CN115843782A - 一种细胞保存液及其在细胞贮藏中的应用以及一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞保存液及其在细胞贮藏中的应用以及一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法，属于细胞保存技术领域。本发明通过设计特定的配方，能够克服现有技术中细胞保存效果较差的问题。本发明提供的细胞保存液各个组分共同作用、对保持冷藏或冷冻阶段的细胞活性具有显著的维持作用。并且本发明在冷藏保存的细胞需冷冻时可直接添加10％V/V二甲基亚砜，用于细胞深低温冻存。通过此方式可以简单的从冷藏状态转换成冷冻状态，相对于离心清除冷藏液后，重新使用冻存液的传统方法，大大简化了细胞治疗的流程。减少细胞污染风险，降低了全流程的成本、提高了细胞活率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其在细胞贮藏中的应用以及一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法。
背景技术
使用细胞对疾病进行治疗的方法在近年已经成为了研究的热点。例如进过嵌合抗原受体处理的免疫细胞在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中已经展现出了显著的效果。
细胞治疗一般都会经过细胞采集、基因修饰、培养扩增、细胞回输/移植治疗这4个过程。在实际操作中，这4个过程可能需要在不同的地点进行，整个环节需要紧密衔接，通常情况下，各操作过程无法保证连续性。以CAR-T细胞治疗为例，由于通过液氮形式冻存转运新鲜采集细胞的成本高、过程繁琐，一般需要通过2～8℃冷藏运输的方式运输至细胞制备中心，同时样本需要立刻处理，然而通常因为采集时间的不确定性导致样本运输至细胞制备中心的时间不确定，细胞制备中心往往无法立刻对采集的免疫细胞进行基因修饰与培养扩增等处理。另一方面，完成基因修饰与培养扩增后，制备的细胞也需要从制备中心再次运输至临床使用，而往往需要面临的问题是，患者因为身体指标变化无法立刻进行回输，或者需要分不同时段回输。
面对无法及时处理或应用细胞的情况，通常的解决办法是离心去除冷藏运输介质，清洗细胞后，再次加入冷冻保存液长期保存。这一操作极大的增加了细胞污染的风险，离心清洗保存介质的同时也大大地降低了细胞的质量。
受制于上述技术难点，细胞治疗的运输存储成本较高，且细胞因离心清洗操作质量明显下降。如何最大的简化细胞治疗中细胞的运输、处理和应用流程，有效应对细胞处理、应用时产生的突发情况，目前尚未有一套切实可行的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞保存液及其在细胞贮藏中的应用以及一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法，以解决现有技术中细胞保存效果较差的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种细胞保存液，所述细胞保存液包括以下终浓度的组分：
3～8％m/V右旋糖酐70、1～5％m/V乳糖酸钠、1～5％m/V甘露醇、0.05～0.2％m/V谷胱甘肽、0.5～2％m/V葡萄糖、0.2～1％m/V海藻糖、0.02～0.08％m/V腺苷、0.02～0.08％m/V氯化钾、0.02～0.08％m/V氯化镁和0.001～0.01％m/V聚乙二醇琥珀酸酯。
优选的，所述细胞保存液的溶剂为PBS缓冲液。
优选的，所述PBS缓冲液的浓度为20～30mmol/L优选的，所述细胞保存液的pH值为6.0～8.0。
优选的，所述细胞保存液还包括终浓度为5～15％V/V的二甲基亚砜。
本发明还提供了所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用。
优选的，将细胞和所述细胞保存液混合，在2～8℃条件下进行保存，所述保存的时间为5天以内。
优选的，将细胞和所述细胞保存液混合，按照1～2℃/min速率的降温至-70℃以下进行保存。
优选的，所述细胞在细胞保存液中的保存密度为2×106～3×107cells/mL。
本发明还提供了一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法，包括以下步骤：
采用上述细胞保存液进行细胞保存，加入占细胞保存液体积浓度为5～15％V/V的二甲基亚砜，按照1～2℃/min速率的降温至-70℃以下进行保存。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供的细胞保存液成分明确，简单易用；其配方原料中创新性的使用了乳糖酸钠，乳糖酸钠在保存液中水解的钠离子有效维持了环境渗透压，乳糖酸根离子的抗氧化性使其有效清除环境中细胞代谢产生的氧自由基，与配方原料中的其他组分共同作用、对保持冷藏或冷冻阶段的细胞活性具有显著的维持作用。并且，本发明在需冷冻时可直接添加10％V/V二甲基亚砜，用于细胞深低温冻存。通过此方式可以简单的从冷藏状态转换成冷冻状态，相对离心清除冷藏液后，重新使用冻存液的传统方法，大大简化了细胞治疗的流程。减少细胞污染风险，降低了全流程的成本、提高了细胞活率。