CN115299431A - 维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种维持细胞活性的保存液，保存液包括以下成分：NaCl1～110mM、KH2PO41～10mM、CaCl20.1～10mM、MgSO40.1～1mM、NaHCO31～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L‑谷氨酰胺1～100mM、L‑天冬氨酸1～10mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM和硫胺素焦磷酸1～100nM，本发明提供的保存液能够在2～8℃的低温条件下，长时间运输后仍然高度维持细胞的活性，细胞增殖快、细胞功能不受影响。本发明还提供了一种保存液的制备方法，操作简便。本发明还提供了一种保存液保存细胞的方法，保存效果好，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种维持细胞活性的保存液及其制备方法和保存细胞的方法。
背景技术
细胞在生命科学研究、药物筛选、组织器官修复和疾病治疗等各领域有着极其重要的用途，尤其是近年来细胞治疗技术发展迅猛，具有广阔的应用前景，但是由于细胞在应用前需要进行适当的处理，这些操作要求在GMP环境下由专业的技术人员完成，在环境上、技术上和时间上均有较高要求，且每一个处理步骤都有可能影响到细胞性能，从而导致细胞的质量控制工作难以统一标准，因此阻碍了细胞在科研、工业和临床的应用。
目前细胞的运输和暂时储存主要采取两种方式：冷冻状态液氮运输和培养状态下装满培养基常温运输。两种方式都存在不便之处，其中，液氮运输需先使用细胞冻存液冷冻细胞，冻存液的成分复杂、冻存后细胞活性下降、复苏操作要求高、复苏时间长和造价高等使其后续应用受到了影响。而常温运输装满培养基的方式，保存过程中细胞代谢产物会对细胞的保存有一定影响，细胞大量增殖使生长受限、细胞易成团堆集等问题导致了常温保存下细胞的存活时间短，且贴壁细胞使用前需在特定条件下由专业人员消化细胞，因此制约了其应用。
目前所使用的运输方式多是低温(2-8℃)运送，大多数细胞保存液含有异种动物蛋白、人血清或激素等，导致应用过程中会有不安全的因素存在。此外细胞保存时间短、长时间保存后细胞活性差、保存液使用方法不便利等都是亟需解决的问题。
现有技术1为中国专利CN 107372464 A公开了一种维持间充质干细胞活性的运输保存液与制备方法，该保存液由溶液介质和细胞活力保护剂组成；其中溶液介质为复方电解质注射液，添加终浓度为0.05g/ml人血白蛋白；细胞活力保护剂包括复方氨基酸、褪黑激素和雷帕霉素，添加终浓度分别为0.4～1.6mg/ml、0.23～2.3μg/ml、20～200nM。现有技术1的运输保存液保存间充质干细胞，24小时后细胞活率为91.93％，但由于人血清白蛋白容易使细胞成团，阻止细胞贴壁，因此其48小时及以上长时间保存后的细胞活率较低，成团率较高。
现有技术2为中国专利CN 106538513 A公开了一种人间充质干细胞保存运输液，包含1-15mg/ml氯化钠、1-15mg/ml葡萄糖酸钠、1-10mg/ml醋酸钠、0.1-9.9v/v％人AB血清、0.1-25mg/ml人参皂苷Rb1、1-100ng/ml转铁蛋白、1-100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01-1mmol/l谷氨酰胺，保存24h后，人AB血清2-5v/v％浓度下细胞的贴壁率高，转铁蛋白、还原型谷胱苷肽和人参皂苷Rb1的添加能提高细胞活性，有利于保持细胞正常代谢活力。现有技术2由于保护剂的作用有限，活力维持时间较短，导致其48小时及以上长时间保存后的细胞活率较低，并且细胞从保存运输液中取出后要离心去保存液，使用麻烦。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题在于，提供一种维持细胞活性的保存液，无动物源成分、无血液制品成分，辅料安全性高，长时间运输后仍能高度维持细胞的活性，细胞存活率高、细胞增殖快、细胞功能不受影响。
本发明所要解决的第二个技术问题在于，提供一种保存液的制备方法，操作简单，配制方便。
本发明所要解决的第三个技术问题在于，提供一种保存液保存细胞的方法，保存后的细胞可直接重悬应用，且适用范围广。
为达到上述技术效果，本发明提供了一种维持细胞活性的保存液，其包括以下成分：
无机盐缓冲液3～250mM、海藻糖1～50mg/ml、氨基酸混合液2～120mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM和硫胺素焦磷酸0.1～100nM。
