(3) 有40%以上的细胞表达离子通道蛋白，具备神经电生理特性。