KR20220078637A - 중간엽 줄기 집단의 상처 치유 효능 평가 방법 및 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한, 중간엽 줄기세포를 선택하고 출발 물질로서 조직을 확인하는 관련 방법 - Google Patents

중간엽 줄기 집단의 상처 치유 효능 평가 방법 및 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한, 중간엽 줄기세포를 선택하고 출발 물질로서 조직을 확인하는 관련 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC) 집단의 상처 치유 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 MSC를 선택하는 방법, 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 MSC 집단을 선택하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 MSC 집단을 선택하는 방법 및 제약 용도를 위한 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 배지 중에서 MSC에 의해 배지에 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함한다.

Description

중간엽 줄기 집단의 상처 치유 효능 평가 방법 및 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한, 중간엽 줄기세포를 선택하고 출발 물질로서 조직을 확인하는 관련 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 10월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/912,374의 우선권을 주장하며, 이 가출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
이 출원은 컴퓨터 판독 가능 형식의 서열 목록을 함유하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 중간엽 줄기세포 집단(mesenchymal stem cell population)의 상처 치유 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법 및 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 마스터 세포 은행(master cell bank)을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법 및 제약 용도(pharmaceutical use)를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도 및 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하는 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포 (MSC)는 자기-재생 및 다중 계통 분화가 가능하다. 그로 인해, 이들 세포는 재생 의약을 위한 매력적이고 유망한 도구이다. MSC는 다양한 조직 예컨대 골수 기질, 지방 조직, 진피, 태반, 제대혈 또는 와튼 젤리를 포함하는 상이한 제대 조직, 제대 정맥의 내피하층, 또는 제대의 양막 조직으로부터 단리될 수 있다 (Mitchell, K.E. et al. (2003) Stem Cells 21, 50-60; 미국 특허 5,919,702; 미국 특허출원 2004/0136967; Romanov, Y.A. et al. (2003) Stem Cells 21, 105-110; Covas, D.T. et al. (2003) Braz. J. Med. Biol. Res. 36, 1179-1183; US2006/0078993). 제대의 양막으로부터 단리된 중간엽 줄기세포는 미국 특허출원 2006/0078993 (허여된 미국 특허 9,085,755, 9,737,568 및 9,844,571을 야기) 및 상응하는 국제 특허출원 WO2006/019357에서 처음 보고되었다. 게다가, 제대의 양막으로부터 이러한 중간엽 줄기세포의 집단은 최근 미국 출원 20181/27721 또는 상응하는 국제출원 WO 2018/067071에 기재되었다.
미국 출원 20181/27721 또는 상응하는 국제출원 WO 2018/067071에 기재된 중간엽 줄기세포 집단은 이 집단의 줄기세포의 99% 이상이 세 가지 MSC 마커 CD73, CD90을 발현하며 한편 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되어 있다는 이점을 갖는다. 따라서 이처럼 매우 균질하고 잘 정의된 세포 집단은, 예를 들어, 문헌 [Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonk et al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94], 또는 [Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol. 19. No. 2. P. 75-79 ]에 의해 정의된 바와 같이, 인간 MSC가 세포 요법에 사용되는 데 일반적으로 허용되는 기준을 완전히 충족하므로 임상 시험 및 세포 기반 요법에 이상적인 후보이다. 국제출원 WO 2018/067071에 기재된 바와 같이, 이러한 중간엽 줄기세포 집단은, 예를 들어, 화상 또는 만성 당뇨병성 상처(chronic diabetic wound)의 치료와 같은 상처 치유 목적을 위해 그의 미분화 상태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 중간엽 줄기세포 집단은, 예를 들어, 인슐린 생산 β-섬 세포로 분화될 수 있으며, 이는 이어서, 예를 들어, 이식에 의해, 진성 당뇨병과 같은 인슐린 결핍을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다 (또한 이와 관련하여 국제출원 WO2007/046775 참조).
국제출원 WO 2018/067071에 또한 기재된 바와 같이 이러한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하는 공정은 이러한 동종이계 세포-기반 요법에 필요한 바와 같은, 우수의약품 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Practice) (GMP) 조건 하에 수행하기에 적합하다. 그러나, GMP 생산은 국제출원 WO 2018/067071의 중간엽 줄기세포 집단의 경우에서와 같이 제조된 완제 의약품(drug product)이 소형 유기 분자이든, 생물학적 분자이든 또는 심지어 세포 집단이든 상관없이 상기 완제 의약품의 품질 관리를 필요로 한다. 따라서, 국제출원 WO 2018/067071의 중간엽 줄기세포 집단의 GMP 생산을 위한 품질 관리 검정을 즉시 쓸 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다.
이러한 맥락에서, 중간엽 줄기세포는, 임의의 다른 생물학적 물질과 마찬가지로, 고유한 가변성을 가지고 있는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포의 세포 생물학의 연구는 그의 수명 및 확장 능력에 영향을 미치는 여러 가지의 요인을 확인하였다. 공여자 조직의 공급원, 공여자 연령, 환경적 배경, 및 단리 방법과 같은 문제는 중간엽 줄기세포의 전반적인 품질에 영향을 미치는 것으로 기재되어 있다 (문헌 [Paladino, et al. "Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells," Cell and Tissue Banking, vol. 17, no. 1, pp. 123-136, (2016), https://doi.org/10.1007/s10561-015-9525-6] 참조). 게다가, 상기 팔라디노(Paladino) 등의 2016 문헌은 세포 은행을 목적으로 제대로부터 MSC의 세 가지 단리 상이한 단리 방법을 비교하고 세포 생존, 배양 수명, 확장 가능성 및 분화 능력의 면에서 이점이 있는지 확인하여 중간엽 줄기세포의 개별적 가변성을 다루었다. 상기 저자들은 동일한 샘플을 세 가지 연구 프로토콜 중 적어도 둘로 처리하고 고도로 제어된 실험 조건 하에 처리하였기 때문에, 그의 결과는 관찰된 가변성의 일부가 시간 및 수명이 2배가 되는 판독으로 각각의 공여자에게 분명히 내재되어 있음을 밝힌다고 보고한다. 추가 연구에서, 문헌 [Paladino et al. (2017) "Intrinsic Variability Present in Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells and T Cell Responses May Impact Cell Therapy". Hindawi, Stem Cells International Volume 2017, Article ID 8492797, 12 pages, https://doi.org/10.1155/2017/8492797]은 면역조정 분자의 유전자 발현은 어떤 구체적 패턴도 존재하지 않는 와튼 젤리 중간엽 줄기세포 (WJ-MSC) 샘플 간에 다양함을 나타냈다. 공동 배양에서, 모든 WJ-MSC는, 비록 정도는 상이하긴 하지만, 미토겐-활성화 CD3+ T 세포 증식을 억제할 수 있었고, 각각의 PBMC는 상이한 억제 수준으로 반응하였다. 상기 저자들은 각각의 WJ-MSC가 시토카인 mRNA 발현 패턴 및 면역조정 능력이 상이한 독특한 거동을 표시한다고 시사하였다. 상기 저자들은 또한 샘플 간의 가변성이 치료적으로 이용되는 WJ-MSC의 유효성에 역할을 할 수 있다고 가정하였다.
이들 결과에 비추어 볼 때, 제대의 양막으로부터의 MSC는 특정 분자의 생산과 관련하여 고유한 가변성을 또한 가지며, 이는 결국 상처 치유 또는 당뇨병과 같은 치료적 적용에 대한 그의 적합성에 영향을 미칠 수 있을 가능성이 있다. 따라서, 예를 들어 상처 치유 목적에 사용하기에 적합한 공여자 조직을 함유하는 MSC 집단 또는 MSC를 확인하는 방법을 즉시 쓸 수 있도록 하는 것이 유리할 것이다. 이러한 방법은 이상적으로는 마스터 세포 은행 (이는 세포 요법 완제 의약품 생산에 필요함)을 생성하거나 후속 약제학적 투여를 위해 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하는 데에 또한 유용할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은, 예를 들어, 상처 치유와 같은 치료적 적용에 적합한 MSC 함유 조직 또는 후속적으로 MSC 집단에 대한 공여자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
이 목적은 독립항의 특색을 갖는 방법 및 용도에 의해 완수된다.
제1 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴(Angiopoietin) 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타(Transforming Growth Factor beta) (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor) (VEGF) 및 간세포 성장 인자(Hepatocyte Growth Factor) (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 조직의 샘플 또는 조직으로부터 단리된 세포에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
제9 측면에서, 본 발명은 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
제10 측면에서, 본 발명은 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
제11 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하는 방법을 제공한다.