作为上述技术方案的改进，所述无机盐缓冲液选用NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3中的一种或多种；
所述氨基酸混合液选用谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸中的一种或多种。
作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
NaCl 1～110mM、KH2PO4 1～10mM、CaCl2 0.1～10mM、MgSO4 0.1～1mM、NaHCO3 1～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L-谷氨酰胺1～100mM、L-天冬氨酸1～10mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM、硫胺素焦磷酸1～100nM。
作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
NaCl 10～30mM、KH2PO4 2～8mM、CaCl2 0.1～5mM、MgSO4 0.3～0.6mM、NaHCO3 10～30mM、海藻糖10～40mg/ml、蔗糖0.1～2mg/ml、甘油0.01～0.3mM、谷氨酸0.03～1mM、L-谷氨酰胺1～20mM、L-天冬氨酸2～5mM、左旋肉碱0.04～0.06mM、氯化胆碱0.04～0.06mM、硫胺素焦磷酸20～50nM。
作为上述技术方案的改进，所述保存液包括以下成分：
NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、氯化胆碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM。
相应的，本发明还提供了一种制备权利上述保存液的方法，包括如下步骤：
(1)按浓度称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液；
(2)将混合溶液在无菌条件下过滤，得到细胞保存液。
作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)包括：
用0.3-0.5μm的过滤膜对混合溶液进行第一次过滤处理；
用0.15-0.25μm的过滤膜对混合溶液进行第二次过滤处理，得到细胞保存液。
相应的，本发明还提供了一种利用上述保存液保存细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(2)将细胞用所述保存液重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口，得到细胞悬液；
(3)将所述细胞悬液放入2～8℃的储存箱进行保存；
(4)将所述细胞悬液取出直接应用或者再次培养。
作为上述技术方案的改进，步骤(1)的所述细胞包括贴壁细胞和悬浮细胞；
所述贴壁细胞在重悬前先使用细胞消化试剂将细胞消化；
所述悬浮细胞直接重悬。
作为上述技术方案的改进，所述细胞悬液再次培养时，包括：
在所述细胞悬液中直接加入细胞培养基混匀，转移至细胞培养瓶或细胞培养皿中，并于37～39℃、4～6％CO2条件下培养。
实施本发明实施例，具有如下有益效果：
1、本发明提供的保存液可以在2～8℃条件下很好地维持细胞的活力及特定功能，以满足细胞的短期低温保存及远距离运输要求，可以维持细胞在2～8℃保存96h仍保持85％以上的存活率、保存144h保持60％以上存活率，且细胞倍增时间及其他功能无影响。
2、本发明提供的保存液无动物源成分、无血液制品成分，辅料均为药用和注射级别，安全性高。
3、本发明提供的保存液使用方便，细胞悬于保存液中暂存或运输，细胞再次应用前直接重悬即可，无需去除保存液。
4、本发明提供的保存液应用范围广，适用于哺乳动物多种类型细胞，如间充质干细胞、免疫细胞和常规细胞系等，对细胞制剂运输后的临床应用提供了极大的方便。
附图说明
图1是本发明实施例1所提供的人间充质干细胞存活率的柱状图；
图2是本发明实施例1所提供的人间充质干细胞保存96h后细胞表面标记物流式分析；
图3是本发明实施例1所提供的人间充质干细胞保存96h后分化能力检测；
图4是本发明实施例6不同细胞在细胞保存液中储存96h后的形态。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
本发明实施例提供了一种维持细胞活性的保存液，主要成分包括无机盐缓冲液、海藻糖、氨基酸混合液、左旋肉碱、氯化胆碱和硫胺素焦磷酸，涵盖了pH缓冲剂、渗透压稳定剂、氧自由基清除剂、细胞膜保护剂、能量底物和能量代谢维持的成分。
