KR20200143399A - 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법 - Google Patents

중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 함유하는 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단으로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상이 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법
본 출원은, 2018년 4월 12일자로 출원된 미국 가특허원 제62/656,531호의 우선권의 이익을 주장하고, 이에 의해 이의 내용은 모든 목적을 위해 이의 전체가 참조로서 도입된다.
본 발명은 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성(wound healing property)을 유도 또는 개선시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는데 적합한 및/또는 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하는데 적합한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단 또는 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단을 함유하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들면, 제대 또는 태반의 매우 균질한 및 양호하게 규정된 중간엽 줄기 세포 모집단에 관한 것이다.
제대의 양막으로부터 단리된 중간엽 줄기 세포는 미국 특허 출원 제2006/0078993호(허여된 미국 특허 제9,085,755호, 제9,737,568호 및 제9,844,571호로 이어짐) 및 상응하는 국제 특허 출원 제WO2006/019357호에서 최초로 보고되었다. 그 이래, 제대 조직은 다능성 세포의 공급원으로서 주목을 받고 있으며; 이의 보급 이용능 때문에, 제대 및 특히 제대 양막으로부터 단리된 줄기 세포(또한 "제대 라이닝 줄기 세포"로서 지칭됨)은 재생 의료용 세포의 우수한 대체 공급원으로서 간주되었다[참조: Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27].
후속 연구는, 제대 양막으로부터 유래하는 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)(제대 라이닝(CL-MCS), 제대 혈액(CB-MSC), 태반(P-MSC) 및 와튼 젤리(WJ-MSC)의 표현형, 증식 속도, 이주, 면역원성 및 면역조절 능력을 비교했다[참조: Stubbendorf et al, Immunological Properties of Extraembryonic Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Gestational Tissue, STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 22, Number 19, 2013, 2619-2629]. 스투벤도르프 등(Stubbendorf et al)은 배체외 임신 조직-유래 MSC 모집단이 면역 반응을 회피할 수 있는 다양한 잠재력을 나타내고 면역조절 효과를 발휘하는 것으로 결론지었다. 저자들은 또한, 세포가 낮은 면역원성을 나타냈지만 또한 증강된 증식 및 이동 가능성을 나타냈기 때문에, CL-MSC가 세포-기반 요법을 위한 가장 유망한 잠재력을 나타냈고, 이에 장래 연구는 CL-MSC가 투여될 수 있는 최고 질환 모델에 집중되어야 한다는 것을 밝혀냈다.
양막의 중간엽 줄기 세포는, 미국 특허 출원 제2006/0078993호 및 국제 특허 출원 제WO2006/019357호에 기재된 프로토콜을 사용하여 용이하게 수득할 수 있지만, 이들 제대 라이닝 MSC에 의한 임상 시험은, 매우 균질하고 따라서 임상 시험에 사용될 수 있는 이들 제대 라이닝 MSC의 모집단을 단리하는 것을 가능하게 하는 방법을 수완으로 갖는 것이 유리할 것이다. 또한, 일반적으로 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 것이 유리할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 이러한 필요를 만족시키는 제대의 양막으로부터 중간엽 줄기 세포의 모집단을 단리하는 것이 목적이다. 따라서, 또한 본 발명의 목적은 중간엽 줄기 세포의 모집단을 고도로 균일하게 제공하는 것이다.
이 목적은, 독립 청구항의 특징을 갖는 방법, 중간엽 줄기 모집단, 각각의 약제학적 조성물 및 세포 배양 배지에 의해 달성된다.
제1 국면에서, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, DMEM(Dulbeco's modified eagle medium; 둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄(Ham's)의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 함유하는 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단(population)을 배양하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 중간엽 줄기 세포 모집단은 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단일 수 있다.
제2 국면에서, 본 발명은 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단으로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상이 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 제공한다. 바람직하게는, 단리된 중간엽 줄기 모집단은 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다. 이러한 제2 국면의 실시형태에서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 세포는 CD73, CD90 및 CD105의 각각을 발현한다. 또한, 제2 국면의 이들 실시형태에서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 세포는 바람직하게는 마커 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다. 중간엽 줄기 세포 모집단은 제1 국면의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법에 의해 수득할 수 있다. 따라서, 제1 국면의 방법은 또한 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하는 방법일 수 있다.
제3 국면에서, 본 발명은 본 발명(제2 국면)의 포유동물 세포를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제4 국면에서, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키거나 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하기 위한 배양 배지를 제조하는 방법으로서, 500ml 배양 배지의 최종 용적을 수득하기 위해,
i. 250ml의 DMEM
ii. 118ml M171
iii. 118ml DMEM/F12
iv. 12.5ml 소태아 혈청(FBS)을 혼합하여 최종 농도 2.5%(v/v)를 수득하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
제5 국면에서, 본 발명은, 제4 국면의 방법에 의해 수득할 수 있는 세포 배양 배지를 제공한다.
제6 국면에서, 본 발명은, 제4 국면의 방법에 의해 제조된 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하는 방법을 제공한다.
제7 국면에서, 본 발명은
- 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)의 DMEM,
- 최종 농도 약 5 내지 15%(v/v)의 F12,
- 최종 농도 약 15 내지 30%(v/v)의 M171 및
- 최종 농도 약 1 내지 8%(v/v)의 FBS
를 포함하는, 세포 배양 배지를 제공한다.
제8 국면에서, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키거나 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하기 위한 제7 국면의 세포 배양 배지의 용도를 제공한다.
본 발명은, 비제한적 실시예 및 도면과 함께 검토하면, 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은, 실험 섹션에서 본 발명의 배지(PTT-6)의 예시적 실시예의 제조에 사용된 DMEM의 카탈로그 번호를 포함하는, 둘베코 변형된 이글 배지에 대한 론자(Lonza)의 기술 정보 시트를 나타낸다.
도 2는, 햄의 F12 배지에 대한 론자의 기술 정보 시트를 나타낸다.
도 3은, 실험 섹션에서 본 발명의 배지(PTT-6)의 예시적 실시예의 제조에 사용된 DMEM:F12(1:1) 배지의 카탈로그 번호를 포함하는, DMEM:F12(1:1) 배지에 대한 론자의 기술 정보 시트를 나타낸다.
도 4는, 실험 섹션에서 본 발명의 배지(PTT-6)의 예시적 실시예의 제조에 사용된 M171 배지의 카탈로그 번호를 포함하는, M171 배지에 대한 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation)의 기술 정보 시트를 나타낸다.
도 5는, 배지 PTT-6의 제조를 위해 실험 섹션에서 사용된 이들의 상업적 공급업자 및 카탈로그 번호를 포함하는, 성분 리스트를 나타낸다.
도 6a 내지 6c는, 제대로부터 단리된 중간엽 줄기 세포를 중간엽 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105의 발현에 대해 분석한 유세포분석 실험의 결과를 나타낸다. 이들 실험을 위해, 중간엽 줄기 세포를 3개의 상이한 배양 배지에서 제대 조직의 배양에 의해 제대 조직으로부터 단리하고, 이어서 각각의 배지에서 중간엽 줄기 세포를 계대배양(subculturing)했다. 3개의 하기 배양 배지를 이들 실험에 사용했다: a) 10% FBS(v/v)가 보충된 90%(v/v) DMEM, b) 90%(v/v) CMRL1066으로 이루어진 미국 특허 출원 제2008/0248005호 및 상응하는 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에 기재된 배양 배지 PTT-4, 및 c) 조성이 본원에 기재되어 있는 본 발명의 배양 배지 PTT-6. 이러한 유세포 분석에서, 제대 라이닝 중간엽 줄기 세포(CLMC) 모집단의 2개 상이한 샘플을 사용된 3개의 배양 배지 각각에 대해 분석했다. 결과는 도 6a 내지 6c에 제시되어 있다.
보다 상세하게는, 도 6a는, 제대 조직으로부터의 단리 및 DMEM/10% FBS에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 6b는, 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-4에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타내고, 도 6c는 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-6에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 7a 및 7b는, 세포 치료에 대한 다능성 인간 중간엽 줄기 세포의 적합성을 정의하기 위해 사용된 줄기 세포 마커(CD73, CD90 및 CD105, CD34, CD45 및 HLA-DR(인간 백혈구 항원-항원 D 관련))의 발현에 대해 제대로부터 단리된 중간엽 줄기 세포를 분석하고 골수 중간엽 줄기 세포에 의한 이들 마커의 발현과 비교한 유세포분석 실험의 결과를 나타낸다. 이 실험의 경우, 제대의 아미노계 막의 중간엽 줄기 세포는 본 발명의 배양 배지 PTT-6에서 제대 조직의 배양에 의해 제대 조직으로부터 단리하고, 골수 중간엽 줄기 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 인간 골수로부터 단리했다.
도 7a는, 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-6 배지에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타내고, 도 7b는, CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 단리된 골수 중간엽 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 8은, 암회색 웰, PTT-4 배지로 재구성한 표준물 및 PTT-4에서 배양한 MSC로부터의 상응하는 샘플; 연회색 웰, TPP-6 배지로 재구성한 표준물 및 PTT-6에서 배양한 MSC로부터의 상응하는 샘플을 사용한 실험의 설정을 나타낸다. 이탤릭체의 샘플은, 저장된 샘플의 반복 시험의 일부로서 시험되어 있는 대조군 상청액이다.
도 9는 TGFβ1의 싱글플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성한다. PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시키는 경우, AT-MSC 및 BM-MSC 배양물만이 다소 동등한 양의 TGFβ1을 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 10a는 PDGF-AA의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 또는 BM-MSC 배양물은, PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 보다 많은 PDGF-AA를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 10b는 VEGF의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 10c는 Ang-1의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 Ang-1을 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 11은 HGF의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 12는 PDGF-AA의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 보다 많은 PDGF-AA를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 배양 배지 둘 다에서 동등량의 PDGF-AA를 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 13a는 VEGF의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 13b는 Ang-1의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 Ang-1을 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 13c는 HGF의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 14는 bFGF의 멀티플렉스 측정을 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 bFGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 PTT-4 및 PTT-6에서 배양한 경우와 동등한 양의 bFGF를 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 15는 5개의 상이한 실험(170328, 170804, 170814, 180105, 180226)에 대한 TGFβ1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 TGFβ 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 TGFβ 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성함을 도시한다. AT-MSC 및 BM-MSC 배양물은 PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시킨 경우와 동등한 양의 TGFβ1을 생성했다. 모든 에러 바는 실험 170328, 170804, 170814, 180105, 180226에 대한 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 16은 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 Ang-1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 Ang-1 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 Ang-1 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성함을 도시한다. AT-MSC 및 BM-MSC 배양물만이 본질적으로 PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시킨 경우와 동등한 양의 Ang-1을 생성했다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226에 대한 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 17은 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 PDGF-BB의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-BB 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 PDGF-BB 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 특히, 어느 실험에서도, PDGF-BB는 검출되지 않았다.
도 18은 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 PDGF-AA의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 PDGF-AA 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 및 WJ-MSC 배양물이 PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 약간 더 많은 PDGF-AA를 생성함을 도시한다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 19는 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 IL-10의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 IL-10 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6에서 수득된 IL-10 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 특히, 어떠한 실험에서도, IL-10은 검출되지 않았다.
도 20은 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 VEGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득된 VEGF 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성함을 도시한다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 21은 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 HGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 HGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6에서 수득된 HGF 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성함을 도시한다. 한편, 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 다른 배양물과 같이 많은 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 22는 TGFβ1의 싱글플렉스 측정이다. 실험 전체의 표준 TGFβ1에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는 PTT-4 또는 DMEM/F12(도 22에서 단지 DMEM으로서만 지칭됨)에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성한다.
도 23은, PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 PDGF-BB의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-BB 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 특히, 어떠한 실험에서도, PDGF-BB는 검출되지 않았다.
도 24는, PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 IL-10의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S6는 검정에 사용된 최저 표준을 나타낸다. 이하에 해당하는 모든 샘플은 검출 이하인 것으로 간주된다. 우측의 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는 PTT-6에서 성장시킨 경우에 검출가능한 수준의 IL-10을 생성하는 반면, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우에는 IL-10가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다.
도 25는, PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 VEGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S1은 검정에 사용된 최고 표준을 나타낸다. 이상에 해당하는 모든 샘플은 외삽(너무 집중됨)된 것으로 간주된다. 우측의 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 더 높은 수준의 VEGF를 생성한다.
도 26은 bFGF의 멀티플렉스 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 배양된 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PPT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 bFGF를 생성한다. 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 낮은 수준의 bFGF를 생성한다.
도 27은 PDGF-AA의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정된 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S6은 검정에 사용된 최저 표준을 나타낸다. 이하에 해당하는 모든 샘플은 검출 이하인 것으로 간주된다. 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 높은 수준의 PDGF-AS를 생성한다.
도 28은 Ang-1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 Ang-1 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S1은 검정에 사용된 최고 표준을 나타낸다. 이상에 해당하는 모든 샘플은 외삽(너무 집중됨)된 것으로 간주된다. 우측의 그래프는 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC가, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 높은 수준의 Ang-1을 생성함을 도시한다.
도 29는 HGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 HGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프는 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC가, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 높은 수준의 Ang-1을 생성함을 도시한다.
상기 설명한 바와 같이, 제1 국면에서, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 함유하는 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 본 출원에서는, 이러한 배지를 사용하면, 중간엽 줄기 모집단의 자연 환경/구획과 무관하게, 광범위한 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선하는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성의 유도 또는 개선은, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β1, VEGF 및 HGF 중의 적어도 1, 2, 3 또는 4개 모두의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 본 발명의 배지의 능력에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 우수한 창상 치유 특성(제대 양막의 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단이 전체 두께 화상(실시예 23), 부분적-두께 창상(실시예 24), 비-치유성 방사선 창상(실시예 25) 및 비-치유성 당뇨병성 창상 및 비-치유성 당뇨병성 족부 창상(실시예 26)을 경감시키는 것을 나타내는 WO 제2007/046775호의 실시예 23 내지 26 참조)을 갖는 것으로 미국 특허 출원 US 2008/0248005 및 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에 제시된 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단의 단리를 위해 미국 특허 출원 US 2008/0248005 및 상응하는 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에서 사용된 배지(PTT-4)에서 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양과 비교하여 본 발명 PTT-6의 배양 배지에서 배양함으로써 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β1, VEGF 및 HGF의 발현/분비가 증가된다는 것을 나타내는 실험 섹션 참조. 본원의 실험 섹션에 제시된 바와 같이, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 포함하는 배지에서의 배양은, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 뿐만 아니라 와튼 젤리 등의 제대의 다른 구획 또는 태반 등의 (인접) 구획의 중간엽 줄기 세포 모집단에서 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β1, VEGF, 및/또는 HGF의 양을 증가시킨다. 따라서, 본 발명은, 중간엽 줄기 세포 모집단을 배지 PTT-6 등의 본 발명의 배지에서 배양함으로써 소정의 중간엽 줄기 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 일반적으로 적용가능한 교시를 제공할 것으로 생각된다.
이러한 문맥에서, 중간엽 줄기 세포 모집단이 생성하는 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및/또는 HGF의 양의 조합된 증가가 이러한 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 개선 또는 개선한다는 본 발명의 발견은 또한, 유일한 창상 치유 단백질로서 Ang-1, TGF-β1, VEGF 또는 HGF 중의 3 또는 4개를 함유하는 조성물/용액에 의한 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 모방하게 한다.
이러한 문맥에서, 창상 치유 프로세스에서 단백질 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β1, VEGF 및 HGF의 관여는 당업자에게 공지되어 있음에 주목한다. 창상 치유에서 안지오포이에틴 1의 관여에 대해서는, 예를 들면, [문헌: Li et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:113 “Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing” or Bitto et al, “Angiopoietin-1 gene transfer improves the impaired wound healing of the genetically diabetic mice without increasing VEGF expression”, Clinical Science May 14, 2008, 114 (12) 707-718]을 참조한다. 리(Li) 등의 연구에서, 안지오포이에틴-1 유전자는 골수 중간엽 줄기 세포에 삽입되었고, 결과는 "Angl-1 MSC가 MSC, Ad-Ang1 또는 거짓 치료와 비교하여 증가된 진피 및 표피 재생 및 증강된 혈관신생과 함께 창상 치유를 현저히 촉진시켰다"는 것을 나타냈다. 특히. 리(Li) 등의 저자들은 중간엽 줄기 세포(MSC) 단독이 충분한 Ang-1을 생성하지 않음을 언급하고, 이러한 이유로, 저자들은 Ang1-유전자를 MSC에 삽입하여 유전적으로 변형된 세포를 생각해냈다. 리(Li)의 연구와 대조적으로, 놀랍게도, 본 출원에서는, PTT-6 등의 배양 배지에서 "천연" 중간엽 줄기 세포의 배양이, 예를 들면, 제대 조직 중간엽 줄기 세포(즉, PTT-6에서 배양되는 중간엽 줄기 세포 모집단)가 증가된 수준의 Ang-1을 생성하고 따라서 중간엽 줄기 세포를 창상 치유에 적합하게 하고 추가로 이들의 창상 치유 특성을 개선시키는 조건을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이는 본 발명이, 중간엽 줄기 세포에서 창상 치유 특성을 유도하기 위해 천연 존재 중간엽 줄기를 유전적으로 변형시키는 대신에(노력을 필요로 할 뿐만 아니라, 유전자 치료의 고유한 위험 때문에 치료 적용을 위한 바람직한 옵션이 아님), 천연 존재 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성이 본 발명의 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단의 "단순한" 배양에 의해 유도 또는 증가된다는 잇점을 제공하는 것을 의미한다. 이러한 접근법은, 보다 용이하고 보다 안전하고 또한 보다 비용 효율적이다.
다른 단백질로 되돌아가면, 창상 치유, 특히 만성/비-치유성 창상에서 간세포 성장 인자(HGF)의 관여에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Yoshida et al., "Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded Cutaneous Wound Healing Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation" J. Invest. Dermatol. 120:335-343, 2003, Li, Jin-Feng et al. "HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferentiation of Epidermal Cells through β1-Integrin/ILK Pathway." BioMed Research International 2013 (2013): 470418 or Conway et al, "Hepatocyte growth factor regulation: An integral part of why wounds become chronic". Wound Rep Reg (2007) 15 683-692]을 참조한다.