제12 측면에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 비제한적인 실시예 및 도면과 함께 고려될 때 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 적합한 상처 치유 효능을 가진 MSC 집단을 함유하는 치료 조성물을 생산하는 방법의 실례의 실험 단계를 개략적으로 나타내는 흐름도를 나타낸다. 이 방법은 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하고, MSC 집단의 상처 치유 효능을 평가하고, 마스터 세포 은행을 생산하기 위한 MSC 집단을 선택하고, 약제학적 투여를 위한 MSC 집단을 선택하는 것을 포함한다. 이 예에서 사용된 줄기세포는 제대의 양막으로부터 단리되며 - 본원에서는 제대 내벽 줄기세포(cord lining stem cell) (CLSC)라고도 칭해진다. 이 예는 MSC 배양을 위한 출발 물질로서 사용할 수 있는, 제대 조직을 포함하는 조직 은행을 설정하는 것으로 시작한다. 이를 위해, 조직 공여에 대한 공여자의 동의를 수득할 수 있다 (단계 1). 추가로, 산모 및 신생아의 혈액 샘플은 감염성 질환에 대해 스크리닝되고 제대는 미생물 오염에 대해 검사된다. 예를 들어, 최대 100개의 제대 샘플이 이러한 조직 은행에서 수집될 수 있다. 상기 문(door)의 오염 또는 감염성 질환과 관련하여 중대하지 않은 것으로 밝혀진 조직은 순수한 MSC 주(lines)를 생산하는 데 사용되는 개발 배양(development culture)에 사용된다 (단계 2). 이를 위해, 제대의 약 10개 개별 양막으로부터의 파생물을 번식을 위해 0 내지 2 계대배양을 위해 배양한다. 계대배양 2 (P2)로부터의 MSC를 MSC 마커에 대한 유세포 분석법에 의해 평가하고 상청액(supernatant)을 시토카인 생산에 대해 평가한다. 단계 2에서 MSC에 대한 공정 중(in-process) 방출 기준은 CD73, CD90, CD105에 대해 >95% 양성, 및 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해 <5% 양성을 포함하며, 시험관내에서 안지오포이에틴-1 및 TGF-β의 >500 pg/ml 생산, 및 VEGF 및 HGF의 >100 pg/ml 및 음성 무균(negative sterility)을 가진다. 이어서, 단계 2 공정 중 방출 기준을 충족하는 세포주를 제조 공정의 단계 3를 위해 테루모 퀀텀(Terumo Quantum) 생물반응기에서 추가로 번식시킨다. 단계 3에서 MSC에 대한 공정 중 방출 기준은 CD73, CD90, CD105에 대해 >95% 양성, 및 CD34, CD45 및 HLA-DR에 대해 <5% 양성을 포함하며, 무균, 내독소, 마이코플라즈마, 인간 병원체 바이러스 및 외래 바이러스에 대해 검사된다. 검사를 통과한 중간엽 세포주 (집단)는 마스터 세포 은행으로서 저장된다 (단계 3). 마스터 세포 은행을 해동하고 배양물에 시딩하고 방출 기준은 무균, 마이코플라즈마 및 내독소이며 마지막으로 검사를 통과한 1x, 3x 및 5x 106개 MSC를 1 ml 히포써모솔(Hypothermosol)®과 같은 담체 배지에 병에 담아 약제학적 투여 전에 2-8℃에서 보관한다 (단계 4).
도 2는 단계 2 후(post-stage 2) 도 1에 대해 기재된 바와 같이 배양된 10개의 상이한 제대 공여자로부터 수득된 10개의 개별 MSC 집단에서 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β (여기서는 TGF-β1)의 분비 수준 분석 결과를 나타낸다. 도 2A는 개별 MSC 집단 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 및 8049384에 대한 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 분비 수준을 나타낸다. 모든 10개의 집단의 분비 수준은 TGF-β에 대한 역치값(threshold value)을 초과하며, 이는 약 500 pg/ml이고 적색 선으로 표시된다. 도 2B는 개별 MSC 집단 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 및 8049384에 대한 간세포 성장 인자 (HGF)의 분비 수준을 나타낸다. 8049365, 8049369, 8049372, 8049373 및 8049384의 분비 수준은 HGF에 대한 역치값을 초과하며, 이는 약 100 pg/ml이고 적색 선으로 표시된다. 도 2C는 개별 MSC 집단 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 및 8049384에 대한 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 분비 수준을 나타낸다. 모든 10개의 집단의 분비 수준은 Ang-1에 대한 역치값을 초과하며, 이는 약 500 pg/ml이며 적색 선으로 표시된다. 도 2D는 개별 MSC 집단 8049356, 8049358, 8049359, 8049364, 8049365, 8049369, 8049370, 8049372, 8049373 및 8049384에 대한 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 분비 수준을 나타낸다. 8049358, 8049359 및 8049370을 제외하고, 모든 집단의 분비 수준은 VEGF에 대한 역치값을 초과이며, 이는 약 100 pg/ml이고 적색 선으로 표시된.
도 3은 MSC 집단 (8049372)에서 시토카인 분비 안정성의 평가를 나타낸다. 이를 위해, TGF-β, HGF, Ang-1 및 VEGF의 분비 수준을 각각 결정하고 단계 4 후(post-stage 4) 동일한 집단의 두 개의 개별 샘플에서 비교한다. 도 3A는 두 개의 개별 샘플 중 TGF-β의 분비 수준을 나타내며 이는 단계 4 후 각각 약 2230 pg/ml 및 2419 pg/ml의 안정적인 단백질 분비를 나타낸다. 도 3B는 두 개의 개별 샘플 중 HGF의 분비 수준을 나타내며 이는 단계 4 후 각각 약 933 pg/ml 및 985 pg/ml의 안정적인 단백질 분비를 나타낸다. 도 3C는 두 개의 개별 샘플 중 Ang-1의 분비 수준을 나타내며 단계 4 후 각각 약 1800 pg/ml 및 1854 pg/ml의 안정적인 단백질 분비를 나타낸다. 도 3D는 두 개의 개별 샘플 중 VEGF의 분비 수준을 나타내며 이는 단계 4 후 각각 약 210 pg/ml 및 219 pg/ml의 안정적인 단백질 분비를 나타낸다.
도 4는 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하기 위한 검정의 결과를 나타낸다. 태반, 와튼 젤리 (WJ MSC) 및 제대의 양막 (제대 내벽 MSC (CL-MSC)로도 지칭됨)으로부터 수득된 MSC를 MSC를 배양하기에 적합한 상이한 배지 (PTT4, PTT6 및 DMEM/F12)에서 배양하였다. 단백질 검출은 MSC 상청액에서 수행되었으며 분석은 루미넥스(Luminex) 200 및 엑스포넌트(Xponent) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 4A는 Ang-1의 측정을 요약한다. S1은 검정에서 사용된 최고 표준물을 의미한다. 상기에 속하는 임의의 샘플은 외삽된 것으로 간주된다 (너무 농축됨). 그래프는 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC 모두 MSC가 PTT4 또는 DMEM/F12에서 성장했을 때와 비교하여 PTT6에서 성장했을 때 훨씬 더 높은 수준의 Ang-1을 생산한다는 것을 나타낸다. 도　4B는 PTT6, PTT4 또는 DMEM/F12에서 배양된 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC의 분석된 상청액에서 VEGF의 측정을 요약한다. S1은 검정에서 사용된 최고 표준물을 의미한다. 상기에 속하는 임의의 샘플은 외삽된 것으로 간주된다 (너무 농축됨). 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC 모두 MSC가 PTT4 또는 DMEM/F12에서 성장했을 때와 비교하여 PTT6에서 성장했을 때 훨씬 더 높은 수준의 VEGF를 생산한다. 도 4C는 HGF의 측정을 요약한다. 그래프는 CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC 모두 MSC가 PTT4 또는 DMEM/F12에서 성장했을 때와 비교하여 PTT6에서 성장했을 때 훨씬 더 높은 수준의 Ang-1을 생산한다는 것을 나타낸다. 도 4D는 TGF-β1의 싱글플렉스(singleplex) 측정을 나타낸다. 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, CL-MSC, WJ-MSC 및 태반 MSC 모두 DMEM/F12에서 성장했을 때보다 PTT6에서 성장했을 때 더 많은 TGF-β1을 생산한다.
본 발명은 치료적 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단의 GMP 제조 공정의 다양한 단계에 대한 검증 및/또는 품질 관리에 모두 적합한 여러 방법에 관한 것이다. 이들 모든 방법은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 이용한다.
따라서 본원에서 놀랍게도 MSC 집단의 배지 중 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비 수준을 결정하는 것이 MSC 집단의 GMP 제조 공정의 여러 측면에 대한 적합한 기준이라는 것이 밝혀졌다. MSC 집단이 배양되거나 보관되는 배지 중 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비 수준을 결정하는 것은 MSC 집단의 상처 치유 효능을 평가하거나, 적합한 상처 치유 효능을 가진 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 (공여자) 조직을 확인하거나, cGMP 생산을 위한 MSC 집단을 선택하거나, 후속 약제학적 투여를 위한 MSC 집단을 선택하거나 마스터 세포 은행을 생산하는데 사용할 수 있다. 게다가, Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비 수준을 결정하는 것은 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하는 데 사용할 수 있다.
상처 치유 과정에서 Ang-1, TGF-β1, VEGF 및 HGF의 관여가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다는 점이 본원에서 주목된다. 상처 치유에서 Ang-1 (서열식별번호: 1)의 관여의 경우, 예를 들어, 문헌 [Li et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:113 "Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing"] 또는 [Bitto et al, "Angiopoietin-1 gene transfer improves the impaired wound healing of the genetically diabetic mice without increasing VEGF expression", Clinical Science May 14, 2008, 114 (12) 707-718]을 참조한다. 리(Li) 등의 연구에서, Ang-1 유전자를 골수 중간엽 줄기세포에 삽입하였으며 그 결과는 " Ang1-MSC는 MSC와 비교하여 표피 및 진피 재생을 증가시켜 상처 치유를 유의하게 촉진하고, 혈관신생을 증진시킨 것"으로 나타났다. 특히, 리 등의 저자들은 MSC 단독은 충분한 Ang-1을 생산하지 못하며 이러한 이유로, 상기 저자들은 Ang-1-유전자를 MSC에 삽입하여 유전자 변형 세포를 생산한 것을 명시한다.
상처 치유, 특히 만성/비치유(non-healing) 상처의 치유에서, TGF-β1 (서열식별번호: 2, TGF-β2, 및 TGF-β3을 포함한 형질전환 성장 인자 베타의 관여의 경우, 예를 들어, 문헌 [Ramirez et al. "The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization" Advances In Wound Care, Volume 3, Number 7, 2013, 482-491] 또는 [Pakyari et al., Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing, Advances In Wound Care, Volume 2, Number 5, 2012, 215-224]을 참조한다.
상처 치유, 특히 만성/비치유 상처의 치유에서 VEGF (서열식별번호: 3)의 관여의 경우, 예를 들어 문헌 [Froget et al., Eur. Cytokine Netw., Vol. 14, March 2003, 60-64] 또는 [Bao et al., "The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing" J Surg Res. 2009 May 15; 153(2): 347-358]을 참조한다.
상처 치유, 특히 만성/비치유 상처의 치유에서 HGF (서열식별번호: 4)로 되돌아가서, 예를 들어, 문헌 [Yoshida et al., "Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded CutaneousWound Healing Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation" J. Invest. Dermatol. 120:335-343, 2003], [Li, Jin-Feng et al. "HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferentiation of Epidermal Cells through β 1-Integrin/ILK Pathway." BioMed Research International 2013 (2013): 470418] 또는 [Conway et al, "Hepatocyte growth factor regulation: An integral part of why wounds become chronic".Wound Rep Reg (2007) 15 683-692]을 참조한다.