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞保存液，所述细胞保存液包括以下终浓度的组分：3～8％m/V右旋糖酐70、1～5％m/V乳糖酸钠、1～5％m/V甘露醇、0.05～0.2％m/V谷胱甘肽、0.5～2％m/V葡萄糖、0.2～1％m/V海藻糖、0.02～0.08％m/V腺苷、0.02～0.08％m/V氯化钾、0.02～0.08％m/V氯化镁和0.001～0.01％m/V聚乙二醇琥珀酸酯；所述细胞保存液包括3～8％m/V右旋糖酐70，进一步优选为4～6％m/V，所述细胞保存液包括1～5％m/V乳糖酸钠，进一步优选为2～4％m/V，所述细胞保存液包括1～5％m/V甘露醇，进一步优选为2～4％m/V，所述细胞保存液包括0.05～0.2％m/V谷胱甘肽，进一步优选为0.08～0.12％m/V，所述细胞保存液包括0.5～2％m/V葡萄糖，进一步优选为0.8～1.5％m/V，所述细胞保存液包括0.2～1％m/V海藻糖，进一步优选为0.6～1.5％m/V，所述细胞保存液包括0.02～0.08％m/V腺苷，进一步优选为0.04～0.06％m/V，所述细胞保存液包括0.02～0.08％m/V氯化钾，进一步优选为0.04～0.06％m/V，所述细胞保存液包括0.02～0.08％m/V氯化镁，进一步优选为0.04～0.06％m/V，所述细胞保存液包括0.001～0.01％m/V聚乙二醇琥珀酸酯，进一步优选为0.003～0.008％m/V；所述细胞保存液的溶剂优选为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度优选为20～30mmol/L，进一步优选为23～27mmol/L，所述细胞保存液的pH值优选为6.0～8.0，进一步优选为6.5～7.5；在本发明中，所述细胞保存液还包括体积浓度优选为5～15％V/V的二甲基亚砜，所述二甲基亚砜的体积浓度进一步优选为8～12％V/V。
本发明还提供了所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用，所述细胞贮藏优选为冷藏条件，在冷藏条件下优选将细胞和所述细胞保存液混合，在2～8℃条件下进行保存，所述保存的时间优选为5天以内，所述冷藏保存的温度进一步优选为3～6℃；本发明所述细胞贮藏还可以为冷冻条件，在冷冻条件下优选将细胞和所述细胞保存液混合，按照1～2℃/min速率的降温至-70℃以下进行保存，所述降温的速率进一步优选为1.3～1.8℃/min，所述冷冻保存的温度进一步优选为-80℃以下，本发明所述的冷冻条件下贮藏优选采用含有二甲基亚砜的细胞保存液；本发明所述细胞和细胞保存液的比例优选为**。
本发明还提供了一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法，包括以下步骤：采用不含二甲基亚砜的细胞保存液进行细胞冷藏保存，需要转入冷冻保存时加入占细胞保存液体积浓度为5～15％V/V的二甲基亚砜，按照1～2℃/min速率的降温至-70℃以下进行保存，所述降温的速率进一步优选为1.3～1.8℃/min，所述冷冻保存的温度进一步优选为-80℃以下。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
配制6％m/V的右旋糖酐70、4％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.1％m/V的谷胱甘肽、1.5％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mM PBS缓冲液为溶剂。
实施例2
配制4％m/V的右旋糖酐70、3％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、1.75％m/V的葡萄糖、0.6％m/V的海藻糖、0.06％m/V的腺苷、0.06％m/V的氯化钾、为0.06％m/V的氯化镁、0.006％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mM PBS缓冲液为溶剂。
实施例3
配制5％m/V的右旋糖酐70、4％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、1.75％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.06％m/V的氯化钾、为0.06％m/V的氯化镁、0.006％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mM PBS缓冲液为溶剂。
实施例4
配制7％m/V的右旋糖酐70、4％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、1.75％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.006％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mM PBS缓冲液为溶剂。
实施例5
配制6％m/V的右旋糖酐70、3％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、1.6％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.06％m/V的氯化钾、为0.06％m/V的氯化镁、0.006％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mM PBS缓冲液为溶剂。
实施例6
配制6％m/V的右旋糖酐70、3％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、1.7％m/V的葡萄糖、0.8％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
实施例7
配制6％m/V的右旋糖酐70、5％m/V的乳糖酸钠、2％m/V的甘露醇、0.1％m/V的谷胱甘肽、2％m/V的葡萄糖、0.7％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.04％m/V的氯化钾、为0.04％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
实施例8
配制7％m/V的右旋糖酐70、5％m/V的乳糖酸钠、1.9％m/V的甘露醇、0.15％m/V的谷胱甘肽、2％m/V的葡萄糖、0.7％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.04％m/V的氯化钾、为0.04％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
