CN114867347B - 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法 - Google Patents

间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114867347B
CN114867347B CN202080084893.6A CN202080084893A CN114867347B CN 114867347 B CN114867347 B CN 114867347B CN 202080084893 A CN202080084893 A CN 202080084893A CN 114867347 B CN114867347 B CN 114867347B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
mesenchymal stem
leu
ser
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202080084893.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114867347A (zh
Inventor
T·T·潘
B·M·弗里德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CellResearch Corp Pte Ltd
University of Colorado
Original Assignee
CellResearch Corp Pte Ltd
University of Colorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CellResearch Corp Pte Ltd, University of Colorado filed Critical CellResearch Corp Pte Ltd
Publication of CN114867347A publication Critical patent/CN114867347A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114867347B publication Critical patent/CN114867347B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞储存或运输制剂，一种制备所述间充质干细胞储存或运输制剂的方法以及使用所述间充质干细胞储存或运输制剂的方法。此类方法包括在该储存或运输制剂中运输间充质干细胞的方法以及治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括局部施用已在该储存或运输制剂中储存或运输的间充质干细胞。还涉及间充质干细胞的单位剂量。

Description

间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月8日提交的第62/912,368号提美国临时申请的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。
序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及一种间充质干细胞储存或运输制剂，一种制备所述间充质干细胞储存或运输制剂的方法以及使用所述间充质干细胞储存或运输制剂的方法。此类方法包括在该储存或运输制剂中运输间充质干细胞的方法以及治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括局部施用已在该储存或运输制剂中储存或运输的间充质干细胞。还涉及间充质干细胞的单位剂量。
背景技术
从脐带羊膜分离的间充质干细胞及其伤口愈合特性已经在美国专利申请2006/0078993(导致授权的美国专利9,085,755、9,737,568和9,844,571)和相应的国际专利申请WO2006/019357中首次报道。从那时起，脐带组织作为多能细胞的来源而受到关注；由于其广泛的可用性，脐带和特别是从脐带羊膜分离的干细胞(也称为“脐带衬干细胞”)被认为是再生医学细胞的极好的替代来源。参见，Jeschke等人，Umbilical Cord Lining Membraneand Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells:the Similarities andDifferences；The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal,2011,4,21-27。同时，在美国申请20181/27721或相应的国际申请WO2018/067071中描述了来自脐带羊膜的这种间充质干细胞群体。
在美国申请2018/127721或相应的国际申请WO2018/067071中描述的间充质干细胞群体具有的优点是该群体的干细胞中99％或更多表达三种MSC标志物CD73、CD90和CD105，而缺乏CD34、CD45和HLA-DR的表达。因此，这种非常同质且明确的细胞群体是临床试验和基于细胞的疗法的理想候选者，因为其例如完全满足例如以下所定义的用于细胞疗法的人MSC通常接受的标准：Dominii等人“用于定义多能间充质基质细胞的最小标准(Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells)。国际细胞治疗协会立场声明(The International Society for Cellular Therapy positionstatement)”，Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317，Sensebe等人，“Production ofmesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices:a,review”,Stem Cell Research&Therapy 2013,4:66)，Vonk等人，Stem Cell Research&Therapy(2015)6:94，或Kundrotas Acta Medica Littuanica.2012.Vol.19.No.2.P.75–79。如国际申请WO2018/067071中所述，该间充质干细胞群体可以，例如，以其未分化状态用于伤口愈合目的，例如烧伤治疗。
然而，干细胞例如上述间充质干细胞通常不在产生它们的部位施用/给予患者。在收获细胞和进一步利用它们之间通常经过相当长的时间。因此，需要提供在通常用于细胞运输或储存的一段时间内保持细胞存活和健康的储存或运输制剂。
因此，本发明的目的是提供一种满足该需要的适于储存和/或运输间充质干细胞的制剂。
发明内容
该目的通过具有独立权利要求的特征的方法、间充质干细胞储存或运输制剂和单位剂量来实现。
在第一方面，本发明提供了制备间充质干细胞储存或运输制剂的方法，其中所述制剂包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞，所述方法包括
a)将间充质干细胞悬浮在预定体积的晶体溶液中，其中所述晶体溶液包含约0.5％或约1％至约5％(w/v)的血清白蛋白，从而获得第一细胞悬液，
b)确定所述第一细胞悬液中的所述间充质干细胞的浓度，以及确定制备包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的制剂所需的所述第一细胞悬液的体积，
c)将确定体积的第一细胞悬液与一定体积的液体载体混合，其中所述液体载体包含约0.5％或约1％至约5％(w/v)的血清白蛋白以及
i)Trolox；
ii)Na+；
iii)K+；
iv)Ca2+；
v)Mg2+；
vi)Cl-；
vii)H2PO4 -；
viii)HEPES；
ix)乳糖醛酸盐；
x)蔗糖；
xi)甘露醇；
xii)葡萄糖；
xiii)葡聚糖-40；
xiv)腺苷，和
xv)谷胱甘肽，
从而获得包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的间充质干细胞储存或运输制剂。
在第二方面，本发明提供了通过如本文所定义的方法获得的间充质干细胞储存或运输制剂。
在第三方面，本发明提供了可通过如本文所定义的方法获得的间充质干细胞储存或运输制剂。
在第四方面，本发明提供了运输间充质干细胞的方法，所述方法包括在如本文所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中运输所述间充质干细胞。
在第五方面，本发明提供了治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括局部施用已经在如本文所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中储存或运输的间充质干细胞。
在第六方面，本发明提供了可通过本文定义的方法获得的单位剂量的间充质干细胞。
附图说明
当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
图1示出了用于Dulbecco改进的Eagle培养基的Lonza的技术信息表，包括在实验部分中用于制造本发明的培养基的说明性实例(PTT-6)的DMEM的目录号；
图2示出了用于Ham的F12培养基的Lonza的技术信息表；
图3示出了DMEM：F12(1:1)培养基的Lonza的技术信息表，包括在实验部分中用于制备本发明培养基的说明性实例(PTT-6)的DMEM：F12(1:1)培养基的目录号；
图4示出了用于M171培养基的Life Technologies公司的技术信息表，包括在实验部分中用于制备本发明的培养基的说明性实例(PTT-6)的M171培养基的目录号；
图5显示了成分列表，包括它们的商业供应商和已经在实验部分中用于制备培养基PTT-6的目录号。在培养基PTT-6用于GMP制造的情况下，其不包含符合美国FDA对生物制剂的制造指南的抗生素剂。
图6显示流式细胞术实验的结果，其中分析了从脐带分离的间充质干细胞标志物CD73、CD90和CD105的表达。对于这些实验，通过在三种不同的培养基中培养脐带组织，然后在各自的培养基中传代培养间充质干细胞，从脐带组织中分离间充质干细胞。在这些实验中使用以下三种培养基：a)90％(v/v/DMEM补充10％FBS(v/v)，b)在美国专利申请2006/0078993和相应的国际专利申请WO2006/019357中描述的培养基PTT-4，其由90％(v/v)CMRL1066和10％(v/v)FBS组成(参见WO2006/019357的第[0183]段，和c)本发明PTT-6的培养基，其组成如本文所述。在该流式细胞术分析中，对所用的三种培养基中的每一种分析了脐带衬间充质干细胞(CLMC)群体的两种不同样品。结果示于图6a至图6c中。更详细地，图6a显示了从脐带组织分离并在DMEM/10％FBS中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬干细胞的百分比，图6b显示了从脐带组织分离并在PTT-4中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬干细胞的百分比，图6c显示了从脐带组织分离并在PTT-6中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬干细胞的百分比。
图7显示了流式细胞术实验的结果，其中已经分析了从脐带分离的间充质干细胞的干细胞标志物(CD73、CD90和CD105、CD34、CD45和HLA-DR(人白细胞抗原-抗原D相关的)的表达，并将其与骨髓间充质干细胞的这些标志物的表达进行比较，所述干细胞标志物用于确定多能人间充质干细胞用于细胞治疗的适宜性，对于该实验，通过在本发明的培养基PTT-6中培养脐带组织从脐带组织分离脐带羊膜间充质干细胞，同时使用标准方案从人骨髓分离骨髓间充质干细胞。
图7a显示了从脐带组织分离并在PTT-6培养基中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105并缺乏CD34、CD45和HLA-DR表达的分离的间充质脐带衬干细胞的百分比，而图7b显示了表达CD73、CD90和CD105并缺乏CD34、CD45和HLA-DR表达的分离的骨髓间充质干细胞的百分比。
图8示出了用于比较不同载体的实验设置。在细胞培养瓶中长出如本文所述的第一间充质干细胞群体。计数活的间充质干细胞的量，然后将2百万个细胞/小瓶在PlasmaLyte-A或HypoThermosolTM-FRS中储存不同的时间段。在储存后，每天在≤50μl的样品中计数细胞，持续第1-5天(总液体抽取250μl)，并通过用锥虫蓝染色细胞来检查生存力。此外，在第1、3和5天，取≤80μl的样品并分析。在第1、3和5天的储存之后，将来自每个时间点的100,000个MSC在PTT-6培养基中培养48小时，获得上清液用于细胞因子测定：通过FLEXMAP 3D系统测量PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF、IL-10、Ang-1、HGF和TGFβ1。
图9总结了生存力数据。从左侧曲线图可以看出，在HypoThermosolTM中储存7天后，细胞总数(当开始储存时约95％)的73％仍然是活的。相反，在PlasmaLyte-A中储存7天后，仅有细胞总数(当开始储存时约94％)的42％仍然存活。所有计数都基于彼此在10％内的重复读数(按照SOP CR D2.600.1)。在计数期间，储存在HypoThermosolTM中的细胞明显更小，具有平滑和确定的边缘。相对照地，Plasmalyte-A中的细胞以一定的大小范围出现。HypoThermosolTM显著地支持膜完整性，并且推测存活超过6天时间跨度。类似的结果也显示在右手侧的图中。
图10显示了当测量细胞的细胞直径时获得的结果。当与保持在PlasmaLyteA中的细胞相比时，当保持在HypoThermosolTM中时，如本文所述的间充质干细胞群体在直径范围上更窄。在储存3天后进行比较。
图11显示了来自在此描述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中的间充质干细胞群体的上清液在储存48小时后TGFβ1的浓度。如从右手侧的图中可以看出，细胞在HypoThermosolTM中储存时分泌的TGFβ1与在PlasmaLyte-A中储存时分泌的TGFβ1差不多，分泌的TGFβ1的量通常随着时间减少(右手侧的图)。
图12和13显示了对照实验。在此，在来自于本文所述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的间充质干细胞群体的上清液中测量PDGF-BB和IL-10的浓度。由于PDGF-BB或IL-10通常不是由本文所述的间充质干细胞群体分泌的，因此在任何样品中都没有检测到PDGF-BB或IL-10。
图14显示了来自本文所述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的间充质干细胞群体的上清液中的VEGF浓度。从右手侧的图中可以看出，当在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第0天分泌大约同样多的VEGF，并且当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第1天和第5天分泌更多的VEGF。值得注意的是，储存3天时，细胞在HypoThermosolTM中比在PlasmaLyte-A中分泌更多的VEGF。检测到的VEGF越多，培养物越健康。因此，通过在HypoThermosolTM中储存3天后比在PlamsaLyte-A中储存分泌更多的VEGF，细胞在HypoThermosolTM中比在PlamsaLyte-A中更健康。从5天开始，在PlasmaLyte中储存似乎变得更有利，因为在这个时间点，储存在PlasmaLyte-A中的细胞分泌更多的VEGF。通常，分泌的VEGF的量随时间减少(右手侧的图)。
图15显示了来自本文所述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的间充质干细胞群体的上清液中PDGF-AA的浓度。从右手侧的图中可以看出，当在HypoThermosolTM中储存时，细胞在第0天分泌的PDGF-AA大约与在PlasmaLyte-A中储存时一样多。当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第1天和第5天分泌更多的PDGF-AA。值得注意的是，在储存3天时，细胞在HypoThermosolTM中储存比在PlasmaLyte-A中储存分泌更多的PDGF-AA。因此，储存3天后，在HypoThermosolTM中储存的细胞比在PlasmaLyte-A中储存的细胞更健康。从储存5天起，PlasmaLyte似乎变成更有利的载体，因为在PlasmaLyte-A中储存的细胞在该时间点分泌更多PDGF-AA。通常，随着时间的推移，分泌的PDGF-AA的量减少(右手侧的图)。
图16显示了来自如本文所述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的间充质干细胞群体的上清液中的Ang-1浓度。从右侧曲线图可以看出，细胞在第0天和第3天当在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中储存时分泌大约同样多的Ang-1。第5天当细胞在PlasmaLyte-A中储存时分泌更多的Ang-1。值得注意的是，当储存1天时，细胞在HypoThermosolTM中储存时比在PlasmaLyte-A中储存时分泌更多的Ang-1。因此，当储存至少48小时直到储存的第3天，细胞在HypoThermosolTM中储存似乎比在PlasmaLyte-A中储存更健康。从第5天开始，PlasmaLyte似乎成为更有利的载体，因为在这个时间点，在PlasmaLyte-A中储存的细胞分泌更多的Ang-1。通常，随着时间的推移，分泌的Ang-1的量减少(右手侧的图)。
图17显示了来自本文所述的储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的间充质干细胞群体的上清液中的HGF浓度。从右手侧的图中可以看出，在第0天，细胞在HypoThermosolTM中储存时与在PlasmaLyte-A中储存时分泌大约同样多的HGF。在第3天和第5天，当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞分泌更多的HGF。值得注意的是，当储存1天时，细胞在HypoThermosolTM中储存时比在PlasmaLyte-A中储存分泌更多的HGF。因此，在至少1天(48小时)直到储存3天之间，在HypoThermosolTM中储存的细胞似乎比在PlasmaLyte-A中储存的细胞更健康。从3天开始，PlasmaLyte-A似乎成为更有利的载体，因为在第3天和第5天的时间点，在PlasmaLyte-A中储存的细胞分泌更多HGF。通常，分泌的HGF的量随时间的推移而降低(右手侧的图)。
图18是从用本发明的间充质干细胞群体在猪中的临床前研究获得的照片。用120mg/kg链脲霉素使猪患上糖尿病，并在其背部产生六个5cm×5cm全厚度伤口之前使猪恢复45天。用105个如本文所述的人间充质干细胞群体/cm2每周两次处理猪(n＝2)4周。用PBS处理两头对照猪。在术后第0天(PODay 0)和每七天对伤口拍照，直到术后第35天，通过ImageJ分析伤口的表面积大小。到第35天，如本文所述加入间充质干细胞群体导致12个糖尿病伤口中的10个(83％)闭合，相比之下PBS处理的对照伤口中的12个伤口中仅有3个(25％)闭合。与对照动物中的0.6cm2/天相比，使用如本文所述的间充质干细胞群体的伤口愈合速率为0.8cm2/天，改善了33％。
图19可从Tocris获得的Trolox的数据表。
图20显示了可从Sigma Aldrich获得的NaCl的数据表。
图21显示了可从Sigma Aldrich获得的KH2PO4的数据表。
图22显示了来自Sigma Aldrich的HEPES的数据表。
图23显示了COMBI-BLOCKS的乳糖醛酸钠产品表。
图24显示了来自Sigma Aldrich的蔗糖的产品表。
图25显示来自Avantor的甘露醇的产品表。
图26显示了来自Sigma Aldrich的葡萄糖的产品表。
图27显示了来自Sigma Aldrich的葡聚糖-40的产品表。
图28显示了来自Sigma Aldrich的腺苷的产品表。
图29显示来自Sigma Aldrich的谷胱甘肽的产品表。
图30显示了来自STEMCELL Technologies的HypoThermosolTM-FRS(HTS-FRS)的产品表。
图31显示了来自Sigma Aldrich的CaCl的产品表。
图32显示了来自Sigma Aldrich的MgCl的产品表。
图33显示了对本文所述的接种在本发明制剂(Plasmalyte/HSA/HypoThermosol)中的脐带衬间充质干细胞群体进行长达3天的稳定性测试的结果。图33a显示了在本发明制剂中储存后MSC活力测试的结果。MSC在2至8℃下储存1至3天以模拟产品在施用到伤口上之前的运输和储存。结果显示，在这些条件下，细胞在长达3天内没有表现出生存力的显著损失。图33b显示了在2-8℃下储存在本发明的制剂中之后的MSC形态，从无菌技术(AT)封闭的小瓶中取出MSC并在37℃下培养24小时后对其拍照。可以看出，在冷藏中获得的细胞长达2天能够粘附到组织培养板上并形成典型的纺锤体结构。在2-8℃下储存2.5天后，细胞呈现越来越多的球形，提示有垂死细胞。图33c显示了在本发明的制剂中储存后MSC的增殖和代谢。分析来自图33a中分析的相同培养物的MSC的乳酸产量，作为在37℃下培养48小时期间内代谢和生长的量度。乳酸是葡萄糖代谢的产物，我们已经证实其与MSC细胞生长的速率成正比。在2-8℃下保存24小时的细胞在代谢和生长方面与保存0小时的细胞相当，保存36小时的细胞表现出对照乳酸或乳酸盐产量的86％。在2-8℃下72小时后，当随后培养时，细胞仅表现出46％的代谢。图33d显示了在本发明的制剂中储存0、1、1.5、2、2.5或3天，然后在培养中24小时和48小时后测量的MSC的乳酸盐生产。可以看出，在本发明制剂中储存24小时(第1天)的MSC在24小时和48小时的乳酸盐生产与未储存的MSC(第0天)相同。到第3天，乳酸盐产量下降40-45％。图33e显示了在37℃下24小时从图33c中分析的相同培养物测量的细胞因子产生。与代谢数据对比，当细胞在本发明的制剂中在2-8℃下储存24小时时，MSC产生血管生成素1(Ang1)、转化生长因子β(TGFβ)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)的能力在对照(第0天)的10-20％内。图33F显示了24小时后从另一培养物测量的细胞因子产生。结果显示当细胞在2至8℃下在本发明的制剂中储存24小时时，MSC产生VEGF、血管生成素-1、TGF-β和HGF的能力得到保持，但当储存＞2天时，其能力降低约50％。
具体实施方式
如上所述，在第一方面，本发明涉及制备间充质干细胞储存或运输制剂的方法，其中所述制剂包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞，所述方法包括
a)将间充质干细胞悬浮在预定体积的晶体溶液中，其中所述晶体溶液包含约0.5％至约5％(w/v)的血清白蛋白，从而获得第一细胞悬液，
b)确定所述第一细胞悬液中的所述间充质干细胞的浓度，以及确定制备包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的制剂所需的所述第一细胞悬液的体积，
c)将确定体积的第一细胞悬液与一定体积的液体载体混合，其中所述液体载体包含约0.5％至约5％(w/v)的血清白蛋白以及
i)Trolox；
ii)Na+；
iii)K+；
iv)Ca2+；
v)Mg2+；
vi)Cl-；
vii)H2PO4 -；
viii)HEPES；
ix)乳糖醛酸盐；
x)蔗糖；
xi)甘露醇；
xii)葡萄糖；
xiii)葡聚糖-40；
xiv)腺苷，和
xv)谷胱甘肽，
从而获得包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的间充质干细胞储存或运输制剂。
在本申请中已经令人惊讶地发现，使用如本文所述的间充质干细胞储存或运输制剂稳定了MSC在储存/运输期间的增殖和代谢，导致MSC的活力改善长达72小时。例如，在本发明的间充质干细胞储存或运输制剂中储存间充质干细胞3天后，约90％的细胞仍然是活的(参见图33a)。相反，在中储存3天后，仅约66％的细胞仍然存活(参见实施例，当用血细胞计数器测量时和图9)。因此，使用如本文所述的间充质干细胞储存或运输制剂允许干细胞在一段时间内的运输/储存而基本上不损失细胞的活力。特别地，在本发明的间充质干细胞储存或运输制剂中储存3天或更短的时间似乎是特别有益的，因为干细胞通常比在PlasmaLyte-A中储存后分泌更多的因子，如在实验部分详细描述的。此外，已令人惊讶地发现，使用如本文所述的间充质干细胞储存或运输制剂允许从储存/运输容器中回收超过95％的MSC，从而确保可向患者施用所需剂量的细胞。
当在本文中使用时，术语“运输(transport)”或“运输(transporting)”是指任何运输。这种运输可以用任何交通工具进行，例如汽车、火车和飞机，或通过携带/运输包含与液体载体接触的干细胞的容器的人从一个地方到另一个地方进行。在一个实施方案中，从产生目的间充质干细胞(或间充质干细胞群体，这两个术语在本文中可互换使用)的位置到干细胞施用位置(例如GMP设施，其中分别产生目的干细胞和干细胞群体到干细胞或干细胞群体的施用部位，例如诊所或医生办公室)进行运输。然而，还设想术语“运输”涉及在相同位置储存细胞一段时间。例如，干细胞可以在收获后储存直到它们在一个地方施用于受试者。其中可以储存或运输干细胞的容器可以是任何适于本发明方法的容器。
间充质干细胞储存或运输制剂的制备包括将MSC重悬于预定体积的晶体溶液中。在本发明中，任何体积的适于充分重悬MSC的晶体溶液都可以用作预定体积。例如，预定体积可以在约0.5ml至约15ml的范围内。在一个实施例中，预定体积可以在约1ml至约10ml的范围内。在一个说明性的实施例中，所述晶体溶液的预定体积可以是约1ml、约2ml、约3ml、约4ml或者约5ml。通过将MSC重悬于预定体积的晶体溶液中，产生第一细胞悬液。所述重悬通常在间充质干细胞/间充质干细胞群体在被用于药物给药的培养后的收获后进行。
在确定第一细胞悬液中MSC的浓度和确定制备包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的制剂所需的第一细胞悬液的体积之后，将第一细胞悬液与一定体积的液体载体混合。与液体载体混合的第一细胞悬液的体积可以是约0.5ml至约10ml。在一个说明性实施例中，第一细胞悬液的测定体积与液体载体的体积，间充质干细胞储存或运输制剂的总体积为约1ml。选择0.5百万至约10百万个间充质干细胞的量以制备单位剂量，其优选地以预定体积如1ml、2ml等含有0.5百万至约10百万个间充质干细胞。在本发明中，所述晶体溶液的预定体积包括约0.1百万至约15百万个活的MSC。在一个实施例中，所述晶体溶液的预定体积包括约0.5百万至约10百万个MSC。在一个说明性实施例中，间充质干细胞储存或运输制剂包含约1百万个MSC、约2百万个MSC、约3百万个MSC、约4百万个MSC、约5百万个MSC或约6百万个MSC。当在本文中使用时，关于间充质干细胞的数量的术语“约”可以指数值可以以特定的百分比变化。例如，“约”可以指±1％至约±15％的数值变化/偏差。因此，“约”也可以指±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％。对于本领域技术人员而言，显而易见的是，发生了这样的变化，特别是如果间充质干细胞储存或运输制剂是手工制备的(这仍然是制备这样的基于活细胞的制剂的常用方法)，用于随后储存和/或将制剂运输至施用部位，例如伤口愈合诊所或医生办公室。
在本发明中，MSC可以直接从含有MSC的组织培养物中或者从分离的MSC或MSC群体的培养物中收获，然后再悬浮于晶体溶液中。无论哪种方式，MSC的培养都可以在细胞培养容器中进行。因此，在将MSC重新悬浮在预先设定体积的晶体溶液中之前，可以从细胞培养容器中收获本发明中使用的MSC。