상처 치유 효능은 상처 치유를 촉진하거나 가속화하는 역량, 능력, 능숙도 또는 유효성을 기재할 수 있다. 본 발명에서, Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 모두의 분비 수준 (농도로서도 지칭됨)이 본원에 정의된 바와 같은 이들 단백질 각각에 특이적인 역치 이상인 경우 (또한 실시예 2 참조), MSC 집단은, 예를 들어, 충분한 상처 치유 효능을 갖는 것으로 간주되거나, 조직은 제약상 적합한 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 적합한 것으로 간주된다. 따라서, 상처 치유를 평가하는 것은 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비 수준을 결정하고 구체적 역치에 도달하거나 초과하는지 여부의 후속적 결정을 포함한다. MSC 집단의 상처 치유 효능 평가는 MSC 배양의 상이한 단계 동안 수행할 수 있다. 상처 치유 효능은 상처 치유 효능을 갖는 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합하고 따라서 후속 제약 용도에 적합할 수 있는 조직을 확인하기 위해 MSC 배양 직전에 조직 상에서 평가될 수 있다. 제약 적용에 적합하기 위해, MSC 집단은 현재의 우수의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP) 조건 하에 생산되어야 한다. 따라서, MSC 집단을 생성하기 전에 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비 수준을 결정하는 것은 cGMP 조건 하에 MSC 집단을 생성하기 위한 MSC 집단을 선택하는 데 적합할 수 있다. 추가로, MSC 집단은 본원에 기재된 방법을 사용하여 후속 약제학적 투여를 위해 선택될 수 있다.
본 발명에 따라 선택된 MSC 집단은 또한 마스터 세포 은행을 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서, 선택된 MSC 집단은 동결보존 전에 무결성 및 오염 물질 예컨대 박테리아, 진균, 마이코플라즈마 및 바이러스에 대해 추가로 특성화되고 검사될 수 있다. 일단 설정되면 MSC 마스터 세포 은행은 필요할 때마다 추가 연구 또는 생산 공정을 위한 배양을 형성하기 위해 구체적 MSC 집단의 확장을 허용할 수 있다. 예를 들어, 상처 치유 특성을 가진 MSC를 포함하는 MSC 마스터 세포 은행은 구체적 MSC 집단의 확장을 허용할 수 있으며 상처 치유에 이상적인 양의 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF를 분비할 수 있다.
Ang-1, TGF-β, VEGF 및/r HGF의 분비 수준은 본원에 기재된 방법에서 선택 기준으로서 사용된다. 역치와 동일하거나 초과하는 분비 수준은, 예를 들어, (i) MSC 집단의 상처 치유 효능 또는 (ii) MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직 또는 단리된 세포 집단을 나타낼 수 있다. 본 발명에서, Ang-1에 대한 역치는 약 100 pg/ml, 약 100　pg/ml, 약 200　pg/ml, 약 300　pg/ml, 약 400　pg/ml, 약 500　pg/ml, 약 600　pg/ml, 약 700　pg/ml, 약 800　pg/ml, 약 900　pg/ml 또는 약 1000　pg/ml일 수 있다. 바람직하게는, Ang-1의 경우 역치는 약 500 pg/ml이다. TGF-β에 대한 역치는 약 100 pg/ml, 약 200　pg/ml, 약 300　pg/ml, 약 400　pg/ml, 약 500　pg/ml, 약 600　pg/ml, 약 700　pg/ml, 약 800　pg/ml, 약 900　pg/ml 또는 약 1000　pg/ml일 수 있다. 바람직하게는, TGF-β의 경우 역치는 약 500 pg/ml이다. VEGF와 관련하여, 역치는 약 80 pg/ml, 약 100　pg/ml, 약 120　pg/ml, 약 140　pg/ml, 약 160　pg/ml, 약 180　pg/ml 또는 약 200　pg/ml일 수 있고, 여기서 VEGF에 대한 역치는 바람직하게는 약 100 pg/ml이다. HGF로 돌아가면 역치는 약 80　pg/ml, 약 100　pg/ml, 약 120　pg/ml, 약 140　pg/ml, 약 160　pg/ml, 약 180　pg/ml 또는 약 200　pg/ml일 수 있다. 바람직하게는, HGF의 경우 역치는 약 100　pg/ml이다.
본 발명의 한 예에서, 하기 역치 수준 (값)이 사용된다:
- 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 경우 약 400　pg/ml의 역치
- 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 400　pg/ml의 역치
- 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치
- 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치.
본 발명의 또 다른 예에서, 하기 역치 수준 (값)이 사용된다:
- 안지오포이에틴　1 (Ang-1)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
- 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
- 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치
- 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치.
이들 두 가지 예에서, 모든 네 가지 단백질의 분비 수준은, 예를 들어, MSC 집단이 적절한 상처 치유 특성을 갖거나 조직을 제약상 적합한 MSC 집단을 생산하기 위한 적합한 출발 물질로서 간주하기 위해, 분비 수준/농도가 그의 각각의 역치값과 동일하거나 초과한다 (실시예 2 참조). 본원에서 본 발명에서 결정된 농도 및 그에 따른 역치 수준은 바람직하게는 절대 농도임을 주목한다.
임의의 제약상 적합한 MSC 집단이 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, MSC 집단은 MSC를 함유하는 것으로 공지된 임의의 포유동물 조직 또는 구획/신체 부분으로부터 유래될 수 있다. 실례에서, MSC 집단은 제대의 MSC 집단, 태반 MSC 집단, 제대-태반 접합부(cordplacental junction)의 MSC 집단, 제대혈의 MSC 집단, 골수의 MSC, 또는 지방-조직 유래 MSC 집단의 MSC 집단일 수 있다. 제대의 MSC 집단은 MSC를 함유하는 제대 조직의 임의의 구획 예컨대 양막, 혈관주위 MSC 집단, 와튼 젤리의 MSC 집단, 제대 양막의 MSC 집단 그러나 또한 제대의 혼합 MSC 집단으로부터 일 수 (유래할 수)있으며, 이는 이들 구획 중 둘 이상의 줄기세포를 포함하는 MSC 집단을 의미한다. 이들 구획의 MSC 및 이로부터의 이의 단리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Subramanian et al "Comparative Characterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Wharton's Jelly Compartment Provides the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem Cells", PLoS ONE 10(6): e0127992, 2015] 및 거기에 인용된 참조문헌, 문헌 [Van Pham et al. "Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications", Cell Tissue Bank (2016) 17:289-302, 2016]에 의해 기재되어 있다. 제대의 혼합 MSC 집단은, 예를 들어, 제대 조직으로부터의 동맥 및 정맥을 제거하고, 나머지 조직 및 와튼 젤리를 조각으로 커팅하고 본 발명의 배양 배지에서 제대 조직을 배양 (조직 이식에 의해)함으로써 수득될 수 있다. 제대의 혼합 MSC 집단은 또한 문헌 [Schugar et al. "High harvest yield, high expansion, and phenotype stability of CD146 mesenchymal stromal cells from whole primitive human umbilical cord tissue. Journal of biomedicine & biotechnology. 2009; 2009:789526"]에 기재된 바와 같은 조건 (10% 소 태아 혈청, 10% 말 혈청, 및 1% 페니실린을 가진 DMEM이 보충된 혈청 중에서 배양) 하에 조직 외식편으로서 무손상 제대 혈관과 함께 전체 제대 조직을 배양함으로써 수득할 수 있다. 이 맥락에서, 제대-태반 접합부의 MSC 집단은 문헌 [Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224]에 의해 기재된 바와 같이 단리될 수 있음을 주목한다. 본 발명의 예에서, MSC 집단은 제대 또는 제대의 양막으로부터 유래된 경우 (실시예 1 내지 4 참조). 제대의 양막의 MSC 집단은 고도로 정의되고 균질할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 국제출원 WO 2018/067071에 기재된 바와 같은 중간엽 줄기세포 집단이 사용된다. 따라서, 방법의 전형적인 예에서 MSC의 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 약 99% 이상은 하기 마커를 발현한다: CD73 (서열식별번호: 5), CD90 (서열식별번호: 6) 및 CD105 (서열식별번호: 7). 게다가, 이들 예에서 MSC의 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상은 하기 마커의 발현이 결여되어 있을 수 있다: CD34 (서열식별번호: 8), CD45 (서열식별번호: 9) 및 HLA-DR (서열식별번호: 10). 특정한 예에서, MSC 집단의 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이 CD73, CD90 및 CD105를 발현하며 한편 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되어 있다. 바람직한 예에서, MSC 집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 약 99% 이상의 세포는 CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하며 한편 MSC의 적어도 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상 약 95% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 약 99% 이상은 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되어 있을 수 있다. 특정한 예에서, MSC 집단의 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상은 CD73, CD90 및 CD105를 발현하며 한편 CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되어 있다.