其中，无机盐成分选用NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3中的一种或多种；氨基酸混合液成分选用谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸中的一种或多种。
低温会导致离子平衡紊乱，尤其是单价和二价阳离子(Na+、K+、Ca2+)和阴离子(Cl-)，低温还会导致渗透性细胞肿胀、氧化应激和细胞内外pH变化，本发明提供的细胞保存液中含有多种无机盐，可以维持各种离子浓度，调节pH值并维持渗透压稳定。
细胞膜有重要的生理功能，它既能使细胞维持稳定代谢的胞内环境，又能调节和选择物质进出细胞。海藻糖作为一种非渗透保护剂，它可以平衡离子输送浓度，保护细胞免受临界膨胀，能够稳定细胞中的磷脂双层和不稳定蛋白质，减少氧化应激的作用。胆碱是鞘磷脂和卵磷脂的成分，它是构成生物膜的重要成分，能维持细胞结构完整性和细胞信号传导，具有调控细胞凋亡和促进脂肪代谢功能，氯化胆碱是胆碱的一种人工合成形式。
细胞的维持和增殖需要线粒体呼吸作用提供能量，细胞在密闭储存和运输条件下，其能量代谢受到影响。左旋肉碱是线粒体β-氧化途径的重要辅助因子，它将长链脂肪酰基辅酶A运输到线粒体中，通过β-氧化降解，在线粒体氧化产生能量，同时这种促进线粒体的脂肪酸氧化作用还可使在无氧产能情况下维持辅酶A在线粒体内的浓度，刺激三羧酸的循环和ATP从线粒体向外输出。此外，左旋肉碱还具有清除多余乳酸、降解氨、解除毒性的作用。
有研究发现，细胞呼吸的精确角色主要表现在天冬氨酸的产生上，对于增殖的细胞而言，必须有足够的天冬氨酸存在才能够制造新细胞所需的RNA、DNA以及蛋白质，因此每一个哺乳动物的细胞都需要自己制造天冬氨酸，本保存液中添加的L-天冬氨酸，GOT1可以消耗它来将电子转移到线粒体中，从而维持细胞的增殖能力。
硫胺素焦磷酸是维生素B1的辅酶形式，是丙酮酸脱氢酶复合物和酮戊二酸脱氢酶复合物的必需中间体，对细胞溶质转酮酶和线粒体丙酮酸、酮戊二酸和支链酮酸脱氢酶的活性维持是必需的。
因此，本发明由上述成分组成的保存液，可以在2～8℃条件下很好地维持细胞的活力及特定功能，以满足细胞的短期低温保存及远距离运输要求，可以维持细胞在2～8℃保存96h仍保持85％以上的存活率、保存144h保持60％以上存活率，且细胞倍增时间及其他功能无影响。而且，所述保存液无动物源成分、无血液制品成分，辅料均为药用和注射级别，安全性高。
相应的，本发明实施例还提供了一种制备上述保存液的方法，包括如下步骤：
(1)按浓度称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液；
(2)将混合溶液在无菌条件下过滤，得到细胞保存液。
优选的，所述步骤(2)包括：
用0.3-0.5μm的过滤膜对混合溶液进行第一次过滤处理；
用0.15-0.25μm的过滤膜对混合溶液进行第二次过滤处理，得到细胞保存液。
更佳的，所述步骤(2)包括：
用0.45μm的过滤膜对混合溶液进行第一次过滤处理；
用0.22μm的过滤膜对混合溶液进行第二次过滤处理，得到细胞保存液。
需要说明的是，细胞的生长环境较为苛刻，本发明对其进行二次过滤处理后，可以更好的保证细胞液的除菌效果。
本发明细胞保存液的制备方法，操作简单，配制方便，保存液既可以随制随用，也可以较长时间保存。
相应的，本发明实施例还提供了一种利用上述保存液保存细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(2)将细胞用所述保存液重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口；
(3)将制备好的细胞悬液放入2～8℃冰箱或运输箱进行保存；
(4)将细胞悬液中的细胞取出，用相应试剂重悬细胞，直接应用。
细胞包括贴壁细胞和悬浮细胞，贴壁细胞在重悬前需使用细胞消化试剂将细胞消化，悬浮细胞直接重悬。
经过保存液保存的细胞需再次培养时，直接加入适量细胞培养基混匀，转移至细胞培养瓶或细胞培养皿中，于37℃、5％CO2条件下培养，无需离心去除细胞保存液，操作简便。
下面以具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1
(1)称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、氯化胆碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM；
(2)在无菌条件下先后于0.45μm和0.22μm过滤，得到细胞保存液；
