CN108651442A

CN108651442A - 一种间充质干细胞4℃储存液

Info

Publication number: CN108651442A
Application number: CN201810485856.0A
Authority: CN
Inventors: 程蕊苹; 邓志宏
Original assignee: Guangdong Fu Jin Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fu Jin Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2018-10-16

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞4℃储存液，其成份包括人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、乳酸钠林格注射液、肝素、L‑谷氨酰胺、EDTA、磷酸盐缓冲液、亚硒酸钠、必需氨基酸、非必需氨基酸等，本发明提供的配方可以维持细胞在4℃保存或运输中经过48h仍保持80%以上的活力和70%以上的贴壁率，能够满足新鲜间充质干细胞的短途运输需求，并且该储存液使用成份明确的临床药品，对人体安全，恢复至室温可直接进行注射，极大方便了间充质干细胞制剂短途运输后的临床应用。

Description

一种间充质干细胞4℃储存液

技术领域

本发明属于间充质干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞4℃储存液。

背景技术

间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSC)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点。目前使用最多的主要有脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞等。

研究表明，人间充质干细胞在软骨再生、脑缺血性疾病、糖尿病、类风湿性关节炎等动物模型和临床研究中有良好的治疗效果，显示出广阔的应用前景。鉴于大多企业趋于通过体外对间充质干细胞进行分离培养、扩增，检测合格后制备成制剂，以制剂的形式应用于临床，但是在运输过程中没有一种很好的储存液来维持细胞的活力和功能，由于营养成份不足、渗透压变化、PH改变、电解质不足等引起的细胞死亡或凋亡。

但是,目前还没有一种储存效果优良的间充质干细胞4℃储存液，能够在4℃保存或运输中经过48h后仍维持间充质干细胞80％以上的活率和70％以上的贴壁率,极大的限制了间充质干细胞制剂在短途运输后的临床应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术问题中间充质干细胞4℃储存液存储间充质干细胞效果不理想的技术缺陷。

为此，本发明提供了一种间充质干细胞4℃储存液，该存储液的成分主要包括：人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、乳酸钠林格注射液、肝素、L-谷氨酰胺、EDTA、磷酸盐缓冲液、亚硒酸钠。

上述该存储液的各个成分的浓度为：人血白蛋白为0.5％-5％mg/ml，氯化钠为0.85％-0.9％mg/ml，葡萄糖为0.1％-5％mg/ml，海藻糖为10-200mM，乳酸钠林格注射液为86％-98％ml/ml，肝素为0.5％-2.66％IU/ml，L-谷氨酰胺为1-10mM，EDTA为0.01-0.4％mg/ml，磷酸盐缓冲液为65％-95％ml/ml，亚硒酸钠为0.01％-0.5％mg/ml，氨基酸为1％-10％ml/ml。

进一步，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为1％mg/ml，氯化钠为0.9％ml/ml，海藻糖为50mM，肝素为1.33％IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05％mg/ml，磷酸盐缓冲液为94.8％ml/ml，亚硒酸钠为0.05％mg/ml，复合氨基酸为5％ml/ml。

进一步，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为1％mg/ml，氯化钠为0.9％mg/ml，葡萄糖为5％mg/ml，乳酸钠林格注射液为91.65％ml/ml，肝素为1.33％IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05％mg/ml，亚硒酸钠为0.1％mg/ml，复合氨基酸为5％ml/ml。

进一步，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为2％mg/ml，氯化钠为0.9％mg/ml，葡萄糖为5％mg/ml，乳酸钠林格注射液为95.10％ml/ml，肝素为1.33％IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05％mg/ml，亚硒酸钠为0.1％mg/ml，复合氨基酸为10％ml/ml。

使用间充质干细胞4℃储存液存储间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)将消化好的间充质干细胞用生理盐水洗涤2-3次，进行计数，按照1-10E5/mL的细胞浓度用所制备的间充质干细胞4℃储存液对细胞进行重悬，分装至50mL转移袋中，然后热合封口，制备成间充质干细胞制剂；

(2)将制备好的间充质干细胞制剂放入4℃冰箱或4℃运输箱进行保存，以便48h之内进行使用。

本发明的有益效果：本发明提供的这种新型的间充质干细胞4℃储存液，是一种可在4℃保存或运输中经过48h后仍维持间充质干细胞80％以上的活率和70％以上的贴壁率的储存液，能够满足新鲜间充质干细胞的短途运输需求，并且该储存液使用成份明确的临床药品，对人体安全，恢复至室温可直接进行注射，极大方便了间充质干细胞制剂短途运输后的临床应用。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1实施例3中的间充质干细胞贴壁结果。

图2a实施例3中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在4倍镜下的图像。

图2b实施例3中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在20倍镜下的图像。

图3实施例4中的间充质干细胞贴壁结果。

图4a实施例4中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在4倍镜下的图像。

图4b实施例4中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在20倍镜下的图像。

图5实施例5中的间充质干细胞贴壁结果。

图6a实施例5中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在4倍镜下的图像。

图6b实施例5中的间充质干细胞放置48h后成脂分化染色在20倍镜下的图像。

具体实施方式

为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。

实施例1

为了克服现有技术问题中间充质干细胞4℃储存液存储间充质干细胞效果不理想的技术缺陷；本发明提供一种间充质干细胞4℃储存液，该存储液的成分主要包括：人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、乳酸钠林格注射液、肝素、L-谷氨酰胺、EDTA、磷酸盐缓冲液、亚硒酸钠。

