CN112167240A - 临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞冷藏保存技术领域，尤其是一种临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用，该细胞冷藏保存液以注射用水为溶剂，每1000mL细胞冷藏保存液中包括如下物质：葡萄糖酸钠10g～60g，柠檬酸钠1g～20g，海藻糖1g～20g，右旋糖酐10g～150g，甘露醇0.1g～15g，葡萄糖0.1g～15g，腺嘌呤0.1g～15g，谷胱甘肽0.1g～15g，磷酸氢二钾0.1g～30g，氯化镁0.1g～15g，氯化钾0.1g～15g，氯化钠0.1g～15g，维生素E 0.01g～2g。该临床级细胞冷藏保存液不含血清、蛋白、二甲基亚砜(DMSO)等传统细胞保存剂成份，成份构成稳定，比例明确，安全无害，可直接用于静脉回输或皮下注射。能在不冻结的冷藏状态下(2～8℃)，有效保持细胞活率的保存液。

Description

临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞冷藏保存领域，具体领域为一种临床级细胞冷藏保存液及其制备方法。
背景技术
近年来利用细胞治疗疾病的研究成为热点。干细胞是具有多向分化潜能的原始细胞，可形成人体各种组织器官。干细胞技术是生物治疗的前沿技术。肿瘤的免疫治疗因其对于常规疗法无效的晚期肿瘤具有显著疗效而受到极大关注，免疫细胞治疗癌症是一种高效、先进的治疗方法，已在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中展现出惊人的效果。
细胞治疗涉及细胞采集、培养扩增、基因修饰、细胞回输/移植治疗这几个过程。通常，这些过程的实施地点或者时间并不一致，治疗用细胞会在不同地点、不同时间点之间运输。多数治疗机构仅仅在细胞回输/治疗前对送达的细胞产品进行质控，容易忽视整个运输过程中的细胞质控和管理，即从细胞采集到最终治疗，在常温或37℃环境中，细胞内生化反应活跃、代谢旺盛、耗氧高、能耗大。这些生理过程会产生的大量氧自由基和脂质过氧化物，它们必须及时被清除，否则会引起环境pH和渗透压变化，造成细胞溶胀和死亡。在细胞运输中，这一问题更为突出，因此通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行转运。在冷冻状态下，细胞停止生命活动和新陈代谢，进入“休眠”。送达的细胞经复温后“苏醒”，复温操作者必须谨慎，避免从“休眠”至“苏醒”过程中的操作对细胞造成不可逆的损伤。冷冻运输对运输条件要求非常苛刻，并且运输成本高昂。因此，虽然冷冻运输是较完美的运输解决方案，细胞活性能长期得到保存，实际应用中却难以广泛采用。所有保存和运输环节都应当执行标准化操作和管理。
除了通过冷冻停止细胞代谢，还可以通过降低代谢达到短期保存和运输细胞的目的，即——低温保存和运输。低温(2～8℃)处理可降低细胞正常生理过程中产生的氧自由基和脂质过氧化物，送达的细胞无需特别处理，可直接使用。此外，低温运输与冷冻运输相比，非常廉价。
低温运输需要特别的保存液。普通缓冲盐溶液无法长期维持细胞活性。临床治疗用的细胞不能接触动物源成分，如血清和成分来源不明的蛋白和氨基酸。如果使用细胞培养基，安全性与稳定性堪忧。因此，为保障细胞的低温保存和运输，研制一种能够安全、稳定、高效保存细胞活性的溶液非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用，以解决市场缺乏可在短期非冻结条件下保存细胞的手段的问题。该临床级细胞冷藏保存液不含血清、蛋白、二甲基亚砜(DMSO)等传统细胞保存剂成份，成份构成稳定，比例明确，安全无害，可直接用于静脉回输或皮下注射。能在不冻结的冷藏状态下(2～8℃)，有效保持细胞活率的保存液。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种临床级细胞冷藏保存液，以注射用水为溶剂，每1000mL细胞冷藏保存液中包括如下物质：葡萄糖酸钠10g～60g，柠檬酸钠1g～20g，海藻糖1g～20g，右旋糖酐10g～150g，甘露醇0.1g～15g，葡萄糖0.1g～15g，腺嘌呤0.1g～15g，谷胱甘肽0.1g～15g，磷酸氢二钾0.1g～30g，氯化镁0.1g～15g，氯化钾0.1g～15g，氯化钠0.1g～15g，维生素E0.01g～2g。
其中，pH值为6.0～8.0；渗透压为250～500mOsm/L。所用原料均为药用级。
本发明的临床级细胞冷藏保存液可直接用于静脉回输或肌肉注射。
本发明所述的临床级细胞冷藏保存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)按比例称取葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇、葡萄糖、腺嘌呤、谷胱甘肽、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钾、氯化钠、维生素E，以注射用水为溶剂，摇匀并定容；