본 발명에서, Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 수준은 전형적으로 MSC 집단이 보관, 수송 또는 배양되는 배지의 상청액 중에서 결정된다. MSC 집단은 장기 또는 단기간 동안 보관될 수 있다. 장기간 보관 배지의 예는 약 -80℃에서 보관할 수 있는 글리세롤 및 트레할로스, 또는 약 -195℃에서 보관할 수 있는 디메틸술폭시드 (DMSO)와 같은 동결보호제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단기간 보관은 투여 장소 (예컨대 진료실 또는 병원)로의 수송 및/또는 MSC 집단이 대상체에게 투여될 때까지 일정 기간 동안의 보관을 포함할 수 있다. 부형제 히포써모솔®은 단기간 보관 배지에 대한 실례이다. 이 보존 배지는 약 2 내지 8℃에서 MSC 보관을 허용하는 수송에 적합하다. 수송에 적합한 배지의 또 다른 예는 플라스말라이트(Plasmalyte)이다. MSC 배양에 적합한 배지의 예는 CTS 스템프로(StemPro) MSC SFM, 메센프로(MesenPRO) RS 배지, 스템프로 MSC SFM 크세노프리(XenoFree)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 예에서, MSC 세포 배양 배지는 국제출원 WO 2018/067071에 기재된 배양 배지 PTT6일 수 있다. 국제출원 WO 2018/067071의 개시내용에 따르면, MSC 세포 배양 배지는 따라서 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 햄의 F12 배지(Ham's F12 Medium) (F12), 무혈청 기본 배지 예컨대 M171 및 소태아 혈청 (FBS)을 포함할 수 있다. 따라서, 한 예에서, 배지는 약 55 내지 65% (v/v)의 최종 농도의 DMEM, 약 5 내지 15% (v/v)의 최종 농도의 F12, 약 15 내지 30% (v/v)의 최종 농도의 M171 및 약 1 내지 8% (v/v)의 최종 농도의 FBS를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "% (v/v)"의 값은 배지의 최종 부피에 대한 개별 성분의 부피를 지칭한다. 이것은, DMEM이, 예를 들어, 배지에 약 55 내지 65% (v/v)의 최종 농도로 존재하는 경우, 배지 1리터는 약 550 내지 650 ml의 DMEM을 함유한다. 다른 예에서, 배지는 약 57.5 내지 62.5% (v/v)의 최종 농도의 DMEM, 약 7.5 내지 12.5% (v/v)의 최종 농도의 F12, 약 17.5 내지 25.0% (v/v)의 최종 농도의 M171 및 약 1.75 내지 3.5% (v/v)의 최종 농도의 FBS를 포함할 수 있다. 추가 예에서, 배지는 약 61.8% (v/v)의 최종 농도의 DMEM, 약 11.8% (v/v)의 최종 농도의 F12, 약 23.6% (v/v)의 최종 농도의 M171 및 약 2.5% (v/v)의 최종 농도의 FBS를 포함할 수 있다. 상기-언급된 성분에 더하여, 배지는 MSC 배양에 유리한 보충제를 포함할 수 있다. 본 발명에서, MSC 배양 배지는, 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, EGF는 약 1 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 최종 농도로 배양 배지에 존재할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 배양 배지는 약 10 ng/ml의 최종 농도로 EGF를 포함할 수 있다. 본 발명의 배양 배지는 또한 인슐린을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 인슐린은 약 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 최종 농도로 존재할 수 있다. 이들 예 중 일부에서, 배양 배지는 약 5 μg/ml의 최종 농도로 인슐린을 포함할 수 있다. 배양 배지는 하기 보충제: 아데닌, 히드로코르티손, 및 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3) 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 배양 배지는 아데닌, 히드로코르티손, 및 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3) 중 세 가지 모두를 포함할 수 있다. 이들 예에서, 배양 배지는 약 0.05 내지 약 0.1 μg/ml 아데닌의 최종 농도의 아데닌, 약 1 내지 약 10 μg/ml 히드로코르티손의 최종 농도의 히드로코르티손 및/또는 약 0.5 내지 약 5 ng/ml의 최종 농도의 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3)을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같은 배지에서 MSC 집단을 배양함으로써, Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 및/또는 분비가 증가될 수 있음을 주목한다.
본 방법에서, 전형적으로 적합한 기간 후에, MSC를 함유하는 배지 중 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 농도를 결정하기 위해 배지를 원심분리하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 맥락에서, 적합한 기간은 검출 가능한 양의 단백질을 분비하는 MSC 집단에 적합한, 임의의 인큐베이션 기간 (예를 들어, 세포 집단이 보관 또는 수송 배지 예컨대 히포써모솔에 보관, 또는 수송되는 경우) 또는 배양 기간 (세포 집단이 배양 배지에서 배양되는 경우)일 수 있다. 실례에서, 적합한 기간은 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 46시간, 약 48시간, 약 50시간 또는 약 54시간의 인큐베이션 또는 배양 시간이다. 원심분리 후, 원심분리된 배지의 상청액을 면역검정에 적용하여 분비된 단백질의 수준/농도를 결정할 수 있다. 배지에서 하나 또는 다수의 분비 단백질을 검출하기에 적합한 임의의 면역검정이 본 발명에서 적용될 수 있다. 배지 중에서 단백질을 검출하기 위한 적합한 면역검정의 실례는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 싱글플렉스 검정이다. 싱글플렉스 검정 (예를 들어, 큐-플렉스(Q-Plex)라는 상품명으로 체코 공화국 브루노 소재의 바이오벤더(BioVendor)로부터, 또는 미국 미네아폴리스 소재의 알앤디 시스템즈 인크로부터 상업적으로 이용가능함)은 정의된 배열로 포획 항체로 이루어진 2개의 지점을 96웰 ELISA 플레이트의 각각의 웰(well) 바닥에 배치함으로써 수행한다 (검정 지점에 더하여, 제2 지점은 적절한 검정 절차를 보장하기 위한 양성 대조군 지점이다). 배지 중 다수의 단백질을 검출하는 적합한 검정의 예는 다중 검정이다. 이러한 다중 검정에서 다중 분석물은 분석물을 공간적으로 분리하는 ELISA 플레이트와 같은 고체 표면 상에 고정될 수 있다. 대안적으로, 다중 검정은 또한 비드(bead) 또는 입자 상에 고정된 분석물을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 분석물에 대한 검정은 상이한 비드/입자를 이용한다. 실례에서, 비드 기반 다중 검정을 사용하여 배지 중 분비된 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF를 검출할 수 있다 (실시예 1 및 실시예 4 참조). 세포 배양 배지와 같은 복잡한 샘플에서 다중 표적 분석물을 동시에 검출하고 정량하기 위한 이러한 다중 검정 시스템은, 예를 들어, 미국 미네아폴리스 소재 알앤디 시스템즈 인크로부터 루미넥스® 검정 및 루미넥스® 고성능 검정으로 상업적으로 이용가능하다.
본 발명은 또한 MSC 집단의 상처 치유 효능을 평가하기 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 MSC 집단을 선택하기 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 결과적으로, 본 발명은 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 MSC 집단을 선택하기 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 MSC 집단을 선택하기 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 제약 용도를 위한 MSC를 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하기 위한 MSC 집단을 선택하기 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서, 이러한 조직은 MSC를 함유하는 것으로 공지된 임의의 포유동물 조직 또는 구획/신체 부분일 수 있다. 이러한 조직의 예는 MSC에 대한 두 서너가지 공지된 조직의 예를 들면, 골수, 지방-조직, 태반 조직, 제대-태반 접합부의 조직, 제대 조직 예컨대 와튼 젤리, 제대의 양막을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일례에서, 조직은 제대 또는 제대의 양막이고 그로부터 생산된 MSC 집단은 제대의 양막의 MSC 집단일 수 있다.
예를 들어, 특정한 공여자로부터의 조직이 제약 용도를 위한 MSC 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한지 여부를 결정하기 위해, 조직은, 예를 들어, 조직 외식편으로서 직접 배양될 수 있다. 이러한 조직 이식편의 경우, 각각의 조직의 샘플 (예를 들어, 와튼 젤리. 태반 양막 또는 제대의 양막)을 조직 배양 접시에 배치하고 여기에 기재된 바와 같이 적합한 배양/성장 배지에서 배양할 수 있다 (이와 관련하여 또한 미국 특허 9,085,755 또는 9,737,568 참조). 이어서 조직으로부터의 세포 파생물 (조직으로부터 배양 접시의 표면으로 MSC의 이동)은 적합한 배양 기간 후에 발생하고 이어서 배양 배지는 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비에 대해 분석될 수 있다. 대안적으로, MSC 집단은 먼저 공지된 단리 방법을 사용하여 선택된 조직으로부터 단리될 수 있고 이어서, 단리된 MSC 집단은 적합한 배지에서 배양될 수 있고 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 분비에 대해 점검될 수 있다. 조직과는 별도로, 본원에 기재된 방법을 위한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 사용은 배지 중에서 MSC 집단에 의해 또는 조직 샘플에 의해 또는 조직 샘플로부터 단리된 세포에 의해 배지 내로 분비되는 상기 단백질 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개 모두의 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 적합한 배지를 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 방법은 MSC 집단에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 결과적으로, 본 발명은 또한 중간엽 줄기세포의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하기 위한 적어도 하나의 단백질의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도는 세포 배양 배지 중에서 중간엽 줄기세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실험예에 의해 추가로 설명될 것이다.
본원에 개시된 폴리펩티드의 서열은 표 1에 도시되어 있다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실험예
실시예 1: MSC를 함유하는 적합한 제대를 확인하고, 상처 치유에 적합한 제약 조성물을 생성하기 위해 제대로부터 수득된 MSC 집단을 평가 및 선택하는 것.
MSC는 콜로라도 대학 병원(University of Colorado Hospital)에서 수집한 신선한 제대 조직으로부터 유래되었다.
단계 1: 조직 은행
첫 번째 단계에서, 대개 조직 공여자로부터 기관 검토 위원회(Institutional Review Board) (IRB)의 동의를 얻은 후 제대를 수집한다. 새로 수집한 제대를 1 내지 2 mm3 섹션으로 커팅하고, 4 내지 5개의 세그먼트를 함유하는 바이알에서 제어된 속도로 동결시키고 -196℃의 액체 질소 (LN2) 증기 상에서 격리되어 보관한다 (도 1 참조). 출산 후 7일 이내에 수집된 산모 혈액 샘플을 감염성 질환에 대해 스크리닝하고 조직은 미생물 오염에 대해 검사한다. 단계 1의 공정 중 방출 기준은 CMV를 제외한 모든 검사에서 감염성 질환 음성, 무균 음성, 및 모성 설문지 허용을 포함한다. 비록 제대는 분만 중 질의 균무리(vaginal flora)에 의해 자연적으로 오염되긴 하지만, 항생제 수집으로 인해 그들 중 일부는 무균 상태가 될 것이다. 이러한 조직 은행에서 최대 100개의 제대 샘플을 수집할 수 있다. 무균 조직은 단계 2에서 사용될 것이다.