창상 치유, 특히 만성/비-치유성 창상의 치유에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 관여에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Froget et al., Eur. Cytokine Netw., Vol. 14, March 2003, 60-64 or Bao et al., "The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing" J Surg Res. 2009 May 15; 153(2): 347-358]을 참조한다.
창상 치유, 특히 만성/비-치유성 창상의 치유에서 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3을 포함)의 관여에 대해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Ramirez et al. "The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization" Advances In Wound Care, Volume 3, Number 7, 2013, 482-491 or Pakyari et al., Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing, Advances In Wound Care, Volume 2, Number 5, 2012, 215-224]을 참조한다.
이러한 문맥에서, 또한, 본 발명은, 본 발명의 배양 배지에서의 배양이, 세포의 90% 이상 또는 심지어 99% 이상이 3개 중간엽 줄기 세포 마커 CD73, CD90에 대해 양성이고 동시에 이들 줄기 세포가 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 양막 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단(실험 섹션 참조)(이는 이러한 모집단의 99% 이상의 세포가 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 마커 CD34, CD45 및 HLA-DR을 발현하지 않는 것을 의미한다) 등의 중간엽 줄기 세포 모집단의 단리를 제공한다는 추가의 놀라운 잇점을 갖는 것에 유의한다. 이러한 매우 균질한 및 명확한 세포 모집단은, 예를 들면, 이들이 인간 중간엽 줄기 세포를, 예를 들면, 문헌[참조: Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonk et al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, or Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol. 19. No. 2. P. 75-79]에 정의된 세포 치료에 사용하기 위해 일반적으로 허용되는 기준에 완전히 부합하기 때문에 임상 시험 및 세포-기반 요법을 위한 이상적 후보이다. 또한, 양자 세포 확장 시스템 등의 생물반응기를 사용하면, 실행당 3억 내지 7억개 중간엽 줄기 세포 등의 중간엽 줄기 세포를 대량으로 수득할 수 있다(또한 실험 섹션 참조). 따라서, 본 발명은, 비용 효율적 방식으로 창상 치유에서 이들의 용도 등의 치료학적 적용을 필요로 하는 줄기 세포의 양을 제공하는 추가의 잇점을 제공한다. 또한, 본 발명의 배양 배지의 제조에 사용된 모든 성분은 GMP 품질로 상업적으로 이용가능하다. 따라서, 본 발명은, 고도로 균질한 중간엽 줄기 세포 모집단, 예를 들면, 대반 조직 또는 제대 조직, 예를 들면, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 또는 와튼 젤리의 중간엽 줄기 세포 모집단의 GMP 생성에 대한 경로를 열어준다.
창상 치유에 적합해지는 중간엽 줄기 세포 모집단(본 발명의 배양 프로세스 전에 창상 치유 특성을 갖지 않는 모집단에서 창상 치유 특성을 유도하거나, 창상 치유 특성을 개선시킴으로써)은 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 중간엽 줄기 세포, 예를 들면, 성체 줄기 세포 모집단 또는 신생아 줄기 세포일 수 있다. 중간엽 줄기 세포 모집단은, 중간엽 줄기 세포를 함유하는 것으로 공지된 임의의 포유동물 조직 또는 구획/신체 부분으로부터 유래할 수 있다. 예시적 예에서, 중간엽 줄기 세포 모집단은 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단(이들은 신생아 줄기 세포의 예이다), 태아 중간엽 줄기 세포 모집단(또한 신생아 줄기 세포의 추가의 예), 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기 세포 모집단(신생아 줄기 세포 모집단의 추가의 예), 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단(여전히 신생아 줄기 세포의 추가의 예), 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단(이는 성체 줄기 세포 모집단일 수 있음), 또는 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단(여전히 성체 줄기 세포 모집단의 또 다른 예)일 수 있다.
제대의 중간엽 줄기 세포 모집단은, 중간엽 줄기 세포를 함유하는 제대 조직의 임의의 구획으로부터 (유도)유래할 수 있다. 중간엽 줄기 세포 모집단은 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단, 게다가 또한 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단일 수 있고, 이는 이들 구획의 2개 이상의 줄기 세포를 포함하는 중간엽 줄기 세포의 모집단을 의미한다. 이들 구획의 중간엽 줄기 세포 및 이로부터의 단리는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Subramanian et al "Comparative Characterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Wharton's Jelly Compartment Provides the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem Cells", PLoS ONE 10(6): e0127992, 2015 및 그 안에 인용된 참고문헌, Van Pham et al. "Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications", Cell Tissue Bank (2016) 17:289-302, 2016]에 기재되어 있다. 제대의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단은, 예를 들면, 제대 조직으로부터 동맥 및 정맥을 제거하고, 잔류 조직 및 와튼 젤리를 조각으로 절단하고 제대 조직을 본 발명의 배양 배지에서 (조직 외식편에 의해) 배양함으로써 수득할 수 있다. 또한, 제대의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단은, 문헌[참조: Schugar et al. "High harvest yield, high expansion, and phenotype stability of CD146 mesenchymal stromal cells from whole primitive human umbilical cord tissue. Journal of biomedicine & biotechnology. 2009; 2009:789526"]에 기재된 조건(10% 소태아 혈청, 10% 말 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신과 함께 혈청-보충된 DMEM에서 배양)하에 전체 제대 조직을 조직 외식편으로서 무손상 제대 혈관과 배양함으로써 수득할 수 있다. 이러한 문맥에서, 문헌[참조: Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 기재된 바와 같이 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리할 수 있음에 유의한다.
상기에 따르면, 이의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키기 위해 DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 포함하는 배양 배지에서 본 발명에서 배양되는 중간엽 줄기 세포 모집단은 본 발명의 배양 배지에서의 배양 전에 이의 자연 환경으로부터 단리할 수 있다. 이러한 접근법은 특히, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단 또는 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단 등의 조직 외식편에 의해 용이하게 단리할 수 없는 중간엽 줄기 세포 모집단에 사용된다. 그러나, 이러한 접근법은 또한, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반의 중간엽 줄기 세포 모집단 또는 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단에 대해서도 수행할 수 있다. 이러한 줄기 세포 모집단, 예를 들면, 와튼 젤리의 중간엽 줄기 세포 모집단은, 문헌[참조: Subramanian et al, 2015, PLoS ONE, supra 또는 국제 특허 출원 WO 2004/072273 "Progenitor Cells From Wharton’s Jelly Of Human Umbilical Cord"]에 의해 상기 기재된 바와 같이 먼저 단리하고, 이어서 DMEM(둘베코 변형된 이글 배지, F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 포함하는 본 발명의 배양 배지에서 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양에 제공할 수 있다. 또한, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단은, 예를 들면, 유럽 특허 출원 제EP1 288 293호, 문헌[참조: Talwadekar et al, "Cultivation and Cryopreservation of Cord Tissue MSCs with Cord Blood AB Plasma" Biomed Res J 2014;1(2):126-136, Talwadekar et al, "Placenta-derived mesenchymal stem cells possess better immunoregulatory properties compared to their cord-derived counterparts - a paired sample study" Scientific Reports 5:15784 (2015), or Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 기재된 바와 같이 태반으로부터 단리하고, 후속적으로 본 발명의 배양 배지에서 배양할 수 있다. 마찬가지로, 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단은, 본원에서 인용된 참조문헌으로서 문헌[참조: Schneider et al, "Adipose-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine" Eur J Med Res. 2017; 22: 17]에 기재된 바와 같이 단리할 수 있고, 후속적으로, 본 발명의 배양 배지에서 배양할 수 있다(또한, 실험 섹션 참조). 추가의 예시적 예로서, 또한 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기 세포 모집단은 먼저 문헌[참조: Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 기재된 바와 같이 단리할 수 있고, 후속적으로 본 발명의 배양 배지에서 배양할 수 있다.
또는, 및 특히 조직 외식편에 의해 단리할 수 있는 중간엽 줄기 세포의 경우, 중간엽 줄기 세포 모집단은 본 발명의 세포 배양 배지에서 자연 조직(natural tissue)을 배양함으로써 이의 자연 조직 환경으로부터 직접 단리할 수 있다. 이러한 방법론은, 제대 조직, 태반 조직(태반 조직은, 예를 들면, 태반의 양막을 포함하거나 양막일 수 있음) 또는 제대-태반 접합부로부터의 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양에 특히 적합하다.
이러한 문맥에서, 본 발명의 배양 배지는 따라서 이의 자연 환경으로부터 중간엽 줄기 세포 모집단(또한 "중간엽 줄기 세포"로서 본원에서 지칭됨)의 단리를 가능하게 함에 유의한다. 따라서, 본 발명의 배양 배지는, 중간엽 줄기/전구세포 세포의 분화 없이 중간엽 줄기/전구세포 세포의 세포 증식을 가능하게 하는 조건하에 중간엽 줄기 세포 모집단의 단리도 수행한다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 배양 배지는, 중간엽 줄기/전구세포 세포의 분화 없이 중간엽 줄기/전구세포 세포의 세포 증식을 가능하게 하는 조건하에 양막으로부터 중간엽 줄기 세포 모집단의 단리를 가능하게 한다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 양막으로부터 중간엽 줄기 세포의 단리 후, 단리된 중간엽 줄기/전구세포 세포 모집단은, 예를 들면, 미국 특허 출원 제2006/0078993호, US 특허 제9,085,755호, 국제 특허 출원 제WO2006/019357호, US 특허 제8,287,854호 또는 제WO2007/046775호에 기재된 바와 같이 다수 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다. 예를 들면, 미국 특허 출원 제2006/0078993호에 기재된 바와 같이, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포는 방추 형상을 갖고, 하기 유전자: POU5f1, Bmi-1, 백혈병 억제 인자(LIF) 및 분비 악티빈 A 및 폴리스타틴을 발현한다. 본 발명에서 단리된 중간엽 줄기 세포는, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 피부 섬유아세포, 연골세포, 골아세포, 건세포, 인대 섬유아세포, 심근세포, 평활근 세포, 골격근 세포, 지방 세포, 무친 생성 세포, 내분비선, 예컨대, 인슐린 생성 세포로부터 유래되는 세포(예: β-섬 세포) 또는 신경외배엽 세포 등의 임의 유형의 중간엽 세포로 분화될 수 있다. 본 발명에서 단리된 줄기 세포는 분화된 세포를 의약 프로세스에 후속적으로 사용하기 위해 시험관내에서 분화시킬 수 있다. 이러한 접근법의 예시적 예는 인슐린 생성 β-섬 세포로 중간엽 줄기 세포의 분화이고, 이어서 이는 진성 당뇨병(또한, 이와 관련하여 WO2007/046775 참조) 등의 인슐린 결핍을 앓고 있는 환자에게 이식에 의해 투여될 수 있다. 또는, 본 발명의 중간엽 줄기 세포는 세포-기반 치료, 예를 들면, 창상 치유 목적, 예컨대, 화상 또는 만성 당뇨병성 창상의 치료를 위해 이들의 미분화 상태로 사용될 수 있다. 이들 치료적 적용에서, 본 발명의 중간엽 줄기 세포는 주변 발병 조직과 상호작용함으로써 창상 치유를 촉진시키도록 작용하거나, 또한 각각의 피부 세포로 분화할 수 있다(또한, 예를 들면, WO2007/046775 참조).
상기 개시에 따르면, 본원에 기재된 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단은, 제대 조직이 양막(이는 또한 "제대 라이닝"으로 지칭됨)을 함유하는 한, 임의의 제대 조직으로부터 단리 및 배양(즉, 유래됨)할 수 있음에 유의한다. 따라서, 중간엽 줄기 세포 모집단은 본 출원의 실험 섹션에 기재된 바와 같이 전체 제대(이의 조직)로부터 단리할 수 있다. 따라서, 이러한 제대 조직은, 양막에 추가하여, 제대의 임의의 다른 조직/성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 출원 제2006/0078993호 또는 국제 특허 출원 제WO2006/019357호에 제시된 바와 같이, 제대의 양막은, 코드를 덮고 있는 제대의 가장 외측 부분이다. 또한, 제대는 하나의 정맥(이는 산소화된 영양소-풍부 혈액을 태아로 운반한다) 및 2개의 동맥(이는 탈산소화 영양소-결핍 혈액을 태아로부터 운반한다)을 함유한다. 보호 및 기계적 서포트를 위해, 이들 3개 혈관은 와튼 젤리, 주로 무코다당류로부터 제조된 젤라틴상 물질에 매립된다. 따라서, 본 발명에 사용된 제대 조직은 또한 이러한 1개의 정맥, 2개의 동맥 및 와튼 젤리를 포함할 수 있다. 제대의 이러한 전체 (무손상) 부분의 사용은 양막이 제대의 다른 성분으로부터 분리될 필요가 없다는 잇점을 갖는다. 이는 단리 단계를 감소시키고, 따라서 본 발명의 방법을 보다 단순하고 보다 신속하며 오차가 적으며 보다 경제적으로 되게 하며, 이들은 중간엽 줄기 세포의 치료적 적용에 필요한 GMP 생성을 위한 모든 중요한 측면이다. 따라서, 중간엽 줄기 세포의 단리는 조직 외식편에 의해 개시할 수 있고, 이어서, 예를 들면, 임상 시험에서 사용하기 위해 보다 다량의 중간엽 줄기 세포가 요구되는 경우, 단리된 중간엽 줄기 세포의 후속 계대배양(배양)을 수행할 수 있다. 또는, 제대의 다른 성분으로부터 양막을 먼저 분리하고, 본 발명의 배양 배지에서 양막을 배양하여 양막으로부터 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포를 단리할 수 있다. 이러한 배양은 또한 조직 외식편에 의해 수행할 수 있고, 임의로 단리된 중간엽 줄기 세포의 계대배양을 수행할 수 있다.
이러한 문맥에서, 용어 "조직 외식편" 또는 "조직 외식 방법"은, 조직(예를 들면, 태반 조직 또는 제대 조직), 회수되는 경우, 또는 조직의 단편이 배양(성장) 배지를 함유하는 세포 배양 접시에 배치되어 있고 경시 변화에 따라 줄기 세포가 조직으로부터 접시의 표면으로 이동하는 방법을 지칭하기 위해 당해 기술분야에서 이의 규칙적 의미로 사용된다. 이어서, 이들 초대 줄기 세포를 확장하고, 본원에 기재된 바와 같이 마이크로전파(계대배양)을 통해 신선한 접시로 이송할 수 있다. 이러한 문맥에서, 치료 목적을 위한 세포의 생성과 관련하여, 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단, 예를 들면, 양막 또는 와튼 젤리 중간엽 줄기 세포 등의 제대 중간엽 줄기 세포를 단리/수득하는 제1 단계에서, 단리된 중간엽 줄기 세포의 마스터 세포 뱅크를 수득하고, 후속 계대배양에서 작동 세포 뱅크를 수득할 수 있다. 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단(특히, 적어도 약 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 세포가 각각의 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 각각의 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 중간엽 줄기 세포의 모집단)이 임상 시험 또는 승인된 치료제로서 사용되는 경우, 작동 세포 뱅크의 세포 모집단은 전형적으로 이러한 목적에 사용될 것이다. 단리 단계의 줄기 세포 모집단(이는 마스터 세포 뱅크를 구성할 수 있음) 및 계대배양 단계의 줄기 세포 모집단(이는 작동 세포 뱅크를 구성할 수 있음) 둘 다는, 예를 들면, 동결-보존된 형태로 저장될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 중간엽 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선(및 임의로 동시에 와튼 젤리 또는 제대 양막 등의 조직으로부터 중간엽 줄기 세포를 단리하는)시키는 본 발명의 방법은 본 발명의 배양 배지에서 사용된 모든 성분이 GMP 품질로 이용가능하고 따라서 후속 치료 투여를 위한 GMP 조건하에 중간엽 줄기 세포를 단리하는 가능성을 제공한다는 잇점을 갖는다.
"중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는"이란, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 단백질 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HGF 중의 적어도 하나의 발현 및/또는 분비를 증가 또는 개시(유도)하는 배양 배지의 능력을 본원에서 의미한다. 상기 설명한 바와 같이, 창상 치유에서 이들 4개 단백질 모두의 관여는 공지되어 있다. "창상 치유 특성의 유도 또는 개선"은, 우수한 창상 치유 특성을 갖는 것으로 미국 특허 출원 제US 2008/0248005호 및 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에 제시된 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단의 단리 및 배양을 위해 미국 특허 출원 제US 2008/0248005호 및 상응하는 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에서 사용된 배지 PTT-4(이는 90%(v/v) CMRL1066 및 10%(v/v) FBS로 이루어져 있다) 등의 참조(배양) 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양과 비교하여 평가한다. 이 경우, 중간엽 줄기 세포 모집단은, 참조 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양과 비교하여 본 발명의 배양 배지에서 배양하는 경우, 상청액/배양 배지 내로 4개 마커 단백질 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HGF 중의 적어도 하나를 보다 많은 양(보다 높은 분비 수준 또는 보다 높은 농도에 상응)으로 분비하고, 이어서 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 증가시킨다. 이 경우, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 이들 4개 마커 단백질 중의 어느 하나의 (검출가능한) 분비는 참조 배지에서의 배양 동안 관찰되지 않지만, 4개 마커 중의 적어도 하나의 검출가능한 분비가 본 발명의 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양 동안 또는 배양 후에 관찰되고, 이어서 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성이 유도된다. 또한, 4개 마커 단백질 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HGF 중의 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 모두의 발현 또는 분비가 참조 배지에서 줄기 세포 모집단의 배양과 비교하여 증가하는 경우, 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성이 개선된다. 배양 배지내로 4개 마커 단백질의 분비(및 따라서 줄기 세포 모집단에 의한 이들 인자의 생성)은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 항체/면역검정(참조: 실험 섹션)에 의해 단백질의 양을 측정함으로써 측정/결정할 수 있다. 이러한 측정은, 예를 들면, FLEXMAP 3D 시스템(Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) 등의 시스템을 사용하여 자동화 방식으로 이루어질 수 있다.