(2)使用无菌滤膜过滤，使保存液无菌。
本发明所述的临床级细胞冷藏保存液的使用方法：将需冷藏的细胞离心收集后，使用临床级细胞冷藏保存液重悬细胞，使细胞浓度达到2×106/mL～1×107/mL，置于2～8℃冰箱冷藏保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的临床级细胞冷藏保存液，其原料中的葡萄糖酸钠等无机盐成份按比例混合，为低温下的细胞提供了良好的离子环境，有效解决了低温情况下细胞钠钾离子泵失效的问题，提高了细胞的存活率
(2)本发明的临床级细胞冷藏保存液，其原料中的右旋糖酐等糖类成份，为低温下的细胞提供了充足的糖原，为代谢能力因温度而降低的细胞生存提供了能量基础。
(3)本发明的临床级细胞冷藏保存液，其原料中的腺嘌呤等成份，作为ATP前体，为低温下的细胞提供了能量代谢所需的物质基础，有效的维持了低温环境下细胞的生物活性。
(4)本发明的临床级细胞冷藏保存液，其原料中的谷胱甘肽、维生素E等抗氧化剂，其本身具有较强的还原性，可以有效的阻止氧自由基对细胞的伤害，显著提高低温环境下细胞的存活率。
(5)本发明的临床级细胞冷藏保存液，所使用的原料均为药用级，无毒无害。成品可直接用于静脉回输或肌肉注射，配方中不含血清、蛋白等物质，有效避免了此类物质在临床应用时产生的安全性隐患。
(6)本发明的临床级细胞冷藏保存液，在2～8℃时冷藏保存细胞，5日活率可达90％以上。使用简便，无需冻结，无需专业冷冻设备，便于冷链运输，有效填补了市场空白。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例2
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.2％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例3
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.001％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例4
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.1％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例5
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，15％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例6
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，1％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例7
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，1％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.01％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例8
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5％w/v葡萄糖酸钠，1％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.1％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例9
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5.5％w/v葡萄糖酸钠，0.5％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
实施例10
一种临床级细胞冷藏保存液，包括以下组分：
5.5％w/v葡萄糖酸钠，1％w/v柠檬酸钠，0.7％w/v海藻糖，10％w/v右旋糖酐，0.5％w/v甘露醇，1％w/v葡萄糖，0.05％w/v腺嘌呤，0.1％w/v谷胱甘肽，0.3％w/v磷酸氢二钾，0.05％w/v氯化镁，0.05％w/v氯化钾，0.04％w/v氯化钠，0.005％w/v维生素E，以注射用水为溶剂。
为突出本发明的有益效果，还进行了以下对比例实验。
对比例1
对比例1使用进口自biolifesolutions公司的产品：HypoThermosol.。该保存液为常用科研级保存液。