(3)取人间充质干细胞进行处理，先使用细胞消化试剂将细胞消化，将消化好的细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(4)按照1×106/ml细胞浓度用细胞保存液对细胞进行重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口；
(5)将制备好的细胞悬液放入4℃冰箱进行保存。
实施例2
(1)称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 10.5mM、KH2PO4 6mM、CaCl2 2.28mM、MgSO4 0.68mM、NaHCO3 30mM、海藻糖15mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺10mM、L-天冬氨酸3mM、左旋肉碱0.04mM、氯化胆碱0.04mM、硫胺素焦磷酸30nM；
(2)在无菌条件下先后于0.45μm和0.22μm过滤，得到细胞保存液；
(3)取人间充质干细胞进行处理，先使用细胞消化试剂将细胞消化，将消化好的细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(4)按照1×106/ml细胞浓度用细胞保存液对细胞进行重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口；
(5)将制备好的细胞悬液放入4℃冰箱进行保存。
实施例3
(1)称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 18.8mM、KH2PO4 2mM、CaCl2 6.15mM、MgSO4 0.40mM、NaHCO3 10mM、海藻糖30mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺15mM、L-天冬氨酸4.8mM、左旋肉碱0.06mM、氯化胆碱0.06mM、硫胺素焦磷酸45nM；
(2)在无菌条件下先后于0.45μm和0.22μm过滤，得到细胞保存液；
(3)取人间充质干细胞进行处理，先使用细胞消化试剂将细胞消化，将消化好的细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(4)按照1×106/ml细胞浓度用细胞保存液对细胞进行重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口；
(5)将制备好的细胞悬液放入4℃冰箱进行保存。
对比例1
称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、氯化胆碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM；
其余步骤与实施例1相同。
对比例2
称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM；
其余步骤与实施例1相同。
对比例3
称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液，其中，细胞保存液包括以下浓度的组分：NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO3 25mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、氯化胆碱0.05mM；
其余步骤与实施例1相同。
对比例4
(1)选用商品化细胞保存液Hypo Thermosol FRS作为细胞保存液；
(2)取人间充质干细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(3)按照1×106/ml细胞浓度用细胞保存液对细胞进行重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口；
(4)将制备好的细胞悬液放入4℃冰箱进行保存。
将人间充质干细胞按照实施例1-3和对比例1-4方法储存后，分别在指定时间点(0、24、48、72、96、120和144小时)取样进行细胞存活率测定，将取样时间点按相同细胞量铺板继续培养，按DT＝t×[lg2/(lgNt-lgNo)]计算细胞倍增时间，结果如表1和表2所示。