"DMEM"이란, 1969년에 개발되고 기초 배지 이글(BME)의 변형인 둘베코 변형된 이글 배지를 의미한다(론자(Lonza)로부터 이용가능한 DMEM의 데이터 시트를 나타내는 도 1 참조). 본래의 DMEM 제형은 1000mg/L의 글루코즈를 함유하고, 배성 마우스 세포를 배양하기 위해 최초로 보고되었다. 그 이래로, DMEM은 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)(카탈로그 번호 11965-084), 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)(카탈로그 번호 D5546) 또는 론자(Lonza) 등의 다양한 공급업자로부터 신규 공급업자까지 상업적으로 이용가능한 세포 배양을 위한 표준 배지로 되었다. 따라서, 임의의 상업적으로 이용가능한 DMEM을 본 발명에서 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 사용된 DMEM은 카탈로그 번호 12-604F하에 론자(Lonza)로부터 이용가능한 DMEM 배지이다. 이 배지는 4.5g/L 글루코즈 및 L-글루타민이 보충된 DMEM이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본원에서 사용된 DMEM은, 1000mg/L 글루코즈 및 중탄산나트륨을 함유하지만 L-글루타민을 함유하지 않는, 시그마 알드리히 카탈로그 번호 D5546의 DMEM 배지이다.
"F12" 배지란, 햄의 F12 배지를 의미한다. 이 배지는 또한 표준 세포 배양 배지이고, 호르몬 및 트랜스페린과 조합하여 혈청과 함께 사용하는 경우, 다종 다양한 포유동물 및 하이브리도마를 배양하기 위해 초기에 설계된 영양소 혼합물이다(론자로부터 햄의 F12 배지의 데이터 시트를 나타내는 도 2 참조). 임의의 상업적으로 이용가능한 햄의 F12 배지(예를 들면, 써모피셔 사이언티픽(카탈로그 번호 11765-054), 시그마 알드리히(카탈로그 번호 N4888) 또는 론자로부터, 새로운 공급업자까지)를 본 발명에서 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 론자로부터의 햄의 F12 배지를 사용한다.
"DMEM/F12" 또는 "DMEM:F12"란, DMEM과 햄의 F12 배양 배지의 1:1 혼합물을 의미한다(론자로부터의 DMEM:F12(1:1) 배지의 데이터 시트를 나타내는 도 3 참조). 또한, DMEM/F12(1:1) 배지는 다수의 상이한 포유동물 세포의 성장을 서포트하기 위한 광범위하게 사용된 기초 배지이고, 써모피셔 사이언티픽(카탈로그 번호 11330057), 시그마 알드리히(카탈로그 번호 D6421) 또는 론자 등의 다양한 공급업자로부터 상업적으로 이용가능하다. 임의의 상업적으로 이용가능한 DMEM:F12 배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 사용된 DMEM:F12 배지는 카탈로그 번호 12-719F(이는 L-글루카민, 15mM HEPES 및 3.151g/L 글루코즈를 갖는 DMEM:F12이다)하에 론자로부터 이용가능한 DMEM/F12(1:1) 배지이다.
"M171"이란, 배양 배지 171을 의미하고, 이는 정상 인간 유선 상피 세포의 배양 또는 성장을 위한 기초 배지로서 개발되었다(라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation)으로부터 M171 배지에 대한 데이터 시트를 나타내는 도 4 참조). 또한, 이러한 기초 배지는 광범위하게 사용되고, 예를 들면, 써모피셔 사이언티픽 또는 라이프 테크놀로지스 코포레이션(카탈로그 번호 M171500) 등의 공급업자로부터 상업적으로 이용가능하다. 임의의 상업적으로 이용가능한 M171 배지를 본 발명에서 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 사용된 M171 배지는 카탈로그 번호 M171500하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션으로부터 이용가능한 M171 배지이다.
"FBS"란, 소태아 혈청(이는 또한 "소태아 혈청"으로 지칭됨), 즉 혈액의 자연 응고 후, 이어서 원심분리하여 임의의 잔류하는 적혈구 세포를 제거한 후에 잔류하는 혈액 분획을 의미한다. 소태아 혈청은, 항체 수준이 매우 낮고 보다 많은 성장 인자를 함유하기 때문에 진핵 세포의 시험관내 세포 배양을 위해 가장 광범위하게 사용되는 혈청-보충제이고, 다수의 상이한 세포 배양 적용에서 범용성을 가능하게 한다. FBS는 바람직하게는, 적절한 원산지 추적성, 표지화의 진실성 및 적절한 표준화 및 감시를 통하여 혈청 및 동물 유래 생성물의 안전성 및 안전한 이용을 첫째로 중요시하는 국제 혈청 공업 위원회(International Serum Industry Association (ISIA))의 멤버로부터 수득한다. ISIA 멤버인 FBS의 공급업자는, 몇가지만 언급하면, 아바토와르 베이직스 컴파니(Abattoir Basics Company), 애니멀 테크놀로지스 인코포레이티드(Animal Technologies Inc.), 비오민 바이오테크놀로지아(Biomin Biotechnologia) LTDA, GE 헬스케어(Healthcare), 기브코 바이 써모피셔 사이언티픽 앤드 라이프 사이언스 프로덕션(Gibco by Thermo Fisher Scientific and Life Science Production)이다. 현재의 바람직한 실시형태에서, FBS는 카탈로그 번호 A15-151하에 GE 헬스케어로부터 수득한다.
이제 본 발명의 배양 배지로 돌아가서, 배양 배지는, 창상 치유 특성을 유도 또는 개선하기 위해 또는 중간엽 줄기 세포의 단리 또는 배양을 위해, DMEM을 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)로, F12를 최종 농도 약 5 내지 15%(v/v)로, M171을 최종 농도 약 15 내지 30%(v/v)로, 및 FBS를 최종 농도 약 1 내지 8%(v/v)로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "%(v/v)"의 값은, 배양 배지의 최종 용적에 대한 각 성분의 용적을 지칭한다. 이는, 예를 들면, DMEM이 배양 배지에 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)로 존재하는 경우, 1리터의 배양 배지가 약 550 내지 650ml DMEM을 함유하는 것을 의미한다.
다른 실시형태에서, 배양 배지는 DMEM을 최종 농도 약 57.5 내지 62.5%(v/v)로, F12를 최종 농도 약 7.5 내지 12.5%(v/v)로, M171을 최종 농도 약 17.5 내지 25.0%(v/v)로 및 FBS를 최종 농도 약 1.75 내지 3.5%(v/v)로 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 배양 배지는 DMEM을 최종 농도 약 61.8%(v/v)로, F12를 최종 농도 약 11.8%(v/v)로, M171을 최종 농도 약 23.6%(v/v)로 및 FBS를 최종 농도 약 2.5%(v/v)로 포함할 수 있다.
상기 성분에 추가하여, 배양 배지는, 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 배양에 유리한 보충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는, 예를 들면, 상피 성장 인자(EGF)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, EGF는 배쟝 배지에 최종 농도 약 1ng/ml 내지 약 20ng/ml로 존재할 수 있다. 이들 일부 실시형태에서, 배양 배지는 EGF를 최종 농도 약 10ng/ml로 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 또한 인슐린을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 인슐린은 최종 농도 약 1㎍/ml 내지 10㎍/ml로 존재할 수 있다. 이들 일부 실시형태에서, 배양 배지는 인슐린을 최종 농도 약 5㎍/ml로 포함할 수 있다.
배양 배지는 추가로 하기 보충제 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다: 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3). 이러한 실시형태에서, 배양 배지는 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)의 3개 모두를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, 배양 배지는 아데닌을 최종 농도 약 0.05 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌으로, 하이드로코르티손을 최종 농도 약 1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손으로 및/또는 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 한 가지 실시형태에서, 제대 조직 또는 태반 등의 조직은, 제대 라이닝 줄기 세포, 와튼 젤리 또는 태반 줄기 세포 등의 적절한 수의 (일차) 중간엽 줄기 세포가 조직으로부터 성장할 때까지 배양할 수 있다. 전형적 실시형태에서, 제대 조직은, 각 조직의 중간엽 줄기 세포의 성장이 약 70 내지 약 80% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 배양된다. 본원에서, 용어 "컨플루언시" 또는 "컨플루언스"는 세포 배양의 기술에서 이의 통상적 의미로 사용되고, 배양 접시 또는 플라스크에서 부착 세포의 수의 추정/지표로서 사용되며, 세포에 의해 덮여 있는 표면의 비율을 지칭하는 것에 유의한다. 예를 들면, 50% 컨플루언스는, 표면의 대략 절반이 덮여 있고 여전히 세포가 성장할 여지가 있다는 것을 의미한다. 100% 컨플루언스는 표면이 세포에 의해 완전히 덮여 있고 세포가 단층으로서 성장할 여지가 없다는 것을 의미한다.
적합한 수의 일차 세포(중간엽 줄기 세포)가 조직 외식편에 의해 각 조직으로부터 수득되면, 중간엽 줄기 세포를 배양에 사용된 배양 용기로부터 제거한다. 이렇게 함으로써, 예를 들면, 제대 또는 태반의 (일차) 단리된 중간엽 줄기 세포를 함유하는 마스터 세포 뱅크를 수득할 수 있다. 전형적으로, 이러한 중간엽 줄기 세포는 부착 세포이기 때문에, 세포의 회수는 표준 효소 처리를 사용하여 수행한다. 예를 들면, 효소 처리는 국제 미국 특허 출원 제2006/0078993호, 국제 특허 출원 제WO2006/019357호 또는 국제 특허 출원 제WO2007/046775호에 기재된 바와 같은 트립신처리(trypsination)를 포함할 수 있고, 세포의 성장은 추가 확장을 위해 트립신처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)에 의해 회수할 수 있음을 의미한다. 회수된 중간엽 줄기 세포가, 예를 들면, 마스터 세포 뱅크의 생성에 사용되는 경우, 세포를 또한 하기 본원에서 설명된 바와 같이 추가로 사용하기 위해 동결 보존 및 저장할 수 있다.
회수되면, 중간엽 줄기 세포를 계대배양용의 배양 용기로 이송할 수 있다. 계대배양 또는 배양(두 용어는 이하 호환적으로 사용된다)는 또한, 이전에 이의 자연 환경으로부터 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단이 사용되는 경우에 수행될 수 있다(상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용된 이러한 단리된 줄기 세포는 제대혈, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래할 수 있지만, 또한 제대 조직 또는 태반 조직으로부터 유래할 수 있다). 계대배양은 또한 동결된 일차 세포, 즉 마스터 세포 뱅크로부터 개시할 수 있다. 계대배양을 위해, 임의의 적합한 양의 세포를 세포 배양 플레이트 등의 배양 용기에 파종할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 중간엽 세포는, 예를 들면, 약 0.5×106 세포/ml 내지 약 5.0×106 세포/ml의 농도로 계대배양하기 위해 적합한 배지(가장 편리하게는, 본 발명의 배양 배지)에 현탁시킬 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포는 약 1.0×106 세포/ml의 농도로 계대배양하기 위해 현탁시킨다. 계대배양은 단일 배양 플라스크, 그러나 또한, 예를 들면, 다층 시스템, 예컨대, 인큐베이터에서 점착할 수 있는 셀스택(CellStacks)(Corning, Corning, NY, USA) 또는 셀팩토리(Cellfactory)(Nunc, part of Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양함으로써 수행할 수 있다. 또는, 계대배양은 또한 밀폐된 자가-급식 시스템, 예컨대, 생물반응기에서 수행할 수 있다. 상이한 설계의 생물반응기, 예를 들면, 평행-플레이트, 중공-섬유 또는 마이크로-유체 생물반응기는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Sensebe et al."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", supra]을 참조한다. 상업적으로 이용가능한 중공-섬유 생물반응기의 예시적 예는 퀀텀(Quantum®) 세포 확장 시스템(Terumo BCT, Inc)이고, 이는, 예를 들면, 임상 시험을 위한 골수 중간엽 줄기 세포의 확장에 사용되어 왔다[참조: Hanley et al, Efficient Manufacturing of Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells Using the Quantum Cell Expansion System, Cytotherapy. 2014 August ; 16(8): 1048-1058]. 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단의 계대배양에 사용될 수 있는 상업적으로 이용가능한 생물반응기의 또 다른 예는 GE 헬스케어로부터 이용가능한 주리(Xuri) 세포 확장 시스템이다. 퀀텀® 세포 확장 시스템 등의 자동화 시스템에서 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양은, 치료적 적용을 위한 작동 세포 뱅크가 GMP 조건하에 생성되어야 하고 다수의 세포가 필요한 경우에 특히 유익하다.
본 발명의 중간엽 줄기 세포의 계대배양은 본 발명의 배양 배지에서 수행한다. 따라서, 본 발명의 배양 배지는, 예를 들면, 태반의 양막 또는 양막 또는 제대의 와튼 젤리로부터 단리하기 위해 및 계대배양에 의해 단리된 일차 세포의 후속 배양 둘 다에 사용될 수 있다. 또한, 계대배양의 경우, 중간엽 줄기 세포는, 적합한 양의 세포가 성장할 때까지 배양할 수 있다. 예시적 실시형태에서, 중간엽 줄기 세포는, 중간엽 줄기 세포가 약 70 내지 약 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 계대배양된다.
중간엽 줄기 세포 모집단의 모집단의 단리/배양은 포유동물 세포의 배양을 위한 표준 조건하에 수행할 수 있다. 전형적으로, 중간엽 줄기 세포의 모집단을 단리하는 본 발명의 방법은 전형적으로, 세포가 유래하는 종의 세포 배양에 통상 사용되는 조건(온도, 분위기)하에 수행된다. 예를 들면, 인간 제대 조직 및 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포는 각각 37℃에서 5% CO2를 갖는 분위기에서 통상 배양된다. 이러한 문맥에서, 본 발명에서 중간엽 세포 모집단은 임의의 포유동물 종, 예컨대, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 돼지, 래빗, 염소, 말, 개, 고양이, 양, 원숭이 또는 인간으로부터 유래할 수 있음에 유의하고, 인간 기원의 중간엽 줄기 세포가 한 가지 실시형태에서 바람직하다.
목적하는/적합한 수의 중간엽 줄기 세포가 배양물 또는 계대배양물로부터 수득되면, 중간엽 줄기 세포는 이들을 계대배양에 사용된 배양 용기로부터 제거하여 회수한다. 중간엽 줄기 세포의 회수는 전형적으로 또한, 세포의 트립신처리를 포함하는 효소 처리에 의해 수행된다. 단리된 중간엽 줄기 세포를 후속적으로 수집하고, 직접 사용하거나 추가 사용을 위해 보존한다. 전형적으로, 보존은 동결-보존에 의해 수행한다. 용어 "동결-보존"은, 중간엽 줄기 세포가 0℃ 이하 온도, 예컨대, (전형적으로) -80℃ 또는 -196℃(액체 질소의 비점)로 냉각시킴으로써 보존되는 프로세스를 기재하기 위해 이의 통상의 의미로 본원에서 사용된다. 동결-보존은 당업자에게 공지된 바와 같이 수행할 수 있고, 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 글리세롤 등의 동결-방지제의 사용을 포함할 수 있으며, 이는 제대의 세포에서 아이스-결정의 형성을 지연시킨다.
본 발명의 배양 및/또는 단리 방법에 의해 수득되는 중간엽 줄기 세포의 단리된 모집단은 고도로 정의되고 균질하다. 이 방법의 전형적 실시형태에서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포는 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현한다. 또한, 이들 실시형태에서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포는 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여할 수 있거나 결여한다. 특정 실시형태에서, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단은 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다.
따라서, 상기 개시에 따라, 본 발명은 또한, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단 또는 제대 중간엽 줄기 세포 모집단(예를 들면, 와튼 젤리 또는 제대 양막으로부터 단리됨) 등의 중간엽 줄기 세포 모집단으로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 중간엽 줄기 세포 모집단에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 세포는 CD73+, CD90+ 및 CD105+이고, 이는 단리된 세포 모집단의 이러한 퍼센트가 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 것을 의미한다(본 출원의 실험 섹션 참조). 또한, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포는 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다. 특정 실시형태에서, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단은 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다. 제대 양막으로부터 유래하는 중간엽 줄기 세포의 이러한 고도 균일성 모집단은 본원에서 최초로 보고되었고, 세포 치료에 사용되는 중간엽 줄기 세포에 대한 기준을 만족시킨다(또한, 실험 섹션 및, 예를 들면, 상기 문헌[참조: Sensebe et al."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review"] 참조). 이러한 문맥에서, 이러한 중간엽 줄기 세포 모집단은 본 발명의 단리 방법, 그러나 또한, 필요한 경우, 세포 선별 등의 상이한 방법에 의해 수득할 수 있음에 유의한다. 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상 세포가 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 본 발명의 제대의 이러한 중간엽 줄기 모집단의 한 가지 실시형태에서, 제대 양막으로부터 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단은 제외된다.
상기에 따라, 본 발명은 또한, 본원에 기재된 중간엽 줄기 모집단을 포함하는 약제학적 조성물로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, 임의로, CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있고, 임의의 목적하는 약제 투여 방식을 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들면, 전신 또는 국소 적용에 적합시킬 수 있다. 관련 국면에서, 본 발명은 또한, 유일한 창상 치유 단백질로서 Ang-1, TGF-β1, VEGF 또는 HGF 중의 3개 또는 4개를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 약제학적 조성물은, 예를 들면, 0.9% 생리식염수, 링거 용액 또는 인산염 완충된 생리식염수(PBS), 또는 동결건조물/동결-건조 제형 등의 약제학적으로 허용되는 완충액을 사용하여 액체로서 제형화된다.