实施例9
配制6％m/V的右旋糖酐70、3.5％m/V的乳糖酸钠、1.8％m/V的甘露醇、0.14％m/V的谷胱甘肽、1.75％m/V的葡萄糖、0.6％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
实施例10
配制6％m/V的右旋糖酐70、3.75％m/V的乳糖酸钠、1.6％m/V的甘露醇、0.14％m/V的谷胱甘肽、1.75％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.006％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
比较例1
配制生理盐水添加1％人血白蛋白，生理盐水为等渗的氯化钠溶液(0.9％氯化钠)。
此比较例配方常用于细胞的2～8℃冷藏保存。
比较例2
配制90％V/V 1640培养基、10％FBS。
此配方基础上添加10％V/V二甲基亚砜后，为实验室常用细胞冷冻保护液，此比较例仅用于冻存对比。
比较例3
配制6％m/V的右旋糖酐70、2％m/V的甘露醇、0.1％m/V的谷胱甘肽、1.5％m/V的葡萄糖、0.5％m/V的海藻糖、0.05％m/V的腺苷、0.05％m/V的氯化钾、为0.05％m/V的氯化镁、0.005％m/V的聚乙二醇琥珀酸酯，以25mMPBS缓冲液为溶剂。
此比较例与实施例1完全一致，但缺少乳糖酸钠。
上述实施例的制备方法：按各实施例所述称取物料溶于25mMPBS溶液混合。使用无菌滤膜过滤，使保存液无菌。
实验例1
以NK92细胞系与UCMSCs细胞为实验对象，分别直接重悬于以上实施例以及比较例1和比较例3中的保存液中。将混合后的细胞置于2～8℃，模拟冷藏运输环境保存5日，利用AO/PI染色法检测活率。采用比较例1保存液的细胞使用离心去除，重新加入对比例2保存液进行重悬细胞，用于细胞冻存。向各实施例和比较例与细胞的混合液中直接添加10％V/V二甲基亚砜，轻摇混匀。使用程序降温仪按照1.5℃/min进行降温，直至-80℃，并存入液氮保存1个月。一个月后复苏并利用AO/PI染色法检测活率。各实施例NK92细胞活率见表1：
表1NK92细胞活率统计表
各实施例UCMSCs细胞活率见表2：
表2 UCMSCs细胞活率统计表
通过实施例1～10与比较例1、2对比发现，本发明细胞冷藏冷冻两用保存液冷藏保存运输NK92、UCMSCs细胞后，各实施例细胞活率均大于85％，其中实施例1细胞活性最高，且远高于比较例1、2的细胞活性，说明使用本发明提供的细胞保存液冷藏保存运输的细胞依旧维持较高的活性；通过直接添加10％V/V二甲基亚砜并冷冻保存NK92、UCMSCs细胞一个月后，实施例1～10相比于比较例1、2细胞活率下降比率更低，说明直接添加10％V/V二甲基亚砜的方式可以有效减少离心清洗等操作对细胞造成的活性损伤。通过实验结果还可知，本发明中的乳糖酸钠在细胞保存液中对NK92、UCMSCs细胞的冷藏运输和冷冻存储均起到了至关重要的作用。
实验例2
选取ICR小鼠(昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，分别对实施例1与实施例2进行急性全身毒性检测。
实施例1与实施例2各使用5只小鼠，体重为20～22g。通过鼠尾部静脉按体重50mL/kg注射入细胞保存液。观察72小时，所有被试小鼠均未发现异常临床症状，体重与体重变化如表3所示，均在正常范围。
表3实施例1、2中ICR小鼠急毒实验体重变化统计
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液包括以下终浓度的组分：
3～8％m/V右旋糖酐70、1～5％m/V乳糖酸钠、1～5％m/V甘露醇、0.05～0.2％m/V谷胱甘肽、0.5～2％m/V葡萄糖、0.2～1％m/V海藻糖、0.02～0.08％m/V腺苷、0.02～0.08％m/V氯化钾、0.02～0.08％m/V氯化镁和0.001～0.01％m/V聚乙二醇琥珀酸酯。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的溶剂为PBS缓冲液。
3.根据权利要求2所述的细胞保存液，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为20～30mmol/L。
4.根据权利要求3所述的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的pH值为6.0～8.0。
5.根据权利要求4所述的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液还包括终浓度为5～15％V/V的二甲基亚砜。
6.权利要求1～5任意一项所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用。
7.根据权利要求6所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用，其特征在于，将细胞和所述细胞保存液混合，在2～8℃条件下进行保存，所述保存的时间为5天以内。
8.根据权利要求6所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用，其特征在于，将细胞和所述细胞保存液混合，按照1～2℃/min速率降温至-70℃以下进行保存。
9.根据权利要求7或8所述的细胞保存液在细胞贮藏中的应用，其特征在于，所述细胞在细胞保存液中的保存密度为2×106～3×107cells/mL。
10.一种冷藏细胞转入冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求1～4任一项所述的细胞保存液进行细胞保存，加入占细胞保存液体积浓度为5～15％V/V的二甲基亚砜，按照1～2℃/min速率的降温至-70℃以下进行保存。
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