本发明的晶体溶液和液体载体都添加有血清白蛋白。不希望受理论的束缚，据信血清白蛋白改善间充质干细胞/间充质干细胞群体的活力，并且还可改善干细胞从储存它们的容器中的回收，以将干细胞运输至施用部位。在晶体溶液和液体载体中血清白蛋白的浓度可以相同或不同。优选地，在晶体溶液和液体载体中血清白蛋白的浓度是相同的。在此上下文中，可以使用适于例如改善MSC活力的任何浓度的血清白蛋白。例如，所述的晶体溶液和液体载体可以分别包括约0.5％(w/v)，约0.6％(w/v)，约0.7％(w/v)，约0.8(w/v)，约0.9％(w/v)，或者约1.0％(w/v)至约5％(w/v)的血清白蛋白。在一个这样的实施例中，所述的晶体溶液和液体载体可以包括约1％(w/v)至约3％(w/v)的血清白蛋白。在一个说明性的实施例中，所述的晶体溶液和液体载体中的每一个都含有约1％(w/v)的血清白蛋白。任何药学上合适的血清白蛋白，例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白可在本文中使用。在一个说明性的实施例中，所述的晶体溶液和液体载体都可以包括人血清白蛋白(HSA)。本文所用的血清白蛋白理想地以药学上可接受的质量获得。这种药物级血清白蛋白的一个例子是人血清白蛋白的25％溶液(w/v)，其可以商品名从Grifols Therapeutics LLC，Clayton，North Carolina，USA商购。
所述晶体溶液还可以包含一种或多种适于支持MSC生长和/或增殖的组分。这种成分可以是矿物质，例如钠、钾、铁、镁、锌、硒、氯化物或其组合。在一个实施例中，所述的晶体溶液包括钠、钾、镁和氯化物。所述的晶体溶液可以是一种商业上可以获得的溶液，其包括适于支持MSC生长和/或增殖的另外的组分。在一个实施例中，所述的晶体溶液可以是PlasmaLyte或者Ringer's乳酸盐。在本发明的配方中，所述晶体溶液的总量可以被限制在一个特定的百分比。例如，间充质干细胞储存或运输制剂可以包含不超过约50％、不超过约40％、不超过约30％、不超过约20％、不超过约10％或不超过约5％的晶体溶液。在一个说明性实施例中，间充质干细胞储存或运输制剂可包含不超过约30％或约20％或约10％的PlasmaLyte。
可以在任何时间段内执行运输/储存。例如，运输/储存可以进行约7天或更少。还可以设想，运输/储存可以进行约6、5、4、3、2、1天或更少。因此，可以进行运输/储存约48小时或约24小时或更短。
还预期在适合于本发明方法的任何温度下进行运输/储存。例如，运输/储存可以在约-5℃至约15℃的温度下进行，因此还设想运输/储存可以在约2℃至约8℃的温度下进行，运输还可以在高于约-5℃、高于约-10℃、高于约-15℃或高于约-20℃的温度下进行，此外还设想运输/储存可以在低于20℃、低于18℃、低于15℃、低于12℃或低于10℃的温度下进行。
本发明的方法还设想干细胞群体(或间充质干细胞)以任何合适的浓度储存或运输。如上所述，术语“间充质干细胞”和“间充质干细胞群体”在本文中可互换使用。如果本文提及“间充质干细胞”，则这些干细胞也可能属于相同的间充质干细胞群体。例如，间充质干细胞可以都属于间充质干细胞群体，其中其细胞的约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多表达CD73、CD90和CD105，而缺乏CD34、CD45和HLA-DR的表达。这里应当注意，如果术语“载体”或“液体载体”可用于包含MSC、PlasmaLyte、HSA和Hyothermosol的溶液的上下文中，则也可意指本发明的间充质干细胞储存或运输制剂。因此，如果溶液包含MSC、PlasmaLyte、HSA和Hyothermosol，则术语“载体”或“液体载体”和“干细胞储存或运输制剂”也可以互换使用。如本文所用的干细胞群体可以例如以约70百万个细胞/1ml载体、约60百万个细胞/1ml载体、约50百万个细胞/1ml载体、约40百万个细胞/1ml载体、约30百万个细胞/1ml载体、约20百万个细胞/1ml载体、约10百万个细胞/1ml载体、约5百万个细胞/1ml载体、约4百万个细胞/1ml载体、约3百万个细胞/1ml载体、约2百万个细胞/1ml载体、约1百万个细胞/1ml载体、约0.5百万个细胞/1ml载体、约0.1百万个细胞/1ml载体或小于0.1百万个细胞/1ml载体的浓度运输/储存。因此，干细胞群体可以以每1ml载体约10百万个细胞至每1ml载体约1百万个细胞的浓度运输/储存。
本发明的方法涉及干细胞的运输/储存。原则上，任何干细胞都可用于本发明的方法中。干细胞的一个特征是它们自我更新的能力。“自我更新”是经历细胞分裂的许多细胞周期同时保持未分化状态的能力。用于测试细胞是否具有自我更新能力的方法是本领域技术人员已知的。例如，自我更新可通过将细胞传代超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30代或更多代来测试。传代包括在将细胞作为单细胞悬液重新铺板之前将细胞分裂。干细胞的另一个特征是它们的多能性或多能性，这也将在本文其它地方描述。原则上，多能性或多能性可通过将所述干细胞分化成不同谱系来测试。
特别地，本发明的方法中使用的干细胞群体可以是胚胎干细胞群体、成体干细胞群体、间充质干细胞群体或诱导多能干细胞群体。
如本文所用，“胚胎干细胞群体”是“多能干细胞群体”。当在本文中提及多能细胞时，其涉及具有自我更新能力和分化成不同细胞类型的潜能的细胞类型。多能干细胞可分化为几乎所有细胞，即来源于以下三种主要胚层中任一种的细胞：外胚层、内胚层和中胚层。术语多能干细胞还包括衍生自称为胚泡的早期胚胎内细胞团的干细胞。值得注意的是，胚胎干细胞研究的最新进展已经导致例如通过使用基于卵裂球活检的技术，在不破坏胚胎的情况下产生新的胚胎干细胞系的可能性，所述技术不干扰胚胎的发育潜力(Klimanskaya(2006)“Embryonic stem cells from blastomeres maintaining embryo viability.”Semin Reprod Med.2013Jan；31(1):49-55)。此外，本领域可获得大量已建立的胚胎干细胞系。因此，可以使用胚胎干细胞而不必破坏胚胎。多能干细胞可以是胚胎干细胞，其不是通过人胚胎的破坏获得的。因此，多能干细胞是从胚胎获得的胚胎干细胞，而不破坏胚胎。
如本文所用，“成体干细胞群体”是多潜能干细胞群体。多潜能干细胞群体可以产生有限数量的细胞类型，因此它们是体细胞命运有限的。例如，神经干细胞可以产生神经元和神经胶质细胞。成体干细胞具有自我更新的能力，并且可以从任何合适的来源获得。例如，成人干细胞可从骨髓、外周血、脑、脊髓、牙髓、血管、骨骼肌、皮肤和消化系统的上皮、角膜、视网膜、肝或胰腺获得。
本发明方法中使用的干细胞群体也可以是间充质干细胞群体。在这种情况下，注意到本文所述的培养基(例如PTT-6)允许在允许间充质干细胞/祖细胞增殖而不使间充质干细胞/祖细胞分化的条件下从羊膜分离间充质干细胞群体(本文也称为“间充质干细胞”)。因此，如本文所述从羊膜分离间充质干细胞后，分离的间充质干细胞/祖细胞群体具有分化成多种细胞类型的能力，例如，如美国专利申请2006/0078993、美国专利9,085,755、国际专利申请WO2006/019357、美国专利8,287,854或WO2007/046775中所述。如美国专利申请2006/0078993中所述，例如，脐带羊膜的间充质干细胞具有纺锤形，表达以下基因：POU5f1，Bmi-1，白血病抑制因子(LIF)，并分泌激活素A和滤泡抑素。本发明中分离的间充质干细胞例如可分化为任何类型的间充质细胞，例如但不限于脂肪细胞、皮肤成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌腱细胞、韧带成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、粘蛋白生成细胞、来源于内分泌腺的细胞，例如胰岛素生成细胞(例如β-胰岛细胞)或神经外胚层细胞。根据本文所述方法分离的干细胞可以在体外分化，以便随后将分化的细胞用于医学目的。这种方法的一个说明性实例是间充质干细胞分化成胰岛素产生β-胰岛细胞，然后例如通过植入将其施用于患有胰岛素缺乏如糖尿病的患者(在这方面也参见WO2007/046775)。或者，本文所述的间充质干细胞可以其未分化状态用于基于细胞的疗法，例如用于伤口愈合目的，如烧伤或慢性糖尿病伤口的治疗。在这些治疗应用中，本发明的间充质干细胞可通过与周围患病组织相互作用而用于促进伤口愈合，或者也可分化成相应的皮肤细胞(例如，再次参见WO2007/046775)。
在这种情况下，注意到MSC可以来源于已知包含MSC的任何哺乳动物组织或区室/身体部分。在说明性实例中，MSC可以是脐带的MSC、胎盘MSC、脐带-胎盘连接处的MSC、脐带血的MSC、骨髓的MSC或脂肪组织来源的MSC。脐带的MSC可(源自)含有MSC的脐带组织的任何区室，例如羊膜、血管周围MSC、Wharton’s胶质的MSC、脐带羊膜的MSC以及脐带的混合MSC，意指包括这些区室中的两个或更多个的干细胞的MSC。本文所述的间充质干细胞群体可以从任何脐带组织分离和培养(即，衍生)，只要脐带组织含有羊膜(其也称为“脐带衬里”)。因此，如本申请的实验部分所述，间充质干细胞群体可以从整个脐带(的片段)分离。因此，除了羊膜之外，该脐带组织可以包含脐带的任何其它组织/组分。例如，如美国专利申请2006/0078993或国际专利申请WO2006/019357的图16所示，脐带的羊膜是脐带的最外面的部分，覆盖脐带。此外，脐带包含一条静脉(其将含氧的、富营养的血液运送至胎儿)和两条动脉(其将脱氧的、营养耗尽的血液运送离开胎儿)。为了保护和机械支持，将这三种血管包埋在Wharton’s胶质中，该胶质物质主要是粘多糖。因此，本文所用的脐带组织也可包含这一静脉、两条动脉和Wharton’s胶质。使用脐带的这种完整(全部)部分具有羊膜不需要与脐带的其它成分分离的优点。这减少了分离步骤，从而使本文所述的方法更简单、更快速、更不易出错且更经济，这些都是间充质干细胞治疗应用所必需的GMP生产的重要方面。因此，间充质干细胞的分离可以通过组织外植体开始，如果需要更大量的间充质干细胞，例如用于临床试验，随后可以进行分离的间充质干细胞的随后传代培养(培养)。或者，也可以首先从脐带的其它成分中分离羊膜，并通过在培养基例如PTT-6中培养羊膜从羊膜中分离间充质细胞衬干细胞，该培养也可以通过组织外植体进行，任选地随后传代培养分离的间充质干细胞。在此上下文中，术语“组织外植体”或“组织外植体方法”以其在本领域中的常规含义使用，以指其中组织一旦被收获或组织的块被置于含有培养(生长)培养基的细胞培养皿中并且通过其干细胞随着时间从组织迁移到皿的表面上的方法。然后，这些原代干细胞可进一步扩增，并通过微繁殖(传代培养)转移到新鲜的培养皿中，如本文所述。在此上下文中，注意到就用于治疗目的细胞的生产而言，在从脐带分离羊膜间充质干细胞的第一步骤中，获得分离的间充质干细胞的主细胞库，而通过随后的传代培养，可获得工作细胞库。在具体的实施方案中，所述干细胞群体因此是间充质干细胞群体。间充质干细胞群体可以通过包括在包含DMEM(Dulbecco’s改良的Eagle培养基)、F12(Ham’s F12培养基)、M171(培养基171)和FBS(胎牛血清)的培养基中培养脐带组织的方法从脐带羊膜分离。使用这种培养基可从脐带羊膜中分离间充质干细胞群体，其中超过90％，或甚至99％或更多的细胞对三种间充质干细胞标志物CD73、CD90和CD105呈阳性，而同时这些干细胞缺乏CD34、CD45和HLA-DR的表达(参见实验部分)，这意味着该群体的99％或更多的细胞表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105，而不表达标志物CD34、CD45和HLA-DR。这种非常同质且良好限定的细胞群体首次在共同未决的于2018年10月5日提交的美国申请序列号15/725,913(公布为US 2018/127721)中被报道，该申请要求于2017年10月5日提交的美国临时申请序列号62/404,582的优先权，这两篇申请的内容通过引用整体并入本文)，并且在共同未决的同样于2018年10月5日提交的PCT申请PCT/SG2017/050500(公布为WO2018/067071)中也被报道，该申请要求于2017年10月5日提交的美国临时申请序列号62/404,582的优先权，并且是临床试验和基于细胞的疗法的理想候选者，因为这种干细胞群体例如完全满足如通过以下定义的用于细胞疗法的人间充质干细胞通常接受的标准：Dominii等人“用于定义多能间充质基质细胞的最小标准。国际细胞治疗协会立场声明”，Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317，Sensebe等人，“Production of mesenchymal stromal/stem cells according to goodmanufacturing practices:a,review”,Stem Cell Research&Therapy 2013,4:66)，Vonk等人，Stem Cell Research&Therapy(2015)6:94，或Kundrotas Acta Medica Littuanica.2012.Vol.19.No.2.P.75–79。此外，使用生物反应器如量子细胞扩增系统，可以获得大量的间充质干细胞，如300至700百万个间充质干细胞/轮次(也参见实验部分)。因此，本发明允许以成本有效的方式运输/储存治疗应用，例如它们在伤口愈合中的用途所需的量的干细胞。此外，用于制备本发明培养基的所有组分都可以GMP质量商购。因此，本发明打开了从脐带羊膜运输/储存GMP生产的且高度同质的间充质干细胞群体的途径。
因此，在一些实施方案中，所述间充质干细胞群体是分离的脐带羊膜间充质干细胞群体。进一步设想分离的间充质干细胞群体的至少约90％或更多细胞表达以下标志物中的每一种：CD73、CD90和CD105。例如，所述分离的间充质干细胞群体的至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种。另外或可选地，至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的分离的间充质干细胞缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA-DR(人白细胞抗原-抗原D相关)。在进一步的实施例中，至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，而至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC可以不表达CD34、CD45和HLA-DR。在具体的实施例中，约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的MSC表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD34、CD45和HLA-DR。
标志物CD73是技术人员已知的。在这方面，CD73指分化簇73，也称为5’-核苷酸酶(5’-NT)或胞外-5’-核苷酸酶。人CD73蛋白的序列可具有SEQ ID NO.1的序列。标志物CD90是技术人员已知的。在这方面，CD90指分化簇90，也称为胸腺细胞分化抗原1(Thy-1)。人CD90蛋白的序列可具有SEQ ID NO：2的序列。标志物CD105是技术人员已知的。CD105也称为内皮素(ENG)。人CD105蛋白的序列可以具有SEQ ID NO：3的序列。
如果本发明的间充质干细胞群体(特别是至少约98％或99％或表达标志物CD73、CD90和CD105中的每一种并且缺乏标志物CD34、CD45和HLA-DR中的每一种的表达的间充质干细胞群体)用于临床试验或用作批准的治疗剂，则工作细胞库的细胞群体通常将用于该目的。如所解释的，间充质干细胞群体可能缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA-DR。在此上下文中，注意到标志物CD34、CD45和HLA-DR是技术人员已知的。人CD34蛋白可具有SEQID NO.4的序列。人CD45蛋白可具有SEQ ID NO：5的序列。人HLA-DR蛋白可具有SEQ ID NO：6的序列。
分离步骤的干细胞群体(其可构成主细胞库)和传代培养步骤的干细胞群体(其可构成工作细胞库)均可例如以冷冻保存的形式储存。
如上所述，本发明自脐带羊膜分离间充质干细胞的方法具有以下优点：本发明培养基中使用的所有成分都可以GMP质量获得，因此提供了在GMP条件下分离间充质干细胞以供后续治疗性施用的可能性。
因此，干细胞群体也可以是诱导的多能干细胞群体。如本文所用，“诱导的多能干细胞”是指通过被强制表达对于维持胚胎干细胞的限定特性重要的基因和因子而已经被基因重编程为胚胎干细胞样状态的成体体细胞。因此，诱导的多能干细胞可以衍生自/产生自非多能细胞。
诱导的多能干细胞是干细胞研究中的重要进步，因为它们允许在不使用胚胎的情况下获得多能干细胞。2006年首次报道了小鼠iPSC Takahashi,K；Yamanaka,S(2006)."Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastcultures by defined factors".Cell 126(4):663–76)，以及2007年首次报道了人iPSC(hiPSC)(Takahashi et al.(2007)“Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.”Cell；131(5):861-72)。小鼠iPSC显示出多能干细胞的重要特征，包括干细胞标志物的表达、形成含有来自所有三个胚层的细胞的肿瘤、以及当在发育的非常早期阶段注射到小鼠胚胎时能够对许多不同组织作出贡献。人iPSC也表达干细胞标志物，并且能够产生所有三个胚层特有的细胞。这样的干细胞标志物可以包括Oct3/4、Sox2、Nanog、碱性磷酸酶(ALP)以及干细胞特异性抗原3和4(SSEA3/4)。而且，iPSC的染色质甲基化模式与胚胎干细胞的相似(Tanabe,Takahashi,Yamanaka(2014)“Induction of pluripotency by defined factors.”Proc.Jpn.Acad.,2014,Ser.B 90)。
此外，iPSC能够在体外自我更新并分化成所有三个胚层。可测试iPSC分化成不同细胞类型的多能性或潜力，例如通过体外分化成神经或神经胶质细胞或通过胚泡注射产生种系嵌合动物。
用于产生人诱导多能干细胞的方法是技术人员熟知的，并且例如描述于WO2009115295、WO2009144008或EP2218778中。因此，本领域技术人员可以通过任何方法获得iPSC。原则上，诱导的多能干细胞可以从(受试者的)任何成体细胞获得。示例性体细胞包括来自血液的外周血单核细胞(PBMC)或从皮肤组织活检获得的成纤维细胞。
本发明尤其涉及通过本文所述方法获得的MSC储存或运输制剂，以及通过本文所述方法获得的MSC储存或运输制剂。此外，本发明涉及运输MSC，其包括在如本文所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中运输所述MSC。在这种情况下，本发明包括使本文所述的干细胞群体与液体载体接触。可以想象，在本发明的方法中，在运输/储存之前，将本文所述的干细胞群体与载体接触。另外或可选地，干细胞群体在其收获后与载体接触。如何进行收获在本文别处以及实验部分中详细描述。例如，干细胞群体可以在其收获后约0分钟、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟或更长时间与载体接触。
收获可以包括从培养基例如从PTT-6中分离干细胞群体，用于这种分离的合适技术是技术人员已知的。例如，分离可以通过在培养基内离心干细胞并倾析培养基来进行。
使干细胞群体与液体载体接触，其中所述液体载体包含
i)Trolox；
ii)Na+；
iii)K+；
iv)Ca2+；
v)Mg2+；
vi)Cl-；
vii)H2PO4 -；
viii)HEPES；
ix)乳糖醛酸盐；
x)蔗糖；
xi)甘露醇；
xii)葡萄糖；
xiii)葡聚糖-40；
xiv)腺苷，和
xv)谷胱甘肽。
“Trolox”是指CAS号为53188-07-1的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，它是维生素E的水溶性类似物，并被认为能减少氧化应激或损伤。图19示出了可从Tocris获得的Trolox的数据表。它也可从Sigma Aldrich购得(产品号：238813)。
Na+和Cl-都是公知的离子。技术人员知道如何获得这些。例如，这些离子可以NaCl盐的形式加入到载体中。GMP质量的NaCl可以从Sigma Aldrich获得。图20显示了可从SigmaAldrich获得的NaCl的数据表。
Ca2+和Mg2+也是公知的离子。技术人员知道如何获得这些。这些离子可以例如以CaCl2或MgCl2盐的形式加入到载体中。图31显示了可从Sigma Aldrich获得的CaCl2的数据表，图32显示了可从Sigma Aldrich获得的MgCl2的数据表。
K+和H2PO4 -(磷酸二氢盐)也是本领域技术人员公知的。它可以例如作为可从SigmaAldrich获得的KH2PO4使用。图21显示了可从Sigma Aldrich获得的KH2PO4的数据表。
HEPES也被命名为4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(CAS号7365-45-9)，通常用作两性离子有机化学缓冲剂。本领域技术人员还知道在哪里获得HEPES，其是可商购的。例如，她/他可以从Sigma Aldrich获得；图22中示出了相应的数据表。
乳糖醛酸盐是乳糖醛酸的羧酸根阴离子。乳糖醛酸(4-O-β-吡喃半乳糖基-D-葡糖酸)是糖酸。乳糖醛酸盐可以以不同的方式使用。当用作乳糖醛酸钾时，它可以例如提供渗透压支持和防止细胞膨胀，并且当与钠结合时，它可以具有防腐功能。或者，乳糖醛酸的矿物盐也可用于补充矿物质。对于药物应用，通常红霉素抗生素尤其可以用作乳糖醛酸红霉素盐。本领域技术人员还知道在哪里获得乳糖醛酸盐，例如乳糖醛酸钠(Cas编号：27297-39-8)，即从例如COMBI-BLOCKS获得，参见图23中的产品表。
蔗糖，也称为D-Glc-(1→2)-β-D-Fru、α-D-吡喃葡萄糖基β-D-呋喃果糖苷、β-D-呋喃果糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷、D(+)-蔗糖或糖(CAS号57-50-1)可以作为其它物质商购获得，并且技术人员知道在哪里购买它。来自Sigma Aldrich的蔗糖的相应产品表如图24所示。
甘露醇是一种糖醇(CAS登记号：69-65-8)。本领域技术人员知道如何获得甘露醇。例如，它可以从Avantor获得。图25中示出了相应的产品表。
葡萄糖(CAS号：50-99-7)也是本领域技术人员熟知的，并且可商购获得。来自Sigma Aldrich的各产品表如图26所示。
葡聚糖是由直链α(1→6)连接的葡萄糖单元和α(1→3)连接起始的支链组成的支链葡聚糖。葡聚糖的大小为10,000-150,000Kd。葡聚糖在许多应用中用作体积增量剂、稳定剂、基质组分、粘合平台、润滑剂和物理结构组分。用于本文所述载体的葡聚糖40(CAS号：9004-54-0)通常用于开发新的改进的器官移植用保存溶液。葡聚糖40可用于确定细胞紧密度和跨细胞层的通量参数。葡聚糖40也可以用作胶体血浆容量增量剂。葡聚糖-40是可商购的，并且尤其可以从Sigma Aldrich获得(图27中所示的产品表)。
腺苷(CAS号58-61-7)是由通过β-N9糖苷键连接到核糖糖分子(呋喃核糖)部分的腺嘌呤分子组成的嘌呤核苷。腺苷可从Sigma-Aldrich等商购(相应的产品表示于图28中)。
谷胱甘肽也称为(2S)-2-氨基-4-{[(1R)-1-[(羧甲基)氨基甲酰基]-2-硫烷基乙基]氨基甲酰基}丁酸。该组分可商购获得，并且尤其可从Sigma Aldrich获得(相应的产品表示于图29中)。
原则上，任何包含如上文i)-xv)中所列物质的液体载体均可用于本发明的方法中。载体是液体载体。因此，可以将i)-xv)中列出的物质溶解在液体中以形成溶液/悬浮液。液体可以是任何合适的液体。例如，液体可以是培养基、水、缓冲液等。
载体可以另外包含其它pH缓冲剂、能量底物、自由基清除剂和渗透/胶体渗透稳定剂-所有这些都是本领域技术人员已知的。此外，液体载体可以是无血清的和/或无蛋白质的。液体载体可以不包含偶极非质子溶剂，例如DMSO。特别地，液体载体可以是如WO 2010/064054中所述的载体。载体可以是HypoThermosolTM或HypoThermosolTM-FRS(HTS-FRS)。HypoThermosolTM-FRS(HTS-FRS)可以从STEMCELL Technologies购买(根据图30中所示的相应产品表)。
进一步设想载体是运输/储存培养基或赋形剂。运输/储存培养基可以是天然培养基，其仅由天然存在的生物流体组成，其另外包含如本文所述的i)-xv)中所列的物质。培养基也可以是包含如本文所述的i)-xv)中所列物质并加入(另外的)营养物(有机和无机)、维生素、盐、O2和CO2气相、血清蛋白、碳水化合物和/或辅因子的培养基。在特定的实施方案中，培养基不含血清和/或蛋白质。
载体也可以是赋形剂。“赋形剂”是与药物的活性成分一起配制的物质。在本方法中，活性成分是干细胞群体。
载体可以进一步包含生物相容的支架或微载体。支架或微载体可以是例如生物可降解的聚合物，最优选聚(D,L乳酸-共-乙醇酸)(PLGA))。或者，支架或微载体可以是光滑的、大的或微孔的结构，其包括包含聚-L-丙交酯(PLLA)、胶原、纤连蛋白、糖胺聚糖(GAG)、纤维蛋白、淀粉、纤维素阿拉伯半乳聚糖(落叶胶)、藻酸、琼脂、角叉菜胶、壳多糖、透明质酸、葡聚糖、结冷胶、支链淀粉、羟基磷灰石、聚羟基链烷酸酯(PHA)、水凝胶或其它自组装材料如基于肽的纳米结构纤维支架的物质。
原则上，任何量的干细胞可以与任何量的液体载体接触。在这方面，可以通过将干细胞群体以约70百万/ml、约60百万/ml、约50百万/ml、约40百万/ml、约30百万/ml、约20百万/ml、约10百万/ml、约5百万/ml、约4百万/ml、约3百万/ml、约2百万/ml、约1百万/ml、约0.5百万/ml、约0.1百万/ml或小于0.1百万细胞的密度悬浮在1ml载体中来进行接触。在一些实施方案中，通过将干细胞群体悬浮在约10百万/1ml载体的密度中进行接触。
在使所述干细胞群体与所述间充质干细胞储存或运输制剂接触后，与所述间充质干细胞储存或运输制剂接触的干细胞可以以约50ml、约20ml、约10ml、约5ml、约4ml、约3ml、约2ml、约1ml、约0.5ml、约0.25ml或小于0.25ml间充质干细胞储存或运输制剂的体积等分到小瓶中。例如，可以将已经与间充质干细胞储存或运输制剂接触的干细胞以约1ml的体积等分到小瓶中。
进一步设想本发明的方法不包括解冻或冷冻步骤。这可以包括在它们收获之后，运输/储存干细胞群体，而不需要冷冻和解冻干细胞群体。
在如本文所述的运输/储存干细胞群体的方法中使用的载体特别适合于该目的。这种载体的一个优点是基本上所有运输/储存于其中的干细胞保持存活。“活细胞”是能够存活的细胞。本领域技术人员知道如何检测活细胞。一种这样的方法是用染料锥虫蓝对细胞染色。活细胞不被锥虫蓝染色为阳性。
在这方面，在本发明的方法中，与运输/储存之前活的干细胞的数量/量相比，群体中至多约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或少于约10％的干细胞在运输/储存期间可能死亡。
本发明的方法还考虑了干细胞群在运输/储存后具有任何细胞直径。本领域技术人员知道如何测量细胞的直径。例如，细胞尺寸/直径可通过捕获显微镜图像并使用辅助软件测量细胞直径来确定。因此，干细胞群体中的大多数干细胞在运输/储存后可以具有约9μm至约20μm的细胞直径。还设想干细胞群体中的大多数干细胞在运输后具有约12μm至约16μm的细胞直径。