추가의 국면에서, 본 발명은, 창상 치유 특성을 유도 또는 개선하고/하거나 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하기 위한 배양 배지를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 500ml 배양 배지를 수득하기 위해
i. 250ml의 DMEM
ii. 118ml M171
iii. 118ml DMEM/F12
iv. 최종 농도 2.5%(v/v)를 달성하는 12.5ml 소태아 혈청(FBS)를 혼합하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
상기 설명된 바와 같이, DMEM/F12 배지는 DMEM 및 햄의 F12 배지의 1:1 혼합물이다. 따라서, 118ml DMEM/F12 배지는 59ml DMEM 및 59ml F12를 함유한다. 따라서, 배양 배지를 제조하는 이러한 방법을 사용하는 경우, 500ml 최종 농도를 만족하는 최종 농도(v/v)는 다음과 같다:
DMEM: 250ml + 59ml = 309 ml, 309/500 = 61.8%(v/v)에 상응
M171: 118ml, 118/500 = 23.6%(v/v)에 상응
F12: 59ml, 59/500 = 11.8%(v/v)에 상응.
추가로, 배양 배지를 제조하는 이러한 방법의 실시형태는
v. 10ng/ml의 최종 EGF 농도를 달성하는 1ml EGF 스톡 용액(5㎍/ml), 및
vi. 5㎍/ml의 최종 인슐린 농도를 달성하는 인슐린 0.175ml 스톡 용액(14.28mg/ml)을 첨가하는 것을 포함한다.
이들 실시형태에서, 혼합하는 경우, 이들 성분 i. 내지 vi의 상술한 용적은 499.675ml 배양 배지의 최종 용적을 제공하는 것에 유의한다. 추가 성분이 배양 배지에 첨가되지 않는 경우, 잔여 성분 0.325ml(500ml의 용적이 되도록 첨가하는)는, 예를 들면, 임의의 성분 i. 내지 iv일 수 있고, 이는 DMEM, M171, DMEM/F12 또는 FBS 중의 어느 하나를 의미한다. 또는, EGF 또는 인슐린의 스톡 용액의 농도는 물론 배양 배지의 전체 용적이 500ml로 되도록 조정될 수 있다. 또한, 성분 i. 내지 iv는 이들이 수록된 순서로 반드시 첨가되어야 하는 것이 아니라, 이들 성분을 혼합하여 본 발명의 배양 배지에 도달하는 임의의 순서를 사용할 수 있음에 유의한다. 이는, 예를 들면, M171 및 DMEM/F12가 함께 혼합된 다음, DMEM 및 FBS와 조합되어 본원에 기재된 최종 농도, 즉 약 55 내지 65%(v/v)의 DMEM의 최종 농도, 약 5 내지 15%(v/v)의 F12의 최종 농도, 약 15 내지 30%(v/v)의 M171의 최종 농도 및 약 1 내지 8%(v/v)의 FBS의 최종 농도에 도달하는 것을 의미한다.
다른 실시형태에서, 이 방법은 DMEM에 하기 보충제 중의 하나 이상을 0.325ml의 용적으로 첨가하여 500ml 배양 배지의 전체 용적에 도달하는 것을 추가로 포함한다: 아데닌, 하이드로코르티손, 3,3',5-요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3). 이러한 실시형태에서, DMEM 중의 이들 보충제의 최종 농도는 다음과 같을 수 있다:
약 0.05 내지 0.1㎍/ml 아데닌, 예를 들면, 약 0.025㎍/ml 아데닌,
약 1 내지 10㎍/ml 하이드로코르티손,
약 0.5 내지 5ng/ml 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3), 예를 들면, 1.36ng/ml 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3).
상기 개시에 따라, 본 발명은 또한, 본원에 기재된 배지를 제조하는 방법에 의해 수득할 수 있거나 수득되는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또한 제대의 양막으로부터 중간엽 줄기 세포를 단리하는 방법으로서, 이 방법이 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 배양 배지에서 양막 조직을 배양하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한
- 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)의 DMEM,
- 최종 농도 약 5 내지 15%(v/v)의 F12,
- 최종 농도 약 15 내지 30%(v/v)의 M171 및
- 최종 농도 약 1 내지 8%(v/v)의 FBS
를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
본원에 기재된 배양 배지의 특정 실시형태에서, 배지는 DMEM을 최종 농도 약 57.5 내지 62.5%(v/v)로, F12를 최종 농도 약 7.5 내지 12.5%(v/v)로, M171을 최종 농도 약 17.5 내지 25.0%(v/v)로 및 FBS를 최종 농도 약 1.75 내지 3.5%(v/v)로 포함한다. 다른 실시형태에서, 배양 배지는 DMEM을 최종 농도 약 61.8%(v/v)로, F12를 최종 농도 약 11.8%(v/v)로, M171을 최종 농도 약 23.6%(v/v)로 및 FBS를 최종 농도 약 2.5%(v/v)로 포함할 수 있다.
또한, 배양 배지는 상피 성장 인자(EGF)를 최종 농도 약 1ng/ml 내지 약 20ng/ml로 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 배지는 EGF를 최종 농도 약 10ng/ml로 포함한다. 본원에 기재된 배양 배지는 인슐린을 최종 농도 약 1㎍/ml 내지 10㎍/ml로 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 배양 배지는 인슐린을 최종 농도 약 5㎍/ml로 포함할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 적어도 하나의 하기 보충제를 추가로 포함할 수 있다: 아데닌, 하이드로코르티손, 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3). 특정 실시형태에서, 배양 배지는 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)의 3개 모두를 포함한다. 존재하는 경우, 배양 배지는 아데닌을 최종 농도 약 0.01 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌 또는 약 0.05 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌으로, 하이드로코르티손을 최종 농도 약 0.1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손 또는 약 1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손으로 및/또는 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml로 포함할 수 있다.
세포 배양 배지의 실시형태에서, 본 발명의 500ml의 세포 배양 배지는
i. 250ml의 DMEM
ii. 118ml M171
iii. 118ml DMEM/F12
iv. 12.5ml 소태아 혈청(FBS)(2.5%의 최종 농도)를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 세포 배양 배지는
v. 최종 농도 10ng/ml의 EGF 및
vi. 최종 농도 5㎍/ml의 인슐린
을 포함한다.
인슐린 및 EGF 둘 다는, 배양 배지의 전체 용적이 500ml를 초과하지 않도록, 선택된 스톡 용액을 사용하여 배양 배지에 첨가할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 배양 배지의 성분 i. 내지 vi는 도 5에 나타낸 성분이고, 이는 이들이 도 5에 나타낸 카탈로그 번호를 사용하여 각각의 제조업자로부터 수득된다는 것을 의미한다. 도 5에 나타낸 바와 같은 성분 i. 내지 vi를 혼합하여 수득되는 배지는 또한 본원에서 "PTT-6"으로서 지칭된다. 또한, 이러한 맥락에서, 임의의 기타 상업적 공급업자의 항생제 등의 임의의 다른 성분 뿐만 아니라 성분 i. 내지 vi는 본 발명의 배지를 제조하는데 사용될 수 있음에 유의한다.
또한, 본 발명의 세포 배양 배지는 아데닌을 최종 농도 약 0.01 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌 또는 약 0.05 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌으로, 하이드로코르티손을 최종 농도 약 0.1 내지 10㎍/ml, 약 0.5 내지 약 10㎍/ml 또는 약 1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손으로 및/또는 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 최종 농도 약 0.1 내지 약 5ng/ml 또는 약 0.5 내지 약 5ng/ml로 포함할 수 있다.
최후로, 본 발명은 또한 질환을 갖거나 병태를 앓고 있는 비-인간 포유동물(예컨대, 몇가지만 말하지면, 고양이, 개, 말) 또는 인간 환자를 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 줄기 세포 모집단 또는 줄기 세포 모집단을 함유하는 약제학적 조성물을 비-인간 포유동물 또는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다. 질환은 임의의 질환 또는 병태, 특히 창상의 치유가 요망/필요한 임의의 질환 또는 병태일 수 있다. 대상체(환자 또는 비-인간 포유동물)은 화상, 벌레물림, 외상, 수술, 또는 피부 질환 또는 대사성 장애 등의 질환에 의해 유발되는 창상을 앓고 있을 수 있다. 이러한 대사성 장애의 예로서, 환자는, 예를 들면, I형 또는 II형 당뇨병으로 고통받거나 만성 족부 궤양을 앓고 있을 수 있다. 대상체를 치료하기 위해, 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단은, 예를 들면, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 국소 투여, 이식 또는 주사를 포함하는 임의의 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 원칙적으로, 본원에서는 임의 방식의 국소 투여를 의미한다. 중간엽 줄기 세포 모집단을 투여하는 것은 시린지에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 또한, 중간엽 줄기 세포를 대상체에게 적용하기 전에 크림, 연고, 겔, 현탁액 또는 임의의 기타 적합한 물질 내의 중간엽 줄기 세포에 접촉시킬 수도 있다. 이어서, 줄기 세포 모집단을, 예를 들면, 화상 또는 당뇨병성 창상 등의 창상에 직접 배치할 수 있다(국제 특허 출원 제WO2007/046775호 참조). 대상체에게 적용한 후, 중간엽 줄기 세포 모집단은, 예들 들면, 테가데름(Tegaderm®) 드레싱 및 테가데름 드레싱을 덮는 크레이프 붕대 등의 드레싱에 의해 그 장소에 유지할 수 있다. 또는 줄기 세포 모집단은, 예를 들면, 피부하에, 체지방 또는 복막 내에 직접 피하 이식할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 중간엽 줄기 세포 모집단을 약 2천만 세포, 약 1천5백만 세포, 약 1천만 세포, 약 5백만 세포, 약 4백만 세포, 약 3백만 세포, 약 2백만 세포, 약 1백만 세포, 약 50만 세포, 약 25만 세포 또는 25만 세포 이하로 포함하는 단위 용량에 관한 것이다.
또한, 단위 용량은 약 1천만, 약 9백만, 약 8백만, 약 7백만, 약 6백만, 약 5백만, 약 4백만, 약 3백만, 약 2백만, 약 1백만, 약 50만, 약 25만, 또는 약 10만 세포를 포함하는 것도 상정된다. 바람직하게는, 단위 용량은 약 1천만 세포를 포함한다. 추가로, 단위 용량은 약 1000 세포 내지 약 5백만 세포를 포함하는 것도 상정된다. 단위 용량은 약 100,000 세포, 300,000 세포, 또는 500,000 세포의 용량으로 적용할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 단위 용량은, 특히, 창상 치유에 사용되는 경우, 국소 적용할 수 있다. 예를 들면, 단위 용량은 cm2당 국소 적용할 수 있다.
필요한 경우, 단위 용량은 1주 1회, 2회, 3회 이상 적용할 수 있다. 예를 들면, 단위 용량은 1주 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회 이상 적용할 수 있다. 약 100,000 세포, 약 300,000 세포 또는 약 500,000 세포를 포함하는 단위 용량은 8주간, 바람직하게는 1cm2으로 1주 2회 적용할 수 있다.
단위 용량은 임의의 적합한 용기에 함유될 수 있다. 예를 들면, 단위 용량은 1ml 바이알에 함유될 수 있다. 이러한 경우, 예를 들면, 0.1ml의 바이알이 대상체에게, 바람직하게는 cm2당 적용될 수 있다. 또는, 단위 용량은 시린지에 함유될 수 있다.
본 발명의 단위 용량은 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 액체 담체와 접촉시킬 수 있다. 담체는 임의의 공지된 담체, 예컨대, 하이포써모솔(HypoThermosolTM), 하이포써모솔(HypothermosolTM)-FRS 또는 플라즈마라이트(플라즈마라이트)일 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 본 발명의 중간엽 줄기 세포 모집단의 (단위 용량)을 위한 캐리어로서 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, 중간엽 줄기 세포는 투여 전에 담체로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 대상체에게 투여하기 전에, 세포를 원심분리 및 단리할 수 있다.
본 발명의 치료 방법 및 단위 용량은 생존 세포의 이용을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포 모집단의 생존력은 공지된 방법, 예를 들면, 실험 섹션에 기재된 바와 같이 트리판 블루에 의한 염색으로 시험할 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실험 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
본 발명은 하기 비-제한적 실험 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
본원에서 사용된 서열은 하기 표 1에 도시되어 있다.
Figure pct00001
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실험 실시예
1. 중간엽 줄기 세포의 단리 전에 제대 조직의 동결보존
제대 조직(제대는 모체의 정보제공 동의로 나타냈다)은 다음과 같이 제대 양막으로부터 중간엽 줄기 세포의 후속 단리를 위해 처리했다.
1.1 제대 조직 샘플의 세척:
a. 메스를 보호 커버로부터 제거한다.
b. 겸자를 사용하여 제대를 메스로 유지하고, 메스를 사용하여 제대를 10cm 길이 조각으로 절단한다. 사용할 수 없는 제대를 본래 조직 컵으로 다시 배치한다.
c. 10cm 길이의 제대 조각을 새로운 150mm 배양 접시로 이송한다. 150mm 배양 접시를 컵 대신에 사용할 수 있다.
d. 150mm 배양 접시의 커버를 겸자 및 메스의 휴식 장소로서 사용한다.
e. 25ml 플라즈마라이트 A(Baxter, Catalog # 2B2543Q)를 30ml 시린지로 제거한다. 한손을 사용하여 시린지를 45° 각도에서 유지하고, 플라즈마라이트 A를 직접 제대 조직에 분주한다.
f. 배양 접시를 약간 경사지게 유지하고, 플라즈마라이트 A를 30ml 시린지 및 무딘 바늘로 제거한다.
g. 사용된 플라즈마라이트 A를, 쓰레기통으로 기능하는 300ml 이송 백에 수집하고, 이를 생물위험 통으로 폐기한다.
h. 필요한 경우, 각 세척에 대해 새로운 배양 접시를 사용하여 세척 공정을 반복한다. 표면 상의 모든 혈전을 제거하는 것을 확인해야 한다. 조직을 세정할 필요가 있는 경우, 추가의 플라즈마라이트 A를 사용할 수 있다.
i. 새로운 표지된 조직 배양 접시에 조직을 넣어, 조직의 절단을 계속한다. 20ml의 플라즈마라이트 A를 접시에 넣고, 절단 중에 조직이 건조되지 않도록 한다.
j. 제대를 균등한 대략 1cm 절편으로 절단하여 합계 10개 섹션을 제공한다.
k. 각각 1cm 섹션을 섹션당 대략 0.3cm×0.3cm 내지 0.5cm×0.5cm의 보다 작은 조각으로 절단한다.
l. 접시에 있는 임의의 플라즈마라이트 A를 제거한다.
m. 본래의 플라즈마라이트 A 백으로부터 25ml 플라즈마라이트 A를 인출하고, 제대 조직 조각에 직접 분주한다.
n. 배양 접시를 소정 각도로 유지하고, 편측의 조직을 세정하기 위해 사용된 모든 플라즈마라이트 A를 수집하고, 시린지 및 무딘 바늘로 이를 제거한다.
o. 한번 더 세정을 반복한다. 혈전은 잔류하지 않아야 한다.
주: 제대가 즉시 동결되지 않은 경우, 동결 준비가 될 때까지 제대 조직을 플라즈마라이트 A에서 유지한다.
1.2 제대 조직의 동결보존:
a. 동결보존 용액을 준비한다:
i. 60% 플라즈마라이트 A, 30%의 5% 인간 혈청 알부민, 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 이루어진 50ml 동결 용액을 준비한다.
ii. 150ml 이송 백을 "조직 동결 용액"으로 표지하고, 무균 기술을 사용하는 포트에 플라즈마 이송 세트를 부착한다.
iii. 본래의 플라즈마라이트 A 백으로부터 30ml 시린지로 30ml 플라즈마라이트 A를 제거하고, 용액을 제조한 시간 및 일에서 이송 백 표지된 "조직 동결 용액"에 이를 이송한다.
iv. 15ml의 5% 인간 혈청 알부민을 20ml 시린지로 제거하고, 이를 표지된 이송 백에 이송한다.
v. 5ml DMSO를 이송 백에 첨가한다.
vi. 잘 혼합하고, 동결 용액의 혼합을 기록한다.
b. 동결 용액을 첨가하기 전에, 조직으로부터 플라즈마라이트 A를 제거한다.
c. 60ml 시린지를 사용하여, 50ml의 모든 동결 용액을 시린지에 인출하고, 제대 조직을 함유하는 150ml 세포 배양 접시에 대략 30ml 동결 용액을 첨가한다. 이를 무균으로 유지하기 위해 시린지에 무딘 바늘을 위치시킨다.
d. 조직 및 동결 용액을 함유하는 배양 접시를 10분 동안 매분 회전시킨다.
e. 겸자를 사용하여, 랜덤으로 선택된 8개의 섹션을 선택하고, 4개의 4ml 크리오바이알의 각각에 배치한다. 랜덤으로 선택된 4개 섹션을 선택하고, 이를 1개의 1.8ml 크리오바이알에 배치한다. 이들 섹션은 혈전을 포함하지 않아야 한다.
f. 제대 조직을 함유하는 각각의 크리오바이알에, 잔류 동결 용액을 4ml 튜브의 3.6ml 충전 라인 및 1.8ml Nunc 바이알의 1.8ml 라인에 충전시킨다.
g. 1개의 박텍 리틱(Bactec Lytic)/10-아나에로빅(Anaerobic)/F 및 박텍 플러스 에로빅/F 병에 조직 ID를 표지한다.
h. 시린지 및 무딘 바늘로 20ml 동결 용액을 제거하고, 박텍 바이알을 알콜 면봉으로 닦아낸 후, 무딘 바늘을 18g 바늘로 교환하고, 호기성 및 혐기성 박텍 병에 각각 10ml를 접종한다.
i. 수집된 속도의 동결기를 개시한다.
j. 조절된 속도의 동결을 완료한 후, 추가로 사용할 때까지 연속 온도 모니터링된 액체 질소 동결기에 유닛을 위치시킨다.