从表1和图1中可以看出，4℃保存条件下，实施例1-3保存人间充质干细胞的效果显著优于对比例1-4。采用本发明优选的细胞保存液保存细胞，人间充质干细胞的活率下降缓慢，48h后细胞活率仍能达到93.06％以上，72h后细胞活率能达到85.4％以上；对比例1-3分别在配方里去除了左旋肉碱、氯化胆碱和硫胺素焦磷酸成分，对比例1的48h和72h细胞活率分别为83.02％和74.61％，对比例2的48h和72h细胞活率分别为86.95％和80.52％，对比例3的48h和72h细胞活率为86.95％和80.52％，都远不及实施例1；对比例4选用商用细胞保存液保存人间充质干细胞，随着保存时间延长，细胞活率下降较快，48h后细胞活率为87.5％，72h后细胞活率仅为75.56％。
从表2可以看出，实施例1-3保存人间充质干细胞后的细胞活性显著优于对比例1-4。实施例1-3保存人间充质干细胞72h后细胞倍增时间在25.11h以内，对比例1-4保存人间充质干细胞后，随保存时间延长，细胞增倍所需时间显著增加，对比例1-4的72h后细胞倍增时间分别为40.6h、38h、40.55h和29.44h。随着时间的延长，实施例1-3相比实施例1-4的细胞倍增时间的缩短更加明显，144h后采用对比例1-4保存的细胞倍增时间分别为实施例1倍增时间的1.65倍、1.7倍、1.69倍和1.86倍。
从表1、图1和表2可以看出本发明的细胞保存液可以延长细胞的保存时间，并且长时间保存后的细胞增倍速度快，细胞活性好。
表1人间充质干细胞在不同时间的存活率
表2人间充质干细胞保存不同时间后培养的倍增时间
间充质干细胞的鉴定标准包括：在标准体外培养条件下呈贴壁生长状态；大于或等于95％的细胞表达CD105、CD73和CD90，且表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19或HLA-Ⅱ类分子的细胞不应超过总数的2％；在体外诱导条件下，具有分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞的能力。
图2和图3表示在实施例1中，人间充质干细胞保存96h后的细胞表面标记物流式分析和分化能力，图2a为表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的细胞，图2b为表达CD73的细胞，图2c为表达CD90的细胞，图2d为表达CD105的细胞，从图中可以看出，实施例1保存96h的细胞仍保持人间充质干细胞生物学活性，图3a为细胞的成脂分化，图3b为细胞的成骨分化，图3c为细胞的成软骨分化，从图3可以看出实施例1保存96h后的细胞仍具有良好的细胞分化能力。
实施例4
本实施例以人间充质干细胞为例，进行细胞保存液的保存浓度对比，采用实施例1中配置的细胞保存液储存不同细胞浓度的人间充质干细胞，于96h取细胞计算细胞存活率，并按相同细胞量铺板继续培养计算细胞倍增时间，表3为不同组别下的细胞浓度。
表4表示不同细胞浓度的人间充质干细胞保存96h后的细胞存活率和倍增时间，从表4中可以看出在1×106/ml细胞浓度条件下，96h后的细胞存活率和倍增时间最佳，过低的细胞浓度和过高的细胞浓度都会影响细胞的存活率和倍增时间，因此在储存细胞时，要注意细胞浓度，选择最合适的浓度范围，以保证保存效果。
表3不同组别的细胞浓度
| 组别 | 细胞浓度 |
| 组1 | 1×10<sup>5</sup>/ml |
| 组2 | 5×10<sup>5</sup>/ml |
| 组3 | 1×10<sup>6</sup>/ml |
| 组4 | 5×10<sup>6</sup>/ml |
| 组5 | 1×10<sup>7</sup>/ml |
表4不同浓度的人间充质干细胞保存后存活率和倍增时间
实施例5
本实施例以人间充质干细胞为例，对细胞保存液的残留对细胞生长的影响进行对比，使用实施例1中配制的细胞保存液储存人间充质干细胞，在96h取细胞，按照相同细胞量不同的细胞铺板方式进行铺板培养，计算细胞倍增时间。组6离心去除细胞保存液后进行铺板，组7直接使用细胞培养基重悬细胞进行铺板。
表5表示不同铺板方式培养的人间充质干细胞的倍增时间，如表5所示，采用实施例1配置的细胞保存液保存细胞，铺张方式对细胞的增倍无明显影响，离心去除细胞保存液后铺张与直接铺张后，人间充质干细胞的倍增时间相近，说明采用本发明优选的细胞保存液，重新培养细胞时不需要去除细胞保存液，减少操作步骤，后续操作更加便利。
表5不同铺板方式培养的人间充质干细胞的倍增时间
实施例6
本实施例采用细胞保存液保存不同类型细胞，进行细胞存活率和活性验证。
分别取hMSC、PBMC、HFF、CHO、293T和MEF细胞，使用实施例1中配制的细胞保存液进行储存，于96h取细胞进行存活率测定，将取样时间点按相同细胞量铺板继续培养，按DT＝t×[lg2/(lgNt-lgNo)]计算细胞倍增时间。