在本文所述的载体中运输/储存的干细胞分泌与活的干细胞相同的蛋白质/因子。例如，本发明的方法考虑到在运输/储存后，(间充质)干细胞群体可以分泌与运输/储存前一样多的TGFβ1。TGFβ1(转化生长因子β，TGF-β1)是本领域技术人员已知的，并且可包含如SEQ ID NO.7所示的序列。另外或可选地，在运输/储存后，(间充质)干细胞群体可分泌与运输/储存前一样多的VEGF(血管内皮生长因子)、PDGF-AA(血小板衍生生长因子亚基AA)、Ang-1(血管生成素-1)和/或HGF(肝细胞生长因子)。所有VEGF、PDGF-AA、Ang-1和/或HGF由于其在伤口愈合中的参与性而为技术人员所知。特别地，VEGF可包含如SEQ ID NO.8所示的序列，PDGF-AA可包含如SEQ ID NO.9所示的序列，Ang-1可包含如SEQ ID NO.10所示的序列，而HGF可包含如SEQ ID NO.11所示的序列。另外或可选地，在运输之前和/或之后基本上没有检测到PDGF-BB和/或IL-10。PDGF-BB(血小板衍生的生长因子亚基BB)和/或IL-10(白细胞介素-10)也是本领域技术人员已知的。PDGF-BB可包含SEQ ID NO.12所示的序列，而IL-10可包含SEQ ID NO：13所示的序列。这些因子的分泌可用任何合适的方法测定，例如，通过测量干细胞分泌到载体中的蛋白(即，例如PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF、IL-10、Ang-1、HGF或TGFβ1)的量。蛋白质的量可以通过商业上可获得的抗体/免疫测定以自动化方式测量，使用例如系统如FLEXMAP 3D系统(Luminex Corporation，Austin，Texas，USA)。在这种情况下，注意到蛋白血管生成素1(Ang-1)、TGF-β1、VEGF和HGF参与伤口愈合过程是本领域技术人员已知的。关于血管生成素1参与伤口愈合，参见，例如，Li等人，Stem Cell Research&Therapy 2013，4:113“Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1genepromote wound healing”。关于肝细胞生长因子(HGF)在伤口愈合，特别是慢性/非愈合伤口的愈合中的参与，参见例如Yoshida等人，“Neutralization of Hepatocyte GrowthFactor Leads to Retarded CutaneousWound Healing Associated with DecreasedNeovascularization and Granulation Tissue Formation.J.Invest.Dermatol.120:335-343,2003，Li，Jin-Feng等人“HGF Accelerates Wound Healing by Promoting theDedifferentiation of Epidermal Cells throughβ1-Integrin/ILK Pathway.”BioMedResearch International 2013(2013):470418或Conway等人，“Hepatocyte growthfactor regulation:An integral part of why wounds become chronic”.Wound RepReg(2007)15 683–692。血管内皮生长因子(VEGF)参与伤口愈合，特别是慢性/非愈合性伤口的愈合，参见例如Froget等人，Eur.Cytokine Netw.,Vol.14,March 2003,60–64或Bao等人，“The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Healing”J SurgRes.2009May15；153(2):347–358。
对于转化生长因子β(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)在伤口愈合，特别是慢性/非愈合伤口愈合中的参与，参见例如Ramirez等人的“The Role of TGFb Signaling inWound Epithelialization”Advances In Wound Care,卷3,Number 7,2013,482-491或Pakyari等人的Critical Role of Transforming Growth Factor Beta in DifferentPhases of Wound Healing,Advances In Wound Care,卷2,Number 5,2012,215-224。
现在转到本发明中使用的培养基，对于间充质干细胞的分离或培养，所述培养基可以包含终浓度为约55％至65％(v/v)的DMEM、终浓度为约5％至15％(v/v)的F12、终浓度为约15％至30％(v/v)的M171和终浓度为约1％至8％(v/v)的FBS。如本文所用，“％(v/v)”的值是指相对于培养基的最终体积的单个组分的体积。这意味着，如果培养基中存在的DMEM例如终浓度为约55-65％(v/v)，1升培养基含有约550-650ml DMEM。
在其它实施方案中，培养基可包含终浓度约57.5-62.5％(v/v)的DMEM、终浓度约7.5-12.5％(v/v)的F12、终浓度约17.5-25.0％(v/v)的M171和终浓度约1.75-3.5％(v/v)的FBS。在进一步的实施方案中，培养基可包含终浓度约61.8％(v/v)的DMEM、终浓度约11.8％(v/v)的F12、终浓度约23.6％(v/v)的M171和终浓度约2.5％(v/v)的FBS。
除了上述成分之外，培养基可以包含对于培养间充质脐带衬干细胞有利的补充物。本发明的培养基可以，例如，包含表皮生长因子(EGF)。如果存在EGF，其在培养基中的终浓度为约1ng/ml至约20ng/ml。在一些这样的实施方案中，所述培养基可以包含终浓度为约10ng/ml的EGF。
培养基也可包含胰岛素。如果存在，胰岛素可以以约1μg/ml至10μg/ml的终浓度存在。在这些实施方案的一些中，培养基可包含终浓度为约5μg/ml的胰岛素。
培养基可以进一步包含至少一种以下补充物：腺嘌呤、氢化可的松和3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。在这样的实施方案中，培养基可以包含腺嘌呤、氢化可的松和3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)中的所有三种。在这些实施方案中，培养基可以包含终浓度为约0.05μg/ml至约0.1μg/ml的腺嘌呤、终浓度为约1μg/ml至约10μg/ml的氢化可的松和/或终浓度为约0.5ng/ml至约5ng/ml的3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。
在一个实施方案中，在PTT6培养基中培养间充质干细胞以获得本文描述和使用的高度纯化的间充质干细胞群体。在此上下文中，注意到如本文所述的PTT6培养基通过混合以下组分以获得最终体积为500ml的培养基：
i.250ml DMEM
ii.118ml M171
iii.118ml DMEM/F12
iv.12.5ml胎牛血清(FBS)达到2.5％(v/v)的终浓度
v.终浓度为10ng/ml的EGF
vi.终浓度为5μg/ml的胰岛素。
vii.胰岛素0.175ml(终浓度为5μg/ml)
“DMEM”是指Dulbecco’s改良eagle培养基，其在1969年开发，并且是基础培养基eagle(BME)的改良(参见图1，其显示了可从Lonza获得的DMEM的数据表)。最初的DMEM配方含有1000mg/L葡萄糖，并首次报道用于培养胚胎小鼠细胞。此后，DMEM已经成为细胞培养的标准培养基，其可从各种来源商购，例如ThermoFisher Scientific(目录号11965-084)、Sigma Aldrich(目录号D5546)或Lonza，仅到新的几个供应商。因此，任何市售的DMEM都可用于本发明。在优选的实施方案中，本文所用的DMEM是可从Lonza获得的目录号为12-604F的DMEM培养基。该培养基是补充了4.5g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的DMEM。在另一优选实施方案中，本文使用的DMEM是Sigma Aldrich目录号D5546的DMEM培养基，其含有1000mg/L葡萄糖和碳酸氢钠，但不含L-谷氨酰胺。
“F12”培养基指Ham’s F12培养基。该培养基也是标准细胞培养基，并且是最初设计用于在与血清和激素和转铁蛋白组合使用时培养多种哺乳动物和杂交瘤细胞的营养混合物(参见图2，显示来自Lonza的Ham’s F12培养基的数据表)。任何市售的Ham’s F12培养基(例如，来自ThermoFisher Scientific(目录号11765-054)、Sigma Aldrich(目录号N4888)或Lonza，仅举几个供应商)均可用于本发明。在优选的实施方案中，使用来自Lonza的Ham’s F12培养基。
“DMEM/F12”或“DMEM:F12”是指DMEM与Ham’s F12培养基的1:1混合物(参见图3，显示了来自Lonza的DMEM:F12(1:1)培养基的数据表)。DMEM/F12(1:1)培养基是一种广泛使用的支持许多不同哺乳动物细胞生长的基础培养基，可从各种供应商如ThermoFisherScientific(目录号11330057)、Sigma Aldrich(目录号D6421)或Lonza商购。任何市售的DMEM:F12培养基可用于本发明。在优选的实施方案中，本文所用的DMEM:F12培养基是DMEM/F12(1:1)培养基，可从Lonza获得，目录号为12-719F(其是DMEM:F12，含有L-谷氨酰胺、15mMHEPES和3.151g/L葡萄糖)。
“M171”是指培养基171，它已经被开发作为培养和生长正常人乳腺上皮细胞的基础培养基(参见显示来自Life Technologies Corporation的M171培养基的数据表的图4)。这种基础培养基被广泛使用，并且可以从供应商例如ThermoFisher Scientific或LifeTechnologies Corporation(目录号M171500)商购获得。任何商业上可获得的M171培养基都可以用于本发明。在优选实施例中，这里使用的M171培养基是可从Life Technologies公司获得的目录号为M171500的M171培养基。
“FBS”是指胎牛血清(也称为“胎牛血清”)，即在血液自然凝固后，接着离心以除去任何剩余的红细胞后剩余的血液级分。胎牛血清是用于真核细胞的体外细胞培养的最广泛使用的血清补充物，因为它具有非常低水平的抗体并且含有更多的生长因子，允许在许多不同的细胞培养应用中的通用性。FBS优选从国际血清工业协会(ISIA)成员获得，其主要焦点是通过适当的来源可追溯性、标记的真实性和适当的标准化和监督，血清和动物衍生产品的安全和安全使用。ISIA成员FBS的供应商包括巴斯塔姆巴斯公司、动物技术公司、生物分子生物技术有限公司、GE医疗保健公司、Thermo Fisher Scientific and Life ScienceProduction的Gibco，仅提及少数。在目前优选的实施方案中，FBS以目录号A15-151从GEHealthcare获得。
如上所述，制备用于分离本发明中使用的间充质干细胞群体的培养基的方法包括混合以下组分以获得最终体积为500ml的培养基：
i.250ml DMEM
ii.118ml M171
iii.118ml DMEM/F12
iv.12.5ml胎牛血清(FBS)以达到2.5％(v/v)的终浓度。
如上所述，DMEM/F12培养基是DMEM和Ham’s F12培养基的1:1混合物。因此，118mlDMEM/F12培养基含有59ml DMEM和59ml F12。因此，当使用这种制备培养基的方法时，500ml总体积的终浓度(v/v)如下：
-DMEM：250ml+59ml＝309ml，对应于309/500＝61.8％(v/v)
-M171：118ml，对应于118/500＝23.6％(v/v)
-F12：59ml，对应于59/500＝11.8％(v/v)。
制备培养基的该方法的实施方案还包括添加
v.1ml EGF储备溶液(5μg/ml)，以使EGF终浓度达到10ng/ml，和
vi.胰岛素0.175ml储备溶液(14.28mg/ml)，以达到5μg/ml的最终胰岛素浓度。
这里注意到，在这些实施方案中，上述体积的这些组分i至vi将导致499.675ml培养基的最终体积。如果没有向培养基中加入其它组分，则剩余的0.325ml(加至500ml的体积)可以是例如组分i至iv中的任一种。即，DMEM、M171、DMEM/F12或FBS。或者，EGF或胰岛素储备溶液的浓度当然可以调节到培养基的总体积为500ml。另外，还应注意，组分i-iv不必以它们所列的顺序加入，当然也可以使用任何顺序混合这些组分以得到本发明的培养基。这意味着，例如，M171和DMEM/F12可混合在一起，然后与DMEM和FBS组合以达到如本文所述的最终浓度，即，DMEM的最终浓度为约55％至65％(v/v)，F12的最终浓度为约5％至15％(v/v)，M171的最终浓度为约15％至30％(v/v)和FBS的最终浓度为约1％至8％(v/v)。
在其它实施方案中，该方法进一步包括向DMEM添加0.325ml体积的一种或多种以下补充物：腺嘌呤，氢化可的松，3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)，从而达到500ml培养基的总体积。在该实施方案中，DMEM中这些补充物的最终浓度可如下：
约0.05μg/ml至0.1μg/ml腺嘌呤，例如约0.025μg/ml腺嘌呤，
约1μg/ml至10μg/ml氢化可的松，
约0.5ng/ml至5ng/ml 3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)，例如1.36ng/ml 3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。
根据上述公开内容，本文所用的细胞培养基是通过本文所述的制备培养基的方法可获得的或通过本文所述的制备培养基的方法获得。
此外，本文描述了从脐带羊膜分离间充质干细胞的方法，其中该方法包括在通过该方法制备的培养基中培养羊膜组织。
因此，本发明还涉及细胞培养基(的用途)，其包含：
-DMEM，终浓度为约55-65％(v/v)，
-F12，终浓度为约5-15％(v/v)，
-M171，终浓度为约15-30％(v/v)，和
-FBS，终浓度为约1-8％(v/v)。
在本文所述培养基的某些实施方案中，培养基包含终浓度约57.5-62.5％(v/v)的DMEM、终浓度约7.5-12.5％(v/v)的F12、终浓度约17.5-25.0％(v/v)的M171和终浓度约1.75-3.5％(v/v)的FBS。在其它实施方案中，培养基可包含终浓度约61.8％(v/v)的DMEM、终浓度约11.8％(v/v)的F12、终浓度约23.6％(v/v)的M171和终浓度约2.5％(v/v)的FBS。
此外，所述培养基还可以包含终浓度为约1ng/ml至约20ng/ml的表皮生长因子(EGF)。在某些实施方案中，所述培养基包含终浓度为约10ng/ml的EGF。本文所述的培养基可进一步包含终浓度为约1μg/mL至10μg/mL的胰岛素。在这样的实施方案中，培养基可以包含终浓度为约5μg/ml的胰岛素。
细胞培养基可以进一步包含至少一种以下补充物：腺嘌呤、氢化可的松和3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。在某些实施方案中，培养基包含腺嘌呤、氢化可的松和3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)中的所有三种。如果存在的话，培养基可以包含终浓度为约0.01μg/ml至约0.1μg/ml腺嘌呤或约0.05μg/ml至约0.1μg/ml腺嘌呤的腺嘌呤，终浓度为约0.1μg/ml至约10μg/ml氢化可的松或约1μg/ml至约10μg/ml氢化可的松的氢化可的松和/或终浓度为约0.5ng/ml至约5ng/ml的3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。
在细胞培养基的实施方案中，500ml本发明的细胞培养基包含：
i.250ml DMEM
ii.118ml M171
iii.118ml DMEM/F12
iv.12.5ml胎牛血清(FBS)(终浓度2.5％)
在进一步的实施方案中，细胞培养基可以进一步包含
v.终浓度为10ng/ml的EGF，和
vi.终浓度为5μg/ml的胰岛素。
胰岛素和EGF都可以使用选择的储备溶液加入到培养基中，使得培养基的总体积不超过500ml。
在一个具体的实施例中，用于本发明的培养基的组分i-vi是图5中所示的组分，这意味着它们是从各自的制造商使用图5中所示的目录号获得的，通过混合如图5中所示的组分i-vi获得的培养基在此也称为“PTT-6”。在此还应注意，成分i-vi以及任何其它商业供应商的任何其它成分如抗生素可用于制备本发明的培养基。
此外，本发明的细胞培养基可以包含终浓度为约0.01μg/ml至约0.1μg/ml腺嘌呤或约0.05μg/ml至约0.1μg/ml腺嘌呤的腺嘌呤，终浓度为约0.1μg/ml至10μg/ml、约0.5μg/ml至约10μg/ml或约1μg/ml至约10μg/ml氢化可的松的氢化可的松和/或终浓度为约0.1ng/ml至约5ng/ml或约0.5ng/ml至约5ng/ml的3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)。
为了获得本文所述的间充质干细胞群体，可以培养脐带组织直至合适数量的(原代)间充质脐带衬里干细胞从组织长出。在典型的实施方案中，培养脐带组织直到羊膜间充质干细胞的细胞生长达到约70％至约80％汇合。这里注意到，术语“汇合(confluency)”或“汇合(confluence)”以其在细胞培养领域中的常规含义使用，并且是指作为培养皿或烧瓶中的粘附细胞的数目的估计值/指示物，指被细胞覆盖的表面的比例。例如，50％汇合意味着大约一半的表面被覆盖，并且仍然有细胞生长的空间。100％汇合意味着表面完全被细胞覆盖，并且不再有空间让细胞生长为单层。
一旦通过组织外植体从脐带膜组织获得了合适数量的原代细胞(间充质干细胞)，就从用于培养的培养容器中取出间充质干细胞。通过这样做，可以获得含有羊膜的(原代)分离的间充质干细胞的主细胞库。通常，由于间充质干细胞是粘附细胞，使用标准酶处理进行去除。例如，酶处理可以包括胰蛋白酶消化，如在国际美国专利申请2006/0078993、国际专利申请WO2006/019357或国际专利申请WO2007/046775中所述，意味着长出的细胞可以通过胰蛋白酶消化(0.125％胰蛋白酶/0.05％EDTA)收获用于进一步扩增。如果收获的间充质干细胞例如用于产生主细胞库，则细胞也可被冷冻保存和储存以用于进一步使用，如本文下文所解释。
一旦被收获，间充质干细胞可以被转移到培养容器中进行传代培养。传代培养也可从冷冻的原代细胞开始，即从主细胞库开始。对于传代培养，可以将任何合适量的细胞接种在培养容器如细胞培养板中。为此目的，间充质干细胞可以以例如约0.5×106个细胞/ml至约5.0×106个细胞/ml的浓度悬浮在合适的培养基(最方便地，培养基PTT-6)中用于传代培养。在一个实施方案中，以约1.0×106个细胞/ml的浓度悬浮细胞用于传代培养。传代培养可以通过在简单的培养瓶中培养来进行，但也可以在例如多层系统中培养，所述多层系统例如CellStacks(Corning，Corning，NY，USA)或CellFactory(Nunc，Thermo FisherScientific公司的部门，Waltham，MA，USA)，其可以在培养箱中堆叠。或者，传代培养也可在封闭的自持式系统如生物反应器中进行。生物反应器的不同设计是本领域技术人员已知的，例如平行板、中空纤维或微流体生物反应器。参见，例如，Sensebe等人“Production ofmesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices:areview”，见上文。市售的中空纤维生物反应器的一个说明性实例是Quantum细胞扩增系统(Terumo BCT公司)。其例如已用于临床试验的骨髓间充质干细胞的扩增(参见Hanley等人，Efficient Manufacturing of Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells Using theQuantum Cell Expansion System,Cytotherapy.2014August；16(8):1048–1058)。可用于本发明的间充质干细胞群体的传代培养的可商购获得的生物反应器的另一个实例是可从GE Heathcare获得的Xuri细胞扩增系统。如果在GMP条件下生产用于治疗应用的工作细胞库并且需要大量细胞，则在自动化系统例如Quantum细胞扩增系统中培养间充质干细胞群体特别有益。
本文所述的间充质脐带血干细胞的传代培养在本文所述的培养基如PTT-6培养基中进行。因此，培养基如PTT-6既可用于从羊膜分离间充质干细胞，又可用于随后通过传代培养来培养分离的原代细胞。对于传代培养，也可培养间充质干细胞直至适当数量的细胞已经生长。在说明性实施方案中，将间充质干细胞传代培养至间充质干细胞达到约70％至约80％汇合。
间充质脐带衬干细胞群体的分离/培养可以在用于培养哺乳动物细胞的标准条件下进行。通常，本发明分离间充质脐带衬干细胞群的方法通常在通常用于培养细胞来源物种的细胞的条件(温度、气氛)下进行。例如，人脐带组织和间充质脐带衬里干细胞分别通常在37℃下在含5％CO2的空气气氛中培养。在这种情况下，应注意间充质细胞可以来源于任何哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、马、狗、猫、绵羊、猴或人，在一个实施方案中优选人来源的间充质干细胞。
一旦从传代培养物中获得了所需/合适数量的间充质干细胞，就可以通过将它们从用于传代培养的培养容器中移出来收获间充质干细胞。间充质干细胞的收获通常再次通过酶处理进行，包括细胞的胰蛋白酶消化。随后收集分离的间充质干细胞，并直接使用或保存以供进一步使用。通常，通过冷冻保存进行保存。术语”冷冻保存“在本文中以其常规含义使用，以描述通过冷却至低的零下温度，诸如(通常)-80℃或-196℃(液氮的沸点)来保存间充质干细胞的方法。冷冻保存可以如本领域技术人员已知的进行，并且可以包括使用冷冻保护剂，例如二甲基亚砜(DMSO)或甘油，其减缓脐带细胞中冰晶的形成。
通过本文所述的分离方法获得的间充质脐带衬干细胞的分离群体是高度确定的和均质的。在所述方法的典型实施方案中，至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的分离的间充质干细胞表达以下标志物：CD73、CD90和CD105。此外，在这些实施方案中，至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的分离的间充质干细胞可能缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA-DR。在具体的实施方案中，约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的分离的间充质干细胞群体表达CD73、CD90和CD105，而缺乏CD34、CD45和HLA-DR的表达。
因此，根据上述公开内容，从脐带羊膜分离间充质干细胞群体，其中所述干细胞群体的至少约90％或更多细胞表达下列标志物中的每一种：CD73、CD90和CD105。在优选的实施方案中，分离的间充质干细胞群体的至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的细胞是CD73+、CD90+和CD105+，这意味着该百分比的分离的细胞群体表达CD73、CD90和CD105中的每一个(参见本申请的实验部分)。此外，至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的分离的间充质干细胞可能缺乏下列标志物的表达。在具体的实施方案中，所述分离的间充质干细胞群体的约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD34、CD45和HLA-DR。这种来源于脐带羊膜的高度同质的间充质干细胞群体首次在2016年10月5日提交的美国临时申请62/404,582中以及在2017年10月5日提交的共同未决的美国申请序列号15/725,913中以及同样在2017年10月5日提交的PCT/SG2017/050500的共同未决的PCT申请中有报道，并且满足用于细胞疗法的间充质干细胞的标准(也参见实验部分和例如Sensebe等人的”Production ofmesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices:areview”，见上文)。在此上下文中应注意，该间充质干细胞群体可通过本发明的分离方法获得，但如果需要，也可通过不同的方法如细胞分选获得。
制备用于分离如本文所述的间充质干细胞的培养基的方法可包括混合以下组分以获得最终体积为500ml的培养基：
i.250ml DMEM
ii.118ml M171
iii.118ml DMEM/F12
iv.12.5ml胎牛血清(FBS)以达到2.5％(v/v)的终浓度。
如上所述，DMEM/F12培养基是DMEM和Ham’s F12培养基的1:1混合物。
因此，118ml DMEM/F12培养基含有59ml DMEM和59ml F12。因此，当使用这种制备培养基的方法时，500ml总体积的终浓度(v/v)如下：
DMEM：250ml+59ml＝309ml，对应于309/500＝61.8％(v/v)
M171：118ml，对应于118/500＝23.6％(v/v)
F12：59ml，对应于59/500＝11.8％(v/v)。
本发明还涉及治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者局部施用已经在间充质干细胞储存或运输溶液中储存或运输的间充质干细胞或如本文所述的群体，其中所述间充质干细胞或所述干细胞群体在从已经收获所述间充质干细胞群体的时间点起约96小时内施用。治疗受试者的方法可如国际专利申请WO2019/199229“一种通过运输溶液运输间充质干细胞的方法和一种将干细胞施用于伤口的方法”中所述进行，该国际专利申请在本PCT申请的优先权日之后公开并以其全文并入本文用于所有目的。
类似地，本发明还涉及如本文所述的间充质干细胞群体，其用于治疗受试者的疾病的方法中，其中在从已收获所述间充质干细胞群体的时间点起约96小时内局部施用所述间充质干细胞群体。
待治疗的受试者可以是任何合适的受试者。受试者可以是脊椎动物，更优选哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类、狗、马、小鼠和大鼠。哺乳动物也可以是人、狗、猫、牛、猪、小鼠、大鼠等。因此，在一个实施方案中，受试者是脊椎动物。受试者也可以是人类受试者。因此，受试者可以是需要治疗的受试者。因此，受试者可能患有本文其它地方所述的疾病。在一些实施方案中，所述受试者患有I型或II型糖尿病，伴有慢性足溃疡。优选地，受试者对于间充质干细胞群体的HLA抗体是阴性的。
间充质干细胞群体可以以任何剂量应用。剂量可以是治疗有效的。“治疗有效量/剂量”可以随因素而变化，所述因素包括但不限于所用细胞的活性、患者体内细胞的稳定性、待减轻病症的严重性、待治疗患者的年龄和敏感性、不良事件等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。当各种因素随时间变化时，可以调节给药量。
间充质干细胞的施用剂量也可以是单位剂量。例如，间充质干细胞群体可以以约20百万个细胞、约15百万个细胞、约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的单位剂量应用。在一个实例中，间充质干细胞可以以约3百万、约5百万或约10百万个细胞的剂量应用。在一个具体实施方案中，间充质干细胞群体以约10百万个细胞的单位剂量应用。
间充质干细胞可以对同一受试者应用几次。例如，干细胞每周施用一次、两次、三次或更多次。原则上，可以将任何单位剂量的间充质干细胞应用适于治愈或减轻疾病的次数。例如，间充质干细胞群体可以每周施用一次、两次、三次或更多次。间充质干细胞群体还可以施用一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一周或更长时间。