2. 제대 조직으로부터 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 단리
2.1. 제대 조직으로부터 MSC를 처리하기 위한 배지의 준비 :
a. 500ml PTT-6(배양/성장 배지)를 제조하기 위해, 하기를 수록된 순서로 첨가한다:
i. DMEM, 250ml
ii. M171 118ml
iii. DMEM F12 118ml
iv. FBS 12.5ml(최종 농도 2.5%)
v. EGF 1ml(최종 농도 10ng/ml)
vi. 인슐린 0.175ml(최종 농도 5㎍/ml)
499.675ml의 최종 용적을 제공하는 경우, 성분 i. 내지 vi의 상술된 용적을 배양 배지에 첨가한다. 추가의 성분이 배양 배지에 첨가되지 않는 경우, 잔류 0.325ml(500ml의 용적까지 첨가하기 위해)는, 예를 들면, 임의의 성분 i. 내지 iv일 수 있고, 이는 DMEM, M171, DMEM/F12 또는 FBS를 의미한다. 또는, EGF 또는 인슐린의 스톡 용액의 농도는 물론, 배양 배지의 합계 용적이 500ml로 되게 하도록 조정될 수 있다. 또는, 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 등의 항생물질의 스톡 용액을 첨가하여 500ml의 최종 용적을 제공할 수 있다. 또한, 하기 보중제: 아데닐, 하이드로코르티손, 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3) 중의 하나 이상을 0.325ml의 용적으로 배양 배지에 첨가하여, 500ml 배양 배지의 합계 용적에 도달하게 할 수 있다.
vii. 병 "PTT-6"에, 배지를 제조한 일자, 운영자의 이니셜, 및 문구 "만료", 이어서 만료일을 표지한다. 만료일은 임의의 성분의 최초 만료일 또는 제조일로부터 1개월중 가장 빠른 일자이다.
b. 세정 배지(칼슘 또는 마그네슘을 포함하지 않고 5% FBS를 포함하는 행크 완충된 염 용액(HBSS))를 제조하기 위해, 2.5ml FBS를 50ml 원심분리 튜브에서 47.5ml의 HBSS에 첨가한다. 튜브 "세정 배지"에 운영자 이니셜, 및 배지를 제조한 일자를 표지한다.
c. 모든 배지는 박텍 리틱/10-아나에로빅/F(Becton Dickinson & Company) 및 박텍 플러스 + 에로빅/F(Becton Dickinson & Company)를 사용하여 무균성에 대해 시험될 것이다. 20ml의 제조된 배지를 각 병에 주입한다.
2.2 MSC 수집을 위한 제대 조직의 해동:
a. 운영자가 청정실에서 샘플을 처리하기 위해 준비하면, 해동을 개시한다. 바이알이 동일한 공여체로부터 기원하지 않는 경우, 한번에 복수의 바이알을 해동시키지 않아야 한다.
b. 수욕을 소독제, 이어서 70% 이소프로판올로 닦아 내고, 여기에 1L 멸균수를 충전시킨다. 수욕을 36 내지 38℃까지 가열시킨다.
c. 생물안전 캐비넷하에 청정실에서 70% 내지 90% 플라즈마라이트 A로 이루어진 10ml의 세정 배지를 준비한다. 용액을 10ml 시린지에 부착된 0.2-㎛ 시린지로 멸균 여과하고, 용액을 사용할 때까지 냉동 상태로 유지한다.
d. 50ml 원추형 튜브에 처리 표지를 위치시킨다.
e. 수욕 온도가 36 내지 38℃인 것을 확인한다.
f. 액체 질소 저장소로부터 조직의 바이알(들)을 취하고, 1L의 멸균수가 충전된 37℃ 수욕에서 신속하게 해동시킨다. 프로스티 날겐(Frosty Nalgene)씨의 크리오 1℃ 냉동 용기를 위한 바이알 홀더를 그 장소에서 바이알로 부유시키고, 샘플을 해동할 때에 부유 랙으로서 사용할 수 있다.
g. 수욕으로부터 바이알을 제거하고, 이들에게 70% 이소프로판올 용액을 분무한다. 수욕으로부터 바이알을 인출하는 적합한 시간은 작은 아이스가 바이알에 부유하는 것을 볼 수 있는 때이다 - 이는 바이알의 내부 온도가 37℃ 미만인 것을 시사한다.
h. 바이알을 패스-스로우에 위치시키고, 청정실 처리 기술자에게 경고한다.
2.3 조직 처리의 준비:
a. 제대 조직 처리는 환경을 모니터링(EM)하는 청정실에서 수행되어야 한다: 각 시프트의 말기에, 전체 실내 및 후드 정화를 수행한다.
b. 생물안전 캐비넷을 준비/세정한다.
c. 생물안전 캐비넷에서 작업하는 동안 생존가능한 입자 계수를 수행한다.
d. 필요한 모든 공급품을 생물안전 캐비넷에서 조립하여, 팩키지 손상 및 만료일에 대해 각각 검사한다. 시린지, 혈청학적 피펫, 멸균 겸자, 메스, 조직 플레이트 및 바늘을 취급할 때, 멸균 제품과 접촉하는 임의의 표면에 접촉하지 않도록 해야 한다. 안전하게 취급할 수 있는 것은 시린지 배럴, 튜브, 플런저 팁 및/또는 바늘 캡 또는 시스의 외측 뿐이다. 표면이 접촉되었거나 비-멸균 표면에 접촉한 경우에는 공급물을 폐기한다.
e. 사용되는 모든 시약 및 공급물의 로트 번호 및 만료일(해당하는 경우)을 기록한다.
f. 생물안전 캐비넷으로 이송하기 전에 70% 알콜로 습윤화시킨 보푸라기 없는 와이프로 바이알을 세정함으로써 해동된 바이알을 수용한다.
g. 시린지를 갖는 흡인 바늘을 사용하여, 바이알로부터 가능한 많은 액체를 회수한다. 조직을 흡인하는 것을 피한다.
h. 멸균 겸자를 사용하여, 조직을 멸균 100mm 페트리 접시로 이송한다.
i. 5ml의 세정 배지의 분취량을 조직 단편에 첨가한다.
j. 내용물을 15 내지 30초 동안 회전시키고, 이어서 피펫 또는 흡인 바늘을 갖는 시린지로 세정 배지를 제거한다. 이러한 세정 프로세스를 2회 반복한다.
k. 2ml의 세정 배지를 조직에 첨가하여 조직의 건조를 방지한다.
2.4. 조직으로부터 MSC 신장의 개시:
a. 6-웰 플레이트의 하부에 "신장 1"을 MSC 로트 번호 또는 제대 조직 ID와 함께 표지하고, 데이터 신장을 개시한다. 60mm 조직 배양 접시를 사용하는 경우, 접시의 하부에 격자를 그려서 플레이트를 4개 사분원으로 분할한다.
b. 멸균 휴대용 겸자를 사용하여, 1개의 3×3mm 내지 5×5mm 조직을 각 웰에 배치한다. 60mm 조직 배양 접시를 사용하는 경우, 조직을 각각의 사분원의 중간에 배치하여 조직을 분리시킨다(서로 1cm 이상).
c. 각 웰에 3ml의 PTT-6을 충전시킨다.
d. 30ml 시린지에 커플링된 흡인 바늘을 사용하여, 조직을 겨우 덮도록 충분한 배지를 인출한다. 플레이트를 경사지게 하지 않아야 한다. 흡인 바늘로 웰의 하부를 접촉하지 않게 해야 한다.
e. 도립 광학 현미경을 사용하여, 매일 세포 신장을 관찰한다(24±6시간). 실시간 세포 배양 이미징 시스템을 광학 현미경 대신에 사용할 수 있다.
f. 매일 배지를 교환한다. 사용 전에 반드시 배지를 실온으로 평형화한다.
i. 배지로부터 흡인한다.
ii. 3ml의 PTT-6을 첨가한다.
iii. 조직이 겨우 배지에 침적할 때까지 흡인한다.
g. 세포 신장이 조직으로부터 관찰되는 경우, 플레이트에 "신장 2"를 표지하는 것을 제외하고는 상기 4.a 내지 4.e와 동일한 공정을 사용하여 조직을 새로운 6-웰 플레이트로 이식한다. 각 웰에 2ml의 PTT-6을 첨가하여 "신장 1" 플레이트에서 세포 신장을 유지한다. 매일 컨플루언시를 관찰한다. 배지를 2 내지 3일마다 교환한다(사용 전에 배지를 실온으로 평형화시키기 위해).
h. 세포 신장이 "신장 2" 플레이트에서 관찰되는 경우, 플레이트에 "신장 3"을 표지하는 것을 제외하고는 단계 4.a 내지 4.e를 반복한다. 각 웰에 2ml의 PTT-6을 첨가하여 "신장 2" 플레이트에서 세포 신장을 유지한다. 매일 컨플루언시를 관찰한다. 배지를 2 내지 3일마다 교환한다(사용 전에 배지를 실온으로 평형화시키기 위해).
i. 신장이 "신장 3" 플레이트에서 관찰되는 경우, 조직을 폐기한다. 조직이 매우 작고 세포 성장을 방해하지 않으면, 계대배양시에 조직을 처분한다.
j. 세포가 40 내지 50% 컨플루언시에 도달하는 경우, 매일 세포를 관찰하여 과-확장을 방지한다.
k. 세포가 70 내지 80% 컨플루언시에 도달하는 경우, 세포를 계대배양한다. 세포가 80% 컨플루언스를 초과하여 확장하지 않도록 한다.
조직 이식편의 크기가 약 1 내지 3mm이고 조직 이식/세포 배양이 175mm 평방 배양 접시에서 수행되는 경우, 이식편으로부터 수거된 중간엽 줄기 세포의 평균 수는 전형적으로 약 4,000 내지 6,000 세포/이식편이다. 따라서, 48개 이식편으로부터 중간엽 줄기 세포가 동시에 성장되는 경우, 약 300,000 세포가 수거시에 수득될 수 있다. 이어서, 이식편으로부터 수집된 이들 300,000 중간엽 줄기 세포는 하기 실시예 2.5에 기재된 바와 같이 이러한 300,000 세포를 175cm2 세포 배양 플라스크에 파종함으로써 계대배양에 사용할 수 있다(이는 계대 1로서 지칭될 수 있다). 이어서, 계대 1로부터 수득된 중간엽 줄기 세포를 사용하여 175cm2 플라스크에 다시 파종하고(계대 2), 하기 실시예 2.5에 기재된 바와 같이 세포를 확장시킬 수 있다. 계대 1 및 계대 2 둘 다로부터 수득된 세포를 동결-보존에 의해 "뱅크화"할 수 있고, 계대 2 후에 수득된 중간엽 줄기 세포는, 예를 들면, 하기 실시예 2.7에서 설명된 바와 같이, 생물반응기에서 중간엽 줄기 세포의 추가 확장을 위한 마스터 세포 뱅크를 나타내는 것으로 간주된다.
2.5. 세포 배양 접시에서 MSC의 계대배양
a. 생물안전 캐비넷에서 작업하는 동안 생존가능한 입자를 수행한다. 모든 배지를 사용 전에 실온으로 평형화시킨다.
b. 세포 신장이 약 70 내지 80% 컨플루언시에 도달하는 경우, 세포를 계대배양한다.
i. 페트리 접시로부터 PTT-6을 제거한다.
ii. 칼슘 또는 마그네슘을 포함하지 않는 HBSS로 세정한다.
iii. 0.2ml 1× TrypLE-EDTA를 첨가하고, 1 내지 2분 동안 회전시킨다.
iv. 접시를 30 내지 45°로 경사시켜 중력 유동에 의해 하향 이동시킨다. 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 분리를 촉진시킨다.
v. 1ml의 PTT-6을 첨가한다. 상하로 온화하게 피펫팅한 다음, 세포를 15ml 원심분리 튜브로 이송한다. 각 웰에 깨끗한 피펫 팁을 사용한다. 모든 6개 웰로부터의 세포를 단일 15ml 튜브에 풀링할 수 있다.
vi. 10분 동안 1200rpm에서 원심분리한다.
vii. 상청액을 제거하고, 세포를 5ml PTT-6으로 재현탁시킨다.
c. MSC의 계대배양
i. 50㎕의 세포 현탁액을 분취하고, 트립판 블루 배제 검정에 의해 TNC 및 생존력을 검정한다.
ii. 혈구계산기를 사용하여 세포를 계수한다. 20 내지 100 세포/평방을 계수할 것으로 예상된다. 계수가 100을 초과하는 경우, 본래 샘플을 1:5로 희석하고, 혈구계산기를 사용하여 트립판 블루 방법을 반복한다.
iii. 생존 세포/ml 및 합계 생존 세포를 계산한다:
1. 생존 세포/ml = 생존 세포 계수 × 희석 계수 × 104
2. 합계 생존 세포 = 생존 세포 계수 × 희석 계수 × 합계 용적 × 104
iv. 생존율 %을 계산한다:
1. 생존율 % = 생존 세포 계수 × 100/(생존 세포 계수 + 사멸 세포 계수)
v. 세포 현탁액을 1.0 x 106 세포/ml로 희석시킨다:
1. "X" 용적 = 합계 생존 세포/106 세포/ml
2. 예를 들면, 합계 생존 세포 수가 1.0 × 107인 경우;
3. "X" = 107/106 세포/ml 또는 10ml, 따라서 세포 현탁액에 5ml를 첨가하여(이는 5ml로 존재함) 합계 세포 용적으로 10ml까지 되게 한다.
vi. 세포 현탁액이 106/ml 미만인 경우, 각 150mm 페트리 접시 또는 175cm2 플라스크에 대해 2×106 세포를 파종하는데 필요한 용적을 결정한다.
1. 2 × 106 세포의 용적 = 2 × 106 세포 ÷ 생존 세포/ml
2. 예를 들면, 생존 세포/ml가 8 × 105 세포/ml인 경우, 2 × 106 세포 ÷ 8 × 105 세포/ml 또는 2.5ml가 필요하다.
vii. MSC 마커 분석을 위해 0.5ml를 확보한다.
viii. 2 × 106 세포를 각각의 150mm 페트리 접시 또는 175cm2 플라스크에 30ml PTT-6와 함께 파종한다.
ix. 3일마다 부착, 콜로니 형성 및 컨플루언스에 대해 세포를 관찰한다. 세포가 40 내지 50% 컨플루언스에 도달하는 경우, 세포를 1 내지 2일마다 관찰하여 과-확장을 방지한다. 세포가 80% 컨플루언스를 초과하여 확장하지 않아야 한다. 실시간 세포 배양 모니터링 시스템을 광학 현미경 대신에 사용할 수 있다.
x. 2 내지 3일마다 배지를 교환한다.
2.6 MSC 세포의 동결보존
a. 생물안전 캐비넷에서 작업하는 동안 생존 입자를 수행한다.
b. 세포가 70 내지 80% 컨플루언스에 도달하는 경우, 각 150mm 페트리 접시 또는 175cm2 플라스크에 대해 2ml 1× TrypLE-EDTA를 사용하여 세포를 분리한다.
i. 페트리 접시로부터 PTT-6을 제거한다.
ii. 칼슘 또는 마그네슘을 포함하지 않는 5ml HBSS 또는 PBS로 세척한다.
iii. 2ml 1× TrypLE-EDTA를 첨가하고, 1 내지 2분 동안 회전시킨다.
iv. 접시를 30 내지 45° 경사지게 하여 중력 유동에 의해 세포를 하향 이동시킨다. 페트리 접시의 측면을 가볍게 두드려 분리를 촉진시킨다.
v. 10ml PTT-6을 첨가하여 TrypLE를 불활성화시킨다. 잘 혼합하여 세포 응집괴를 분리한다.
vi. 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 15ml 원심분리 튜브로 이송시킨다.
vii. 10분 동안 1200rpm에서 원심분리한다.
viii. 배지를 흡인하고, 10ml PTT-6에 재현탁시킨다.
ix. 50㎕를 분취하고, 상기와 같이 합계 생존 세포 수 및 생존율 %를 결정한다. 세포가 응집을 개시할 수 있기 때문에, 세포 계수는 15분 이내에 수행할 필요가 있다.
c. 동결보존을 위한 세포의 준비.
i. 세포 현탁 배지 및 동결보존 배지를 준비하고, 세포를 동결시킨다.
2.7. 양자 생물반응기(Terumo BTC, Inc.)에서 MSC의 계대배양(확장)
또한, MSC를 확장하기 위해 양자 생물반응기를 사용할 수 있다. 양자 생물반응기에서 확장을 위한 개시 세포 수는 실행당 2억 내지 3억개 세포의 범위이어야 한다. 실행당 전형적 수율은 수거시에 3억 내지 7억개 MSC이다. 생물반응기는 제조업자의 프로토콜에 따라 조작한다. 이렇게 수득된 중간엽 줄기 세포는 전형적으로 동결-보존되고(하기 참조), 작동 세포 뱅크로서 기능한다.
재료/시약:
1. 양자 확장 세트
2. 양자 폐기물 백
3. 양자 배지 백
4. 양자 주입구 백
5. PTT-6
6. PBS
7. 피브로넥틴
8. TrypLE
9. 3ml 시린지
10. 글루코즈 시험 스트립
11. 락테이트 시험 스트립
12. 60ml 세포 배양 플레이트 또는 동등품
13. 의료 등급 5% CO2 기체-혼합물
14. 50ml 콤비-팁(Combi-tip)
장비:
1. 생물안전 캐비넷
2. 글루코즈 계측기(Bayer Healthcare/Ascensia Contour Blood Glucose Meter)
3. 락테이트 플러스(Nova Biomedical)
4. 헤드를 갖는 연동 펌프연동 펌프
5. 원심분리기, 에펜도르프 5810
6. 멸균 튜브 커넥터
7. M4 반복 피페터
8. RF 밀봉기
순서:
1. 양자 생물반응기의 준비
a) 양자 생물반응기의 프라이밍
b) 생물반응기의 코팅:
1) 생물안전 캐비넷에서 피브로넥틴 용액을 준비한다.
1) 동결건조된 피브로넥틴을 실온으로 순응시킨다(실온에서 15분 이상)
2) 5ml의 멸균 증류수를 첨가한다; 회전 또는 진탕시키지 않는다
3) 피브로넥틴을 30분 동안 용액으로 되게 한다.
4) 18g 바늘이 부착된 10ml 시린지를 사용하여, 피브로넥틴 용액을, 95ml의 PBS를 함유하는 세포 주입구 백에 이송한다.
2) 백을 "시약" 라인에 부착한다.
3) 기포를 검사한다(기포는 "IC 공기 제거" 또는 "EC 공기 제거" 및 주입구 공급원으로서 "세척"을 사용하여 제거할 수 있다).