단계 2: 개발 배양
개발 배양은 순수한 MSC 주를 생산하는 데 사용되는 제대 조직으로부터의 파생물이다. 10개의 조직 세그먼트를 6웰 플레이트에 개별적으로 배치하고 약 10-20일 동안 번식시켜 계대배양 0 (P0) 세포를 생성한다. P0 세포를 1175 cm2 플라스크에 시딩하고 배양하여 계대배양 1 (P1) 세포를 수득한다. P1 세포를 크리오스토르(CryoStor) 5에서 1-3 x 106개 세포/바이알로 동결시키거나 배양을 위해 시딩한다. 계대배양 1 세포를 2-3 x 105개 세포/175 cm2 플라스크에 시딩한다. 번식 동안, 세포 형태를 기록한다. 계대배양 2 (P2)로부터의 세포를 MSC 마커에 대한 유세포 분석법에 의해 평가하고, 상청액을 시토카인 생산에 대해 평가한다. 보다 상세하게는, P2 세포를 하기 분석물 Ang-1, VEGF, HGF를 사용하여 다중 분석 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)/바이오-테크네(Bio-techne) 카탈로그 번호 LXSAHM)을 수행하고 TGF-β를 사용하여 싱글플렉스 검정을 수행하였다. 검정은 다음과 같이 수행하였다:
다중 검정:
(i) 전체 부피를 1000 μl로 만들기 위해 적절한 부피의 완전한 PTT6 배지를 이미 함유한 단일 미세원심분리관에 100 μl의 각각의 표준물을 합함으로써 표준물을 제조하였다. 표준물 S1은 단일 바이알에 함께 합해진 모든 다중 표준물을 함유하였다. S1의 3배 연속 희석액을 만들기 위해, 200 μl의 완전한 PTT6 배지를 S2-S6으로 표지된 5개의 1.5 ml 폴리프로파일렌 관 각각에 피펫팅하였다. 이어서, 100 μl를 S1로부터 S2로 옮겼다. 볼텍싱 후, 100 μl를 S2로부터 S3으로 옮겼다. 절차는 S6까지 계속하였다. PTT6 완전 배지는 블랭크(Blank)로서 역할을 하였다.
(ii) 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현착시킴으로써 비드를 제조하였다. 바이알을 도치되지 않도록 주의하는 것이 중요하였다. 전체 플레이트를 사용하는 경우, 500 μl 비드를 5.0 ml 희석제 RD2-1과 배합하였다. 더 적은 수의 웰이 사용된 경우, 그에 따라 부피를 조정하였다. 바이알 또는 웰을 빛으로부터 보호하였다.
(iii) 필요한 경우: 샘플 제조. 모든 샘플을 샘플 농도가 최고 표준 값 (S1)을 초과하지 않는 한 희석되지 않은 상태로 사용하였다. 이러한 경우에, 적절하게 희석된 샘플을 사용하여 검정을 반복하였다. 희석을 위해 PTT6을 사용하였다. 모든 샘플은 삼중으로 측정하였다.
(iv) 다중-채널 피펫과 저장소를 사용하여 각각의 웰에 50 μl를 첨가하기 전에 비드를 부드럽게 볼텍싱하였다.
(v) 50 μl의 표준물 또는 샘플을 웰당 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 플레이트 실러로 덮고 800 rpm으로 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 실온 (RT)에서 2시간 동안 빛으로부터 보호하여 인큐베이션하였다.
(vi) 샘플 인큐베이션 동안, 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현탁시킴으로써 비오틴 항체 칵테일을 제조하였다. 바이알을 도치하지 않도록 주의하는 것이 중요하였다. 이어서, 500 μl 비오틴 항체 칵테일을 5.0 ml 희석제 RD2-1과 배합하였다. 용액을 철저히 혼합하였다.
(vii) 스트렙타비딘 피코에리트린 (PE)은 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현탁시킴으로써 준비하였다 (바이알이 도치되지 않도록 주의). 이어서, 200 μl 스트렙타비딘-PE 농축액을 5.35 ml 세척 완충제와 배합하였다. 용액을 철저히 혼합하고 빛으로부터 보호하였다.
(Viii) 플레이트는 다음과 같이 세척하였다: 플레이트를 자석에 부착하고 적어도 1분 동안 그대로 두었다. 플레이트를 자석에 부착하는 동안, 플레이트를 빠르게 도치하여 플레이트를 싱크대에 가만히 따른 다음에 상대적으로 강력한 하향 운동 (1-2회)을 수행하여 웰을 비웠다. 도치에 의한 액체의 완전한 제거는 필수적이었으나, 플레이트를 얼룩지게 하지는 않았다. 자석을 떼고 다중-채널 피펫을 사용하여 웰에 100 μl 세척 완충제를 채웠다. 그 후, 자석을 다시 부착하고 앞서 기재한 바와 같이 가만히 따르기 전에 1분 동안 그대로 두었다. 세척을 총 3회 세척으로 반복하였다.
(ix) 50 μl 희석된 비오틴 항체를 다중-채널 피펫을 사용하여 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 800 rpm으로 설정된 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하였다.
(x) 50 μl 희석된 스트렙타비딘-PE를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 이전과 같이 진탕기에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하였다.
(xi) 100 μl 세척 완충제를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 이전과 같이 진탕기에서 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 120 μl로 설정된 다중-채널 피펫을 사용하여 웰 내용물을 즉시 코스타(Costar) 6509 96-웰4 플레이트로 옮겼다. 이어서 플레이트를 루미넥스 3D 스캐너의 피팅 몰드에 배치하였다.
(xii) 루미넥스 3D 및 엑스포넌트 소프트웨어를 사용하여 플레이트를 판독하고 분석하였다.
TGF-β1 싱글플렉스:
(i) 1.5 ml 폴리프로파일렌관 사용하여 희석하여 표준물을 제조하였다. 이를 위해, 500 μl 표준물 S1을 S1 관에 피펫으로 옮겼다. 관 S2-S6에, 200 μl의 완전한 PTT6 배지를 첨가하였다. 하나의 S1로부터 S7까지 100 μl를 연속적으로 옮기고 철저히 혼합함으로써, 표준물을 1:3으로 희석하였다.
(ii) 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현착시킴으로써 비드를 제조하였다. 바이알을 도치되지 않도록 주의하는 것이 중요하였다. 전체 플레이트를 사용하는 경우, 50 μl 비드를 5.0 ml 마이크로입자 희석제 RD2-1과 배합하였다. 더 적은 수의 웰이 사용된 경우, 그에 따라 부피를 조정하였다. 바이알 또는 웰을 빛으로부터 보호하였다.
(iii) TGF-β1 면역반응성 (표준이 아닌 샘플만)을 만들기 위해, 30 μl의 활성화 시약을 150 μl의 상청액에 첨가하였다. 용액을 철처히 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 샘플 농도가 최고 표준 값 (S1)을 초과하지 않는 한 희석되지 않은 상태로 사용하였다. 이러한 경우에, 적절하게 희석된 샘플을 사용하여 검정을 반복하였다. 희석을 위해 PTT6을 사용하였다. 모든 샘플은 삼중으로 측정하였다.
(iv) 다중-채널 피펫과 저장소를 사용하여 각각의 웰에 50 μl를 첨가하기 전에 비드를 부드럽게 볼텍싱하였다.
(v) 50 μl의 표준물 또는 샘플을 웰당 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 플레이트 실러로 덮고 800 rpm으로 오비탈 진탕기에서 실온에서 2시간 동안 빛으로부터 보호하여 인큐베이션하였다.
(vi) 샘플 인큐베이션 동안, 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현탁시킴으로써 비오틴 항체 칵테일을 제조하였다. 바이알을 도치하지 않도록 주의하는 것이 중요하였다. 이어서, 500 μl 비오틴 항체 농축물을 5.0 ml 희석제와 배합하였다. 용액을 철저히 혼합하였다.
(vii) 스트렙타비딘 피코에리트린 (PE)은 바이알을 부드럽게 볼텍싱하여 재현탁시킴으로써 준비하였다 (바이알이 도치지 않도록 주의). 이어서, 55 μl 100 x 스트렙타비딘-PE 농축액을 5.35 ml 세척 완충제와 배합하였다. 용액을 철저히 혼합하고 빛으로부터 보호하였다.
(Viii) 플레이트는 다음과 같이 세척하였다: 플레이트를 자석에 부착하고 적어도 1분 동안 그대로 두었다. 플레이트를 자석에 부착하는 동안, 플레이트를 빠르게 도치하여 플레이트를 싱크대에 가만히 따른 다음에 상대적으로 강력한 하향 운동 (1-2회)을 수행하여 웰을 비웠다. 도치에 의한 액체의 완전한 제거는 필수적이었으나, 플레이트를 얼룩지게 하지는 않았다. 자석을 떼고 다중-채널 피펫을 사용하여 웰에 100 μl 세척 완충제를 채웠다. 그 후, 자석을 다시 부착하고 앞서 기재한 바와 같이 가만히 따르기 전에 1분 동안 그대로 두었다. 세척을 총 3회 세척으로 반복하였다.
(ix) 50 μl 희석된 비오틴 항체를 다중-채널 피펫을 사용하여 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 800 rpm으로 설정된 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하였다.
(x) 50 μl 희석된 스트렙타비딘-PE를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 이전과 같이 진탕기에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 이전과 같이 3회 세척하였다.
(xi) 100 μl 세척 완충제를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 이전과 같이 진탕기에서 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 120 μl로 설정된 다중-채널 피펫을 사용하여 웰 내용물을 즉시 코스타 6509 96-웰4 플레이트로 옮겼다. 이어서 플레이트를 루미넥스 3D 스캐너의 피팅 몰드에 배치하였다.
(xii) 루미넥스 3D 및 엑스포넌트 소프트웨어를 사용하여 플레이트를 판독하고 분석하였다.
단계 3: 마스터 세포 은행
이어서 단계 2 공정 중 방출 기준을 충족하는 3개의 세포주를 20 - 40 x 106개의 생존 세포로 테루모 퀀텀 생물반응기에 시딩하고 대략 7-14일 동안 번식시킨다. 퀀텀 후(Post-Quantum) 세포를 무균, 내독소, 마이코플라즈마, 인간 병원체 바이러스 및 외래 바이러스 검사에 대해 검사한다. 세포를 9 내지 10 x 106개 세포/바이알 (뱃치(batch)당 50-70 바이알)로 동결보존한다. MSC는 플라스크와 테루모 퀀텀에서 배양 배지 PTT6에서 번식되며, 1000 ml에 대해 다음과 같이 제제화하며 (500 ml의 PTT6 기본 배지, 236 ml의 M171, 236 ml의 DMEM F12, 25 ml의 소태아 혈청, 0.1 ml의 0.1 mg/ml 표피 성장 인자 [10 ng/ml 최종 농도]), 0.35 ml의 인슐린 (5　μg/ml 최종 농도) 및 5% CO2 중에서 37℃에서 인큐베이션한다.