表6为不同细胞在细胞保存液中储存后的存活率和倍增时间，如表6所示，不同细胞在本发明优选的细胞保存液中的保存效果好，96h后细胞的存活率能达到82.68％以上，尤其是CHO细胞，存活率高达97.48％，倍增时间最快仅需19.68h，其中由于PBMC细胞本身的特殊性，本实施例中细胞经细胞保存液储存后仅使用普通培养基可维持细胞量不增殖，说明本发明优选的细胞保存液可以适用于多种细胞的保存。
图4表示不同细胞在细胞保存液中储存后的形态，图4a为hMSC细胞，图4b为PBMC细胞，图4c为HFF细胞，图4d为CHO细胞，图4e为293T细胞，图4f为MEF细胞，从图4可以看出，不同的细胞在保存96h后仍保持了很好的细胞活性。
表6不同细胞在细胞保存液中储存后的存活率和倍增时间
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：
无机盐缓冲液3～250mM、海藻糖1～50mg/ml、氨基酸混合液2～120mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM和硫胺素焦磷酸0.1～100nM。
2.如权利要求1所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述无机盐缓冲液选用NaCl、KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3中的一种或多种；
所述氨基酸混合液选用谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：
NaCl 1～110mM、KH2PO4 1～10mM、CaCl2 0.1～10mM、MgSO4 0.1～1mM、NaHCO3 1～100mM、海藻糖1～50mg/ml、蔗糖0.1～10mg/ml、甘油0.01～0.5mM、谷氨酸0.03～10mM、L-谷氨酰胺1～100mM、L-天冬氨酸1～10mM、左旋肉碱0.01～1mM、氯化胆碱0.01～1mM、硫胺素焦磷酸1～100nM。
4.如权利要求3所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：
NaCl 10～30mM、KH2PO4 2～8mM、CaCl2 0.1～5mM、MgSO4 0.3～0.6mM、NaHCO3 10～30mM、海藻糖10～40mg/ml、蔗糖0.1～2mg/ml、甘油0.01～0.3mM、谷氨酸0.03～1mM、L-谷氨酰胺1～20mM、L-天冬氨酸2～5mM、左旋肉碱0.04～0.06mM、氯化胆碱0.04～0.06mM、硫胺素焦磷酸20～50nM。
5.如权利要求4所述的维持细胞活性的保存液，其特征在于：所述保存液包括以下成分：
NaCl 12.7mM、KH2PO4 5mM、CaCl2 1.25mM、MgSO4 0.45mM、NaHCO325mM、海藻糖20mg/ml、蔗糖0.8mg/ml、甘油0.11mM、谷氨酸0.3mM、L-谷氨酰胺12mM、L-天冬氨酸4.4mM、左旋肉碱0.05mM、氯化胆碱0.05mM、硫胺素焦磷酸40nM。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述的保存液的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)按浓度称取各成分并使用超纯水充分溶解，得到混合溶液；
(2)将混合溶液在无菌条件下过滤，得到细胞保存液。
7.如权利要求6所述的保存液的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)包括：
用0.3-0.5μm的过滤膜对混合溶液进行第一次过滤处理；
用0.15-0.25μm的过滤膜对混合溶液进行第二次过滤处理，得到细胞保存液。
8.一种利用权利要求1-5任一项所述的保存液保存细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将细胞用生理盐水重悬，进行计数；
(2)将细胞用所述保存液重悬，分装至细胞冻存管或冻存袋中，封口，得到细胞悬液；
(3)将所述细胞悬液放入2～8℃的储存箱进行保存；
(4)将所述细胞悬液取出直接应用或者再次培养。
9.如权利要求8所述的保存液保存细胞的方法，其特征在于：步骤(1)的所述细胞包括贴壁细胞和悬浮细胞；
所述贴壁细胞在重悬前先使用细胞消化试剂将细胞消化；
所述悬浮细胞直接重悬。
10.如权利要求8所述的保存液保存细胞的方法，其特征在于：所述细胞悬液再次培养时，包括：
在所述细胞悬液中直接加入细胞培养基混匀，转移至细胞培养瓶或细胞培养皿中，并于37～39℃、4～6％CO2条件下培养。
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