因此，每周一次或两次施用约20百万个细胞、约15百万个细胞、约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的单位剂量。约20百万个细胞、约15百万个细胞、约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的单位剂量也可每周一次或两次施用，持续三周、四周、五周或六周、或七周、或八周或十周或更多周的时间段。
本发明的治疗方法还考虑间充质干细胞或间充质干细胞群体以约1000个细胞/cm2至约5百万个细胞/cm2的剂量施用。这里，表述cm2表示干细胞所应用的伤口/皮肤的面积。还设想间充质干细胞群体以约100,000个细胞/cm2、300,000个细胞/cm2或500,000个细胞/cm2的剂量施用。间充质干细胞群体还可以以约100,000个细胞/cm2、约300,000个细胞/cm2或约500,000个细胞/cm2的剂量每周施用两次，持续约8周。
在从已收获所述间充质干细胞群体的时间点开始约96小时内施用所述间充质干细胞群体。收获如何发生在本文别处描述。也可以在从收获间充质干细胞群体的时间点开始约72小时、约48小时、约24小时、约12小时、约6小时或更短时间内施用间充质干细胞或间充质干细胞群体。在收获和应用之间，间充质干细胞群体可以在如本发明中所述的间充质干细胞储存或运输制剂中运输或储存。因此，如所描述的用于在本申请的间充质干细胞储存或运输制剂中运输/储存的方面同样涉及治疗受试者的方法，其包括施用已经储存在本发明的间充质干细胞储存或运输制剂中的MCS，加以必要的变更。
本发明的治疗受试者的方法用于缓解受试者所患的疾病。原则上，本文意指可由如本文所述的间充质干细胞群体治疗的任何疾病。特别地，所述疾病可以是皮肤病或伤口。伤口可以由任何原因引起，例如由烧伤、咬伤、创伤、手术或疾病引起。伤口也可以由糖尿病引起。因此，伤口也可以是糖尿病伤口。伤口也可以是糖尿病足溃疡。值得注意的是，间充质干细胞群体可以例如直接置于伤口例如烧伤或糖尿病伤口上(参见国际专利申请WO2007/046775)。
如本文所述，在收获如本文所述的间充质干细胞群体与将它们应用于受试者之间，可以将细胞运输/储存在如本文所定义的载体中。因此，本发明的治疗受试者的方法还可包括在将所述间充质干细胞群体施用于所述受试者之前将所述间充质干细胞群体与所述载体分离的步骤。本领域技术人员知道如何进行细胞与载体的分离。例如，从载体分离间充质干细胞群体可以包括离心。另外或可替代地，将间充质干细胞群体与载体分离可以包括借助于注射器从小瓶中抽出细胞群体。
在从间充质干细胞储存或运输制剂分离干细胞之后，或在收获间充质干细胞之后，或在通过任何其他方法获得如本文所述的间充质干细胞群体之后，将这些细胞局部施用于受试者。原则上，本文是指任何局部给药方式。所述间充质干细胞群体的施用可以通过注射器进行。然而，在将间充质干细胞施用于受试者之前，还可以在乳膏剂、软膏剂、凝胶、悬浮液或任何其他合适的物质内接触间充质干细胞。间充质干细胞群体在施用于受试者后可以通过膜或绷带保持在适当的位置。这种膜或绷带的实例可以是敷料，例如敷料和覆盖/>敷料的绉纱绷带。为了使细胞更均匀地分布，可以轻轻地按摩施用部位。
本发明还涉及通过本文所述的方法获得的或可通过本文所述的方法获得的间充质干细胞的单位剂量。例如，单位剂量可以包含1ml体积的如本文所述的间充质干细胞群体的约20百万个细胞、约15百万个细胞、约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞。
还设想单位剂量包含约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.25或约0.1百万个细胞。在一个实例中，单位剂量可包含约1百万、约3百万或约5百万个细胞。优选地，单位剂量包含约10百万个细胞。进一步设想单位剂量包含约1000个细胞至约5百万个细胞。单位剂量可以以约100,000个细胞、300,000个细胞或500,000个细胞的剂量应用。如本文所述，单位剂量可局部应用。例如，单位剂量可每cm2局部施用。
单位剂量可以每周施用一次、两次、三次或更多次。例如，单位剂量可以施用一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一周或更长。包含约100,000个细胞、约300,000个细胞或约500,000个细胞的单位剂量可每周施用两次，持续8周，优选应用至1cm2。
单位剂量可以包含在任何合适的容器中。例如，单位剂量可以包含在1ml小瓶中。在这种情况下，例如0.1ml的小瓶可以应用于受试者，优选每cm2。单位剂量可以备选地包含在注射器中。
本发明的单位剂量中，细胞可与本文定义的液体载体接触。如果是这种情况，那么在给药前将间充质干细胞与载体分离。例如，在给予受试者之前，可以离心和分离细胞。载体可以包括或者可以是本文所述的任何载体，例如HypoThermosolTM或HypothermosolTM-FRS。
本发明的单位剂量可以包含脐带的MSC。如上所述，脐带的MSC可以(衍生自)含有MSC的脐带组织的任何区室。因此，单位剂量可包含羊膜的MSC、血管周围MSC、Wharton’s胶质的MSC、脐带羊膜的MSC。脐带羊膜的MSC可以是高度确定和均质的。因此，在本发明的一个实施方案中，使用如国际申请WO2018/067071中所述的单位剂量可以包含MSC。因此，在所述方法的典型实例中，单位剂量可以包含表现出至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC表达下列标志物中的每一种的MSC：CD73、CD90和CD105。此外，单位剂量可以包含表现出至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC缺乏以下标志物表达的MSC：CD34、CD45和HLA-DR。在具体的实例中，单位剂量包含约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的MSC表达CD73、CD90和CD105，而缺乏CD34、CD45和HLA-DR的表达。在进一步的实施例中，至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，而至少约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的MSC可以不表达CD34、CD45和HLA-DR。在具体的实例中，约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的MSC表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD34、CD45和HLA-DR。
本发明的治疗方法和单位剂量可以包括活细胞的利用。如何测试生存力在本文别处描述。
本发明将通过以下非限制性实验实施例进一步说明。
本文所用的序列描述于下表1中。
表1.本文所用的序列。
/>
/>
/>
实验例
1.在分离间充质干细胞之前冷冻保存脐带组织
处理脐带组织(脐带是在母亲知情同意的情况下捐献的)用于随后如下从脐带羊膜分离间充质干细胞。
1.1脐带组织样品的洗涤：
a.从保护性覆盖物移除手术刀。
b.使用镊子牢固地保持脐带，并使用手术刀将脐带切成10cm长的片。将未使用的脐带放回原始组织杯中。
c.将10cm长的脐带片转移到新的150mm培养皿中。可以使用150mm培养皿代替杯子。
d.使用150mm培养皿的盖子作为镊子和手术刀的放置位置。
e.用30ml注射器取出25ml Plasmalyte A(Baxter，目录号#2B2543Q)。用一只手以45°角握住注射器，并将Plasmalyte A直接分配到脐带组织上。
f.用30ml注射器和钝针以微小角度保持培养皿以除去Plasmalyte A。
g.将用过的Plasmalyte A收集在用作垃圾容器的300ml转移袋中，并将其放置在生物危害性箱中。
h.重复洗涤程序，如果必要，每次洗涤使用新的培养皿。确保表面上的所有血凝块都被除去。如果需要清洁组织，可以使用更多的Plasmalyte A。
i.将组织放入新的标记的组织培养皿中以继续切割组织。将20ml Plasmalyte A放入培养皿中，以便在切割时组织不会变干。
j.将脐带切割成相等的大约1cm的部分，从而总共产生10个部分。
k.进一步将每个1cm切片切成每切片约0.3cm×0.3cm至0.5cm×0.5cm的小片。
l.除去培养皿中的任何Plasmalyte A。
m.用30ml注射器从原始Plasmalyte A袋中拉出25ml Plasmalyte A，并直接分配到脐带组织块上。
n.将培养皿保持一定角度，以收集用于清洗一侧组织的所有Plasmalyte A，并用注射器和钝针将其取出。
o.再重复洗涤一次。不应留下任何凝块。
注：如果脐带不是立即冷冻，脐带组织被保存在Plasmalyte A中直到准备冷冻。
1.2脐带组织的冷冻保存：
a.配制冻存液：
i.制备50ml由60％Plasmalyte A、30％5％人血清白蛋白和10％二甲基亚砜(DMSO)组成的冷冻溶液。
ii.用“组织冷冻溶液”标记150ml转移袋，并使用无菌技术将血浆转移装置附接至端口。
iii.用30ml注射器从原始Plasmalyte A袋中取出30ml Plasmalyte A，并将其转移到标记有“组织冷冻溶液”以及制备溶液的时间和日期的转移袋中。
iv.用20ml注射器移出15ml 5％人血清白蛋白，并将其转移到标记的转移袋中。
v.向转移袋中加入5ml DMSO。
vi.混合均匀并记录冷冻溶液的混合
b.在加入冷冻溶液之前从组织中除去Plasmalyte A。
c.使用60ml注射器，将所有50ml冷冻溶液抽入注射器中，将约30ml冷冻溶液加入含有脐带组织的150mm细胞培养皿中。将钝针置于注射器上以保持其无菌。
d.每分钟旋转含有组织和冷冻溶液的培养皿，持续10分钟。
e.使用镊子，选择8个随机选择的切片并将它们放置在四个4ml冷冻管的每一个中。选择4个随机选择的切片并将它们置于一个1.8ml的冷冻管中。这些切片应该没有血凝块。
f.用剩余的冷冻溶液将每个含有脐带组织的冷冻管填充至3.6ml填充管线(对于4ml管)和1.8ml管线(对于1.8ml Nunc瓶)。
g.标记一个Bactec裂解/10-厌氧/F和一个Bactec加需氧/F瓶，具有组织ID。
h.用注射器和钝针从培养皿中取出20ml冷冻溶液，用酒精药签擦拭Bactec小瓶后，将钝针换成18g针，并接种需氧菌和厌氧菌Bactec瓶，每瓶10ml。
i.启动可控速率冷冻机。
j.在受控速率冷冻完成后，将所述单元置于连续温度监测液氮冷冻器中直至进一步使用。
2.从脐带组织分离间充质脐带衬里干细胞
2.1.制备用于处理来自脐带组织的MSC的培养基：
a.为了制备500ml PTT6(培养/生长培养基)，按所列顺序加入以下物质：
i.DMEM，250ml
ii.M171 118ml
iii.DMEM F12 118ml
iv.FBS 12.5ml(终浓度2.5％)
v.EGF 1ml(终浓度为10ng/ml)
vi.胰岛素0.175ml(终浓度为5μg/ml)
当上述成分i-vi的体积导致499.675ml培养基的最终体积时。如果没有其它成分加入培养基中，剩余的0.325ml(加至500ml体积)可以是例如成分i-iv中的任何一种，即DMEM、M171、DMEM/F12或FBS。或者，EGF或胰岛素储备溶液的浓度当然可以调节到培养基的总体积为500ml。或者，可以加入抗生素如青霉素-链霉素-两性霉素的储备溶液，得到500ml的最终体积。还可以向培养基中加入0.325ml体积的一种或多种以下补充物：腺嘌呤，氢化可的松，3,3’,5-三碘-L-甲腺原氨酸钠盐(T3)，从而达到500ml培养基的总体积。
vii.在瓶子上贴上“PTT6”标签，注明培养基制备日期、操作者姓名首字母、短语“到期日”和到期日期。到期日期是任何组分的最早到期日期或从制备日期起1个月，以先到者为准。
b.为了制备冲洗介质(不含钙或镁和含有5％FBS的Hank’s缓冲盐溶液(HBSS))，在50ml离心管中向47.5ml HBSS中加入2.5ml FBS。在管上标记“冲洗介质”以及操作员首字母和介质制备日期。
c.使用Bactec裂解/10-厌氧/F(Becton Dickinson&Company)和Bactec Pluc+需氧/F(Becton Dickinson&Company)测试所有培养基的无菌性。向每瓶中注入20ml制备的培养基。
2.2解冻脐带组织以收获MSC：
a.一旦操作者准备在洁净室中处理样品，就开始解冻。一次解冻不超过1个小瓶，除非小瓶来源于相同的供体。
b.用消毒剂然后用70％异丙醇擦拭水浴，并用1L无菌水填充。将水浴加热至36-38℃。
c.在生物安全柜中，在洁净室中制备10mL由70％至90％PlasmaLyte A组成的冲洗介质。用连接到10ml注射器上的0.2μm注射器过滤器无菌过滤溶液，并保持溶液冷冻直至使用。
d.将处理标签置于50ml锥形管上。
e.确定水浴温度为36-38℃。
f.从液氮库中取出组织小瓶并在装有1L无菌水的37℃水浴中迅速解冻。用于Frosy Nalgene Cryo 1℃冷冻容器的小瓶支架与小瓶一起漂浮在适当位置，并且当解冻样品时可用作漂浮支架。
g.从水浴中取出小瓶并用70％异丙醇溶液对其进行喷雾。从水浴中拔出小瓶的良好时间是当可以看到小冰块漂浮在小瓶中时-表明小瓶的内部温度低于37℃。
h.将小瓶放入到通道中并通知洁净室处理技术人员。
2.3组织处理的准备：
a.脐带组织处理应在环境监测(EM)的洁净室中进行：.在每次转换结束时，进行满室和机罩的清洁
b.准备/清洁生物安全柜。
c.在生物安全柜内工作的同时进行活菌计数。
d.将所有必需的供应品装配在生物安全柜中，检查每个供应品的包装损坏和有效期。当操作注射器、血清移液管、无菌镊子、手术刀、组织板和针时，确保不接触将与无菌产品接触的任何表面。只有注射器筒、管、柱塞尖端和/或针头帽或护套的外部可以被安全地处理。如果所述表面已经被触摸或已经触摸非无菌表面，则丢弃供应。
e.记录所有试剂和要使用的用品的批号和有效期(如果适用的话)。
f.在转移到生物安全柜之前，通过用70％乙醇润湿的无绒抹布清洁小瓶来接收解冻的小瓶。
g.使用带有注射器的抽吸针，从小瓶中抽取同样多的液体。避免抽吸组织。
h.使用无菌镊子，将组织转移至无菌100mm培养皿中。
i.向组织碎片中加入5ml等分的冲洗介质。
j.将内容物旋转15-30秒，然后用带有吸液针的移液管或注射器除去冲洗介质。重复该冲洗过程两次。
k.向组织中加入2mL冲洗介质以避免组织干燥。
2.4.启动MSC从组织长出：
a.用MSC批号或脐带组织ID标记6孔板“长出1”的底部，并标记开始生长日期。如果使用60mm组织培养皿，通过在培养皿底部画网格将培养皿分成4个象限。
b.使用无菌的一次性镊子，将一个3×3mm至5×5mm的组织置于每个孔中。如果使用60mm组织培养皿，将组织置于每个象限的中间以保持组织分开(彼此之间大于1cm)。
c.用3ml PTT6填充每个孔。
d.使用与30ml注射器连接的抽吸针，抽取足够的培养基以几乎不覆盖组织。不使板倾斜。不与抽吸针接触的孔底。
e.使用倒置光学显微镜，每天(24±6小时)观察细胞生长。实时细胞培养成像系统可以用于代替光学显微镜。
f.每天更换培养基。确保在使用前将培养基平衡至室温。
i.吸出培养基。
ii.加入3ml PTT6。
iii.抽吸直到组织几乎没有浸没在培养基中。
g.当从组织观察到细胞生长时，使用与上述4.a至4.e相同的程序将组织移植到新的6孔板，除了将板标记为“生长2”。通过在每孔中加入2ml PTT6维持“生长1”板中的细胞生长。每天观察汇合。每2-3天更换培养基(确保在使用前将培养基平衡至室温)。
h.当在“生长2”板中观察到细胞生长时，重复步骤4.a至4.e，除了除了将板标记为“生长3”。通过向每个孔中加入2ml PTT6来维持“生长2”板中的细胞生长。每天观察汇合。每2-3天更换培养基(确保在使用前将培养基平衡至室温)。
i.当在“生长3”板中观察到长出时，丢弃该组织。如果组织非常小并且似乎不干扰细胞生长，则在传代培养时处理组织。
j.当细胞达到40-50％汇合时，每天观察细胞以防止过度扩增。
k.当细胞达到70-80％汇合时，对细胞进行传代培养。不允许细胞扩增超过80％汇合。
组织外植体的大小约为1-3mm，并且组织外植体/细胞培养在175mm见方的培养皿中进行，从外植体中收获的间充质干细胞的平均数量通常约为4,000-6,000个细胞/外植体。因此，当间充质干细胞从48个外植体同时生长时，在收获时可以获得约300,000个细胞。然后，通过用这种300,000个细胞接种175cm2细胞培养瓶，可以将从外植体收集的这300,000个间充质干细胞用于传代培养，如以下实施例2.5中所述(这可以称为传代1)。然后，从该传代1获得的间充质干细胞可以再次用于接种175cm2瓶(传代2)，并如以下实施例2.5中所述扩增细胞。从第1代和第2代获得的细胞可通过冷冻保存“储存”，认为第2代后获得的间充质干细胞代表了主细胞库，其将用于进一步扩增间充质干细胞，例如在生物反应器中，如以下实施例2.7中所解释的。
2.5.在细胞培养皿中传代培养MSC
a.在生物安全柜中工作时，执行可行的粒子操作。在使用前将所有培养基平衡至室温。
b.当细胞生长达到约70-80％汇合时，传代培养细胞。
i.从培养皿中移出PTT6。
ii.用无钙或镁的HBSS冲洗。
iii.加入0.2ml 1×TrypLE-EDTA并旋转1-2分钟。
iv.将培养皿倾斜30-45°，以允许细胞通过重力流动而向下移动。在平板侧面轻轻敲击可加快脱离。
v.加入1ml PTT6。轻轻地上下移液，然后将细胞转移至15ml离心管中。对每个孔使用清洁的移液管尖端。来自所有6个孔的细胞可以合并到单个15ml管中。
vi.1200rpm离心10分钟。
vii.除去上清液并用5ml PTT6重悬细胞。
c.传代培养MSC
i.取50μl细胞悬浮液，通过锥虫蓝排斥分析法测定TNC和生存力。
ii.使用血细胞计数器计数细胞。预计每平方计数20-100个细胞。如果计数高于100，将原始样品1:5稀释，并使用血细胞计数器重复锥虫蓝方法。
iii.计算活细胞/ml和总活细胞：
1.活细胞/mL＝活细胞计数×稀释因子×104
2.总活细胞＝活细胞计数×稀释因子×总体积×104
iv.计算％生存力：
1.生存力％＝活细胞数×100/(活细胞数+死细胞数)
v.将细胞悬浮液稀释至1.0×106个细胞/ml：
1.“X”体积＝总活细胞/106细胞/ml
2.例如，如果总活细胞数是1.0×107；
3.“X”＝107/106细胞/ml或10ml，因此，你可以通过向你的细胞悬浮液(即5ml)中加入5ml而使你的总细胞体积达到10ml。
vi.如果细胞悬浮液小于106/ml，确定每个150mm培养皿或175cm2烧瓶接种2×106个细胞所需的体积。
1.2×106细胞的体积＝2×106细胞/ml÷活细胞/ml
2.例如，如果活细胞/ml是8×105个细胞/ml，则需要2×106个细胞÷8×105个细胞/ml或2.5ml。
vii.留出0.5ml用于MSC标记分析。
viii.将2×106个细胞接种到每个150mm培养皿或175cm2烧瓶中，所述烧瓶具有30ml PTT6。
ix.每三天观察细胞的附着、集落形成和汇合。当细胞达到40-50％汇合时，每二天观察一次细胞，以防止过度扩增。不允许细胞扩增超过80％汇合。可以使用实时细胞培养监测系统代替光学显微镜。
x.每2-3天更换培养基。
2.6冻存MSC细胞
a.在生物安全柜中工作时，执行可行的粒子操作。
b.当细胞达到70-80％汇合时，对于每个150mm培养皿或175cm2烧瓶使用2ml 1×TrypLE-EDTA使细胞脱离。
i.从培养皿中移出PTT6。
ii.用5ml HBSS或不含钙或镁的PBS洗涤。
iii.加入2ml 1×TrypLE-EDTA并旋转1-2分钟。
iv.将培养皿倾斜30-45°，以允许细胞通过重力流动而向下移动。在培养皿的侧面轻轻敲击有助于加快脱离。
v.加入10ml PTT6以灭活TrypLE。充分混合以解离细胞团块。
vi.使用巴斯德吸管将细胞转移至15ml离心管中。
vii.以1200rpm离心10分钟。
viii.吸出培养基，并用10ml PTT6重悬。
ix.将50μL等分试样与如上所述测定总活细胞数和％活力。细胞计数需要在15分钟内进行，因为细胞可能开始聚集。
c.制备用于冷冻保存的细胞
i.制备细胞悬浮培养基和冷冻保存培养基并冷冻细胞
2.7.MSC在量子生物反应器(Terumo BTC,Inc.)中的传代培养(扩增)
还可以使用量子生物反应器来扩增MSC。在量子生物反应器中扩增的起始细胞数应为每轮次20至30百万个细胞。每次操作的典型产量是收获时300百万至700百万MSC。生物反应器按照制造商的方案操作。如此获得的间充质干细胞通常是冷冻保存的(见下文)并用作工作细胞库。
材料/试剂：
1.量子扩展装置
2.量子垃圾袋
3.量子培养基袋
4.量子注口袋
5.PTT6
6.PBS7.纤连蛋白
8.TrypLE
9.3ml注射器
10.葡萄糖测试条
11.乳酸盐测试条
12.60ml细胞培养板或等同物
13.医用级5％CO2混气剂
14.50ml分液仪头(Combi-tip)
设备：
1.生物安全柜
2.血糖仪(Bayer Healthcare/Ascensia courg血糖仪)
3.Lactate Plus(Nova Biomedical)
4.带有头的蠕动泵
5.离心机，Eppendorf 5810
6.无菌管连接器
7.M4重复移液器
8.RF密封器
程序：
1.制备量子生物反应器
a)引发量子生物反应器
b)生物反应器的涂覆：
1)在生物安全柜中制备纤连蛋白溶液。
1)使冻干的纤连蛋白适应室温(≥15min，室温)
2)加入5ml无菌蒸馏水；不打旋或搅动
3)使纤连蛋白进入溶液30分钟。
4)用10ml附有18g针头的注射器将纤连蛋白溶液转移到含有95ml PBS的细胞入口袋中。
2)将袋子连接到“试剂”线上
3)检查气泡(可以通过使用“去除IC空气”或“去除EC空气”并使用“洗涤”作为入口源来去除气泡。
4)打开或设置用于涂覆生物反应器的程序(图1，步骤3-5)。
5)运行程序
6)在程序运行以涂覆生物反应器的同时，用4L PTT6培养基制备培养基袋。
7)使用无菌管连接器将所述培养基袋附接到所述IC培养基管线。
8)当生物反应器涂覆步骤完成时，使用RF密封器将用于纤连蛋白溶液的细胞入口袋分开。
c)洗去过量的纤连蛋白
d)用培养基调节生物反应器
2.在量子生物反应器中培养细胞
a)用均匀悬浮液加载和粘附细胞：
b)细胞的饲养和培养
1)选择培养基流速以供给细胞。
2)每天对乳酸盐和葡萄糖取样。
3)随着乳酸盐水平的增加调节培养基的流速。实际最大可容忍乳酸盐浓度将由细胞来源的瓶培养物来定义。确定培养基袋中是否有足够的PTT6培养基。如果必要，用新的PTT6培养基袋替换PTT6培养基袋。
4)当流速达到期望值时，每8-12小时测量乳酸盐水平。如果乳酸盐水平没有降低或者如果乳酸盐水平继续增加，收获细胞。
3.从所述量子生物反应器收获所述细胞
a)当乳酸盐浓度不降低时，在最后一次取样乳酸盐和葡萄糖后收获细胞。
b)收获细胞：
1)使用无菌管连接器将填充有100ml TrypLE的细胞入口袋附接至“试剂”线。
2)确定PBS袋中有足够的PBS。如果不是，使用无菌管连接器将具有至少1.7升PBS的新袋连接到“冲洗”线上。
3)运行收获程序
4.冷冻保存细胞
1)一旦收获细胞，将细胞转移至50ml离心管中以沉淀细胞。
2)用25ml冷细胞悬浮液重悬。使用Sysmex或Biorad细胞计数器计数细胞。将所述细胞计数报告附加到相应的量子处理批记录。
3)调节细胞浓度至2×107/ml
4)加入等体积冷冻保存液并混匀(不摇晃或涡旋)
5)使用重复移液器，向每1.8ml小瓶中加入1ml冷冻保存的细胞悬浮液。使用受控速率冷冻器的SOP D6.100 CB冷冻保存中的CRF程序的冷冻保存
6)将小瓶储存在指定的液氮储存空间中。
7)将所述CRF运行报告附加到来自相应MSC P3-量子处理批记录。
3.使用不同培养基分析从脐带组织分离的间充质脐带衬里干细胞群体中的干细 胞标志物表达
进行流式细胞术实验以分析从脐带分离的间充质干细胞标志物CD73、CD90和CD105的表达。
对于这些实验，通过在三种不同的培养基中培养脐带组织，接着在如实施例2所述的相应培养基中传代培养间充质干细胞，从脐带组织分离间充质干细胞。
在这些实验中使用以下三种培养基：a)90％(v/v/DMEM补充10％FBS(v/v)，b)在美国专利申请US 2008/0248005和相应的国际专利申请WO2007/046775中描述的由90％(v/v)CMRL1066和10％(v/v)FBS组成的培养基PTT-4(参见WO2007/046775的第[0183]段)和c)本发明PTT-6的培养基，其组成如本文所述。在该流式细胞术分析中，对所用的三种培养基中的每一种分析了脐带衬里间充质干细胞(CLMC)群体的两种不同样品。
使用下列方案进行流式细胞术分析。
材料和方法
仪表名称 公司名称 系列名称
BD FACS CANDO BD V07300367
倒置显微镜，CKX41SF Olympus 4K40846
离心机，微型旋转桌面 Biosan 010213-1201-0003
试剂列表 公司名称 CatLog编号
10×Trypsin Biowest X0930-100
10×PBS Lonza 17-517Q
DMEM Lonza 12-604F
胎牛血清 GE healthcare A11-151
抗体列表 公司名称 CatLog编号
人CD73纯化的AD2 0.1mg BD 550256
人CD90纯化的5E10 1mL BD 550402
人CD105纯化的266 0.1mg BD 555690
Alexa Fluor 647羊抗鼠IgG(H+L)号*2mg/mL* BD A21235
试剂名称 成分
1×PBS(1L) 100ml 10×PBS+900ml无菌蒸馏H2O
1×PBA(50ml) 49.5ml 1×PBS+0.5ml FBS
程序
a)从脐带衬膜分离和培养细胞
1.外植体组织样品在细胞培养板中孵育并浸没在各自的培养基中，然后如实施例2中所述将其保持在CO2培养箱中于37℃。
2.每3天更换培养基。
3.在光学显微镜下监测来自组织培养外植体的细胞生长。
4.在大约70％的汇合时，通过胰蛋白酶消化(0.0125％胰蛋白酶/0.05％EDTA)从培养皿中分离细胞，并用于流式细胞术实验。
b)实验用细胞的胰蛋白酶消化
1.从细胞培养板上除去培养基
2.用无菌1×PBS轻轻冲洗以除去痕量FBS，因为FBS将干扰胰蛋白酶的酶促作用。
3.将1×胰蛋白酶加入细胞培养板并在37℃温育3-5分钟。
4.在显微镜下观察细胞以确保它们被移出。通过加入含有FBS的完全培养基(含有10％FBS的DMEM)中和胰蛋白酶。
5.使用移液管通过对着板壁吸取培养基中的细胞来破碎细胞团块。收集细胞悬液并将其转移到50ml离心管中
6.加入无菌1×PBS至板中并将其冲洗，收集细胞悬液至同一离心管中。
7.以1800rpm离心10分钟。
8.弃去上清液，用PBA培养基重悬细胞沉淀。
c)细胞计数
1.确保血细胞计数器及其盖片清洁和干燥，优选通过用70％乙醇洗涤它们并在用Kim擦拭纸(无绒纸)擦拭它们之前让它们干燥。
2.将少量悬浮细胞等分至微离心管中，并从BSC盖子中移出。
3.用等体积的锥虫蓝对悬浮液中的细胞染色，例如，向500μl悬浮液中加入500μl锥虫蓝(稀释因子＝2×，产生0.2％锥虫蓝溶液)。
4.避免细胞暴露于锥虫蓝超过30分钟，因为锥虫蓝是有毒的并且将导致无活力细胞的增加，给出错误的细胞计数。
5.将20μl细胞悬浮液混合物加入到血细胞计数器的每个室中，并在光学显微镜下观察。
a.计数上室和下室中总共8个象限的血细胞计数器的每个象限中的活细胞(亮细胞；非活细胞容易摄取锥虫蓝，因此是暗的)的数目。
总细胞计数以(细胞平均数/象限)×104细胞/ml给出。
d)染色细胞
i.细胞染色前的准备
·将细胞悬浮液等分成一式两份的3管(CD73、CD90、CD105)和2管(阴性对照)，每个管含有50,000个细胞。
ii.用一抗(Ab)染色
·将1μl[0.5mg/ml Ab]的一抗加到100μl细胞悬浮液中。在4℃下孵育45分钟。
·用PBA补足1ml。
·4℃下8000rpm离心5分钟。
·除去上清液。
·加入1ml PBA并重悬沉淀
·4℃下8000rpm离心5分钟。
·除去上清液。
·在100ul PBA中重新悬浮。
iii.在黑暗中-用第二Ab染色
·将1μl[0.5mg/ml Ab]的第二抗体加入100μl细胞悬浮液中。在4℃下孵育30分钟。
·用PBA补足1ml。
·4℃下8000rpm离心5分钟。
·除去上清液。
·加入1ml PBA并重悬沉淀