단계 4: 치료적 배양
Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF에 대해 양성으로 검사된 1x, 3x 및 5x 106개 MSC를 히포써모솔®에 병에 담아 약제학적 투여 전에 2-8℃에서 보관한다 (단계 4).
실시예 2: 적합한 공여자 제대(donor cord)를 확인하기 위한 단백질 분비 수준 분석
분석을 위해, 상이한 공여자로부터 10개의 제대를 수집하였다. 이들 제대는 제대의 양막으로부터 유래된 10개의 개별 MSC 집단을 생산하는 데 사용되었다.
실험의 목적은 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β1의 분비 수준을 결정하여 개별 MSC 집단의 분비 프로파일의 가변성에 대한 결론을 도출하고 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β1이 충분히 분비되는 MSC 집단을 확인하는 것이었다.
따라서, 개별 MSC 집단을 본 발명에 따라 배양하고 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β (여기서 TGF-β1)의 단계 2 후 분비 수준을 실시예 1에 기재된 바와 같이 MSC 집단 각각에 대해 결정하였다. 분비 수준 분석의 결과는 도 2에 나타냈으며, 여기서 단백질 특이적 역치 (Ang-1 및 TGF-β 각각에 대해 500 pg/ml, VEGF 및 HGF 각각에 대해 100 pg/ml)는 수평, 흑색 선으로 표시하였다.
결과로부터 알 수 있는 바와 같이, TGF-β1의 분비 수준은 모든 10개의 개별 MSC 집단에서 역치값의 2배 초과만큼 높다. 따라서, TGF-β1에 대한 500 pg/ml의 역치값은 모든 개별 MSC 집단에 대해 초과되었다. HGF의 플롯팅된 분비 수준은 10개 샘플 중 5개가 100 pg/ml의 역치값을 초과한다는 것을 나타내며, 즉 MSC 집단 8049365는 약 600 pg/ml의 분비 수준을 나타내고, MSC 집단 8049369는 약 300 pg/ml의 분비 수준을 나타내고, MSC 집단 8049372는 약 1450　pg/ml의 분비 수준을 나타내고, MSC 집단 8049373은 약 380　pg/ml의 분비 수준을 나타내고 MSC 집단 8049384는 약 190　pg/ml의 분비 수준을 나타낸다. 플롯팅된 분비 수준 Ang-1은 모든 개별 MSC 집단이 500 pg/ml의 역치값을 초과했음을 나타낸다. VEGF의 분비 수준은 8049358, 8049359 및 8049370을 제외한 모든 샘플에 대해 100 pg/ml의 역치값을 초과했음을 나타낸다. 이러한 맥락에서, 8049359의 분비 수준은 단지 약 50 pg/ml이었으며, 한편 8049358 및 8049359의 수준은 0에 가깝다.
결과는 상이한 개별 MSC 집단의 단백질 분비 수준이 다양함을 나타내며, 이는 MSC가 개별 분비 프로파일을 갖는다는 것을 확인시켜준다. Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β1이 충분히 분비되는 MSC 집단을 확인하기 위해, 이들 단백질의 분비 수준을 분석하였다.
이러한 맥락에서, MSC는 이들 단백질의 수준이 그의 각각의 역치값을 초과하는 경우 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 충분한 분비를 나타낸다. 따라서, MSC 집단 88049365, 8049369, 8049372, 8049373 및 8049384 (그 각각이 상이한 공여자 제대로부터 수득됨)는 이들이 4개의 선택된 단백질 각각에 대한 주어진 역치값을 초과하는 유일한 MSC 집단이기 때문에 충분한 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF 분비를 나타낸다. 후속 실험을 위해 (마스터 세포 은행 설정 및 제약 목적으로 세포의 생산, MSC 집단 8049372가 여기에서 선택되었다.
실시예 3: 분비 수준 안정성의 분석
실시예 2에서 단백질 Ang-1, TGF-β, VEGF 및 HGF의 충분한 분비를 나타내는 MSC 집단 8049372를 사용하여 단백질 분비 수준의 안정성을 분석하였다. 따라서, MSC 집단은 세포가 네 번째로 계대배양될 때까지 추가로 배양되었다. 이어서, 단계 4 후 MSC 집단의 두 가지 샘플 (웰 1의 MSC 및 웰 2의 MSC)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β (여기서는 TGF-β1)의 분비 수준에 관해 분석하였다. 이어서 이 실험 (단계 4 후)에서 결정된 MSC 집단 8049372의 단백질 분비 수준을 실시예 2 (단계 2 후)에서 결정된 MSC 집단 8049372의 분비 수준과 비교한다. 이러한 방식으로, 상이한 시점 내에서 분비 수준의 변화가 드러날 수 있다. 그로 인해, 단백질 분비 수준의 안정성 및 시간 경과에 따른 단백질 분비의 충분성에 대한 결론을 도출할 수 있다. 결과는 도 3에 나타냈다.
단계 2 후, MSC 집단 8049372는 TGF-β1에 대해 약 2200 pg/ml의 분비 수준을 나타냈다. 세포를 2회 더 계대배양한 후, 단계 4 후 MSC 집단 8049372는 평균 약 2345 pg/ml의 TGF-β1을 나타낸다. 따라서, MSC 집단 8049372의 분비 수준은 세포를 2회 더 계대배양한 후 약 7% 증가하였다. HGF의 분비 수준은 단계 2 후 약 1450 pg/ml로부터 단계 4 후 평균 약 959 pg/ml로 세포를 2회 더 계대배양한 후 약 33% 감소하였다. 단계 4 후 MSC 집단 8049372는 평균 약 1827 pg/ml Ang-1을 나타내며, 이는 단계 2 후 2000 pg/ml Ang-1에 대해 약 9% 감소한 것이다. VEGF의 분비 수준은 단계 2 후 약 150 pg/ml로부터 단계 4 후 평균 약 215 pg/ml로 세포를 2회 더 계대배양한 후 약 43% 증가하였다.
결과는, 단백질 Ang-1, VEGF, HGF 및 TGF-β (여기서는 TGF-β1)의 분비 수준이 또한 세포를 2회 더 계대배양한 후에 변한다는 것을 나타낸다. 그러나, 본원에서 선택된 각각의 역치값은 세포를 2회 더 계대배양한 후에도 분석된 모든 단백질에 대해 여전히 초과되었다. 결과적으로, 이 실험의 결과는 MSC 집단 8049372가 상대적인 단백질 분비 안정성 및 따라서 그의 상처 치유 효능을 유지하였음을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 MSC 집단의 상처 치유 효능이 일정 기간 동안 안정적일 수 있음을 나타낸다. 이 결과에 기초하여, MSC 집단 8049372는 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 출발 물질로서 또는 대상체에 대한 후속 투여를 위한 제약 조성물의 생산을 위한 적절한 후보이다.
실시예 4: 중간엽 줄기세포의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지의 확인
이 실험을 위해, 국제출원 WO 2018/067071에 기재된 바와 같이 제대 양막의 다양한 단분리된 MSC 집단을 PTT4, PTT6 또는 DMEM/F12에서 배양하고 후속적으로 비교를 위해 상처 치유 마커 단백질의 분비에 대해 분석하였다.
단리된 MSC의 배양을 위한 배양 프로토콜
· 5백만 개의 MSC를 DMEM/F12/10%FCS 중 100 mm 조직 배양 접시에 24시간 동안 플레이팅하였다.
· 배지를 폐기하고 PTT4, PTT6/DMEM/F12를 첨가하고 24시간 동안 배양하였다.
· 배지를 폐기하고 세포를 PBS로 세척하였다.
· 10 ml DMEM을 첨가하고 24시간 동안 배양하였다.
· 배지를 폐기하고 DMEM 5 ml를 첨가하여 배양하였다.
· 24시간 배양 후, 컨디셔닝된 배지를 수확하고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, -80℃에서 보관하기 위해 관에 상청액을 분취하고, 시토카인 검정에 의한 마커 단백질 분비의 후속 분석
PTT4, PTT6 대 DMEM/F12 배지 상청액에 대한 분비 수준 분석
MSC 상청액 중에서 분비 수준 분석을 수행하였다. 측정 및 분석은 루미넥스 200 및 엑스포넌트 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
태반의 상청액 샘플을 제외하고 각각의 샘플을 삼중으로 검사하였다 이 실험의 목적은 PTT4 또는 PTT6 중 어느 하나에서 배양된 MSC의 시토카인 프로파일을 생성하고 상이한 조직 기원 (제대 내벽 대 와튼 젤리 대 태반 MSC)으로부터 MSC의 프로파일을 비교하는 것이었다. 시토카인 측정은 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 프로파일은 어떤 배지가 MSC의 상처 치유 특성을 유도하거나 촉진하는 데 적합한 지를 의미하는, 어떤 배지가 관심 시토카인을 더 많이 분비할 것인지 성장한 줄기세포 집단을 밝혀줄 것이다.
다중 분석
다중 정보:
알앤디 시스템즈/바이오-테크네 카탈로그 번호 LXSAHM. 이 키트는 로트 번호 L123680이며, 08/28/18에 만료되며, 하기 분석물을 가진다:
· Ang-1, 안지오포이에틴
· VEGF, 혈관 내피 성장 인자
· HGF, 간세포 성장 인자
TGFβ1 싱글플렉스 정보: 알앤디 시스템즈/바이오-테크네:
· 기본 키트, 카탈로그 번호 LTGM00, 로트 번호 P156217, 02/27/18에 수령, 08/30/18에 만료.
· TGFβ1 성분, 카탈로그 번호 LTGM100, 로트 번호 P161760, 02/27/18에 수령, 11/27/19에 만료.
다중 정보:
알앤디 시스템즈/바이오-테크네 카탈로그 번호 LXSAHM. 이 키트는 로트 번호 L123999이며, 09/25/18에 만료되며, 하기 분석물을 가진다:
· Ang-1, 안지오포이에틴
· VEGF, 혈관 내피 성장 인자
· HGF, 간세포 성장 인자
· 데이터 입력
원시 데이터 출력은 PDF 및 엑셀 형식이다. 엑셀 형식의 데이터를 사용하여 데이터를 처리한다.