在本技术方案中，间充质干细胞4℃储存液各成份的作用如下：

人血白蛋白：主要调节细胞内水分动态平衡，维持细胞溶液渗透压作用，也是一种非渗透性冷冻保护剂。

海藻糖：细胞生物活性物质的稳定剂，用于细胞的的保存，可有效保护细胞膜及胞内活性蛋白。

氯化钠：在生理盐水浓度下可有效调节溶液的渗透压，保持液体渗透压相对平衡，从而使细胞不受渗透压的影响。

肝素：作为抗凝剂，具有抗凝血、抗血栓的作用，用于细胞制剂中防止细胞静脉注射后产生凝集反应。

葡萄糖：5％的浓度可以有效维持细胞渗透压，保持细胞渗透压相对平衡，同时为细胞基础代谢提供能量，有效维持细胞的能量需求。

乳酸钠林格注射液：调节体液、电解质及酸碱平衡，乳酸钠的pH为6.5～7.5，口服后很快被吸收，在1～2小时内经肝脏氧化，代谢转变为碳酸氢钠，但一般以静脉注射为常用，用乳酸钠替代醋酸钠作腹膜透析液的缓冲剂可减少腹膜刺激，对心机抑制和周围血管阻力影响也可有所减少。

L-谷氨酰胺：L-谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。

EDTA：是二价金属螯合剂，抗凝剂，可抑制核酸酶活性。

磷酸盐缓冲液：是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液，有助于保持恒定的pH值，维持体系渗透压和离子浓度，通常与人体pH相近(等渗)。

亚硒酸钠：硒是谷胱苷肽过氧化酶的组成部分，通过氧化作用维持细胞膜的功能，提高蛋白质的脂类性质的内源性抗氧化剂的产量。参与能量的转化，影响代谢，对脂肪的乳化、吸收和多种维生素的吸收起着极其重要的作用。同时还参与与辅酶A、辅酶Q的合成，影响其他生物酶系统的功能。对氨基酸的代谢、蛋白质的合成、糖类代谢、生物氧化都有影响。

氨基酸：氨基酸包括必需氨基酸和非必须氨基酸，必需氨基酸赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。

上述该存储液的各个成分的浓度可为：人血白蛋白为0.5％-5％mg/ml，氯化钠为0.85％-0.9％mg/ml，葡萄糖为0.1％-5％mg/ml，海藻糖为10-200mM，乳酸钠林格注射液为86％-98％ml/ml，肝素为0.5％-2.66％IU/ml，L-谷氨酰胺为1-10mM，EDTA为0.01-0.4％mg/ml，磷酸盐缓冲液为65％-95％ml/ml，亚硒酸钠为0.01％-0.5％mg/ml，氨基酸为1％-10％ml/ml。

综上所述，该间充质干细胞4℃储存液是一种可在4℃保存或运输中经过48h后仍维持间充质干细胞80％以上的活率和70％以上的贴壁率的储存液，能够满足新鲜间充质干细胞的短途运输需求，并且该储存液使用成份明确的临床药品，对人体安全，恢复至室温可直接进行注射，极大方便了间充质干细胞制剂短途运输后的临床应用。

实施例2

使用间充质干细胞4℃储存液存储间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

⑴各个成份包括人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、乳酸钠林格注射液、肝素、L-谷氨酰胺、EDTA、磷酸盐缓冲液、亚硒酸钠，按照技术方案的浓度配制间充质干细胞4℃储存液。

⑵将消化好的间充质干细胞用生理盐水洗涤2-3次，进行计数，按照1-10E5/mL的细胞浓度用上述间充质干细胞4℃储存液对细胞进行重悬，分装至50mL转移袋中，每袋40mL，然后热合封口，制备成间充质干细胞制剂。

⑶将制备好的间充质干细胞制剂放入4℃冰箱或4℃运输箱进行保存，48h之内使用。

⑷静脉输注前将间充质干细胞制剂回温至室温，轻柔摇晃使细胞分散，然后进行静脉注射，每袋宜在15-20min内打完。

实施例3

⑴按照各个成份人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、肝素、磷酸盐缓冲液、L-谷氨酰胺、EDTA、亚硒酸钠、复合氨基酸的浓度配制间充质干细胞4℃储存液。

⑵将消化好的间充质干细胞用生理盐水洗涤2-3次，进行计数，按照1-10E5/mL用上述间充质干细胞4℃储存液进行重悬，分装至50mL转移袋中，每袋40mL，然后热合封口，制备成间充质干细胞制剂。

⑶将制备好的间充质干细胞制剂放入4℃冰箱或4℃运输箱进行保存。

⑷分别在0h 6h 17h 24h 48h时进行取样，每组2个重复，分别检测间充质干细胞活率(台盼蓝拒染法)和贴壁率，贴壁率＝贴壁细胞/(贴壁细胞+死细胞)，取48h样品铺板进行成脂分化检测，如图1、图2所示。

⑸检测结果如下

表1

时间点	0h	6h	17h	24h	48h
						平均活率	96.67％	92.82％	92.05％	90.48％	88.51％
平均贴壁率	88.89％	85.67％	82.95％	76.83％	75.36％

⑹将制备好的间充质干细胞制剂于4℃冰箱或4℃运输箱保存48h后对5只小鼠进行尾静脉注射，每只注射1mL，观察一周未见小鼠产生异常反应。

实施例4

⑴按照各个成份人血白蛋白、葡萄糖、氯化钠、肝素、乳酸钠林格注射液、L-谷氨酰胺、EDTA、亚硒酸钠的浓度配制间充质干细胞4℃储存液。

⑷分别在0h 6h 17h 24h 48h时进行取样，每组2个重复，分别检测间充质干细胞活率(台盼蓝拒染法)和贴壁率，贴壁率＝贴壁细胞/(贴壁细胞+死细胞)，取48h样品铺板进行成脂分化检测，如图3、图4所示。

⑸检测结果如下

表2

时间点	0h	6h	17h	24h	48h
						平均活率	93.98％	92.11％	95.36h％	88.41％	89.39％
平均贴壁率	84.06％	87.59％	83.76％	74.35％	79.78％

⑹将制备好的间充质干细胞制剂于4℃冰箱或4℃运输箱保存36h后对5只小鼠进行尾静脉注射，每只注射1mL，观察一周未见小鼠产生异常反应。

实施例5

⑴按照各个成份人血白蛋白、葡萄糖、氯化钠、肝素、乳酸钠林格注射液、L-谷氨酰胺、EDTA、亚硒酸钠、复合氨基酸的浓度配制间充质干细胞4℃储存液。

⑷分别在0h 6h 17h 24h 48h时进行取样，每组2个重复，分别检测间充质干细胞活率(台盼蓝拒染法)和贴壁率，贴壁率＝贴壁细胞/(贴壁细胞+死细胞)，取48h样品铺板进行成脂分化检测，如图5、图6所示。

⑸检测结果如下

表3

时间点	0h	6h	17h	24h	48h
						平均活率	90.91％	93.10％	88.62％	85.47％	89.88％
平均贴壁率	88.36h％	86.28％	81.05％	75.29％	72.65％

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种间充质干细胞4℃储存液，其特征在于，该存储液的成分主要包括：人血白蛋白、海藻糖、氯化钠、葡萄糖、乳酸钠林格注射液、肝素、L-谷氨酰胺、EDTA、磷酸盐缓冲液、亚硒酸钠。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞4℃储存液，其特征在于，该存储液的各个成分的浓度为：人血白蛋白为0.5%-5%mg/ml，氯化钠为0.85%-0.9%mg/ ml，葡萄糖为0.1%-5% mg/ml，海藻糖为10-200mM，乳酸钠林格注射液为86% -98%ml/ml，肝素为0.5%-2.66%IU/ml，L-谷氨酰胺为1-10mM，EDTA为0.01-0.4%mg/ml，磷酸盐缓冲液为65%-95%ml/ml，亚硒酸钠为0.01%-0.5%mg/ml，氨基酸为1%-10%ml/ml。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞4℃储存液，其特征在于，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为1% mg/ml，氯化钠为0.9% ml/ml，海藻糖为50mM，肝素为1.33%IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05% mg/ml，磷酸盐缓冲液为94.8% ml/ml，亚硒酸钠为0.05% mg/ml，复合氨基酸为5% ml/ml。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞4℃储存液，其特征在于，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为1% mg/ml，氯化钠为0.9% mg/ml，葡萄糖为5% mg/ml，乳酸钠林格注射液为91.65% ml/ml，肝素为1.33% IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05% mg/ml，亚硒酸钠为0.1% mg/ml，复合氨基酸为5% ml/ml。

5.如权利要求1所述的间充质干细胞4℃储存液，其特征在于，该存储液的各个成分的浓度具体为：人血白蛋白为2% mg/ml，氯化钠为0.9% mg/ml，葡萄糖为5% mg/ml，乳酸钠林格注射液为95.10% ml/ml，肝素为1.33% IU/ml，L-谷氨酰胺为1mM，EDTA为0.05% mg/ml，亚硒酸钠为0.1% mg/ml，复合氨基酸为10% ml/ml。

6.使用权利要求1所述的间充质干细胞4℃储存液存储间充质干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将消化好的间充质干细胞用生理盐水洗涤2-3次，进行计数，按照1-10E5/mL的细胞浓度用所制备的间充质干细胞4℃储存液对细胞进行重悬，分装至50mL转移袋中，然后热合封口，制备成间充质干细胞制剂；

（2）将制备好的间充质干细胞制剂放入4℃冰箱或4℃运输箱进行保存，以便48h之内进行使用。