4) 생물반응기를 코팅하기 위한 프로그램을 개방 또는 설정한다(도 1, 단계 3 내지 5).
5) 프로그램을 실행한다
6) 생물반응기를 코팅하기 위해 프로그래밍을 실행하는 동안, 4L의 PTT-6 배지를 갖는 배지 백을 준비한다.
7) 멸균 튜브 커넥터를 사용하여 배지 백을 IC 배지 라인에 부착시킨다.
8) 생물반응기 코팅 단계가 완료되면, RF 밀봉기를 사용하여 피브로넥틴 용액에 사용된 세포 주입구 백을 분리한다.
c) 과량의 피브로넥틴을 세척 제거한다.
d) 배지로 생물반응기를 조정한다.
2. 양자 생물반응기에서 세포의 배양
a) 균일한 현탁액으로 세포를 로딩 및 부착한다:
b) 세포의 공급 및 배양
1) 세포를 공급하기 위해 배지 유속을 선택한다.
2) 매일 락테이트 및 글루코즈를 샘플링한다.
3) 락테이트 수준이 증가함에 따라 배지의 유속을 조정한다. 실제 최대 허용가능한 락테이트 농도는, 세포가 기원하는 플라스크 배양에 의해 정의된다. 적절한 PTT-6 배지가 배지 백에 존재하는지를 결정한다. 필요한 경우, PTT-6 백을 신선한 PTT-6 배지 백으로 교환한다.
4) 유속이 목적하는 값에 도달하는 경우, 8 내지 12시간마다 락테이트 수준을 측정한다. 락테이트 수준이 저하되지 않거나 락테이트 수준이 지속적으로 증가하는 경우, 세포를 수거한다.
3. 양자 생물반응기로부터 세포의 수거
a) 락테이트 농도가 증가하지 않는 경우, 최후에 락테이트 및 글루코즈를 샘플링한 후에 세포를 수거한다.
b) 세포의 수거:
1) 멸균 튜브 커넥터를 사용하여 100ml TrypLE가 충전된 세포 주입구 백을 "시약" 라인에 부착시킨다.
2) PBS 백에 충분한 PBS가 존재하는지를 확인한다. 그렇지 않은 경우, 멸균 튜브 커넥터를 사용하여 적어도 1.7L의 PBS를 갖는 새로운 백을 "세척" 라인에 부착한다.
3) 수거 프로그램을 실행한다.
4. 세포의 동결보존
1) 세포가 수거되면, 세포를 50ml 원심분리 튜브로 이송하여 세포를 펠렛화한다.
2) 25ml의 냉각 세포 현탁액 용액을 사용하여 재현탁시킨다. 시스멕스(Sysmex) 또는 비오라드(Biorad) 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수한다. 세포 계수 리포트를 각각의 양자 처리 배치 레코드에 부착한다.
3) 세포 농도를 2×107/ml로 조정한다.
4) 동등한 용적의 동결보존 용액을 첨가하고, 잘 혼합한다(진탕 또는 와동시키지 않음).
5) 반복 피페터를 사용하여, 각각 1.8ml 바이알에 동결보존액 중의 1ml의 세포 현탁액을 첨가한다. 조절된 속도 동결기를 사용한 SOP D6.100 CB 동결보존에 기재된 바와 같이 CRF 프로그램을 사용하여 동결보존시킨다.
6) 바이알을 지정된 액체 질소 저장 공간에 저장한다.
7) CRF 실행 리포트를 각각의 MSC P3-양자 처리 배치 레코드의 형태로 부착한다.
3. 상이한 배양 배지를 사용하여, 제대 조직으로부터 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 모집단에서 줄기 세포 마커 발현의 분석
유세포분석 실험은 중간엽 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105의 발현에 대해 제대로부터 단리된 중간엽 줄기 세포를 분석하기 위해 수행했다.
이들 실험을 위해, 중간엽 줄기 세포는 3개의 상이한 배양 배지에서 제대 조직을 배양하고, 이어서 실시예 2에 기재된 바와 같이 각각의 배지에서 중간엽 줄기 세포를 계대배양하여 제대 조직으로부터 단리했다.
3개의 하기 배양 배지를 이들 실험에 사용했다: a) 10% FBS(v/v)가 보충된 90%(v/v) DMEM, b) 90%(v/v) CMRL1066 및 10%(v/v) FBS로 이루어진, 미국 특허 출원 제2008/0248005호 및 대응 국제 특허 출원 제WO 2007/046775호에 기재된 배양 배지 PTT-4(WO 2007/046775의 문단 [183] 참조), 및 c) 본원에 기재된 조성물인 본 발명 PTT-6의 배양 배지. 이러한 유세포분석 분석에서, 제대 라이닝 중간엽 줄기 세포(CLMC) 모집단의 2개 상이한 샘플을 3개 사용된 배양 배지 각각에 대해 분석했다.
하기 프로토콜을 유세포분석 분석에 사용했다.
재료 및 방법
Figure pct00006
Figure pct00007
순서
a) 제대 라이닝 막으로부터 세포 단리 및 배양
1. 이식편 조직 샘플을 세포 배양 플레이트에서 배양하고, 각각의 배지에 침지시킨 다음, 이를 실시예 2에서 설명된 바와 같이 CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지시킨다.
2. 배지는 3일마다 교환했다.
3. 조직 배양 이식편으로부터의 세포 신장은 광학 현미경하에 모니터링했다.
4. 약 70%의 컨플루언스에서, 세포는 트립신처리(0.0125% 트립신/0.05% EDTA)에 의해 접시로부터 분리한 다음, 유세포분석 실험에 사용했다.
b) 실험을 위한 세포의 트립신처리
1. 배지를 세포 배양 플레이트로부터 제거한다.
2. FBS는 트립신의 효소적 처리를 방해하기 때문에, 멸균 1× PBS로 온화하게 세정하여 미량의 FBS를 제거한다.
3. 1× 트립신을 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 3 내지 5분 동안 37℃에서 인큐베이팅한다.
4. 현미경하에 세포를 관찰하여, 이들이 이탈된 것을 확인한다. FBS를 함유하는 완전 배지(10% FBS를 갖는 DMEM)을 첨가하여 트립신을 중화시킨다.
5. 피펫을 사용하여, 플레이트의 벽에 대하여 배지 중의 세포를 피펫팅함으로써 세포 응집괴를 분해한다. 세포 현탁액을 수집하고, 50ml 원심분리 튜브에 이송한다.
6. 멸균 1× PBS를 플레이트에 첨가하고, 이를 세정한다. 세포 현탁액을 동일한 원심분리 튜브로 수집한다.
7. 이를 1800rpm에서 10분 동안 원심분리한다.
8. 상청액을 폐기하고, 세포 펠렛을 PBA 배지로 재-현탁시킨다.
c) 세포 계수
1. 혈구계수기 및 이의 커버 슬립은, 바람직하게는 이들을 70% 에탄올로 세척하고 이들을 킴 물티슈(보푸라기 없는 페이퍼)로 닦아내기 전에 건조시킴으로써 세정 및 건조시킨다.
2. 현탁액 중의 소량의 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 분취하고, BSC 후드로부터 제거한다.
3. 현탁액 중의 세포를 동일 용적의 트립신 블루로 염색하고, 예를 들면, 500㎕의 현탁액에 500㎕의 트립판 블루를 첨가한다(희석 계수 = 2X, 0.2% 트립판 블루 용액을 제공).
4. 트립판 블루는 독성이 있고 비-생존 세포를 증가시켜, 오류 세포 계수를 제공할 수 있기 때문에, 세포를 30분 이상 동안 트립판 블루에 노출시키는 것을 회피한다.
5. 20㎕의 세포 현탁액 혼합물의 혈구계수기의 각 챔버에 첨가하고, 광학 현미경하에 관측한다.
a. 상부 및 하부 챔버에서 합계 8개 사분원에 대해 혈구계수기의 각 사분원에서 생존 세포의 수를 계수한다(밝은 세포; 비-생존 세포는 트립판 블루를 용이하게 흡수하고, 따라서 어둡다).
합계 세포 계수는 (세포의 평균 수/사분원) × 104 세포/ml로서 제공된다.
d) 세포의 염색
i. 세포 염색 전의 준비
· 세포 현탁액을 3개 튜브(CD73, CD90, CD105)로 이중으로 및 2개 튜브(음성 대조군)에서 분취하고, 각각은 50,000개 세포를 함유한다.
ii. 일차 항체(Ab)로 염색
· 1㎕[0.5mg/ml Ab]의 일차 항체를 100㎕의 세포 현탁액에 첨가한다. 4℃에서 45분 동안 인큐베이팅한다.
· PBA로 최대 1ml를 구성한다.
· 8000rpm에서 4℃로 5분 동안 원심분리한다.
· 상청액을 제거한다.
· 1ml의 PBA를 첨가하고, 펠렛을 재-현탁시킨다.
· 8000rpm에서 4℃로 5분 동안 원심분리한다.
· 상청액을 제거한다.
· 1000㎕ PBA에 재-현탁시킨다.
iii. 이차 항체로 염색 - 암 상태
· 1㎕[0.5mg/ml ab]의 이차 항체를 100㎕의 세포 현탁액에 첨가한다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅한다.
· PBA로 최대 1ml를 구성한다.
· 8000rpm에서 4℃로 5분 동안 원심분리한다.
· 상청액을 제거한다.
· 1ml의 PBS를 첨가하고, 펠렛을 재-현탁시킨다.
· 8000rpm에서 4℃로 5분 동안 원심분리한다.
· 상청액을 제거한다.
· 유세포분석 분석을 위해 200 내지 300㎕ PBA에 재-현탁시킨다.
· 세포를 FACS 튜브로 이송하여 BD FACS CANDO 유세포분석을 판독한다.
유세포분석 분석의 결과는 도 6a 내지 6c에 제시되어 있다. 도 6a는, 제대 조직으로부터 단리 및 DMEM/10% FBS에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 6b는, 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-4에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타내고, 도 6c는 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-6에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, 배양 배지 배양으로서 DMEM/10% FBS를 사용하여 단리한 모집단은 약 75% CD73+ 세포, 78%의 90+ 세포 및 80% CD105+ 세포(2개 실험의 평균)을 갖고, PTT-4 배양 배지를 사용하여 제대 조직의 단리/배양 후에(도 6b 참조), CD73-양성, CD90-양성 및 CD105-양성인 중간엽 줄기 세포의 수는 약 87%(CD73+ 세포), 93%(CD90+ 세포) 및 86%(CD105+ 세포)의 2개 실험의 평균이다. 본 발명의 PTT-6 배지에서의 배양에 의해 수득된 중간엽 줄기 세포 모집단의 순도는 모든 3개 마커(CD73, CD90, CD105)에 대하여 적어도 99.0%이고, 이는 이러한 세포 모집단의 순도가 PPT-4 배지 또는 DMEM/10% FBS를 사용한 배양보다 현저히 높은 것을 의미한다. 또한 및 보다 중요하게는, PTT-6에서의 배양에 의해 수득된 중간엽 줄기 세포 모집단은 본질적으로 100% 순수한 및 규정된 줄기 세포 모집단이다. 이는 본 발명의 줄기 세포 모집단을 줄기 세포-기반 치료를 위한 이상적 후보로 되게 한다. 따라서, 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 모집단은 이러한 줄기 세포-기반 치료 접근법에 대한 최적 기준이 될 수 있다.
도 6에 제시된 발견은 추가로, 도 7a 및 도 7b에 제시되어 있는 유세포분석 분석의 결과에 의해 확증된다. 도 7a는, 제대 조직으로부터의 단리 및 PTT-6 배지에서의 배양 후에 줄기 세포 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 단리된 중간엽 제대 라이닝 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 7a에 제시된 바와 같이, 97.5% 생존 세포를 함유하는 중간엽 줄기 세포 모집단은 세포의 100%가 각각의 CD73, CD90 및 CD105(열 "CD73+CD90+" 및 "CD73+CD105+" 참조)를 발현한 반면, 줄기 세포 모집단의 99.2%는 CD45를 발현하지 않았고 줄기 세포 모집단의 100%는 CD34 및 HLA-DR을 발현하지 않았다(열 "CD34-CD45-" 및 "CD34-HLA-DR-" 참조). 따라서, PTT-6 배지에서의 배양에 의해 수득된 중간엽 줄기 세포 모집단은 본질적으로 100% 순수한 및 규정된 줄기 세포 모집단이고, 중간엽 줄기 세포가 세포 치료에 사용하기 위해 충족해야 하는 기준을 만족시킨다(줄기 세포 모집단의 95% 이상은 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, 줄기 세포 모집단의 98% 이상은 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여한다.)[참조: Sensebe et al."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", supra]. 양막의 본 발명의 중간엽 줄기 세포는 표준 배양 조건하에서 플라스틱에 부착하고 골아세포, 지방세포 및 연골세포로 시험관내에서 분화하고[미국 특허 제9,085,755호, 미국 특허 제8,287,854호 또는 WO2007/046775호 참조), 따라서 세포 치료에서 중간엽 줄기 세포의 사용이 일반적으로 허용되는 기준에 부합함에 유의한다.
도 7b는, CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는 단리된 골수 중간엽 줄기 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 7b에 제시된 바와 같이, 94.3% 생존 세포를 함유하는 골수 중간엽 줄기 세포 모집단은 세포의 100%가 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면(열 "CD73+CD90+" 및 "CD73+CD105+" 참조), 골수 줄기 세포 모집단의 62.8%만이 CD45의 발현을 결여했고, 줄기 세포 모집단의 99.9%는 CD34 및 HLA-DR의 발현을 결여했다(열 "CD34-CD45-" 및 "CD34-HLA-DR-" 참조). 따라서, 중간엽 줄기 세포의 최적 기준인 것으로 간주되는 골수 중간엽 줄기 세포는, 본 출원의 중간엽 줄기 세포 모집단(제대 양막의)보다 줄기 세포 마커의 점에서 훨씬 낮은 균일성/순도에 의한 것이다. 이러한 발현은 또한, 본 발명의 줄기 세포 모집단이 줄기 세포-기반 치료에 이상적 후보일 수 있고 줄기 세포-기반 치료 접근법에 대한 최적 기준이 될 수 있음을 나타낸다.
4. 본 발명의 배양 배지에서 배양한 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단에서 창상 치유 마커 단백질 선택의 분석
고도로 현저한 결과(PTT-6에서 배양함으로써 본질적으로 100% 순수한 및 규정된 중간엽 줄기 세포 모집단을 수득함)에 기초하여, 다양한 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 PTT-6에서 배양하고, PTT-4 배지에서의 배양(참조 배지로서 기능)와 비교하여 창상 치유 마커 단백질의 분비에 관하여 분석했다.
보다 상세하게는, 하기 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 분석했다.
- 제대 양막의 중간엽 줄기 세포(제대 라이닝 MSC/CL-MSC). CL-MSC의 이러한 모집단은, 제WO2007/046775호의 실시예 2(10% 소태아 혈청이 보충된 DMEM, DMEM/10% FBS에서 배양)에 기재된 인간 제대 라이닝 막의 조직 이식편에 의해 단리했다.
- 와튼 젤리의 중간엽 줄기 세포(WJ-MSC). WJ-MSC의 이러한 모집단은, 문헌[참조: Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 기재된 바와 같이 인간 제대의 와튼 젤리의 조직 이식편(10% 인간 혈청/FBS 및 항생물질 용액이 보충된, 4,500mg/mL 글루코즈 및 2mM L-글루타민을 갖는 DMEM에서 배양)에 의해 단리했다.
- 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포(AT-MSC). AT-MSC의 이러한 모집단은 문헌[참조: Schneider et al, "Adipose-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine" Eur J Med Res. 2017; 22: 17]에 기재된 바와 같이 조직 외식편(5% 페니실린/스트렙토마이신 및 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양)에 의한 복부성형 후에 공여된 피부 조직의 지방 조직으로부터 단리했다.
- 골수 중간엽 줄기 세포(BM-MSC). BM-MSC의 이러한 모집단은 AO 파운데이션(AO Foundation, Davos, Switzerland)의 증여물이다.
- 태반 중간엽 줄기 세포(PT-MSC). PT-MSC의 이러한 모집단은, 문헌[참조: Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 기재된 바와 같이 태반으로부터 단리했다.
단리된 MSC의 배양을 위한 배양 프로토콜
· 각 공급원으로부터의 5백만개 MSC를 24시간 동안 DMEM/F12/10% FCS에서 100mm 조직 배양 접시에 플레이팅했다.
· 배지를 폐기하고, PTT-6/PTT-4를 24시간 동안 배양물에 첨가했다.
· 배지를 폐기하고, 세포를 PBS로 세척했다.
· 10ml DMEM을 24시간 동안 배양물에 첨가했다.
· 배지를 폐기하고, 5ml DMEM을 배양물에 첨가했다.
24시간 배양 후, 조절된 배지를 수거하고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 상청액을 -80℃에서 저장하고 사이토킨 검정에 의한 마커 단백질 분비의 후속 분석을 위해 튜브에 분취했다.
CL-MSC, WJ-MSC, 골수 MSC 및 지방 MSC 기원의 MSC로부터의 PTT-6 대 PTT-4 배지 상청액에 대한 사이토킨 검정
사이토킨 검출은 MSC 상청액에서 수행했다. 측정 및 분석은 루미넥스(Luminex) 200 및 엑스포넨트(Xponent) 소프트웨어를 사용하여 수행했다.
이 실험의 목적은 세포 배양 상청액에 대한 멀티플렉스(PDGF-AA, PDGF-BB, IL-10, VEGF, Ang-1 및 HGF), TGFβ1 싱글플렉스 및 bFGF2 싱글플렉스 사이토킨의 상대 수준을 측정하는 것이었다. 상청액은 (MSC, 중간엽 줄기 세포; CL, 제대 라이닝; WJ, 와튼 젤리; AT, 지방 조직; BM, 골수)이다:
ㆍ PTT-4에서 배양한 CL-MSC
ㆍ PTT-4에서 배양한 WJ-MSC
ㆍ PTT-4에서 배양한 AT-MSC
ㆍ PTT-4에서 배양한 BM-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 CL-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 WJ-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 AT-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 BM-MSC
각 샘플은, 6 웰에서 시험된 PTT-4에서 공급된 샘플을 제외하고는 삼중(3 웰)으로 시험했다. 또한, 샘플 CR001A, CR001C, CR001D 및 CR001G는 사이토킨 검정을 검증하기 위한 양성 대조군으로서 포함되었다(CR001A, CR001C, CR001D 및 CR001G로부터 조절된 배지는 PTT-6 또는 PTT-4에서 세포의 배양에 의해 제조되지 않았다).