절차
MSC 상청액에서 단백질 검출은 상세한 프로토콜 정보에 따라 수행하였다. 이 실험의 일부로서, 프로토콜은 단일 수정을 갖는다: 다중 키트의 Std. 8은 더 이상 사용되지 않는다. Std.를 중단하는 이유는 알앤디 시스템즈 프로토콜 자체가 단지 표준물 1 내지 6을 사용하기 때문이다. 더욱이, Std. 8은 다중물: HGF를 구성하는 6개 분석물 중 2개에 대해서만 검증하였다. HGF의 경우에, 해당 분석물은 표준 곡선의 중간 영역에 속한다. 표준물은 성장 배지를 사용하여 재구성되었으므로, 표준 곡선은 PTT4 및 PTT6 둘 다로 구축되었다. PTT4 또는 PTT6 중 어느 하나에서 성장한 검사 샘플은 각각의 표준 곡선로부터 외삽되었다. 결과는 동일한 소프트웨어에 의해 생성된 분석물-특이적 표준 곡선으로부터 루미넥스 소프트웨어에 의해 외삽되었다: 분석 알고리즘은 가중 분석을 위해 1/y2를 사용하여, 칭량된 북석으로 칭량된 로지스틱 5P로 설정된다.
샘플
1. DMEM/F12 및 PTT6 및 PTT4 배지 (MSC에 노출되지 않음)
2. 검사할 MSC의 상청액
3. 선택사항: 상이한 공여자로부터의 상청액; CR001A, C, D, 및 G.
Ang-1에 대한 결과는 도 4A에 나타냈으며, 제대 양막의 MSC가 DMEM/F12 또는 PTT4에서 성장할 때보다 PTT6에서 성장할 때 더 많은 Ang-1을 생산한다는 것을 나타낸다. VEGF에 대한 결과는 도 4B에 나타냈으며, 제대 양막의 MSC가 DMEM/F12 또는 PTT4에서 성장할 때보다 PTT6에서 성장할 때 더 많은 VEGF를 생산한다는 것을 나타낸다. HGF에 대한 결과는 도 4C에 나타냈으며, 제대 양막의 MSC가 DMEM/F12 또는 PTT4에서 성장할 때보다 PTT6에서 성장할 때 더 많은 HGF를 생산한다는 것을 나타낸다. 마지막으로, TGF-β1에 대한 결과는 도 4D에 나타냈으며, 제대 양막의 MSC가 DMEM/F12 또는 PTT4에서 성장할 때보다 PTT6에서 성장할 때 더 많은 TGF-β1을 생산한다는 것을 나타낸다.
상기 기재된 실험으로부터 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다. MSC를 PTT6 배지에서 배양할 때, MSC 집단에 의한 Ang-1, TGF-β1, VEGF, 및 HGF의 분비는 PTT4 또는 DMEM/F12와 같은 상업적으로 이용가능한 배양 배지에서의 그의 분비 수준과 비교하여 유의하게 증가한다. PTT6 배지는 MSC 집단에서 Ang-1, TGF-β1, VEGF, 및 HGF 모두의 분비를 촉진함으로써 MSC 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하는 최고 능력을 가지고 있다 (본원에 논의된 바와 같이, 상처 치유에 관여하는 것으로 공지되어 있음) 따라서, Ang-1, TGF-β1, VEGF, 및 HGF의 분비 수준을 결정하는 것은 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하는 데 적합한 배지를 확인하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 범위 및 사상을 벗어남이 없이 본원에 개시된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 수정이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 예시적으로 기재된 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은, 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포함한", "함유하는" 등은 제한 없이 광범위하게 판독되어야 한다. 게다가, 본원에 이용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 용어로서 사용되었으며, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 표시 및 설명된 특색 또는 그 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 어떤 의도는 없으나, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 수정이 가능함을 인식한다. 따라서, 비록 본 발명이 바람직한 실시양태 및 임의적 특색에 의해 구체적으로 개시되었긴 하지만, 본원에 개시된 거기에 구현된 발명의 수정 및 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 의지될 수 있고 이러한 수정 및 변형은 본 발명 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기재되었다. 일반 개시내용에 속하는 보다 좁은 종 및 아속 그룹 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 절제된 재료가 본원에 구체적으로 언급되었는지 여부에 상관없이, 속으로부터 임의의 주제를 제거하는 단서조항 또는 부정적인 제한을 가진 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다. 게다가, 본 발명의 특색 또는 측면이 마쿠시 그룹의 면에서 기재되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 면에서 그로 인해 기재된다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 추가 실시양태는 하기 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 하기 항목을 특징으로 한다.
1. 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하는 방법.
2. 배지 중에서 조직의 샘플 또는 조직으로부터 단리된 세포에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법.
3. 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
4. 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
5. 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 한 항목에 있어서, 배지 중에서 중간엽 줄기세포에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법.
7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 한 항목에 있어서, 역치값과 동일하거나 초과하는 분비 수준이
(i) 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능; 또는
(ii) 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직 또는 단리된 세포 집단
을 나타내는 것인 방법.
8. 항목 7에 있어서, 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 경우 역치값이 약 400 pg/ml 또는 약 500 pg/ml인 방법.
9. 항목 7 또는 항목 8에 있어서, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 역치값이 약 400 pg/ml 또는 약 500 pg/ml인 방법.
10. 항목 7 내지 항목 9 중 어느 한 항목에 있어서, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 역치값이 약 80 mg/ml 또는 약 100 pg/ml인 방법.
11. 항목 7 내지 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서, 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 역치값이 약 80 pg/ml 또는 약 100 pg/ml인 방법.
12. 항목 8 내지 항목 11 중 어느 한 항목에 있어서, 모든 4개의 단백질의 분비 수준이 그의 각각의 역치값과 동일하거나 초과하고, 여기서 역치값이
- 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 경우 약 400　pg/ml의 역치값
- 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 400　pg/ml의 역치값
- 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치값
- 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치값인 방법.
13. 항목 8 내지 항목 11 중 어느 한 항목에 있어서, 모든 4개의 단백질의 분비 수준이 그의 각각의 역치값과 동일하거나 초과하고, 여기서 역치값이
- 안지오포이에틴　1 (Ang-1)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
- 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
- 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치
- 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치인 방법.
14. 항목 1 내지 항목 13 중 어느 한 항목에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단, 제대혈의 중간엽 줄기세포 집단, 골수의 중간엽 줄기세포 집단, 및 지방-조직 유래 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
15. 항목 14에 있어서, 제대의 중간엽 줄기세포 집단이 양막 (AM)의 중간엽 줄기세포 집단, 혈관주위 (PV) 중간엽 줄기세포 집단, 와튼 젤리 (WJ)의 중간엽 줄기 세포 집단, 제대 양막의 중간엽 줄기세포 집단 및 제대 (MC)의 혼합 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
16. 항목 2에 있어서, 조직이 제대 또는 제대의 양막이고 중간엽 줄기세포 집단이 제대 양막의 줄기세포 집단인 방법.
17. 항목 15 또는 항목 16에 있어서, 제대 양막의 중간엽 줄기세포 집단이중간엽 줄기세포 집단이고, 여기서 줄기세포 집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커: CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하는 것인 방법.
18. 항목 17에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되어 있는 것인 방법.
19. 항목 17 또는 항목 18에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 약 99% 이상의 세포는 CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하며 한편 CD34, CD45 및 HLA-DR 각각의 발현이 결여되어 있는 것인 방법.
20. 항목 1 내지 항목 19 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 세포 배양 배지 또는 보관 배지인 방법.
21. 항목 20에 있어서, 보관 배지가 히포써모솔 또는 플라스말라이트인 방법.
22. 항목 1 내지 19 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 약 55 내지 65% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 5 내지 15% (v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 15 내지 30% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 1 내지 8% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 것인 방법.
23. 항목 22에 있어서, 배지가 약 57.5 내지 62.5% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 7.5 내지 12.5　%　(v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 17.5 내지 25.0% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 1.75 내지 3.5% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 것인 방법.
24. 항목 23에 있어서, 배지가 약 61.8% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 11.8% (v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 23.6% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 2.5% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 것인 방법.
25. 항목 23 또는 항목 24에 있어서, 무혈청 기본 배지가 M171인 방법.
26. 항목 22 내지 항목 25 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 약 1 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 최종 농도로 표피 성장 인자 (EGF)를 추가로 포함하는 것인 방법.
27. 항목 26에 있어서, 배지가 약 10 ng/ml의 최종 농도로 표피 성장 인자 (EGF)를 포함하는 것인 방법.
28. 항목 22 내지 항목 27 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 약 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 최종 농도로 인슐린을 포함하는 것인 방법.
29. 항목 28에 있어서, 배지가 약 5 μg/ml의 최종 농도로 인슐린을 포함하는 것인 방법.
30. 항목 22 내지 항목 29 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 하기 보충제: 아데닌, 히드로코르티손, 및 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 방법.
31. 항목 22 내지 항목 30 중 어느 한 항목에 있어서, 배지가 아데닌, 히드로코르티손, 및 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3) 중 세 가지 모두를 포함하는 것인 방법.
32. 항목 30 또는 항목 31에 있어서, 배지가 약 0.01 내지 약 0.1 μg/ml 아데닌의 최종 농도의 아데닌, 약 1 내지 약 10 μg/ml 히드로코르티손의 최종 농도의 히드로코르티손 및/또는 약 0.5 내지 약 5 ng/ml의 최종 농도의 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3)을 포함하는 것인 방법.
33. 항목 1 내지 항목 32 중 어느 한 항목에 있어서, 전술한 항목 22 내지 항목 32 중 어느 한 항목에 정의된 바와 같은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단을 배양하는 것이 DMEM (둘베코 변형 이글 배지), F12 (햄의 F12 배지), M171 (배지 171) 및 FBS (소태아 혈청) 모두를 포함하는 것은 아닌 참조 배지에 비해 중간엽 줄기세포 집단에 의해 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β; 특히 TGF-β1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 중 적어도 하나의 단백질의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 것인 방법.