对比例2
对比例2使用生理盐水、生理盐水为等渗的氯化钠溶液，常用于短期存放细胞或清洗细胞。
实施例1-10的制备方法：
按各实施例所注称取葡萄糖酸钠，柠檬酸钠，海藻糖，右旋糖酐，甘露醇，葡萄糖，腺嘌呤，谷胱甘肽，磷酸氢二钾，氯化镁，氯化钾，氯化钠，维生素E。以注射用水为溶剂，摇匀并定容至1L；使用无菌滤膜过滤，使保存液无菌。
以上实施例1～10与对比例1-2分别按照下述方法对间充质干细胞以及NK细胞进行处理。
保存间充质干细胞：
准备：将培养成单层、汇合度约80％的人脂肪间充质干细胞弃掉上清，加入生理盐水清洗细胞表面2次。加入0.25％胰蛋白酶液消化约3分钟，弃胰酶液，加入DMEM-F12完全培养液终止消化，收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，分别加入实施例1-10所制备的和液和对比例，重悬混均，以细胞浓度1×107/管，置入无菌的冻存管内，每组3管。
冷藏：将冻存管置于2～8℃的冰箱，放置5日。
验证：取出冻存管，用5倍体积生理盐水稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，再重复3次，计算细胞存活率。
保存NK细胞：
准备：将培养状态良好NK细胞弃掉上清，生理盐水稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，再重复2次，弃上清，分别加入实施例1-10所制备的保存液和比较例1、2，重悬混均，以细胞浓度1×107/管，置入无菌的冻存管内，每组3管。
冷藏：将冻存管置于2～8℃的冰箱，放置5日。
细胞活率验证：
取出冻存管，用5倍体积生理盐水稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，再重复3次，计算细胞存活率。
各类细胞冷藏5日后活率见下表1：
表1
Figure BDA0002114912710000071
Figure BDA0002114912710000081
细胞表型验证：
选取实施例1～5所保存间充干细胞，流式检测显示CD29，CD44，CD105都是强表达，在98％以上，说明间充质细胞未分化性保持比比较例的效果好。
选取实施例1～5所保存NK细胞，流式显示CD56为强表达，90％以上。CD3基本未表达低于5％。说明被测细胞为NK细胞且活性良好。
安全性验证：
选取ICR小鼠，分别对实施例1与实施例2进行急性全身毒性检测。
实施例1与实施例2各使用5只小鼠，体重为20～22g。通过鼠尾部静脉按体重50mL/kg注射临床级细胞冷藏保存液。观察72小时，所有被试小鼠均未发现异常临床症状，体重与体重变化均在正常范围。
通过对上述实施例的验证，说明本发明的临床级细胞冷藏保存液，在2～8℃时对间充干细胞及免疫细胞有十分明显的保护作用，显著提升了细胞的存活率。保存液组分为药用级原料，安全无毒，可以直接进行静脉回输。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种临床级细胞冷藏保存液，其特征在于：以注射用水为溶剂，每1000mL细胞冷藏保存液中包括如下物质：葡萄糖酸钠10g～60g，柠檬酸钠1g～20g，海藻糖1g～20g，右旋糖酐10g～150g，甘露醇0.1g～15g，葡萄糖0.1g～15g，腺嘌呤0.1g～15g，谷胱甘肽0.1g～15g，磷酸氢二钾0.1g～30g，氯化镁0.1g～15g，氯化钾0.1g～15g，氯化钠0.1g～15g，维生素E0.01g～2g。
2.根据权利要求1所述的临床级细胞冷藏保存液，其特征在于：pH值为6.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的临床级细胞冷藏保存液，其特征在于：渗透压为250～500mOsm/L。
4.根据权利要求1所述的临床级细胞冷藏保存液，其特征在于：所用原料均为药用级。
5.权利要求1-4任一所述的临床级细胞冷藏保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按比例称取葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、海藻糖、右旋糖酐、甘露醇、葡萄糖、腺嘌呤、谷胱甘肽、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钾、氯化钠、维生素E，以注射用水为溶剂，摇匀并定容；
(2)使用无菌滤膜过滤，使保存液无菌。
6.权利要求1-4任一所述的临床级细胞冷藏保存液的使用方法，其特征在于：将需冷藏的细胞离心收集后，使用临床级细胞冷藏保存液重悬细胞，使细胞浓度达到2×106/mL～1×107/mL，置于2～8℃冰箱冷藏保存。
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