·4℃下8000rpm离心5分钟。
·除去上清液
·用于流式细胞术分析的200-300ul PBA中的再悬浮
·将细胞转移至FACS管中以在BD FACS CANDO流式细胞术中读取。
流式细胞术分析的结果示于图6a至图6c中。图6a显示了从脐带组织分离并在DMEM/10％FBS中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬里干细胞的百分比，图6b显示了从脐带组织分离并在PTT-4中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬里干细胞的百分比，图6c显示了从脐带组织分离并在PTT-6中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105的分离的间充质脐带衬里干细胞的百分比。从图6a可以看出，使用DMEM/10％FBS作为培养基培养分离的群体具有约75％的CD73+细胞、78％的CD90+细胞和80％的CD105+细胞(两个实验的平均值)，而在使用PTT-4培养基分离/培养脐带组织后(参见图6b)，CD73阳性、CD90阳性和CD105阳性的间充质干细胞的数目(两个实验的平均值)为约87％(CD73+细胞)、93％/CD90+细胞)和86％(CD105+细胞)。通过在本发明的PTT-6培养基中培养获得的间充质干细胞群体的纯度就所有三种标志物(CD73、CD90、CD105)而言为至少99.0％，这意味着该细胞群体的纯度显著高于使用PTT-4培养基或DMEM/10％FBS培养的纯度。此外，甚至更重要的是，通过在PTT-6中培养获得的间充质干细胞群体基本上是100％纯的和确定的干细胞群体。这使得本发明的干细胞群体成为基于干细胞的疗法的理想候选物。因此，这种间充质脐带衬里干细胞群体可以成为此类基于干细胞的治疗方法的黄金标准。
图6中所示的发现进一步由图7a和图7b中所示的流式细胞术分析的结果证实。图7a显示了分离自脐带组织并在PTT-6培养基中培养后，表达干细胞标志物CD73、CD90和CD105并缺乏CD34、CD45和HLA-DR表达的分离的间充质脐带衬里干细胞(脐带羊膜的间充质干细胞)的百分比。如图7a所示，间充质干细胞群体包含97.5％的活细胞，其中100％表达CD73、CD90和CD105中的每一种(参见“CD73+CD90+”和“CD73+CD105+”行)，而99.2％的干细胞群体不表达CD45，100％的干细胞群体不表达CD34和HLA-DR(参见“CD34-CD45-”和“CD34-HLA-DR-”行)。因此，通过在PTT-6培养基中培养获得的间充质干细胞群体基本上是100％纯的和确定的干细胞群体，其满足了间充质干细胞群体将满足用于细胞疗法的标准(95％或更多的干细胞群体表达CD73、CD90和CD105，而98％或更多的干细胞群体不表达CD34、CD45和HLA-DR，参见Sensebe等人的“Production of mesenchymal stromal/stem cellsaccording to good manufacturing practices:a review”，同上)。这里注意到，本发明的羊膜间充质干细胞在标准培养条件下粘附于塑料，并在体外分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞，参见美国专利9,085,755、美国专利8,287,854或WO2007/046775，因此符合细胞疗法中使用间充质干细胞通常接受的标准。
图7b显示了表达CD73、CD90和CD105且不表达CD34、CD45和HLA-DR的分离的骨髓间充质干细胞的百分比。如图7b所示，骨髓间充质干细胞群体包含94.3％的活细胞，其中100％表达CD73、CD90和CD105中的每一种(参见“CD73+CD90+”和“CD73+CD105+”行)，而仅62.8％的骨髓干细胞群体不表达CD45，99.9％的干细胞群体不表达CD34和HLA-DR(参见“CD34-CD45-”和“CD34-HLA-DR-”行)。因此，就干细胞标志物而言，被认为是间充质干细胞的黄金标准的骨髓间充质干细胞远不如本申请的(脐带羊膜的)间充质干细胞群体均一/纯。这个发现还表明本发明的干细胞群体可以是基于干细胞的疗法的理想候选者，并且可以成为基于干细胞的治疗方法的黄金标准。
4.显示本发明的间充质干细胞群体可以在HypoThermosolTM中运输/储存的实验：
为了分析本文所述的间充质干细胞在不同储存或运输载体中的健康和生存力，将两种不同的载体彼此进行比较。即，将载体HypoThermosolTM-FRS与载体PlasmaLyte-A进行比较。HypoThermosolTM-FRS的产品表在图30中示出，并且其组成在本文别处描述。每100mLPlasmaLyte包含526mg氯化钠USP(NaCl)；502mg葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)；368mg三水合乙酸钠USP(C2H3 NaO2.3H2O)；37mg氯化钾USP(KCl)；和30mg氯化镁USP(MgCl2·6H2O)。PlasmaLyte不含有抗微生物剂。用氢氧化钠将PlasmaLyte的pH调节到7.4(6.5到8.0)。
用于比较的实验设置显示于图8中，首先，在细胞培养瓶中长出如本文所述的间充质干细胞群体。计数活的间充质干细胞的数目，然后将2百万个细胞/小瓶在PlasmaLyte-A或HyphotomolTM-FRS中储存不同的时间段。在储存后，每天在≤50μl的样品中计数细胞，持续第1-5天(总液体抽取250μl)，并通过用锥虫蓝染色细胞来检查生存力。此外，在第1、3和5天，取≤80μl的样品并分析。另外，获得上清液并冷冻。然后通过FLEXMAP 3D系统测定PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF、IL-10、Ang-1、HGF和TGFβ1。
图9总结了生存力数据。从左侧曲线图可以看出，在HypoThermosolTM中储存7天后，开始储存的全部细胞(约95％)中的73％仍然是活的。相反，在PlasmaLyte-A中储存7天后，开始储存的细胞总数(约94％)中仅有42％仍存活。基于重复读数的所有计数在彼此的10％内(按照SOP CR D2.600.)。在计数期间，保存在HypoThermosolTM中的细胞明显更小，具有平滑和确定的边缘。相反，Plasmalyte-A中的细胞出现了一定的大小范围。HypoThermosolTM显著地支持膜完整性，并且可能存活超过一周时间间隔(6天)。类似的结果也显示在右侧的图中。
图10显示了当测量细胞的细胞直径时获得的结果。当与保持在PlasmaLyteA中的细胞相比时，当保持在HypoThermosolTM中时，如本文所述的间充质干细胞群体在直径范围上更窄。在储存3天后进行比较。
图11显示了来自储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时后的本文描述的间充质干细胞群体的上清液的TGFβ1的浓度。如从右侧的图中可以看出，当储存在HypoThermosolTM中时和当储存在PlasmaLyte-A中时，细胞分泌大约同样多的TGFβ1。通常，随着时间的推移，分泌的TGFβ1的量减少(右侧的图)。
图12和13显示了对照实验。在此，在来自储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的如本文所述的间充质干细胞群体的上清液中测量的PDGF-BB和IL-10浓度。由于PDGF-BB或IL-10通常不是由本文所述的间充质干细胞群体分泌的，因此在任何样品中都没有检测到PDGF-BB或IL-10。
图14显示了来自储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的本文所述的间充质干细胞群体的上清液中的VEGF浓度。从右侧的图中可以看出，当在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第0天分泌大约同样多的VEGF。当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第1天和第5天分泌更多的VEGF。值得注意的是，在HypoThermosolTM中储存3天时，细胞比在PlasmaLyte-A中储存时分泌更多的VEGF。因此，在储存第3天后，HypoThermosolTM的性能优于PlasmaLyte-A。检测到的VEGF越多，培养物越健康。因此，通过在HypoThermosolTM中储存3天后比在PlasmaLyte-A中储存分泌更多的VEGF，细胞在HypoThermosolTM中比在PlasmaLyte-A中更健康。从储存5天起PlasmaLyte似乎变成更有利的载体，因为在时间点5天，储存在PlasmaLyte-A中的细胞分泌更多的VEGF。通常，分泌的VEGF的量随时间减少(右侧的图)。
图15显示了来自储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的本文所述的间充质干细胞群体的上清液中PDGF-AA的浓度。从右侧的图中可以看出，在第0天，当在HypoThermosolTM中储存时，细胞分泌的PDGF-AA大约与在PlasmaLyte-A中储存时分泌的PDGF-AA一样多。当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第1天和第5天分泌更多的PDGF-AA。值得注意的是，当细胞储存3天时，储存在HypoThermosolTM中的细胞比储存在PlasmaLyte-A中时分泌更多的PDGF-AA。因此，储存在HypoThermosolTM中的细胞在储存3天后比储存在PlasmaLyte-A中的细胞更健康。从储存5天起，PlasmaLyte似乎变成更有利的载体，因为在时间点5天时，储存在PlasmaLyte-A中的细胞分泌更多PDGF-AA。通常，分泌的PDGF-AA的量随时间降低(右侧的图)。
图16显示了来自储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中48小时的本文所述的间充质干细胞群体的上清液中的Ang-1浓度。从右侧的图中可以看出，当在第0天和第3天储存在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中时，细胞分泌大约同样多的Ang-1。当储存在PlasmaLyte-A中时，第5天细胞分泌更多的Ang-1。值得注意的是，储存1天时，当储存在HypoThermosolTM中时，细胞分泌的Ang-1比储存在PlasmaLyte-A中时多得多。因此，在HypoThermosolTM中储存至少48小时直到储存3天的细胞似乎比在PlasmaLyte-A中储存更健康。从储存5天起，PlasmaLyte似乎成为更有利的载体，因为在这个时间点，储存在PlasmaLyte-A中的细胞分泌更多的Ang-1。通常，随着时间的推移，分泌的Ang-1的量减少(右侧的图)。
图17显示了来自在HypoThermosolTM或PlasmaLyte-A中储存48小时后的如本文所述的间充质干细胞群体的上清液的HGF浓度。从右侧的图中可以看出，在第0天，细胞在HypoThermosolTM中储存时与在PlasmaLyte-A中储存时分泌大约同样多的HGF。当在PlasmaLyte-A中储存时，细胞在第3天和第5天分泌更多HGF。值得注意的是，当储存1天时，储存在HypoThermosolTM中的细胞比储存在PlasmaLyte-A中的细胞分泌更多的HGF。因此，在至少1天(48小时)到3天的储存期间，储存在HypoThermosolTM中的细胞似乎比储存在PlasmaLyte-A中的细胞更健康。从第3天开始，PlasmaLyte-A似乎成为更有利的载体，因为在时间点3和5天，在PlasmaLyte-A中储存的细胞分泌更多HGF。通常，分泌的HGF的量随时间降低(右侧的图)。
从上述数据可以总结，本发明的间充质干细胞群体在HypoThermosolTM中的储存优于在PlasmaLyte-A中的储存，特别是在储存的前3天。
5.实验显示本发明的间充质干细胞群体通过猪的局部治疗具有伤口愈合特性：
临床前研究也已经使用10周龄的雌性Yorkshire-Landrace猪(50kg)进行。在新加坡的SingHealth实验医学中心进行处理。用120mg/kg链脲霉素使猪患上糖尿病，并在其背部产生六个5cm×5cm全厚度伤口之前使猪恢复45天(见图18)。用105个如本文所述的人间充质干细胞群体/cm2每周两次治疗猪(n＝2)4周。用PBS处理两个对照猪。在术后第0天(PODay 0)和每七天对伤口拍照，直到术后第35天，通过ImageJ分析伤口的表面积大小。到第35天，如本文所述加入间充质干细胞群体导致12个糖尿病伤口中的10个(83％)闭合，相比之下PBS处理的对照伤口中的12个伤口中仅有3个(25％)闭合。与对照动物中的0.6cm2/天相比，使用如本文所述的间充质干细胞群体的伤口愈合速率为0.8cm2/天，改善了33％。该研究的结果总结在图18中。
猪模型虽然不是自发的，但是皮肤结构最接近地类似于人。数据表明本发明的脐带衬里间充质干细胞群体将改善伤口愈合，而没有严重不良副作用的风险。因此，这些数据强烈地支持了本文所述的人脐带衬里间充质干细胞群体可通过抑制炎症和促进血管生成来促进慢性伤口愈合的假设。此外，在小鼠或猪中使用异种间充质干细胞显然没有炎症的迹象，因此同种异种间充质干细胞在人类中具有任何严重副作用的可能性非常低。
6.实验显示如本文所述的间充质干细胞在人的局部治疗中是有效的：
WO 2007/046775中描述了显示本文所述间充质干细胞在人的局部治疗中有效的实验。特别地，如WO 2007/046775实施例23-26中所解释的，脐带羊膜(UCMC)间充质干细胞可减轻全层烧伤(实施例23)、部分厚度伤口(实施例24)、不愈合辐射伤口(实施例25)以及不愈合糖尿病伤口和不愈合糖尿病足伤口(实施例26)。值得注意的是，根据WO 2007/046775的实施例2，间充质干细胞重悬于PTT-4培养基中。
值得注意的是，如图6b和6c所示，当使用PTT6(如本文所用)培养基时通过培养获得的干细胞群比通过使用PTT4培养基(WO 2007/046775中所用)获得的细胞群体明显更同质。由于在WO 2007/046775的实施例23-26中使用PTT-4作为间充质干细胞的培养基，很明显在PTT-6中培养后分离的更均质的间充质干细胞群体(如本文所用)在伤口愈合应用中具有相同的有益效果，所述伤口愈合应用例如全层烧伤、部分厚度伤口、不愈合性辐射伤口以及不愈合性糖尿病伤口和不愈合性糖尿病足伤口。
7.实验显示如本文所述的间充质干细胞在人的局部治疗中是有效的：
这是在科罗拉多大学科罗拉多医学学院进行的按本文所述获得的剂量递增的间充质干细胞群体的有计划的研究。本研究的目的是确定如本文所述的间充质干细胞群体(人脐带衬里间充质干细胞)的安全剂量。这是一个单中心、剂量递增研究，其中三个剂量水平中的每一个将登记五名受试者，总共十五名受试者。第一组5名患者每周两次接受100,000MSC/cm2(皮肤/伤口面积)，持续8周。第二组5名患者每周两次接受300,000MSC/cm2，共8周。第三组5名患者每周两次接受500,000MSC/cm2，共8周。该方案将持续到达到最高剂量，或直到至少2名处于某剂量水平的受试者患有≥2级过敏反应，其怀疑与如本文所获得的间充质干细胞群体相关，或2名或更多名处于某剂量水平的受试者在如本文所述获得的间充质干细胞群体的初始剂量后14天内经历出乎意料的、治疗相关的严重不良事件或剂量限制性毒性。所有患者在治疗后30天评价抗HLA抗体的产生和伤口闭合。目前，我们没有考虑HLA抗体的产生是特定剂量的绝对禁忌症，但是它将成为我们的安全性总体评估的因素。这是开放标签研究，其中所有受试者将服用研究药物，并且所有研究人员将知道每个受试者接受的剂量。该研究的第二个终点是伤口状况的显著改善。该终点将基于伤口闭合率、成功闭合的伤口面积的百分比和完全闭合的伤口的百分比，如使用剪影伤口测量和记录系统所测量的。该装置被FDA批准用于该目的。
受试者群体。患有I型或II型糖尿病并伴有慢性足溃疡的患者，其在至少30天的常规治疗后未治愈，并且对于针对如本文所述的间充质干细胞群体的HLA抗体是阴性的。患者将从入选时开始在前2周继续常规伤口治疗，此时他们将已经被筛查出患有在30天内未治愈的糖尿病性足溃疡。伤口参数的光记录和测量将在此时开始。在前2周内，将每周进行两次常规敷料更换，之后将如本文所述的间充质干细胞群以指定浓度每周两次施用于伤口。如本文所述的间充质干细胞群体-处理的伤口也将用和绉布敷料覆盖。
剂量水平。本研究的目的是确定如本文所述的人脐带衬里间充质干细胞的安全剂量以用于进一步研究。患者将用三种剂量之一治疗：100,000个细胞/cm2皮肤/伤口面积、300,000个细胞/cm2或500,000个细胞/cm2，每周两次，持续8周。每100,000个细胞剂量代表0.1ml来自含有1百万细胞/ml HypoThermosol的小瓶的本文所述间充质干细胞群体。
给药方案。这是如本文所述的间充质干细胞的剂量递增的安全性和耐受性研究。本研究的目的是确定如本文所述的人脐带衬里间充质干细胞的安全剂量以用于进一步研究。三个剂量水平中的每一个将登记五名受试者。第一组5名患者每周两次接受100,000MSC/cm2皮肤/伤口面积，持续8周。第二组5名患者每周两次接受300,000MSC/cm2，共8周。第三组5名患者每周两次接受500,000MSC/cm2，共8周。该方案将持续到达到最高剂量，或直到至少2名处于某剂量水平的受试者患有疑似与本文所述间充质干细胞相关的2级过敏反应，或2名或更多名处于某剂量水平的受试者在本文所述间充质干细胞群体的初始剂量后30天内经历出乎意料的、治疗相关的严重不良事件或剂量限制性毒性。所有患者在治疗后30天评价抗HLA抗体的产生和伤口闭合程度。目前，我们没有考虑HLA抗体的产生是特定剂量的绝对禁忌症，但是它将成为我们的安全性总体评估的因素。这是开放标签研究，其中所有受试者将服用研究药物，并且所有研究人员将知道每个受试者接受的剂量。
给药途径。如本文所述的间充质干细胞群体局部应用于清创的糖尿病足溃疡并通过绷带保持在适当位置。
给药程序。在适当的清创术之后，如果需要，患者以俯卧位放置，并且患腿以90°角弯曲。将本文所述的间充质干细胞群体的这个小瓶轻轻地旋动以确保细胞的均匀分布。然后，通过使用无菌注射器从小瓶中每cm2取出100,000(0.1ml)至500,000(0.5ml)个细胞并将其放置在伤口中心来治疗抬高的脚。然后用膜密封伤口，轻轻按摩使细胞均匀分布。保持脚升高五分钟以允许细胞沉降和附着。然后用绉纱绷带覆盖足部以覆盖敷料。
8.间充质干细胞储存或运输制剂(包括干细胞群体，其中超过99％的细胞表达 CD73、CD90和CD105中的每一种并且缺乏表达CD34和HLA-DR)的制备。
第四次细胞传代后的处理准备(阶段4处理)：
阶段4处理通常在环境监控(EM)的洁净室中进行。需要的溶液和器具应该预先制备以供使用。
将细胞从冷冻管转移至标记的50ml离心管中。
在从冰箱移出的5分钟内(从冰箱移出PTT6培养基的记录时间)使用完全PTT6培养基。缓慢地将9ml完全PTT6培养基加入细胞，同时温和地涡旋以促进混合。
在室温(15-25℃)下以1200rpm离心5分钟以沉淀细胞。在Form Centrifuge定期预防性维护-CR中记录离心机使用情况，并按照SOP离心机预防性维护验证性能。
除去上清液并将细胞再悬浮在足够的完全PTT6培养基中以计数。
计数：
为了测定细胞浓度(有或没有锥虫蓝)，在TC20上进行细胞计数。在大多数情况下，不需要稀释样品，因为TC20适应宽范围的细胞浓度(5×104至1×107细胞/ml)。
为了确定生存力，按照相同SOP在血细胞计数器上计数。确保总共计数至少200个细胞。
如果通过血细胞计数器期望生存力和细胞浓度两者，则可能必须稀释悬浮液以适应血细胞计数器范围(每平方外20-100个细胞)。如果估计10百万个解冻细胞被再悬浮，6ml的体积应产生该范围。
治疗性培养(P4)：
将300,000个活细胞接种于30ml完全PTT6培养基中每175cm2烧瓶中，并在35-39℃下与4-6％CO2一起温育。确保培养箱预防性维护是最新的，按照SOP培养箱预防性维护和一般使用。用P1-P4 MSC处理标签标记烧瓶。
一旦大多数细胞变得粘附(优选过夜)，在位于洁净室中的倒置Nikon显微镜下对岗哨(Sentinel)烧瓶进行粗略检查，以确定烧瓶的区域是否含有明显更大密度的细胞。如果是，则使用该区域由CytoSmart进行连续监视。如果接种多个烧瓶，则可以使用单个烧瓶作为代表性的“岗哨”烧瓶。作为选择，对于“岗哨”烧瓶，CytoSmart将电子邮件警告通知设置为60％、70％和80％汇合。
每2-3天用每瓶30ml完全PTT6预热的新鲜培养基更换培养基，并继续温育。
当细胞生长达到80％±10％汇合时，如下收获MSC：
用10ml无Ca2+或Mg2+的HBSS冲洗每个烧瓶。
每个烧瓶中加入5ml 1×TrypLE。倾斜烧瓶以覆盖整个表面，并立即通过倾斜烧瓶并用无菌血清学移液管除去大部分TrypLE来吸出TrypLE，仅留下足够的TrypLE来覆盖表面。丢弃吸入的TrypLE。
使细胞分离(15-25℃下10-20分钟)。将烧瓶倾斜30-45°允许细胞由于重力流动而向下移动。在烧瓶侧面轻轻敲打可加快脱离。在倒置显微镜下监测烧瓶以确保所有细胞已经分离。
将5ml无Ca2+或Mg2+的HBSS加入第一个烧瓶中。轻轻地上下吸取，然后将细胞悬浮液转移至下一个烧瓶。重复直至从所有烧瓶中收获细胞并转移至50ml标记有处理标签的离心管中。
用新鲜的5ml无Ca2+或Mg2+的HBSS重复，并与悬浮液合并。
在显微镜下确认所有细胞被取出，并且如果需要，重复第三次以收获所有烧瓶中的细胞。
将合并的细胞悬液在1200rpm下在15-25℃离心5分钟，记录离心使用的形式，离心周期性预防性维护-CR和验证性能。
制备收获的细胞悬浮液：
在不干扰沉淀的情况下除去上清液，并用合适大小的血清学移液管将细胞重悬于每个收获的烧瓶的1.0ml完全PTT6培养基中。培养基不需要预热。
将细胞重悬于完全PPT6培养基中，于1200rpm室温离心5分钟。
在不干扰沉淀的情况下除去全部PTT6上清液，并在合适大小的血清移液管中，在每个收获的烧瓶中，将沉淀轻轻地再悬浮在1.0ml“Plasmalyte中的1％HSA”中。这是收获的细胞悬浮液。从这一点开始，将收获的细胞悬浮液保持在冷却块中。
计数收获的细胞悬浮液：
在每次从收获的细胞悬浮液中取样以计数之前，确保细胞充分混合。
为了测定细胞浓度(有或没有锥虫蓝)，按照SOP细胞计数和生存力测定在TC20上计数。在大多数情况下，不需要稀释样品，因为TC20适应宽范围的细胞浓度(5×104至1×107细胞/ml)。
为了确定生存力，按照相同SOP在血细胞计数器上计数。确保总共计数至少200个细胞。
制备小瓶负载悬浮液(在冷却块中在50ml锥形杯中保持冷却)：
基于先前对收获的细胞悬浮液的计数，确定收获的细胞悬浮液的体积和制备所需患者剂量所需的“HypoThermosol中的1％HSA”。用适当的标签贴锥形管。将锥形的包含小瓶的负载悬浮液保持在其自身的预冷却的冷却块中。
将HypoThermosol和制备的“HypoThermosol中的1％HSA”在冷藏温度范围(2-8℃)下储存和使用，因此将小瓶负载悬浮液保持在冷却块中。
记录用于制备该最终悬浮液的各组分(HSA、Plasmalyte-A和HypoThermosol-FRS)的体积。基于该体积，还记录了将存在于每个AT封闭小瓶中的HSA、Plasmalyte和HypoThermosol的体积。
计数小瓶负载悬浮液：
在从小瓶负载悬浮液中进行计数的每次取样之前，确保细胞充分混合。
为了测定细胞浓度(有或没有锥虫蓝)，按照SOP细胞计数和生存力测定在TC20上计数。
为了确定生存力，按照相同SOP在血细胞计数器上计数。确保总共计数至少200个细胞。生存力可以在VLS上仅执行一次。
如下装载AT封闭的小瓶：
从冰箱中取出先前放置的注射器+针头，并放入生物安全柜(BSC)中。
从冰箱中取出先前放置在CoolRackSV10/XT冷却芯组合件中的AT封闭的小瓶，并将所述装置放置在BSC室中。启动计时器以确保在30分钟内完成装载。
用酒精棉签擦拭注射口。
在装载小瓶之前，将无菌22G针插入塞子中靠近中心处，以使小瓶通气(这是为了避免在填充期间对小瓶加压)。
旋转小瓶负载悬浮液以混合，然后将其缓慢吸入注射器中而不引入气泡。用注射器刺穿塞子的中心，并将1.0ml注射到每个AT封闭的小瓶中(从注射器上的弯液面到弯液面读数)，小心不引入气泡。
取下装载注射器，然后取下压力排出针。
用伴随的帽覆盖小瓶端口，并将其牢固地压在四周。回到CoolRackSV10，在2-8℃储存，运到目的地。
收集样品用于P4后细胞因子评估(细胞因子测定每批号至少进行一次，即相同的CBU#和供体组织批号)：
基于来自上面的小瓶负载悬浮液浓度，将足够体积的小瓶负载悬浮液分配到6孔板的至少一个孔中，使得每孔分配100,000个总(活+死)细胞。将小瓶负载悬浮液直接加入已经加入到每个孔中的足够的完全PTT6培养基中，使得每个孔中的总体积为2ml。标记温育起始时间。
温育48小时±1小时。在温育结束时：
取随机放置在每个孔的近似中心的单个代表性CytoSmart图像。
测量每个孔中的乳酸盐并报告乳酸盐测试结果。
从每个孔中收集培养基，并在室温下以1200rpm离心5分钟。记录离心机在形成离心机上的使用周期性的预防性维护-CR和验证性能。
将培养基上清液分配到冷冻管中，并在收集1小时内冷冻。在批记录上标记存储位置。
9.MSC在储存/运输期间增殖和代谢的稳定性研究
将来自早期传代的脐带组织和细胞储存在-195℃并测试稳定性。
已经用最终产物进行了本文所述的间充质脐带衬里干细胞(MSC)的原始稳定性测试，所述MSC具有相对于阳性和阴性标志物(在这方面参见图7)大于99％的纯度，所述最终产物由单独在中的活MSC组成。在实际的生产操作中发现，由于间充质干细胞的固有性质和/>的粘度，发生间充质干细胞的粘附。
为了减轻由于在分配时将MSC单独放入在第4阶段处理的各个步骤中，MSC与塑料的粘附而导致的细胞损失，并最大限度地从分配时使用的小瓶中回收药物产品，发现了两种药学上无活性的成分—Plasmalyte和人血清白蛋白(HSA)，当添加时，可优化最终药物产品的质量。
进行了新的稳定性研究以支持这两种药学上无活性的成分的加入不会不利地影响最终药物产品的稳定性。结果示于图33中。
生存力分析
将间充质干细胞以106个细胞/小瓶接种到AT封闭的小瓶中，每小瓶含1mLPlasmalyte/HSA/在不同的时间点对各个小瓶取样，用锥虫蓝(血细胞计数器)人工评估生存力，并通过自动化系统(TC20)记录总细胞数。
MSC在2-8℃下储存1-3天以模拟产品在施用到伤口上之前的运输和储存。如图33a所示，在这些条件下，细胞在长达3天内没有表现出明显的生存力损失。
外观分析
从AT封闭的小瓶中取出MSC并在37℃下培养24小时后拍照如下，在冷藏中获得的细胞最多2天能够粘附到组织培养板上并形成典型的纺锤体结构。在2-8℃下储存2.5天后，细胞呈现越来越多的球形，提示有垂死细胞。结果示于图33b中。
增殖和代谢的分析
测定了图33a所示相同培养物的MSC的乳酸盐产量，作为代谢和生长的量度，在37℃培养48小时后，在2-8℃下储存24小时的细胞的代谢和生长与储存0小时的细胞相当，储存36小时的细胞表现出对照乳酸盐产量的86％。在2-8℃下72小时后，当随后培养时，细胞仅表现出46％的代谢。结果如图33c所示。
在第0、1、1.5、2、2.5和3天，基于确定的3天细胞生存力阈值，进一步测试各个小瓶。从密封小瓶中取出细胞后立即进行锥虫蓝生存力，并且在2.5天内没有明显的生存力损失(范围92-98％)。还将细胞以105个细胞/cm2铺板于标准PTT6培养基中，24和48小时后测量乳酸盐产量。乳酸盐是葡萄糖代谢的产物，我们已经证实其与MSC细胞生长的速率成正比。图33d显示了通过MSC的乳酸盐产生，所述MSC在Plasmalyte/HSA/中储存0、1、1.5、2、2.5或3天，然后在培养中24小时和48小时后测量。在Plasmalyte/HSA/中储存24小时(第1天)的MSC在24小时和48小时的乳酸盐产生与没有储存的MSC(第0天)相同。到第3天，乳酸盐产量下降40-45％。
细胞因子产生的分析
在37℃24小时，测量相同培养物的细胞因子产生，与代谢数据对比，MSC产生Ang1、TGFβ、VEGF和HGF的能力在细胞在2-8℃下储存24小时的对照(第0天)的10-20％内。图33e中所示的结果表明，当细胞在Plasmalyte/HSA/中于2-8℃保存24小时时，MSC产生VEGF、血管生成素-1、TGF-β和HGF的能力得到了保持。然而，当储存＞2天时，MSC产生VEGF和血管生成素-1的能力降低约50％。HGF的结果同样保持24小时，但当储存＞2天时，其下降＞70％。TGF-β的结果显示，当在Plasmalyte/HSA//>中于2至8℃储存＞2天时，MSC产生TGF-β的能力保持约75％。