34. 항목 1 내지 항목 33 중 어느 한 항목에 있어서, 세포 배지를 적합한 배양 기간 후에 원심분리에 적용하는 것인 방법.
35. 항목 34에 있어서, 적합한 배양 기간이 약 12h, 약 24h, 약 36h, 약 46h, 약 48h 또는 약 50h, 바람직하게는 약 48h를 포함하는 것인 방법.
36. 항목 34 또는 항목 35에 있어서, 원심분리된 세포 배양 배지의 상청액을 다중 검정에 적용하는 것인 방법.
37. 항목 36에 있어서, 다중 검정이 비드-기반(bead-based)인 방법.
38. 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
39. cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
40. 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
41. 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
42. 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하기 위한 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
43. 항목 42에 있어서, 조직이 제대 또는 제대의 양막이고 중간엽 줄기세포 집단이 제대 양막의 줄기세포 집단인 용도.
44. 항목 38 내지 항목 41 중 어느 한 항목에 있어서, 용도가 세포 배양 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
45. 항목 42 또는 항목 43에 있어서, 용도가 세포 배양 배지 중에서 조직의 샘플 또는 조직으로부터 단리된 세포에 의해 세포 배양물로 분비되는 안지오포이에틴 1 (Ang 1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
46. 항목 38 내지 항목 44항 중 어느 한 항목에 있어서, 용도가 세포 배양 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
47. 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하는 방법.
48. 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하기 위한 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질의 용도.
49. 항목 48에 있어서, 용도가 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 적어도 2개, 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
SEQUENCE LISTING <110> CELLRESEARCH CORPORATION PTE LTD <120> A METHOD OF ASSESSING WOUND HEALING POTENCY OF A MESENCHYMAL STEM POPULATION AND RELATED METHODS OF SELECTING MESENCHYMAL STEM CELLS AND IDENTIFYING TISSUE AS STARTING MATERIAL FOR PRODUCING A MESENCHYMAL STEM CELL POPULATION <130> SCH-5600-PV <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His 1 5 10 15 Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg 20 25 30 Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro 35 40 45 Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr 50 55 60 Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser 65 70 75 80 Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met 100 105 110 Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu 115 120 125 Glu Ile Gly Thr 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925 Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala 930 935 940 Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile 945 950 955 960 Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile 965 970 975 Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser 980 985 990 Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp 995 1000 1005 Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser 1010 1015 1020 Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys 1025 1030 1035 Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val 1040 1045 1050 Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu 1055 1060 1065 Ile Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp 1070 1075 1080 Ile Glu Val Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr 1085 1090 1095 Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg 1100 1105 1110 Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu 1115 1120 1125 Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys 1130 1135 1140 Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His 1145 1150 1155 Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln 1160 1165 1170 Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu 1175 1180 1185 Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala Leu Arg 1190 1195 1200 Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln Phe 1205 1210 1215 Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln 1220 1225 1230 Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn 1235 1240 1245 Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu 1250 1255 1260 Gly Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly 1265 1270 1275 Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn 1280 1285 1290 Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser 1295 1300 <210> 10 <211> 254 <212> PRT <213> human <400> 10 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val 1 5 10 15 Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile 20 25 30 Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met 35 40 45 Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys 50 55 60 Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu 65 70 75 80 Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu 85 90 95 Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro 100 105 110 Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn 115 120 125 Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val 130 135 140 Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr 145 150 155 160 Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu 165 170 175 Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His 180 185 190 Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro 195 200 205 Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Val Val Cys Ala Leu Gly Leu 210 215 220 Thr Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Thr Ile Phe Ile Ile Lys 225 230 235 240 Gly Val Arg Lys Ser Asn Ala Ala Glu Arg Arg Gly Pro Leu 245 250

Claims (45)

  1. 중간엽 줄기세포 집단(mesenchymal stem cell population)의 상처 치유 효능을 평가하는 방법으로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단은 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부(cordplacental junction)의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 방법이 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하는 방법.
  2. 제약 용도(pharmaceutical use)를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법으로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단은 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 방법이 배지 중에서 조직의 샘플 또는 조직으로부터 단리된 세포에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하는 방법.
  3. cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법으로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단은 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 방법이 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
  4. 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법으로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단은 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이며, 여기서 상기 방법이 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
  5. 마스터 세포 은행(master cell bank)을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법으로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단은 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 방법이 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 중에서 중간엽 줄기세포에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 역치값(threshold value)과 동일하거나 이를 초과하는 분비 수준이
    (i) 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능; 또는
    (ii) 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직 또는 단리된 세포 집단
    을 나타내는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 경우 역치값이 약 400 pg/ml 또는 약 500 pg/ml인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 역치값이 약 400 pg/ml 또는 약 500 pg/ml인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 역치값이 약 80 mg/ml 또는 약 100 pg/ml인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 역치값이 약 80 pg/ml 또는 약 100 pg/ml인 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 4개의 단백질의 분비 수준이 이의 각각의 역치값과 동일하거나 이를 초과하고, 여기서 역치값이
    - 안지오포이에틴 1 (Ang-1)의 경우 약 400　pg/ml의 역치값
    - 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 400　pg/ml의 역치값
    - 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치값 및
    - 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 80　pg/ml의 역치값인 방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 4개의 단백질의 분비 수준이 이의 각각의 역치값과 동일하거나 이를 초과하고, 여기서 역치값이
    - 안지오포이에틴　1 (Ang-1)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
    - 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β)의 경우 약 500 pg/ml의 역치
    - 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치 및
    - 간세포 성장 인자 (HGF)의 경우 약 100 pg/ml의 역치인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제대의 중간엽 줄기세포 집단이 양막 (AM)의 중간엽 줄기세포 집단, 혈관주위 (PV) 중간엽 줄기세포 집단, 와튼 젤리 (Wharton's jelly; WJ)의 중간엽 줄기 세포 집단, 제대의 양막의 중간엽 줄기세포 집단 및 제대 (MC)의 혼합 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제2항에 있어서, 조직이 제대 또는 제대의 양막이고 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 양막의 줄기세포 집단인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 제대의 양막의 중간엽 줄기세포 집단이 중간엽 줄기세포 집단이고, 여기서 줄기세포 집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커(marker): CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단의 적어도 약 90% 이상의 세포가 하기 마커: CD34, CD45 및 HLA-DR의 발현이 결여되는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 중간엽 줄기세포 집단의 적어도 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 약 99% 이상의 세포는 CD73, CD90 및 CD105 각각을 발현하며 한편 CD34, CD45 및 HLA-DR 각각의 발현이 결여되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 세포 배양 배지 또는 보관 배지인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 보관 배지가 히포써모솔(Hypothermosol) 또는 플라스말라이트(Plasmalyte)인 방법.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 약 55 내지 65% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 5 내지 15% (v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 15 내지 30% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 1 내지 8% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 배지가 약 57.5 내지 62.5% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 7.5 내지 12.5　%　(v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 17.5 내지 25.0% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 1.75 내지 3.5% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 배지가 약 61.8% (v/v)의 최종 농도의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 약 11.8% (v/v)의 최종 농도의 햄의 F12 배지 (F12), 약 23.6% (v/v)의 최종 농도의 무혈청 기본 배지 및 약 2.5% (v/v)의 최종 농도의 소태아 혈청 (FBS)을 포함하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 무혈청 기본 배지가 M171인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 약 1 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 최종 농도로 표피 성장 인자 (EGF)를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 배지가 약 10 ng/ml의 최종 농도로 표피 성장 인자 (EGF)를 포함하는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 약 1 μg/ml 내지 10 μg/ml의 최종 농도로 인슐린을 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 배지가 약 5 μg/ml의 최종 농도로 인슐린을 포함하는 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 하기 보충제: 아데닌, 히드로코르티손, 및 3,3',5-트리아이오도-L-티로닌 나트륨 염 (T3) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 전술한 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단을 배양하는 것이 DMEM (둘베코 변형 이글 배지), F12 (햄의 F12 배지), M171 (배지 171) 및 FBS (소태아 혈청) 모두를 포함하는 것은 아닌 참조 배지에 비해 중간엽 줄기세포 집단에 의해 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β; 특히 TGF-β1), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 중 적어도 하나의 단백질의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배지를 적합한 배양 기간 후에 원심분리에 적용하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 적합한 배양 기간이 약 12h, 약 24h, 약 36h, 약 46h, 약 48h 또는 약 50h, 바람직하게는 약 48h를 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 원심분리된 세포 배양 배지의 상청액(supernatant)을 다중 검정에 적용하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 다중 검정이 비드-기반(bead-based)인 방법.
  35. 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 효능을 평가하기 위한, 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  36. cGMP 조건 하에 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한, 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  37. 후속 약제학적 투여를 위한 줄기세포 집단을 생산하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한, 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  38. 마스터 세포 은행을 생성하기 위한 중간엽 줄기세포 집단을 선택하기 위한, 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  39. 제약 용도를 위한 중간엽 줄기세포 집단을 생산하기 위한 출발 물질로서 적합한 조직을 확인하기 위한, 안지오포이에틴 1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도로서, 여기서 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 중간엽 줄기세포 집단, 태반 중간엽 줄기세포 집단, 제대-태반 접합부의 중간엽 줄기세포 집단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  40. 제39항에 있어서, 조직이 제대 또는 제대의 양막이고 중간엽 줄기세포 집단이 제대의 양막의 줄기세포 집단인 용도.
  41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 용도가 세포 배양 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 세포 배양 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
  42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 용도가 세포 배양 배지 중에서 조직의 샘플 또는 조직으로부터 단리된 세포에 의해 세포 배양물 내로 분비되는 안지오포이에틴 1 (Ang 1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
  43. 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는, 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하는 방법.
  44. 중간엽 줄기세포 집단의 상처 치유 특성을 유도하거나 개선하기에 적합한 배지를 확인하기 위한, 안지오포이에틴　1 (Ang-1), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 간세포 성장 인자 (HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질의 용도.
  45. 제44항에 있어서, 용도가 배지 중에서 중간엽 줄기세포 집단에 의해 배지 내로 분비되는 적어도 3개 또는 4개 모두의 단백질의 수준을 결정하는 것을 포함하는 용도.
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