이 실험의 목적은, PTT-4 또는 PTT-6에서 배양한 MSC의 사이토킨 프로파일을 생성하고 상이한 조직 기원(제대 라이닝 대 와튼 젤리 대 지방 조직 대 골수)으로부터의 MSC의 프로파일을 비교하기 위한 것이었다. 프로파일은, 창상 치유를 촉진시키기 위해 어느 배지에서 성장한 어느 줄기 세포 모집단이 보다 많은 목적 사이토킨을 분비하는지에 대해 조명한다.
모든 플레이트에 대한 플레이트 설정은 도 8에 기재되어 있다. 하기 약어는 하기에 사용된다: MSC, 중간엽 줄기 세포; CL, 제대 라이닝; WJ, 와튼 젤리; AT, 지방 조직; BM, 골수.
멀티플렉스 분석
멀티플렉스 정보:
R&D Systems/Bio-techne 카탈로그 # LXSAHM. 이 키트는 로트 # L123680이고, 만료일은 08/28/18이고, 하기 분석물을 포함한다:
ㆍ Ang-1, 안지오포이에틴
ㆍ VEGF, 혈관 내피 증식 인자
ㆍ PDGF-AA, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF-AA는 A 쇄로 이루어진 디설파이드-결합된 호모이량체를 지칭하고, PDGF-BB는 B 호모이량체로 이루어지고, R&D는 PDGF-BB 항체가 또한 PDGF-AB 헤테로이량체를 검출한다는 것은 언급한다)
ㆍ PDGF-BB
ㆍ HGF, 간세포 증식 인자
ㆍ IL-10, 인터류킨-10
TGFβ1 싱글플렉스 정보: R&D Systems/Bio-techne:
ㆍ 베이스 키트, 카탈로그 # LTGM00, 로트 # P156217, 수신일 02/27/18, 만료일 08/30/18.
ㆍ TGFβ1 성분, 카탈로그 # LTGM100, 로트 # P161760, 수신일 02/27/18, 만료일 11/27/19.
bFGF2 싱글플렉스 정보(2018년 3월 19일에 사용됨): eBioscience/Thermo:
ㆍ 베이스 키트, 카탈로그 # EPX010-10420-901, 로트 # 172174000, 만료일 01/31/20.
ㆍ bFGF2 성분, 카탈로그 # EPX01A-12074-901, 로트 # 169751102, 만료일 12/31/19.
bFGF2 싱글플렉스 정보(2018년 3월 22일에 사용됨): eBioscience/Thermo:
ㆍ 베이스 키트, 카탈로그 # EPX010-10420-901, 로트 # 172174000, 만료일 01/31/20.
ㆍ bFGF2 성분, 카탈로그 # EPX01A-12074-901, 로트 # 166916102, 만료일 12/31/19.
멀티플렉스 정보:
R&D Systems/Bio-techne 카탈로그 # LXSAHM. 이 키트는 로트 # L123999이고, 만료일은 09/25/18이고, 하기 분석물을 포함한다:
ㆍ Ang-1, 안지오포이에틴
ㆍ VEGF, 혈관 내피 성장 인자
ㆍ PDGF-AA, 혈소판-유래 성장 인자 2,
ㆍ PDGF-BB
ㆍ HGF, 간세포 성장 인자
ㆍ IL-10, 인터류킨-10
ㆍ bFGF, 기본 섬유아세포 성장 인자
데이터 입력
생 데이터 출력은 PDF 및 엑셀 포맷이다. 엑셀 포맷의 데이터는 데이터를 처리하기 위해 사용된다.
순서
MSC 상청액에서 사이토킨 검출은 상세된 프로토콜 정보에 따라 수행했다. 이 실험의 일부로서, 프로토콜은 단일 보정을 갖는다: 멀티플렉스 키트에서 표준 8은 더이상 사용되지 않는다. 표준 8을 중단한 이유는 R&D 시스템즈 프로토콜 자체가 표준 1 내지 6만을 사용하기 때문이다. 추가로, 표준 8은, 멀티플렉스: PDGF-BB 및 HGF을 포함하는 6개 분석물 중의 2개에 대해서만 클린이뮨(ClinImmune)에서 검증되었다. PDGF-BB의 경우에, 이 분석물은 상청액에서 검출되지 않았다. HGF의 경우에, 이 분석물은 표준 곡선의 중간-영역에 있다. 표준은 성장 인자를 사용하여 재구성되기 때문에, 표준 곡선은 PTT-6 및 PTT-4 둘 다로 작성되었다. PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시킨 시험 샘플을 각각의 표준 곡선으로부터 외삽했다.
결과는, 동일한 소프트웨어에 의해 생성되는 분석물-특이적 표준 곡선으로부터 루미넥스(Luminex) 소프트웨어에 의해 외삽했다: 분석 알고리즘은, 가중을 위한 1/y2를 사용하여, 가중 분석으로 가중된 로지스틱(Logistic) 5P로 설정한다.
샘플
1. PTT-4 및 PTT-6 배지(MSC에 노출되지 않음)
2. 시험되는 MSC의 상청액
3. 옵션: 상이한 공여체: CR001A, C, D, 및 G로부터 CL-MSC로부터의 상청액.
실험 결과 요약
TGFβ1 싱글플렉스 검정
ㆍ 사용된 분취량 1/3 - 도 9에 제시되어 있다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 9: TGFβ1의 싱글플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성한다. PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시키는 경우, AT-MSC 및 BM-MSC 배양물만이 다소 동등한 양의 TGFβ1을 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
제1 멀티플렉스 검정
· 사용된 분취량 1/3.
· PDGF-BB 및 IL-10은 어느 샘플에서도 검출되지 않았다.
데이터는 도 10 및 11에 도시되어 있다.
도 10: 도 10a. PDGF-AA의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 또는 BM-MSC 배양물은, PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 보다 많은 PDGF-AA를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다. 도 10b. VEGF의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다. 도 10c. Ang-1의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 Ang-1을 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 11: HGF의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
멀티플렉스 검정(bFGF 포함)
· 사용된 분취량 3/3. 데이터는 도 12 내지 14에 제시되어 있다.
도 12: PDGF-AA의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 보다 많은 PDGF-AA를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 배양 배지 둘 다에서 동등량의 PDGF-AA를 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 13: 도 13a. VEGF의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성한다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다. 도 13b. Ang-1의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 Ang-1을 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다. 도 13c. HGF의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 본질적으로 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 14: bFGF의 멀티플렉스 측정. 볼 수 있는 바와 같이, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC 배양물은, PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 bFGF를 생성한다. 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 PTT-4 및 PTT-6에서 배양한 경우와 동등한 양의 bFGF를 생성했다. 모든 에러 바는 3회 측정으로부터의 표준 편차이다.
ㆍ bFGF 샘플은, 검출 한계의 하한 또는 그 부근에서, 풍부함이 매우 낮은 것에 유의해야 한다.
도 15 내지 도 21은 상이한 실험에 걸쳐 관찰된 데이터의 요약을 나타낸다.
도 15: 5개의 상이한 실험(170328, 170804, 170814, 180105, 180226)에 대한 TGFβ1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 TGFβ 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 TGFβ 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성함을 도시한다. AT-MSC 및 BM-MSC 배양물은 PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시킨 경우와 동등한 양의 TGFβ1을 생성했다. 모든 에러 바는 실험 170328, 170804, 170814, 180105, 180226에 대한 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 16: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 Ang-1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 Ang-1 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 Ang-1 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는, 배양물 CL-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 Ang-1을 생성함을 도시한다. AT-MSC 및 BM-MSC 배양물만이 본질적으로 PTT-6 또는 PTT-4에서 성장시킨 경우와 동등한 양의 Ang-1을 생성했다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226에 대한 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 17: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 PDGF-BB의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-BB 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 PDGF-BB 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 특히, 어느 실험에서도, PDGF-BB는 검출되지 않았다.
도 18: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 PDGF-AA의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득한 PDGF-AA 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 및 WJ-MSC 배양물이 PTT-6에서 성장시킨 경우보다 PTT-4에서 성장시킨 경우에 약간 더 많은 PDGF-AA를 생성함을 도시한다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 19: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 IL-10의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 IL-10 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6에서 수득된 IL-10 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 특히, 어떠한 실험에서도, IL-10은 검출되지 않았다.
도 20: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 VEGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6 배지에서 수득된 VEGF 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, AT-MSC 및 BM-MSC 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 VEGF를 생성함을 도시한다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
도 21: 6개의 상이한 실험(170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226)에 대한 HGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 HGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 하부 그래프에 도시되어 있다. PTT-4 및 PTT-6에서 수득된 HGF 표준 곡선에 대한 MFI는 상부 그래프에 제시되어 있다. 우측의 하부 그래프는 배양물 CL-MSC, 및 WJ-MSC가 PTT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 HGF를 생성함을 도시한다. 한편, 배양물 AT-MSC 및 BM-MSC는 다른 배양물과 같이 많은 HGF를 생성하지 않았다. 모든 에러 바는 실험 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226의 상이한 측정으로부터의 표준 편차이다.
CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC 기원의 MSC로부터 PPT-6 대 PTT-4 배지 또는 DMEM/F12-상청액에 대한 사이토킨 검정
사이토킨 검출은 MSC 상청액에서 수행했다. 측정 및 분석은 상기 기재된 바와 같이 수행했다.
이 실험의 목적은, 세포 배양 상청액에 대한 멀티플렉스(PDGF-AA, PDGF-BB, IL-10, VEGF, Ang-1 및 HGF), TGFβ1 싱글플렉스 및 bGFG2 싱글플렉스 사이토킨의 상대 수준을 측정하는 것이었다. 상청액은 제대 라이닝(CL), 와튼 젤리(WJ) 및 태반으로부터의 중간엽 줄기 세포로부터 수득했다. 중간엽 줄기 세포는 PTT-6, PPT-4 또는 DMEM/F12 배지에서 배양했다.
ㆍ PTT-4에서 배양한 CL-MSC
ㆍ PTT-4에서 배양한 WJ-MSC
ㆍ PTT-4에서 배양한 태반 MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 CL-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 WJ-MSC
ㆍ PTT-6에서 배양한 태반 MSC
ㆍ DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC
ㆍ DMEM/F12에서 배양한 WJ-MSC
각 샘플은 태반의 상청액 샘플을 제외하고는 삼중으로 시험했다. 이 실험의 목적은 PTT-4 또는 PTT-6에서 배양한 MSC의 사이토킨 프로파일을 생성하고 상이한 조직 기원(제대 라이닝 대 와튼 젤리 대 태반 MSC)로부터의 MSC의 프로파일을 비교하기 위한 것이었다. 사이토킨 측정은 상기 기재된 바와 같이 수행했다. 프로파일은, 창상 치유를 촉진하기 위해 어느 배지에서 성장한 어느 줄기 세포 모집단이 보다 많은 목적 사이토킨을 분비하는지에 대해 조명한다.
도 22: TGFβ1의 싱글플렉스 측정이다. 실험 전체의 표준 TGFβ1에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는 PTT-4 또는 DMEM/F12(도 22에서 단지 DMEM으로서만 지칭됨)에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 TGFβ1을 생성한다.
도 23: PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 PDGF-BB의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-BB 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 특히, 어떠한 실험에서도, PDGF-BB는 검출되지 않았다.
도 24: PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 IL-10의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S6는 검정에 사용된 최저 표준을 나타낸다. 이하에 해당하는 모든 샘플은 검출 이하인 것으로 간주된다. 우측의 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는 PTT-6에서 성장시킨 경우에 검출가능한 수준의 IL-10을 생성하는 반면, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우에는 IL-10가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다.
도 25: PTT-6, PTT-4 또는 DMEM/F12에서 배양한 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 VEGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 VEGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S1은 검정에 사용된 최고 표준을 나타낸다. 이상에 해당하는 모든 샘플은 외삽(너무 집중됨)된 것으로 간주된다. 우측의 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 더 높은 수준의 VEGF를 생성한다.
도 26: bFGF의 멀티플렉스 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 배양된 CL-MSC 및 WJ-MSC는, PPT-4에서 성장시킨 경우보다 PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 많은 bFGF를 생성한다. 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 낮은 수준의 bFGF를 생성한다.
도 27: PDGF-AA의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 PDGF-AA 표준 곡선에 대해 측정된 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S6은 검정에 사용된 최저 표준을 나타낸다. 이하에 해당하는 모든 샘플은 검출 이하인 것으로 간주된다. 볼 수 있는 바와 같이, 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC는, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 보다 높은 수준의 PDGF-AS를 생성한다.
도 28: Ang-1의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 Ang-1 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. S1은 검정에 사용된 최고 표준을 나타낸다. 이상에 해당하는 모든 샘플은 외삽(너무 집중됨)된 것으로 간주된다. 우측의 그래프는 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC가, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 높은 수준의 Ang-1을 생성함을 도시한다.
도 29: HGF의 측정을 요약한 것이다. 실험 전체의 HGF 표준 곡선에 대해 측정한 평균 형광 강도(MFI)는 좌측의 그래프에 도시되어 있다. 우측의 그래프는 모든 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC가, MSC를 PTT-4 또는 DMEM/F12에서 성장시킨 경우와 비교하여, PTT-6에서 성장시킨 경우에 훨씬 높은 수준의 Ang-1을 생성함을 도시한다.
상기 기재된 실험으로부터, 다음과 같이 결론지을 수 있다. 중간엽 줄기 세포, 특히 제대의 구획으로부터 단리되거나 태반으로부터 단리된 중간엽 줄기 세포를 PTT-6 배지에서 배양하는 경우, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 인자 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β1, VEGF 및 HGF의 분비는, PTT-4 배지 또는 DMEM/F12 등의 상업적으로 이용가능한 배양 배지에서의 생성 수준과 비교하는 경우에 유의적으로 증가한다. 특히, PTT-6 배지는 자연 환경/중간엽 줄기 모집단의 구획과 무관하게 이들 인자의 생성/분비를 증가시킬 수 있다.
PTT-6 배지는 중간엽 줄기 세포 모집단에서 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HGF(본원에서 언급된 바와 같이, 창상 치유에서 이의 관여가 공지되어 있음) 모두의 분비를 유발하기 때문에, PTT-6 배지가, 중간엽 줄기 세포가 본래 유래하는 자연 환경/중간엽 줄기 모집단과 무관하게, 광범위한 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 효과를 갖는 것이 명백하다 - 실험 4는, PTT-6에서의 배양 전에 이들의 자연 환경으로부터 단리된 세포 모집단으로 수행되었음에 유의한다.
또한, 조직 이식편에 의한 PTT-6에서 중간엽 줄기 세포의 배양은, 제대 양막의 고도로 균질한 중간엽 줄기 세포 모집단(이는 97.5% 생존 세포를 함유하고, 이의 100%는 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현했고, 줄기 세포 모집단의 99.2%는 CD45를 발현하지 않았고, 줄기 세포 모집단의 100%은 CD34 및 HLA-DR을 발현하지 않았다(열 "CD34-CD45-" 및 "CD34-HLA-DR-" 참조)). PTT-6에서 와튼 젤리의 중간엽 줄기 세포 모집단의 배양은 사이토킨 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HG의 생성에 대해, 제대 라이닝 줄기 세포에서 이들 사이토킨의 생성에 대해 갖는 것과 동일한 양성 효과를 갖기 때문에, PTT-6에서 와튼 젤리의 배양은 또한 이러한 고도의 균질한 중간엽 와튼 젤리 줄기 세포 모집단을 제공할 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 또한, 제대 혈관의 배양 등의 제대의 다른 구획의 조직 이식편은 유사한 균일성의 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단을 제공할 것으로 예상할 수 있다. 마찬가지로, PTT-6에서의 배양에 의해 태반 양막을 포함하는 태반 조직의 조직 외식편은 유사한 균일성의 태반 중간엽 줄기 세포 모집단을 제공할 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 세포가 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 각각의 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단을 수득하는 일반적으로 적용가능한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 항목을 특징으로 한다:
1. 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 함유하는 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것을 포함하는, 방법.
2. 항목 1에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
3. 항목 2에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
4. 항목 1 내지 3 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 5 내지 15%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 15 내지 30%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 1 내지 8%(v/v)의 FBS를 포함하는, 방법.
5. 항목 4에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 57.5 내지 62.5%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 7.5 내지 12.5%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 17.5 내지 25.0%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 1.75 내지 3.5%(v/v)의 FBS를 포함하는, 방법.
6. 항목 5에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 61.8%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 11.8%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 23.6%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 2.5%(v/v)의 FBS를 포함하는. 방법.
7. 항목 1 내지 6 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 1ng/ml 내지 약 20ng/ml의 상피 성장 인자(EGF)를 추가로 포함하는, 방법.
8. 항목 7에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 10ng/ml의 EGF를 포함하는, 방법.
9. 항목 1 내지 8 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 1㎍/ml 내지 10㎍/ml의 인슐린을 포함하는, 방법.
10. 항목 9에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 5㎍/ml의 인슐린을 포함하는, 방법.
11. 항목 1 내지 10 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가, 하기 보충제: 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3) 중의 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
12. 항목 1 내지 11 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가, 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)의 3개 모두를 포함하는, 방법.
13. 항목 12 또는 13에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 0.01 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌의 아데닌, 최종 농도 약 0.1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손의 하이드로코르티손 및/또는 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 포함하는, 방법.
14. 항목 1 내지 13 중의 어느 하나에 있어서, 항목 1 내지 13 중의 어느 하나에 정의된 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것이, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)의 모두를 포함하지 않는 참조 배양 배지에 대하여, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β(특히 TGF-β1), VEGF 및 HGF 중의 적어도 하나의 발현 및/또는 분비를 증가시키는, 방법.
15. 항목 14에 있어서, 참조 배지가 90%(v/v) CMRL1066 및 10%(v/v) FBS로 이루어지는, 방법.
16. 항목 1 내지 15 중의 어느 하나에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 정의된 배양 배지에서 배양하기 전에, 이의 자연 환경으로부터 단리된, 방법.
17. 항목 1 내지 15 중의 어느 하나에 있어서, 항목 1 내지 13 중의 어느 하나에 정의된 세포 배양 배지에서 자연 조직을 배양함으로써 자연 조직 환경으로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하는 것을 포함하는, 방법.
18. 항목 17에 있어서, 조직이 제대 조직인, 방법.
19. 항목 18에 있어서, 제대 조직이, 제대 전체의 조직, 제대 양막을 포함하는 조직, 와튼 젤리를 포함하는 조직, 양막을 포함하는 조직, 양막 및 와튼 젤리, 단리된 제대 혈관, 제대 조직의 다른 성분으로부터 분리된 와튼 젤리, 및 제대의 단리된 양막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
20. 항목 17에 있어서, 조직이 태반의 양막 조직을 포함하거나 태반의 양막 조직인, 방법.
21. 항목 17 내지 20 중의 어느 하나에 있어서, 제대 조직이 전체 제대의 단편, 제대 양막의 단편 또는 태반 양막의 단편인, 방법.
22. 항목 19 내지 21 중의 어느 하나에 있어서, 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단이 약 70 내지 80% 컨플루언시에 도달할 때까지, 태반의 제대 조직 또는 양막 조직을 배양하는 것을 포함하는, 방법.
23. 항목 22에 있어서, 배양에 사용된 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것을 포함하는, 방법.
24. 항목 23에 있어서, 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것이 효소 처리에 의해 수행되는, 방법.
25. 항목 24에 있어서, 효소 처리가 트립신처리를 포함하는, 방법.
26. 항목 23 내지 25 중의 어느 하나에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 계대배양을 위해 계대배양용의 배양 용기로 이송되는, 방법.
27. 항목 1 내지 16 중의 어느 하나에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 배양을 위해 계대배양용의 배양 용기로 이송되는, 방법.
28. 항목 26 또는 27에 있어서, 중간엽 세포 모집단이, 배양 또는 계대배양을 위해 1.0×106 세포/ml의 농도로 현탁되는, 방법.
29. 항목 28에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 항목 1 내지 13 중의 어느 하나에 정의된 배양 배지에서 계대배양되는, 방법.
30. 항목 29에 있어서, 중간엽 줄기 세포가 약 70 내지 80% 컨플루언시에 도달할 때까지, 중간엽 줄기 세포 모집단이 계대배양되는, 방법.
31. 항목 26 내지 30 중의 어느 하나에 있어서, 배양 또는 계대배양이 자가-급식 생물반응기(self-contained bioreactor)에서 수행되는, 방법.
32. 항목 31에 있어서, 생물반응기가 평행-플레이트 생물반응기, 중공-섬유 생물반응기(hollow-fiber bioreactor) 및 마이크로-유체 생물반응기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
33. 항목 1 내지 32 중의 어느 하나에 있어서, 배양이 CO2 세포 배양 인큐베이터에서 37℃의 온도로 수행되는, 방법.
34. 항목 33에 있어서, (계대)배양에 사용된 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것을 포함하는, 방법.
35. 항목 34에 있어서, 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것이 효소 처리에 의해 수행되는, 방법.
36. 항목 35에 있어서, 효소 처리가 트립신처리를 포함하는, 방법.
37. 항목 36에 있어서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 수집하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
38. 항목 1 내지 37 중의 어느 하나에 있어서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 방법.
39. 항목 1 내지 38 중의 어느 하나에 있어서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR(인간 백혈구 항원-항원 D 관련)의 발현을 결여하는, 방법.
40. 항목 38 또는 39에 있어서, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 방법.
41. 항목 1 내지 40 중의 어느 하나에 있어서, 추가로 사용하기 위해, 단리된 줄기/전구세포 세포 모집단을 보존하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
42. 항목 41에 있어서, 보존이 동결-보존에 의해 수행되는, 방법.
43. 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단으로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상이 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단.
44. 항목 43에 있어서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
45. 항목 44에 있어서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 세포가 CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR 각각의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
46. 항목 43 내지 45 중의 어느 하나에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
47. 항목 43 내지 46 중의 어느 하나에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
48. 항목 43 내지 47 중의 어느 하나에 있어서, 모집단이 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 정의된 방법에 의해 수득될 수 있는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
49. 항목 43 내지 48 중의 어느 하나에 있어서, 모집단이 항목 1 내지 42 중의 어느 하나에 정의된 방법에 의해 수득되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
50. 항목 43 내지 47 중의 어느 하나에 정의된 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, 각각의 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 약제학적 조성물.
51. 항목 50에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 전신 또는 국소 적용을 위해 조정되는, 약제학적 조성물.
52. 항목 50 또는 51에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
53. 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성의 유도 또는 개선에 적합한 배양 배지를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
최종 용적 500ml 배양 배지를 수득하기 위해,
i. 250ml의 DMEM
ii. 118ml M171
iii. 118ml DMEM/F12
iv. 12.5ml 소태아 혈청(FBS)(최종 농도 2.5%)를 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
54. 항목 53에 있어서,
v. 최종 농도 10ng/ml를 달성하는 1ml EGF 스톡 용액(5㎍/ml)
vi. 최종 농도 5㎍/ml를 달성하는 인슐린 0.175ml 스톡 용액(14.28 mg/ml)을 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
55. 항목 53 또는 54에 있어서, 하기 보충제: 아데닌, 하이드로코르티손, 3,3',5=트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3) 중의 하나 이상을 DMEM에 첨가하여 합계 용적 500ml 배양 배지에 도달하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
56. 항목 55에 있어서, DMEM 중의 보충체의 최종 농도가 다음과 같은, 방법:
약 0.05 내지 0.1㎍/ml 아데닌, 예를 들면, 약 0.025㎍/ml 아데닌,
약 1 내지 10㎍/ml 하이드로코르티손,
약 0.5 내지 5ng/ml 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3), 예를 들면, 1.36ng/ml 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3).
57. 항목 53 내지 56 중의 어느 하나의 방법에 의해 수득할 수 있는 세포 배양 배지.
58. 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, 항목 53 내지 56 중의 어느 하나에 정의된 방법에 의해 제조된 배양 배지에서 양막 조직을 배양하는 것을 포함하는, 방법.
59. 항목 58에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
60. 항목 59에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단(MC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
61. - 약 55 내지 65%(v/v) 농도의 DMEM,
- 약 5 내지 15%(v/v) 농도의 F12,
- 약 15 내지 30%(v/v) 농도의 M171 및
- 약 1 내지 8%(v/v) 농도의 FBS를 포함하는,
세포 배양 배지.
62. 항목 61에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 57.5 내지 62.5%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 7.5 내지 12.5%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 17.5 내지 25.0%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 1.75 내지 3.5%(v/v)의 FBS를 포함하는, 세포 배양 배지.
63. 항목 62에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 61.8%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 11.8%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 23.6%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 2.5%(v/v)의 FBS를 포함하는, 세포 배양 배지.
64. 항목 61 내지 62 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 1ng/ml 내지 약 20ng/ml의 상피 성장 인자(EGF)를 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
65. 항목 61 내지 65 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 EGF를 최종 농도 약 10ng/ml로 포함하는, 세포 배양 배지.
66. 항목 61 내지 65 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 인슐린을 최종 농도 약 1㎍/ml 내지 10㎍/ml로 포함하는, 세포 배양 배지.
67. 항목 66에 있어서, 배양 배지가 인슐린을 최종 농도 약 5㎍/ml로 포함하는, 세포 배양 배지.
68. 항목 61 내지 67 중의 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 하기 보충제: 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3) 중의 적어도 하나를 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
69. 항목 68에 있어서, 배양 배지가 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)의 3개 모두를 포함하는, 세포 배양 배지.
70. 항목 68 또는 69에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 0.05 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌의 아데닌, 최종 농도 약 1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손의 하이드로코르티손 및/또는 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 포함하는, 세포 배양 배지.
71. 항목 61 내지 70 중의 어느 하나에 있어서, 500ml의 세포 배양 배지가
i. 250ml의 DMEM
ii. 118ml M171
iii. 118ml DMEM/F12
iv. 12.5ml 소태아 혈청(FBS)(최종 농도 2.5%)
를 포함하는, 세포 배양 배지.
72. 항목 71에 있어서,
v. 최종 농도 10ng/ml의 EGF,
vi. 최종 농도 5㎍/ml의 인슐린,
vi. 인슐린 0.175ml(최종 농도 5㎍/ml)
을 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
73. 항목 71 또는 72에 있어서, 최종 농도 약 0.05 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌의 아데닌, 최종 농도 약 1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손의 하이드로코르티손 및/또는 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 추가로 포함하는, 세포 배양 배지.
74. 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키기 위한, 항목 61 내지 73 중의 어느 하나의 세포 배양 배지의 용도.
75. 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하기 위한, 항목 61 내지 73 중의 어느 하나의 세포 배양 배지의 용도.
76. 항목 74 또는 75에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
77. 항목 76에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
78. 항목 74 내지 77 중의 어느 하나에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상 세포가 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 용도.
79. 항목 78에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 용도.
80. 항목 79에 있어서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상 세포가 각각의 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고 각각의 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 용도.
81. 유일한 창상 치유 단백질로서 Ang-1, TGF-β1, VEGF 또는 HGF의 3 또는 4개를 함유하는 약제학적 조성물.
82. 항목 81에 있어서, 액체 또는 동결건조물/동결-건조 제형으로서 제형화된, 약제학적 조성물.
본 발명의 범위 및 정신으로부터 일탈하지 않고서, 본원에 개시된 발명에 대하여 다양한 치환 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 관계하는 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은, 각각의 간행물이 참조에 의해 도입되는 것이 구체적 및 개별적으로 나타내도록, 참조에 의해 본원에 도입된다.
본원에서 예시적으로 기재된 발명은 적합하게는, 본원에서 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들의 부재하에서 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 등은 확장적으로 및 제한 없이 읽혀져야 한다. 추가로, 본원에 사용된 용어 및 표현은 제한 없이 기재의 용어로서 사용되었고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여, 도시 및 설명된 특징 또는 이의 일부의 동등물을 제외하는 의도는 없지만, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식한다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시형태 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 본원에서 구체화된 발명의 수정 및 변형이 당업자에 의해 수행될 수 있고 이러한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 본 발명은 본원에서 광범위하게 및 일반적으로 기재되어 있다. 일반적 개시 내에 포함되는 보다 좁은 종류 및 하위 그룹의 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는, 추출된 물질이 본원에서 구체적으로 언급되는지의 여부에 관계 없이, 임의의 주제를 종류로부터 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 수반하는 본 발명의 일반적 기재를 포함한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 국면이 마르쿠쉬 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 당업자는 본 발명이 마르쿠쉬 그룹의 멤버의 임의의 개별 멤버 또는 하위 그룹의 관점에서 기재된다는 것을 인식한다. 본 발명의 추가의 실시형태는 하기 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

Claims (58)

  1. 중간엽 줄기 세포 모집단(population)의 창상 치유 특성(wound healing property)을 유도 또는 개선시키는 방법으로서, DMEM(Dulbeco's modified eagle medium; 둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의(Ham's) F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)을 포함하는 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 55 내지 65%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 5 내지 15%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 15 내지 30%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 1 내지 8%(v/v)의 FBS를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 57.5 내지 62.5%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 7.5 내지 12.5%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 17.5 내지 25.0%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 1.75 내지 3.5%(v/v)의 FBS를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 61.8%(v/v)의 DMEM, 최종 농도 약 11.8%(v/v)의 F12, 최종 농도 약 23.6%(v/v)의 M171 및 최종 농도 약 2.5%(v/v)의 FBS를 포함하는. 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 1ng/ml 내지 약 20ng/ml의 상피 성장 인자(EGF)를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 10ng/ml의 EGF를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 1㎍/ml 내지 10㎍/ml의 인슐린을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 배양 배지가 최종 농도 약 5㎍/ml의 인슐린을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가, 하기 보충제: 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3) 중의 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가, 아데닌, 하이드로코르티손 및 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)의 3개 모두를 포함하는, 방법.
  13. 제12항 또는 제13항에 있어서, 배양 배지가, 최종 농도 약 0.01 내지 약 0.1㎍/ml 아데닌의 아데닌, 최종 농도 약 0.1 내지 약 10㎍/ml 하이드로코르티손의 하이드로코르티손 및/또는 최종 농도 약 0.5 내지 약 5ng/ml의 3,3',5-트리요오도-L-티로닌 나트륨 염(T3)을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 정의된 배양 배지에서 중간엽 줄기 세포 모집단을 배양하는 것이, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지), F12(햄의 F12 배지), M171(배지 171) 및 FBS(소태아 혈청)의 모두를 포함하지 않는 참조 배양 배지에 대하여, 중간엽 줄기 세포 모집단에 의한 안지오포이에틴 1(Ang-1), TGF-β(특히 TGF-β1), VEGF 및 HGF 중의 적어도 하나의 발현 및/또는 분비를 증가시키는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 참조 배지가 90%(v/v) CMRL1066 및 10%(v/v) FBS로 이루어지는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 정의된 배양 배지에서 배양하기 전에, 이의 자연 환경으로부터 단리된, 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 정의된 세포 배양 배지에서 자연 조직(natural tissue)을 배양함으로써 자연 조직 환경으로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 조직이 제대 조직인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제대 조직이, 제대 전체의 조직, 제대 양막을 포함하는 조직, 와튼 젤리를 포함하는 조직, 양막을 포함하는 조직, 양막 및 와튼 젤리, 단리된 제대 혈관, 제대 조직의 다른 성분으로부터 분리된 와튼 젤리, 및 제대의 단리된 양막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 조직이 태반의 양막 조직을 포함하거나 태반의 양막 조직인, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 제대 조직이 전체 제대의 단편, 제대 양막의 단편 또는 태반 양막의 단편인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단이 약 70 내지 80% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지, 태반의 제대 조직 또는 양막 조직을 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 배양에 사용된 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것이 효소 처리에 의해 수행되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 효소 처리가 트립신처리(trypsination)를 포함하는, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 계대배양(subculturing)을 위해 계대배양용의 배양 용기로 이송되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 배양을 위해 계대배양용의 배양 용기로 이송되는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 중간엽 세포 모집단이, 배양 또는 계대배양을 위해 1.0×106 세포/ml의 농도로 현탁되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 정의된 배양 배지에서 계대배양되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 중간엽 줄기 세포가 약 70 내지 80% 컨플루언시에 도달할 때까지, 중간엽 줄기 세포 모집단이 계대배양되는, 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 또는 계대배양이 자가-급식 생물반응기(self-contained bioreactor)에서 수행되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 생물반응기가 평행-플레이트 생물반응기, 중공-섬유 생물반응기 및 마이크로-유체 생물반응기(hollow-fiber bioreactor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양이 CO2 세포 배양 인큐베이터에서 37℃의 온도로 수행되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, (계대)배양에 사용된 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 배양 용기로부터 중간엽 줄기 세포 모집단을 제거하는 것이 효소 처리에 의해 수행되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 효소 처리가 트립신처리를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 수집하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR(인간 백혈구 항원-항원 D 관련)의 발현을 결여하는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 단리된 중간엽 줄기 세포가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가로 사용하기 위해, 단리된 줄기/전구세포 세포 모집단을 보존하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 보존이 동결-보존에 의해 수행되는, 방법.
  43. 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단으로서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상이 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하는, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단.
  44. 제43항에 있어서, 줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  45. 제44항에 있어서, 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 세포가 CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하고, CD34, CD45 및 HLA-DR 각각의 발현을 결여하는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  46. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  47. 제43항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  48. 제43항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 모집단이 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득될 수 있는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  49. 제43항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 모집단이 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득되는, 중간엽 줄기 세포 모집단.
  50. 제43항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 정의된 단리된 중간엽 줄기 세포 모집단을 포함하는 약제학적 조성물로서,
    줄기 세포 모집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 각각의 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, 각각의 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현을 결여하는, 약제학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 약제학적 조성물이 전신 또는 국소 적용을 위해 조정되는, 약제학적 조성물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  53. 중간엽 줄기 세포 모집단의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키기 위한,
    - 약 55 내지 65%(v/v) 농도의 DMEM,
    - 약 5 내지 15%(v/v) 농도의 F12,
    - 약 15 내지 30%(v/v) 농도의 M171 및
    - 약 1 내지 8%(v/v) 농도의 FBS를 포함하는,
    세포 배양 배지의 용도.
  54. 제53항에 있어서, 배양 배지가, 약 57.5 내지 62.5%(v/v) 농도의 DMEM, 약 7.5 내지 12.5%(v/v) 농도의 F12, 약 17.5 내지 25.0%(v/v) 농도의 M171 및 약 1.75 내지 3.5%(v/v) 농도의 FBS를 포함하는, 세포 배양 배지의 용도.
  55. 제54항에 있어서, 배양 배지가, 약 61.8%(v/v) 농도의 DMEM, 약 11.8%(v/v) 농도의 F12, 약 23.6%(v/v) 농도의 M171 및 약 2.5%(v/v) 농도의 FBS를 포함하는, 세포 배양 배지의 용도.
  56. 제53항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단을 단리하기 위한, 세포 배양 배지의 용도.
  57. 제53항 내지 제56항 중의 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포 모집단이, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단, 태반 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대혈의 중간엽 줄기 세포 모집단, 골수의 중간엽 줄기 세포 모집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세포 배양 배지의 용도.
  58. 제57항에 있어서, 제대의 중간엽 줄기 세포 모집단이 양막(AM)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 혈관주위(PV) 중간엽 줄기 세포 모집단, 와튼 젤리(WJ)의 중간엽 줄기 세포 모집단, 제대 양막의 중간엽 줄기 세포 모집단 및 제대(MC)의 혼합 중간엽 줄기 세포 모집단으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세포 배양 배지의 용도.
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