另一种在Plasmalyte/HSA/中储存0、1、1.5、2、2.5或3天的MSC上产生细胞因子的分析证实了通过第一次细胞因子分析产生获得的结果(图33e)。结果显示，当细胞在Plasmalyte/HSA//>中于2-8℃储存24小时时，MSC产生VEGF、血管生成素-1和TGF-β的能力得到保持。此外，当储存＞2天时，VEGF和血管生成素-1的分泌水平降低约50％，其中TGF-β的分泌水平降低约25％。
总之，基于在这些研究期间由细胞所证明的生存力、外观、代谢和细胞因子产生，可以设定从产品瓶封闭物开始72小时的期满。因此，由于原则上可以在72小时内通过航空旅行到达(发达)世界中的任何地方，本发明的储存和运输制剂基本上允许将活的MSC从MSC生产设备运输到世界上基本上任何地方，其中MSC被施用于受试者。。因此，本发明的储存和/或运输制剂显著降低了GMP生产的复杂性和药学上合适的间充质干细胞/干细胞群体的供应链，从而使得基于间充质干细胞的疗法对于更大的公众而言易于获得。
本发明的特征还在于以下项目：
1.一种制备间充质干细胞储存或运输制剂的方法，其中所述制剂包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞，所述方法包括
a)将间充质干细胞悬浮在预定体积的晶体溶液中，其中所述晶体溶液包含约0.5％至约5％(w/v)的血清白蛋白，从而获得第一细胞悬液，
b)确定所述第一细胞悬液中的所述间充质干细胞的浓度，以及确定制备包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的制剂所需的所述第一细胞悬液的体积，
c)将确定体积的第一细胞悬液与一定体积的液体载体混合，其中所述液体载体包含约0.5％至约5％(w/v)的血清白蛋白以及
i)Trolox；
ii)Na+；
iii)K+；
iv)Ca2+；
v)Mg2+；
vi)Cl-；
vii)H2PO4 -；
viii)HEPES；
ix)乳糖醛酸盐；
x)蔗糖；
xi)甘露醇；
xii)葡萄糖；
xiii)葡聚糖-40；
xiv)腺苷，和
xv)谷胱甘肽，
从而获得包含约0.5百万至约10百万个间充质干细胞的间充质干细胞储存或运输制剂。
2.根据项目1所述的方法，其中，用于悬浮所述间充质干细胞的所述晶体溶液的预定体积为约1ml至约10ml。
3.根据项目1或2所述的方法，其中，在将所述确定体积的所述第一细胞悬液与所述一定体积的所述液体载体混合之后，所述间充质干细胞储存或运输制剂的总体积为约1ml。
4.根据项目2所述的方法，其中所述制剂包含约0.5百万至约10百万个活的间充质干细胞。
5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中所述制剂包含约1百万、约3百万或约5百万个间充质干细胞。
6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中关于间充质干细胞的数目的“约”意指±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％。
7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，在将所述间充质干细胞重新悬浮在所述预定体积的晶体溶液中之前，已经从细胞培养容器中收获所述间充质干细胞。
8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述晶体溶液和所述液体载体都包含相同浓度的血清白蛋白。
9.根据项目8所述的方法，其中所述晶体溶液和所述液体载体都包含约0.5％至约5％(w/v)的血清白蛋白。
10.根据项目8或9所述的方法，其中，所述晶体溶液和所述液体载体都包含约1％至约5％(w/v)的血清白蛋白。
11.根据项目8至10中任一项所述的方法，其中，所述晶体溶液和所述液体载体都包含约1％至约3％(w/v)的血清白蛋白。
12.根据项目8至11中任一项所述的方法，其中，所述晶体溶液和所述液体载体都包含约1％(w/v)的血清白蛋白。
13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述晶体溶液包括钠、钾、镁和氯化物。
15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述晶体溶液是PlasmaLyte或Ringer’s乳酸盐。
16.根据项目15所述的方法，其中所述间充质干细胞储存或运输制剂包含不超过20％的PlasmaLyte。
17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞是选自以下的间充质肝细胞：脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带-胎盘连接处的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪组织来源的间充质干细胞。
18.根据项目17所述的方法，其中脐带间充质干细胞选自羊膜间充质干细胞、血管周围间充质干细胞、Wharton’s胶质间充质干细胞、脐带羊膜间充质干细胞。
19.根据项目17或18所述的方法，其中脐带羊膜间充质干细胞是间充质干细胞群体，其中间充质干细胞群体的至少约90％或更多细胞表达下列标志物中的每一种：CD73、CD90和CD105。
20.根据项目19所述的方法，其中所述间充质干细胞群体的至少约90％或更多细胞缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA DR。
21.根据项目19或20所述的方法，其中所述间充质干细胞群体的至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，并且不表达CD34、CD45和HLA-DR(人白细胞抗原-抗原D相关的)中的每一种。
22.一种间充质干细胞储存或运输制剂，其通过如项目1至21中任一项所定义的方法获得。
23.一种间充质干细胞储存或运输制剂，其可通过如项目1至21中任一项所定义的方法获得。
24.一种运输间充质干细胞的方法，所述方法包括在如项目22或23中所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中运输所述间充质干细胞。
25.根据项目24所述的方法，其中所述运输进行约7天或更短。
26.根据项目24或25所述的方法，其中所述运输进行约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约1天或少于约1天。
27.根据项目24至26中任一项所述的方法，其中所述运输进行约48小时或约24小时或更短。
28.根据项目24至27中任一项所述的方法，其中在约-5℃至约15℃的温度下进行运输。
29.根据项目24至28中任一项所述的方法，其中在约2℃至约8℃的温度下进行运输。
30.根据项目24至29中任一项所述的方法，其中在高于约-5℃、高于约-10℃、高于约-15℃或高于约-20℃的温度下进行所述运输。
31.一种治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括局部施用间充质干细胞，所述间充质干细胞已经在如项目22或23中所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中储存或运输。
32.根据项目31所述的方法，其中在将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离之后，将所述间充质干细胞施用于所述受试者。
33.根据项目32所述的方法，其中将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离包括离心。
34.根据项目32和33所述的方法，将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离包括借助于注射器从小瓶中抽出细胞群体。
35.根据项目31至34中任一项所述的方法，包括通过注射器施用所述间充质干细胞。
36.根据项目31至35中任一项所述的方法，其中，所述间充质干细胞以约3百万个细胞、约5百万个细胞或约10百万个细胞的剂量应用。
37.根据项目31至36中任一项所述的方法，其中从间充质干细胞群体已被收获的时间点起在约72小时、约48小时、约24小时、约12小时、约6小时或更短时间内施用所述间充质干细胞群体。
38.根据项目37所述的方法，其中从间充质干细胞已经被收获的时间点起在约72小时、约48小时、约24小时、约12小时、约6小时或更短时间内施用所述间充质干细胞。
39.根据项目31至38中任一项所述的方法，其中所述疾病是皮肤疾病或伤口。
40.根据项目39所述的方法，其中所述伤口由烧伤、咬伤、创伤、手术或疾病引起。
41.根据项目40所述的方法，其中所述伤口由糖尿病引起，其中所述伤口优选地是糖尿病伤口。
42.根据项目41所述的方法，其中所述伤口是糖尿病足溃疡。
43.根据项目31至42中任一项所述的方法，其中以约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次。
44.根据项目43所述的方法，其中以约10百万个细胞、约5百万个细胞、约4百万个细胞、约3百万个细胞、约2百万个细胞、约1百万个细胞、约0.5百万个细胞、约0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次，持续三周、四周、或五周或六周、或七周、或八周或十周或更多周的时间段。
45.根据项目31至44中任一项所述的方法，其中将所述间充质干细胞局部施用并被膜或绷带覆盖。
46.根据项目31至45中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞以约1000个细胞/cm2至约5百万个细胞/cm2的剂量施用。
47.根据项目31至46中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞以约100,000个细胞/cm2、约300,000个细胞/cm2或约500,000个细胞/cm2的剂量施用。
48.根据项目31至47中任一项所述的方法，其中，每周一次、两次或更多次地施加所述间充质干细胞。
49.根据项目31至48中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞施用一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一周或更长时间。
50.根据项目31至49中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞以约100,000个细胞/cm2、约300,000个细胞/cm2或约500,000个细胞/cm2的剂量每周施用两次，持续约8周。
51.通过如项目1至21中任一项所定义的方法获得的间充质干细胞的单位剂量。
52.可通过项目1至21中任一项所定义的方法获得的间充质干细胞的单位剂量。
53.根据项目51或52所述的单位剂量，其中所述单位剂量包含1ml体积的约0.5百万至约10百万个间充质干细胞。
54.根据项53所述的单位剂量，其中所述单位剂量包含约1百万、约3百万或约5百万个细胞。
55.根据项目52至54中任一项所述的单位剂量，其中脐带间充质干细胞选自羊膜间充质干细胞、血管周围间充质干细胞、Wharton’s胶质间充质干细胞、脐带羊膜间充质干细胞。
56.根据项目55所述的单位剂量，其中脐带羊膜间充质干细胞是间充质干细胞群体，其中间充质干细胞群体中至少约90％或更多的细胞表达下列标志物中的每一种：CD73、CD90和CD105。
57.根据项目56所述的单位剂量，其中所述间充质干细胞群体的至少约90％或更多细胞缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA DR。
58.根据项目56或57所述的单位剂量，其中所述间充质干细胞群体的至少约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、约99％或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，并且不表达CD34、CD45和HLA-DR(人白细胞抗原-抗原D相关的)中的每一种。
对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改是显而易见的。
本说明书中提及的所有专利和出版物都表示本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和出版物在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指明引入作为参考。
在此示例性描述的本发明可以在没有任何元件、限制的情况下适当地实施，而没有在此具体公开的元件、限制。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广义地而非限制性地理解。另外，本文所采用的术语和表达方式已经用作描述性术语而非限制性术语，并且在使用这些术语和表达方式时，无意排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但是应认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和任选特征具体公开，但是本领域技术人员可以采用本文公开的其中实施的发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。本发明在此已经被广泛和一般地描述。落入一般公开内容的每个较窄的种类和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，附带条件或负面限制从该属中除去任何主题，而不管所去除的材料是否在本文中具体叙述。另外，在本发明的特征或方面以马库什组的形式描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明也因此以马库什组的任何单独成员或成员的亚组的形式描述。本发明的其它实施例将从以下权利要求书中变得显而易见。
当在本文中使用时，术语“约”应理解为是指在相应的值或范围(如pH、浓度、百分比、摩尔浓度、氨基酸的数目、时间等)中可以存在变化，该变化可以是给定值的至多5％、至多10％、至多15％或至多并包括20％。例如，如果制剂包含约5mg/ml的化合物，这被理解为意指制剂可以具有4至6mg/ml，优选4.25至5.75mg/ml，更优选4.5至5.5mg/ml，甚至更优选4.75至5.25mg/ml，最优选5mg/ml。如本文所用，定义为“(从)X至Y”的区间等同于定义为“在X和Y之间”的区间。两个区间具体包括上限以及下限。这意味着例如“5mg/ml至10mg/ml”或“5mg/ml至10mg/ml之间”的间隔包括5、6、7、8、9和10mg/ml的浓度以及任何给定的中间值。
序列表
<110> 细胞研究私人有限公司
科罗拉多大学董事会，法人
<120> 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 人()
<400> 1
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro
405 410 415
Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
420 425 430
Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys
450 455 460
Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile
485 490 495
Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys
500 505 510
Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val
515 520 525
Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly
530 535 540
Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu
545 550 555 560
Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln
565 570
<210> 2
<211> 161
<212> PRT
<213> 人()
<400> 2
Met Asn Leu Ala Ile Ser Ile Ala Leu Leu Leu Thr Val Leu Gln Val
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gln Lys Val Thr Ser Leu Thr Ala Cys Leu Val Asp Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Arg His Glu Asn Thr Ser Ser Ser Pro Ile
35 40 45
Gln Tyr Glu Phe Ser Leu Thr Arg Glu Thr Lys Lys His Val Leu Phe
50 55 60
Gly Thr Val Gly Val Pro Glu His Thr Tyr Arg Ser Arg Thr Asn Phe
65 70 75 80
Thr Ser Lys Tyr Asn Met Lys Val Leu Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Ser
85 90 95
Lys Asp Glu Gly Thr Tyr Thr Cys Ala Leu His His Ser Gly His Ser
100 105 110
Pro Pro Ile Ser Ser Gln Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val
115 120 125
Lys Cys Glu Gly Ile Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met Ser
145 150 155 160
Leu
<210> 3
<211> 658
<212> PRT
<213> 人()
<400> 3
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu
20 25 30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln
35 40 45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val
50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu
65 70 75 80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu
85 90 95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu
100 105 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln
115 120 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr
130 135 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala
145 150 155 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
180 185 190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
195 200 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
210 215 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu
225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
275 280 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
290 295 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
325 330 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
355 360 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly
385 390 395 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser
465 470 475 480
Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala
500 505 510
Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln
545 550 555 560
Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser
565 570 575
Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val
580 585 590
Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala
595 600 605
Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu
610 615 620
Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr
625 630 635 640
Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser
645 650 655
Met Ala
<210> 4
<211> 385
<212> PRT
<213> 人()
<400> 4
Met Leu Val Arg Arg Gly Ala Arg Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Gly
1 5 10 15
Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser Gly Phe Met Ser
20 25 30
Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu Thr Thr Thr Pro
50 55 60
Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser Gln His Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys Phe Thr Ser Thr
85 90 95
Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser Ser Val Gln Ser
100 105 110
Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro Ala Asn Val Ser
115 120 125
Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Asn Val Ser
130 135 140
Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser Pro Thr Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys Ala Glu Ile Lys
165 170 175
Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly Ile Cys Leu Glu
180 185 190
Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys Asp Arg Gly Glu
195 200 205
Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala Asp Ala Asp Ala
210 215 220
Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser Glu Val Arg Pro
225 230 235 240
Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu Ile Ser Ser Lys
245 250 255
Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys Lys Leu Gly Ile
260 265 270
Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln Ser Tyr Ser Gln
275 280 285
Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu Ala Val Leu
290 295 300
Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser Trp Ser Pro Thr
305 310 315 320
Gly Glu Arg Leu Gly Glu Asp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asn Gly Gly Gly
325 330 335
Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Pro Gly Thr Ser Pro Glu Ala Gln Gly Lys
340 345 350
Ala Ser Val Asn Arg Gly Ala Gln Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ala Thr
355 360 365
Ser Arg Asn Gly His Ser Ala Arg Gln His Val Val Ala Asp Thr Glu
370 375 380
Leu
385
<210> 5
<211> 1304
<212> PRT
<213> 人()
<400> 5
Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe Leu Asp
1 5 10 15
Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro Thr Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp Pro Leu
35 40 45
Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu Arg Glu
50 55 60
Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe Asn Thr
85 90 95
Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp
100 105 110
Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser Gly Ser
115 120 125
Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala Ile Ser
130 135 140
Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala
165 170 175
Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser
180 185 190
Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro Ser Gly
195 200 205
Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser Lys Pro
210 215 220
Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn
225 230 235 240
Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val
245 250 255
Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr
260 265 270
Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala
275 280 285
Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu Lys Phe
290 295 300
Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys
305 310 315 320
Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile
325 330 335
Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu Ile
340 345 350
Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser Glu
355 360 365
Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile Lys
370 375 380
Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg Ser
385 390 395 400
Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg Ser
405 410 415
Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp Cys
420 425 430
Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu Lys
435 440 445
Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile Ala Lys
450 455 460
Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys Ser
465 470 475 480
Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr Ser Asp
485 490 495
Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn Gly Pro
500 505 510
His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu Val Arg
515 520 525
Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu Gln Tyr
530 535 540
Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp Tyr Pro
545 550 555 560
Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser Lys Ala
565 570 575
Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu
580 585 590
Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg Ser Cys
595 600 605
Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln
610 615 620
Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr
625 630 635 640
Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln
645 650 655
Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala Arg Lys
660 665 670
Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp
675 680 685
Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly Ser Asn
690 695 700
Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr
705 710 715 720
Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg
725 730 735
Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys
740 745 750
Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu
755 760 765
Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His
770 775 780
Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys
785 790 795 800
Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser
805 810 815
Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu
820 825 830
Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val
835 840 845
Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile
850 855 860
Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr
865 870 875 880
Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val
885 890 895
Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln
900 905 910
Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His
915 920 925
Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala
930 935 940
Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile
945 950 955 960
Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile
965 970 975
Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser
980 985 990
Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp
995 1000 1005
Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser Tyr
1010 1015 1020
Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Glu Thr
1025 1030 1035 1040
Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys Val Ile
1045 1050 1055
Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln
1060 1065 1070
Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu
1075 1080 1085
Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu
1090 1095 1100
Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr
1105 1110 1115 1120
Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile
1125 1130 1135
Ser Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser
1140 1145 1150
Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg
1155 1160 1165
Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu
1170 1175 1180
Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys
1185 1190 1195 1200
Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr
1205 1210 1215
Gln Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly
1220 1225 1230
Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn
1235 1240 1245
Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly
1250 1255 1260
Ala Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser Glu
1265 1270 1275 1280
Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala
1285 1290 1295
Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser
1300
<210> 6
<211> 254
<212> PRT
<213> 人()
<400> 6
Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val
1 5 10 15
Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile
20 25 30
Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met
35 40 45
Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys
50 55 60
Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu
85 90 95
Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro
100 105 110
Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn
115 120 125
Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val
130 135 140
Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr
145 150 155 160
Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu
165 170 175
Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His
180 185 190
Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro
195 200 205
Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn Val Val Cys Ala Leu Gly Leu
210 215 220
Thr Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Ile Gly Thr Ile Phe Ile Ile Lys
225 230 235 240
Gly Val Arg Lys Ser Asn Ala Ala Glu Arg Arg Gly Pro Leu
245 250
<210> 7
<211> 503
<212> PRT
<213> 人()
<400> 7
Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr
20 25 30
Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys
35 40 45
Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys
50 55 60
Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg
65 70 75 80
Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr
85 90 95
Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro
100 105 110
Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala
115 120 125
Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met
130 135 140
Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn
145 150 155 160
Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr
165 170 175
Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly
180 185 190
Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln
195 200 205
Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp
210 215 220
Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg
225 230 235 240
Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His
245 250 255
Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr
260 265 270
Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys
290 295 300
Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile
305 310 315 320
Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser
325 330 335
Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu
340 345 350
Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala
355 360 365
Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu
370 375 380
Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp
385 390 395 400
Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser
405 410 415
Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val
420 425 430
Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln
435 440 445
Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu
450 455 460
Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala
465 470 475 480
Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser
485 490 495
Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met
500
<210> 8
<211> 232
<212> PRT
<213> 人()
<400> 8
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225 230
<210> 9
<211> 1089
<212> PRT
<213> 人()
<400> 9
Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg
35 40 45
Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu
65 70 75 80
Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly
85 90 95
Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu
100 105 110
Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe
115 120 125
Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp
130 135 140
Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln
165 170 175
Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr
180 185 190
Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu
195 200 205
Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val
210 215 220
Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys
245 250 255
Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr
275 280 285
Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys
290 295 300
Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr
305 310 315 320
Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val
325 330 335
Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn
340 345 350
Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu
355 360 365
Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala
370 375 380
Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp
385 390 395 400
Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr
420 425 430
Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met
435 440 445
Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile
450 455 460
Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp
465 470 475 480
Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr
485 490 495
Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg
500 505 510
Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala
515 520 525
Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val
530 535 540
Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg
545 550 555 560
Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp
565 570 575
Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly
580 585 590
Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val
595 600 605
Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val
610 615 620
Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala
625 630 635 640
Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn
645 650 655
Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile
660 665 670
Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys
675 680 685
Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu
690 695 700
Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr
705 710 715 720
Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln
725 730 735
Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser
740 745 750
Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr
755 760 765
Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp
770 775 780
Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr
785 790 795 800
Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His
805 810 815
Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val
820 825 830
Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn
835 840 845
Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro
850 855 860
Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser
865 870 875 880
Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr
885 890 895
Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly
900 905 910
Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile
915 920 925
Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr
930 935 940
His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys
945 950 955 960
Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala
965 970 975
Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr
980 985 990
Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp
995 1000 1005
Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp
1010 1015 1020
Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His
1025 1030 1035 1040
Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser
1045 1050 1055
Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met
1060 1065 1070
Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe
1075 1080 1085
Leu
<210> 10
<211> 498
<212> PRT
<213> 人()
<400> 10
Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Ala Phe Leu Ala Ala Ile Leu Thr His
1 5 10 15
Ile Gly Cys Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Glu Asn Ser Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu Pro
35 40 45
Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn Thr
50 55 60
Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser Ser
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu Met
100 105 110
Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met Leu
115 120 125
Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu Glu
145 150 155 160
Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys Gln
165 170 175
Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val Thr
210 215 220
Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg Ala
225 230 235 240
Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met Asp
245 250 255
Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu
260 265 270
Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp
275 280 285
Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile
290 295 300
Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn
305 310 315 320
Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp
325 330 335
Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser
340 345 350
Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln
355 360 365
Arg Gln Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg
370 375 380
Ala Tyr Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn
385 390 395 400
Tyr Arg Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser
405 410 415
Ser Leu Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn
420 425 430
Asp Asn Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp
435 440 445
Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala
450 455 460
Gly Gln Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu
485 490 495
Asp Phe
<210> 11
<211> 728
<212> PRT
<213> 人()
<400> 11
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 12
<211> 241
<212> PRT
<213> 人()
<400> 12
Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met
20 25 30
Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu
35 40 45
His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met
50 55 60
Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg
65 70 75 80
Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu
85 90 95
Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp
100 105 110
Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln
115 120 125
Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr
130 135 140
Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg
145 150 155 160
Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu
165 170 175
Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser
180 185 190
Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val
195 200 205
Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg
210 215 220
Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly
225 230 235 240
Ala
<210> 13
<211> 178
<212> PRT
<213> 人()
<400> 13
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn

Claims (41)

1.一种制备间充质干细胞储存或运输制剂的方法，其中所述间充质干细胞为脐带羊膜间充质干细胞，其中所述制剂包含0.5百万至10百万个间充质干细胞，所述方法包括：
a) 将间充质干细胞悬浮在预定体积的晶体溶液中，其中所述晶体溶液是PlasmaLyte并且包含0.5%至3% (w/v)的血清白蛋白，从而获得第一细胞悬液，
b) 确定所述第一细胞悬液中的所述间充质干细胞的浓度，以及确定制备包含0.5百万至10百万个间充质干细胞的制剂所需的所述第一细胞悬液的体积，
c) 将确定体积的第一细胞悬液与一定体积的液体载体混合，其中在混合后所述间充质干细胞储存或运输制剂包含不超过20%的PlasmaLyte，其中所述液体载体包含0.5%至3%(w/v)的血清白蛋白以及
i) Trolox；
ii) Na+；
iii) K+；
iv) Ca2+；
v) Mg2+；
vi) Cl-；
vii) H2PO4 -；
viii) HEPES；
ix) 乳糖醛酸盐；
x) 蔗糖；
xi) 甘露醇；
xii) 葡萄糖；
xiii) 葡聚糖-40；
xiv) 腺苷，和
xv) 谷胱甘肽，
从而获得包含0.5百万至10百万个间充质干细胞的所述间充质干细胞储存或运输制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于悬浮所述间充质干细胞的所述晶体溶液的预定体积为1 ml至10 ml。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中在将所述确定体积的第一细胞悬液与所述体积的液体载体混合后，所述间充质干细胞储存或运输制剂的总体积为1 ml。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中在将所述确定体积的第一细胞悬液与所述体积的液体载体混合后，所述间充质干细胞储存或运输制剂的总体积为1 ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述制剂包含0.5百万至10百万个活的间充质干细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述制剂包含1百万、3百万或5百万个间充质干细胞。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在将所述间充质干细胞重新悬浮在所述预定体积的晶体溶液中之前，已经从细胞培养容器中收获所述间充质干细胞。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有相同浓度的血清白蛋白。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有相同浓度的血清白蛋白。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有1%至3% (w/v)的血清白蛋白。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有1%至3% (w/v)的血清白蛋白。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有1% (w/v)的血清白蛋白。
13. 根据权利要求9所述的方法，其中所述的晶体溶液和液体载体均含有1% (w/v)的血清白蛋白。
14.根据权利要求1-5和9-13中任一项所述的方法，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
16.根据权利要求1-5和9-13中任一项所述的方法，其中所述脐带羊膜间充质干细胞是间充质干细胞群体，其中所述间充质干细胞群体的至少90%或更多细胞表达下列标志物中的每一种：CD73、CD90和CD105。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述间充质干细胞群体的至少90%或更多细胞缺乏以下标志物的表达：CD34、CD45和HLA-DR。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述间充质干细胞群体的至少91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，并且缺乏CD34、CD45和HLA-DR中的每一种的表达。
19.根据权利要求6所述的方法，其中所述间充质干细胞群体的至少91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多的细胞表达CD73、CD90和CD105中的每一种，并且缺乏CD34、CD45和HLA-DR中的每一种的表达。
20.一种间充质干细胞储存或运输制剂，其通过如权利要求1-19中任一项所定义的方法获得。
21.一种运输间充质干细胞的方法，所述方法包括在如权利要求20中所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中运输所述间充质干细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述运输进行7天或更少。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的方法，其中所述运输在-5℃至15℃的温度下进行。
24.如权利要求20中所定义的间充质干细胞储存或运输制剂用于制造用于治疗患有疾病的受试者的药物组合物的用途，其中所述疾病是皮肤病或伤口，并且所述用途包括局部施用已在如权利要求20中所定义的间充质干细胞储存或运输制剂中储存或运输的间充质干细胞，所述用途包括将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离并且将所述间充质干细胞施用于所述受试者。
25.根据权利要求24所述的用途，其中将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离包括离心。
26.根据权利要求24所述的用途，其中将所述间充质干细胞与所述间充质干细胞储存或运输制剂分离包括通过注射器从小瓶中抽出细胞群体。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的用途，其中所述间充质干细胞以3百万、5百万或10百万个细胞的剂量应用。
28.根据权利要求24-26中任一项所述的用途，其中从所述间充质干细胞群体已经收获的时间点起72小时、48小时、24小时、12小时、6小时或更短时间内应用所述间充质干细胞群体。
29.根据权利要求27所述的用途，其中从所述间充质干细胞群体已经收获的时间点起72小时、48小时、24小时、12小时、6小时或更短时间内应用所述间充质干细胞群体。
30.根据权利要求24-26和29中任一项所述的用途，其中所述伤口由烧伤、咬伤、创伤、手术或疾病引起。
31.根据权利要求27所述的用途，其中所述伤口由烧伤、咬伤、创伤、手术或疾病引起。
32.根据权利要求28所述的用途，其中所述伤口由烧伤、咬伤、创伤、手术或疾病引起。
33.根据权利要求30所述的用途，其中所述伤口由糖尿病引起。
34.根据权利要求30所述的用途，其中所述伤口是糖尿病伤口。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述伤口是糖尿病足溃疡。
36.根据权利要求24-26、29和31-35中任一项所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次。
37.根据权利要求27所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次。
38.根据权利要求28所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次。
39.根据权利要求30所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次。
40.根据权利要求36所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次，持续三周、四周、或五周或六周、或七周、或八周或十周或更多周的时间段。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的用途，其中以10百万个细胞、5百万个细胞、4百万个细胞、3百万个细胞、2百万个细胞、1百万个细胞、0.5百万个细胞、0.25百万个细胞或小于0.25百万个细胞的剂量每周施用一次或两次，持续三周、四周、或五周或六周、或七周、或八周或十周或更多周的时间段。
CN202080084893.6A 2019-10-08 2020-10-08 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法 Active CN114867347B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962912368P 2019-10-08 2019-10-08
US62/912,368 2019-10-08
PCT/SG2020/050572 WO2021071430A1 (en) 2019-10-08 2020-10-08 A mesenchymal stem cell storing or transport formulation and methods of making and using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114867347A CN114867347A (zh) 2022-08-05
CN114867347B true CN114867347B (zh) 2024-03-05

Family

ID=75274894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080084893.6A Active CN114867347B (zh) 2019-10-08 2020-10-08 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210102171A1 (zh)
EP (1) EP4040957A4 (zh)
JP (1) JP2022552230A (zh)
KR (1) KR20220108763A (zh)
CN (1) CN114867347B (zh)
AU (1) AU2020364930A1 (zh)
BR (1) BR112022006272A2 (zh)
CA (1) CA3152751A1 (zh)
WO (1) WO2021071430A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3523421A4 (en) * 2016-10-05 2020-06-10 CellResearch Corporation Pte. Ltd. METHOD FOR INSULATING MESENCHYMAL STEM CELLS MADE FROM NAVELINE AMNION MEMBRANE WITH A CELL CULTURE MEDIUM
CN113498779B (zh) * 2021-04-22 2022-05-31 重庆医科大学附属儿童医院 一种运输细胞的试剂及方法
WO2023192484A2 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Bright Cell, Inc. A mesenchymal stem cells formulation for cosmetic use
CN115843782A (zh) * 2022-12-27 2023-03-28 南京三生生物技术股份有限公司 一种细胞保存液及其在细胞贮藏中的应用以及一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046775A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation and cultivation of stem/progenitor cells from the amniotic membrane of umbilical cord and uses of cells differentiated therefrom
CN103648507A (zh) * 2010-12-30 2014-03-19 人类起源公司 用于冷冻保存和包封细胞的方法
WO2015022670A1 (en) * 2013-08-14 2015-02-19 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Management of osteoarthritis using pooled allogeneic mesenchymal stem cells
WO2015175457A1 (en) * 2014-05-12 2015-11-19 Jonathan Allen Rowley Ready-to-print cells and integrated devices
AU2017345677A1 (en) * 2016-10-19 2019-05-23 Habil F KHORAKIWALA Topical dressing composition for the treatment of damaged skin tissue
CN109804063A (zh) * 2016-10-05 2019-05-24 细胞研究私人有限公司 一种采用细胞培养基自脐带羊膜中分离间充质干细胞的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160095307A1 (en) * 2014-10-07 2016-04-07 NuTech Medical, Inc. Method and composition for hypothermic storage of placental tissue
CZ306800B6 (cs) * 2016-05-13 2017-07-12 Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. Prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk
JP7446619B2 (ja) * 2018-04-09 2024-03-11 セルリサーチ コーポレイション プライベート リミテッド 輸送溶液によって間葉系幹細胞を輸送する方法および幹細胞を創傷に投与する方法
US11930808B2 (en) * 2018-09-20 2024-03-19 Universidad De Valladolid Method for obtaining an enriched population of functional mesenchymal stem cells, cells obtained thereof and compositions and comprising the same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046775A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Cellresearch Corporation Pte Ltd Isolation and cultivation of stem/progenitor cells from the amniotic membrane of umbilical cord and uses of cells differentiated therefrom
CN103648507A (zh) * 2010-12-30 2014-03-19 人类起源公司 用于冷冻保存和包封细胞的方法
WO2015022670A1 (en) * 2013-08-14 2015-02-19 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Management of osteoarthritis using pooled allogeneic mesenchymal stem cells
WO2015175457A1 (en) * 2014-05-12 2015-11-19 Jonathan Allen Rowley Ready-to-print cells and integrated devices
CN109804063A (zh) * 2016-10-05 2019-05-24 细胞研究私人有限公司 一种采用细胞培养基自脐带羊膜中分离间充质干细胞的方法
AU2017345677A1 (en) * 2016-10-19 2019-05-23 Habil F KHORAKIWALA Topical dressing composition for the treatment of damaged skin tissue

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022552230A (ja) 2022-12-15
AU2020364930A1 (en) 2022-04-14
BR112022006272A2 (pt) 2022-08-30
EP4040957A1 (en) 2022-08-17
CN114867347A (zh) 2022-08-05
CA3152751A1 (en) 2021-04-15
WO2021071430A1 (en) 2021-04-15
US20210102171A1 (en) 2021-04-08
EP4040957A4 (en) 2023-11-01
KR20220108763A (ko) 2022-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11821006B2 (en) Method of isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord, a mesenchymal stem cell population isolated from the amniotic membrane of the umbilical cord and a cell culture medium for isolating mesenchymal stem cells from the amniotic membrane of the umbilical cord
CN114867347B (zh) 间充质干细胞的储存或运输制剂及其制备和使用方法
KR20200143399A (ko) 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법
JP2024059760A (ja) 輸送溶液によって間葉系幹細胞を輸送する方法および幹細胞を創傷に投与する方法
WO2019199230A1 (en) A method of transporting mesenchymal stem cells by means of a cell culture medium and a method of administering stem cells to wounds
US20200325443A1 (en) Method of inducing or improving wound healing properties of mesenchymal stem cells
US11998569B2 (en) Method of transporting mesenchymal stem cells by means of a transporting solution and a method of administering stem cells to wounds
TWI836505B (zh) 從臍帶的羊膜分離間質幹細胞的方法、從臍帶的羊膜分離的間質幹細胞群以及用於從臍帶的羊膜分離間質幹細胞的細胞培養基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant