KR20110016175A

KR20110016175A - 세포 보존 방법 및 세포 보존 조성물

Info

Publication number: KR20110016175A
Application number: KR1020090073752A
Authority: KR
Inventors: 최태부
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2011-02-17

Abstract

본 발명은 1차 세포 및 확립된 세포주를 포함하는 동물세포의 저온보존에 관한 것이다. 특히, 본 발명에서 제공한 보존용기의 회전 및 반전을 이용한 보존 방법은 보존 기간 동안 현저하게 증가된 세포 생존율을 보이며, 단백질 성분의 가수분해물을 함유한 배지에 첨가물을 첨가한 세포 보존 조성물은 세포 손상을 감소시켜 세포의 보존 기간을 신장시키므로 다양한 세포 내지는 조직, 장기의 보존에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

세포(Cell), 세포주(Cell line), 가수분해물(hydrolysate), 배지(medium), 회전(Rolling), 반전(Reverting)

Description

세포 보존 방법 및 세포 보존 조성물{METHOD AND COMPOSITION FOR PRESERVING CELLS}

본 발명은 세포의 저온 보존 방법과 세포 보존 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 세포의 저온보존(0℃~10℃)에 있어 보존용액을 회전(rolling)하거나 반전(inverting)하여 세포의 보존을 개선시키는 보존 방법과 유효성분으로 적어도 단백질 가수분해(protein hydrolysate)성분을 함유하는 가수분해물(hydrolysate)을 포함한 보존액 조성물에 관한 것이다.

살아있는 세포는 세포 고유의 생리적 기능과 활성을 가지며 이는 여러 방면에서 다양한 이용 가치를 가지게 한다. 최근에는 살아있는 세포를 이용하여 다양한 질병의 치료에 적용하는 세포치료제 연구가 활발히 이루어지고 있어, 치료용 단백질과 같은 세포 생산물 이용 분야에서부터 세포 자체를 직접 이용하는 분야까지 그 범위가 확대되고 있다. 세포를 이용한 모든 치료 및 공정은 세포가 살아있어야 하며 세포의 고유 기능이 유지되어 있는 상태여야 하기 때문에 세포의 생존을 유지시키는 세포 보존기술은 세포를 이용한 모든 분야에서 매우 중요한 요소이다.

일반적으로 세포를 보존하는 데에는 4℃ 저온보존과 -80 ~ -196℃ 동결보존 의 두 가지 방법이 주로 사용되고 있다. 이론적으로 저온보존을 통해 수일에서 수 주간 세포보존이 가능하고, 동결보존의 경우는 몇 달에서 몇 년간의 보존이 가능하다. 동결보존은 보존 기간이 길지만 세포 생존율의 급격한 감소, 세포 손상 및 유전자 변이, 세포 기능 저하의 문제점이 저온보존의 경우보다 많기 때문에 세포를 직접 이용하는 분야에서는 동결보존법을 적용하기에 무리가 있다. 따라서 치료 목적의 세포를 보존하는 데에는 주로 저온보존법이 이용되고 있다.

세포보존과 관련된 세포손상은 그 종류가 많은 반면에 아직 완전히 알려져 있지는 않은데, 최근의 연구에 따르면 저온에 의한 스트레스가 지속되면서 에너지 부족이 발생하고 산화체계의 파괴로 활성산소가 생성되며 이에 따른 일련의 과정으로 결국 세포는 죽음에 이르게 된다. 이러한 연구들은 세포의 생존율과 기능이 보존 과정 및 형태에 의해 상당히 영향을 받으며, 보존액의 조성 등에 의해 보존효과가 개선될 수 있음을 제시한다.

세포나 조직의 저온보존에는 콜린스(Collins)액, 유로콜린스(Euro-Collins)액, Sacks액, UW(University of Wisconsin)액 등의 보존액이 종래부터 이용되고 있으며, 현재 가장 널리 사용되고 있는 UW액은 다양한 장기(organs)의 이식에서 주로 적용되고 있다. 하지만 이러한 용액들도 실제 임상에서는 장기를 24시간 이상 보존하기가 어려운 실정이다. 또한 장기 보존을 최적화하기 위해 설계된 용액이기 때문에 세포의 보존에서는 보존능력이 탁월하지 못하여 그 효과가 미미하다.

본 발명자들은 종래 개발된 세포 및 장기 보존 조성물의 보존능력을 개선하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 저온보존시에 보존 용기를 회전 및/또는 반전하면 종래의 정치 보존 방법보다 개선된 효과를 보이며, 단백질 성분의 가수분해물을 함유한 배지에 항산화제, 삼투 조절제 및/또는 에너지 공급원을 첨가하면 종래의 세포 보존 조성물보다 개선된 효과를 보임을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 개선된 세포의 저온 보존 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 개선된 세포 보존 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1)세포; 및 단백질 성분을 함유하는 가수분해물을 함유한 배지로 구성된 보존액을 용기에 넣는 단계, (2) 상기 용기를 저온에서, 회전 또는 반전하는 단계를 포함하는 세포의 보존 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 미생물, 동물 또는 식물 유래의 단백질 성분을 함유하는 가수분해물을 함유한 배지에 항산화제, 삼투 조절제 및 에너지 공급원 중에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 첨가한 세포 보존 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 세포는 동물 세포이며, 바람직하게는 장기(organ)나 조직(tissue)에서 유래하는 1차 배양 세포 또는 확립된 세포주이다.

본 명세서에서 용어 "장기(organ)"은 본 발명의 조성물이 적용되는 대상을 구체적으로 표현한 것일 뿐이며, 본 발명의 조성물은 장기 이외에도 장기의 일부분, 조직 그리고 조직의 일부분에서 유래하는 세포의 보존에 적용된다. 나아가 장기나 조직 자체의 보존에도 적용될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물과 관련하여 이용되는 용어 "장기"는 상기한 장기, 장기의 일부, 조직 그리고 조직의 일부분을 포함하는 포괄적인 의미로 해석된다. 본 발명의 조성물은 다양한 세포에 적용될 수 있으며, 나아가 장기나 조직의 보존에 있어서도 적용될 수 있다.

본 발명에서는 1차 배양세포인 HDF(Human dermal fibroblast,MTT) 인간 피부각질세포주인 HaCaT(donated by Dr. Fusening), 산업용 세포주인 CHO(Chinese hamster ovary, 한국세포주은행)세포를 사용하였는데, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 저온보존 세포의 밀도는 0.5 ~ 2 x 10⁶ 세포/ml 이다.

본 발명의 용기는 원통형의 크리오바이알(cryovial)을 사용하였으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니고 회전이나 반전에 용이한 구조면 사용 가능하다.

본 발명의 저온이란, 용액이 동결하지 않는 조건으로서, 0 내지 25℃, 바람직하게는 0 내지 10 ℃, 더욱 바람직하게는 4 내지 6℃의 범위이다.

본 발명의 회전 또는 반전은 정치 상태로 두게 되면 세포가 뭉치게 되는 현상을 방지하기 위한 것이며, 이는 세포와 저온보존액의 접촉을 증가시켜 높은 세포밀도에 따른 저온에서의 세포 손상을 감소시킨다. 회전 또는 반전 속도는 1 내지 30 rpm, 바람직하게는 1 내지 10 rpm 이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "세포 보존 조성물"은 "보존액", "세포 보존액", "세포 배양액", "배지"를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "가수분해물"이란 용어는 임의의 효소의 분해물, 특히 추출할 물질 (예: 식물 구성 재료, 동물 구성 재료 또는 효모 세포)의 구성재료를 더 간단한 형태( 예컨대, 단당류 또는 이당류 및/또는 이당류 및/또는 모노펩타이드, 디펩타이드 또는 트리펩타이드를 포함하는 제조물)로 붕괴할 수 있는 적어도 하나의 효소로 처리함으로써 제조되는 특별한 유형의 추출물을 포함한다. 또한, "가수분해물"은 효소 분해될 수 있고(있거나), 그 외에도 자가분해, 열분해 및/또는 원형질 분리에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 일부 실시 양태에서 동물계 가수분해물의 예는 젤라틴(gelatin), 카제인(casein), 알부민(albumin), 락트알부민(lactalbumin) 또는 콜라겐(collagen) 등의 가수분해물이 포함되고, 식물계 가수분해물의 예는 목화(cotton), 완두콩(pea), 벼(rice), 대두(soybean), 밀(wheat) 또는 옥수수(corn) 등의 가수분해물이 포함되며, 미생물계 가수분해물의 예는 효모(yeast) 등의 가수분해물이 포함되나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용되는 효모 가수분해물의 예는 TC Yeastolate(BD Diagnostic) 및 Yeastolate UF(SAFC Biosciences) 가 있다.

일부 실시 양태에서, 가수분해물의 양은 조성물 중에 0.01 내지 30%(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 10 %(w/v), 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 %(w/v) 범위의 양으로 존재한다.

본 발명의 "배지"는 통상적인 배지를 사용할 수 있다. "배지"란 용어는 세포의 성장과 보존을 지지할 수 있는 임의의 배지를 의미한다. 배지는 표준 무기 염, 예컨대 아연, 철, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨뿐만 아니라, 미량원소, 비타민, 에너지 공급원, 완충 시스템 및 필수아미노산을 공급한다.

바람직한 양태에서 본 발명의 세포 보존액 배지는 혈청 (예컨대, 소태아 혈청(FBS), 말 혈청, 염소 혈청 또는 당업자에게 공지된 다른 임의의 동물 유래 혈청)을 함유하지 않는 것을 의미하는 무혈청 배지이다.

본 발명은 전적으로 또는 부분적으로 변형된 배지를 포함하는 보존액을 제공한다. 변형된 세포 배지는 당업계에 공지된 표준 기본 세포 배지에서 유래될 수 있다. 적당한 기본 배지의 예로는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지 (minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지 (α-MEM), 맥코이스 (McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL (Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스 (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 및 이들의 혼합 배지가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 일부 실시 양태에서는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)과 F-12(nutrient mixture)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지를 포함한다.

본 발명은 미생물, 동물 또는 식물 유래의 단백질 성분을 함유하는 가수분해물을 함유한 배지에 항산화제, 삼투 조절제 및 에너지 공급원 중에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 첨가한 세포 보존액을 제공한다.

본 발명에서는 항산화제를 세포의 저온 보존시 발생되는 세포손상을 억제하는 성분으로 이용한다.

본 발명의 항산화제는 공지되어 있으며, 일부 실시 양태로 알파 토코페롤(비타민 E), 알파 토코페롤 아세테이트, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니돌, 부틸화 하이드록시퀴논, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이드록시시쿠마린, 에틸 갈레이트, 프로필 갈레이트, 옥틸 갈레이트, 라우릴 갈레이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 트리하이드록시부틸로페논, 디메틸페놀, 레시틴, 조효소 Q10, 에탄올아민 또는 이들의 배합물 등이 있고, 알파 토코페롤이 바람직하다.

일부 실시양태에서 항산화제의 양은 알파 토코페롤의 경우에는 일반적으로 1 내지 1000uM, 바람직하게는 10 내지 500uM 범위의 양으로 존재한다. 항산화제의 양이 10uM 미만인 경우에는 세포 손상 방지의 효과가 거의 나타나지 않고, 500uM 을 초과하는 경우에는 항산화제의 비특이적인(non-specific) 작용으로 인한 세포독성의 문제점이 있다.

본 발명의 삼투 조절제는 공지되어 있으며, 일부 실시 양태로 덱스트란, 염화 나트륨, 포도당, 소르비톨, 자일리톨, 만니톨, 덱스트로스, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산나트륨, 링거용액, 락테이트화시킨 링거 용액, 하이드록시에틸 전분, 라피노오스, 글라이세롤 또는 이들의 조합 등이 있고, 염화나트륨 및/또는 텍스트로스가 바람직하다.

본 발명의 조성물이 상기의 삼투압 조절제를 포함하는 경우에는 이들 세포막 투과 분자들 때문에 고삼투압(hyperosmolar)용액이 되며, 이는 냉장 보관에서 자주 발견되는 세포 부종(cell oedema)을 억제하는 작용을 한다.

일부 실시 양태에서, 삼투조절제의 양은 덱스트란이 이용되는 경우에는 조성물 중에 1 내지 500mg/mL , 바람직하게는 10 내지 100 mg/ml, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 mg/ml 범위의 양으로 존재한다.

한편, 에너지 공급원의 결여는 장기 보존의 경우 장기 손상을 가져오는 중요한 요인 중에 하나이다. 따라서, 본 발명의 일부 실시 양태로, 본 발명의 조성물은 에너지 공급원을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 에너지 공급원으로 이용 가능한 것은 당업계에서 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 일부 실시 양태로 아데노신-5-트리포스페이트(ATP, adenosine 5'-triphosphate), 아데노신-5-트리포스페이트 이나트륨 염, 글루코스, 말토스, 만노스, 갈락토스 또는 프럭토스 등이 있고, 아데노신-5-트리포스페이트(ATP, aden.osine 5'-triphosphate) 및/또는 아데노신-5-트리포스페이트 이나트륨 염이 바람직하다.

일부 실시 양태에서, 에너지 공급원이 아데노신-5-트리포스페이트인 경우 조성물 중에 1 내지 100mM, 바람직하게는 1 내지 50mM, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 mM 범위의 양으로 존재한다

본 발명에서는 KUL261 보존액을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 "KUL261" 보존액은 DMEM/F-12, 효모 가수분해물, 알파토코페롤, 덱스트란 및 ATP를 포함한다. 상기 KUL261 보존액의 바람직한 양태는 효모 가수분해물(yeastolate)을 0.01 내지 30%(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 10 %(w/v)로 포함한 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)과 F-12(nutrient mixture)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지에 알파토코페롤을 1 내지 1000uM, 바람직하게는 1 내지 100 uM 로 포함하고, 덱스트란을 1 내지 500mg/ml, 바람직하게는 10 내지 50 mg/ml로 포함하며, ATP 를 1 내지 100mM, 바람직하게는 1 내지 5mM 로 포함하는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 세포의 저온보존은 보존 방식에 따라 보존능력이 개선될 수 있으며 본 발명에서 제시한 방법인 보존용기의 회전 및 반전을 통한 보존방법은 정치를 통한 방법보다 개선된 세포 저온보존법을 제공한다. 또한 본 발명에서 제공한 세포 보존 조성물은 저온보존 기간 동안 현저히 우수한 세포 보존능력을 제공한다. 특히, 본 발명의 저온보존액은 확립된 세포주에 비해 저온에 의한 세포손상을 더 많이 입는 1차 세포의 보존에서 최소 1주일 이상의 보존기간을 제공하므로, 다양한 동물세포 내지는 조직의 보존에서도 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 저온보존 방식에 따른 세포의 저온보존 효과

본 발명자들은 세포의 저온보존에서 보존 형태가 미치는 효과를 조사하여 세포 보존능력이 개선된 저온보존 방식을 제공하고자 하였다. 저온보존에 사용한 세포는 확립된 세포주로서 산업용으로 널리 쓰이는 CHO(Chinese hamster ovary, 한국세포주은행)세포와 인간 피부각질세포인 HaCaT(donated by Dr. Fusenig)을 사용하였으며 1차 배양세포로는 HDF(Human dermal fibroblast, MTT)세포를 사용하였다. 각 세포는 5% CO₂, 37℃의 배양 환경에서 저온보존 실시 전까지 세포배양용 디쉬에 컨플루언스(confluence)까지 생장시켰으며, 저온보존 직전에 Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 회수한 후 저온보존액에 재현탁시켰다. 본 실시예에서는 저온보존 용기로 원통형의 크리오바이알을 사용하였으며 약 1 x 10⁶세포/ml의 세포농도로 0~10℃ 온도 범위의 콜드챔버(cold chamber)에서 세포를 저온보존한 후 트리판블루(Trypan blue) 염색시약을 이용하여 세포생존율을 측정하였다.

상기의 세포배양, 회수 및 저온보존 과정은 이하 실시예 2 내지 5에서도 동일하게 적용하였다. 본 실시예에서는 저온보존액으로 시판중인 무혈청배지(Sigma, C5467)를 이용하였으며, 저온보존 방식은 종래의 저온보존 방식으로 사용되는 정치보존 형태로서 보존 용기를 세워두거나 눕힌 상태로 보존하는 방식과 본 발명자들이 제안한 방법인 보존용기를 1~10 rpm으로 서서히 회전하거나 반전하여 보존하는 방식으로 실시하였다. ( 도1 )

저온보존 기간 동안의 세포 생존율을 비교하여 세포 보존능력을 평가한 결과, 보존용기를 서서히 회전하거나 반전하여 보존한 방식에서 보존용기를 세워두거나 눕혀 보존한 방식에 대해 우수한 세포 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 본 실시예에서 사용한 세포주 내지는 1차 세포 모두에서 유사한 경향을 나타내었다.( 도2 a~c) 확립된 세포주인 CHO세포와 HaCaT세포는 1차배양 세포인 HDF세포에 비해 저온에 의한 세포손상이 적어 상대적으로 오랜 기간 저온보존이 가능하였으나 보존방식에 따른 경향성은 동일하였다.

따라서 세포의 저온보존시 보존용기를 서서히 회전하거나 반전하여 보존하는 방법은 기존의 정치보존에 의한 보존방법보다 우수한 보존능력을 제공하였다. 상기 결과에 따라 이하 실시예에서는 모두 보존용기를 회전하는 저온보존법을 세포의 보존에 적용하였다.

< 실시예 2> 가수분해물이 포함된 저온보존액의 보존능력 개선 효과

본 실시예를 포함한 이하 실시예(실시예 3~5)에서는 1차 배양세포인 HDF세포 를 이용하여 저온보존액의 보존능력을 평가하였다. 1차 배양 세포는 확립된 세포주에 비해 저온에 의한 세포손상이 상대적으로 크므로 1차배양 세포를 이용한 평가는 세포주를 이용하는 것보다 저온보존액을 평가하는데 적절하다. 보존에 사용한 HDF세포는 앞선 실시예에 따라 배양 및 회수하였으며, 기본 저온보존액으로 DMEM/F12(1:1(v/v)) 배지를 사용한 것과 기본 저온보존액에 유효성분으로 가수분해물을 첨가한 보존액을 사용한 것을 비교하여 세포 보존능력을 평가하였다. 본 실시예에서 사용한 가수분해물은 미생물, 동물, 식물 유래의 가수분해물로서 효모(yeast), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein), 알부민(albumin), 락트알부민(lactalbumin), 콜라겐(collagen), 목화(cotton), 완두콩(pea), 벼(rice), 대두(soybean), 밀(wheat) 또는 옥수수(corn)의 가수분해물을 사용하였다.

상기 가수분해물을 기본 저온보존액에 0.5% 씩 첨가하여 HDF세포를 저온보존한 결과, 저온보존 기간동안 기본 저온보존액을 이용한 것에 비해 월등히 우수한 세포 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 가수분해물 별로 다소 상이하기는 하지만 상기 가수분해물 모두에서 유사하게 나타났으며, 대부분 저온보존 1주일 간 80% 이상의 세포 생존율을 유지하였다. ( 도3 a~b)

따라서 대부분의 가수분해물은 세포의 저온보존에서 세포죽음을 억제하는 핵심적인 역할을 하는 것으로 보이며 저온보존액 유효성분으로 충분한 가치를 지닌다고 볼 수 있다.

또한, 생세포 내의 ATP 함량은 루시퍼레이즈(luciferase)를 이용한 시판용 시험시약(assay kit)(Sigma, FLAA-IKT)을 사용하여 실시하였는데, 보존 중인 세포 를 회수하여 계수한 후 생세포 수를 기준으로 96-well 플레이트에 세포 5000개를 로딩(loading)하고 발광측정기(luminometer)를 이용하여 ATP 함량을 결정하였다. 저온보존 24시간 후에 기본 저온보존액과 가수분해물이 첨가된 저온보존액에서의 세포내 ATP 함량을 조사한 결과, 가수분해물이 포함된 보존액에서 보존된 세포의 ATP 함량이 기본 저온보존액에서 보존된 세포의 ATP 함량보다 현저히 높음을 확인하였다.( 도3 c)

본 실시예에서는 ATP함량을 결정할 때 생세포만을 기준으로 하였으므로 저온보존에 의한 세포죽음이 세포내 ATP 소모에 의한 것이라는 종래의 이론을 확인할 수 있었으며, 가수분해물이 이러한 세포내 ATP 감소를 막아주는 핵심 성분으로 작용함을 확인하였다. 따라서 저온보존액의 유효성분으로서 가수분해물의 첨가는 세포의 저온보존에 있어 우수한 보존능력을 제공함을 확인하였다.

< 실시예 3> 가수분해물 농도에 따른 세포의 저온보존 효과

상기 실시예에서 확인된 세포의 저온보존에서 가수분해물의 효과를 더욱 확실히 하기 위해 효모 가수분해물을 농도별(0.05 ~ 3 % (w/v))로 첨가하여 세포의 저온보존 능력을 평가하였다. 세포의 배양, 회수 및 보존방법은 앞선 실시예와 동일하게 적용하였다.

저온보존 기간동안 세포의 생존율을 측정한 결과, 가수분해물 농도에 의존적으로 세포 생존율이 상승함을 확인하였다.( 도4 )

이러한 결과는 가수분해물이 세포의 저온보존에서 세포손상을 막는 핵심 유 효성분으로 작용함을 재확인시켜주는 것이다. 가수분해물이 첨가된 저온보존액은 모든 농도에서 기본 저온보존액에 비해 향상된 보존능력을 보여주었으나, 약 0.5% 이상의 가수분해물을 첨가한 저온보존액이 더욱 월등히 우수한 보존능력을 가지는 것을 확인하였다.

< 실시예 4> 첨가물에 의한 저온보존액 세포 보존 개선 효과

앞선 실시예에서 확인한 바와 같이 가수분해물을 포함한 저온보존액은 세포의 저온보존에서 우수한 보존능력을 제공하였다. 따라서 본 발명자들은 가수분해물을 포함한 저온보존액을 바탕으로 더욱 우수한 보존능력을 보이는 추가적인 성분을 조사하였다. 본 실시예에서는 효모가수분해물이 포함된 저온보존액에 항산화 성분과 삼투압 조절 물질로서 알파 토코페롤(비타민E)과 덱스트란(Dextran)을 첨가하였으며, 에너지 공급원으로서 아데노신-5-트리포스페이트(ATP)을 첨가하여 세포를 저온보존하였다. 첨가물의 농도는 알파-토코페롤 10 ~ 100uM, 덱스트란 10 ~ 50 mg/ml, 아데노신-5-트리포스페이트 1 ~ 5mM 로 실시하였으며, 앞서 기술한 방법과 동일하게 저온보존을 실시하였다.

상기 첨가물이 포함된 저온보존액을 사용하여 세포를 저온보존한 결과, 유효성분으로 효모가수분해물만을 포함한 저온보존액에 비해 상기 성분을 추가로 첨가한 저온보존액에서 좀 더 우수한 세포 생존율을 나타냈으며, 상기 성분 모두 농도에 의존적으로 세포 생존율이 향상되었다.( 도면5 )

앞선 실시예와 같이 기본 저온보존액인 DMEM/F12(1:1(v/v)) 배지를 사용한 저온보존에 비해 가수분해물만을 첨가한 저온보존액에서도 월등히 우수한 보존능력이 나타나지만, 상기 성분을 첨가하면 그 이상의 더욱 우수한 보존 효과를 나타낸다.

또한, 세포는 환경의 변화에 대해 민감하게 반응하는데 세포의 보존과정에서 발생하는 저온 스트레스는 세포내 산화체계를 파괴하고 이에 따라 활성산소가 생성되게 된다. 본 실험에서는 저온보존에 의한 세포내 활성산소 증가를 확인하고, 세포의 저온보존에서 우수한 보존효과를 보인 yeastolate와 ATP를 대상으로 이들의 첨가가 세포 내 활성산소 농도에 미치는 영향을 알아보았다. DCFH-DA법을 이용해 저온보존 24시간 후의 세포내 활성산소를 측정한 결과, 저온보존 전과 비교하여 세포내 활성산소의 증가를 확인할 수 있었다. Yeastolate(BD, 255771)와 ATP를 기본 저온보존액에 첨가한 실험군에서는 무첨가군에 비해 낮은 활성산소 수준을 나타내었는데, 그 중 yeastolate 첨가군에서 가장 우수한 활성산소 억제능력이 관찰되었다. ATP만을 1~10mM 농도범위로 첨가한 경우에는 활성산소의 농도 의존적인 감소가 관찰된 반면 그 효과는 yeastolate 1% 첨가군의 감소효과에 비해 낮은 수준이었다 (도면 6).

따라서 본 발명은 가수분해물을 포함한 저온보존액과 더불어 항산화물질, 삼투압 조절물질, 에너지 공급원을 첨가한 개선된 저온보존액을 제공한다.

< 실시예 5> 기존 저온보존액과의 비교 평가

개선된 저온보존 기술을 개발하기 위해 상기 연구에서 확인된 유효성분을 첨 가한 저온보존액과 현재 널리 사용되고 있는 저온보존액을 비교 평가하였다. 미국 위스콘신대학교에서 개발한 UW (University of Wisconsin) 용액은 조직보존 및 장기보존 등에서 현재 가장 널리 사용되고 있는 저온보존액이며, HypoThermosol^R (HTS) 용액은 미국 BioLife Solutions 사가 개발한 세포 및 조직보존을 위한 개선된 저온보존액이다. 본 발명에서 최종적으로 개발한 저온보존액은 KUL261 (Konkuk University Laboratory 261)용액이라 명명하였는데, 성분으로는 DMEM/F12(1:1(v/v)) 배지를 기본성분으로 사용하고 여기에 단백질 가수분해물로서 yeastolate 1%, 항산화제로서 α-tocopherol 100uM, 삼투압 조절물질로서 dextran 2.5%(w/v), 에너지 공급원으로 ATP 2mM 을 첨가한 것이다.

상기의 저온보존액을 이용하여 HDF를 저온보존하고 2일 간격으로 세포 생존율을 측정하여 저온보존액을 비교 평가한 결과, KUL261용액에서 가장 오랜 기간 높은 세포 생존율을 유지하는 것을 확인하였다 (도면 7). 기존의 저온보존액인 UW 및 HTS 용액은 DMEM/F12 배지를 이용한 저온보존에 비해서는 비교적 높은 세포 생존율을 유지하였으나, DMEM/F12 배지에 yeastolate 1%를 첨가한 저온보존에 비해서는 낮은 세포 생존율을 나타내었다.

또한 저온보존 후 세포의 회복율을 평가하기 위해 HDF를 사용하여 보존기간에 따른 세포 성장률을 조사하였다. DMEM/F12배지를 사용하여 HDF를 보존한 경우에는 보존 후 정상적인 세포 성장이 이루어지지 않은 반면, KUL261 용액을 사용한 경우는 6일 동안 저온보존한 후에도 정상적인 세포 성장이 이루어짐을 확인하였다 (도면 8).

이상의 결과를 종합해 보면, 본 발명에서 개발한 KUL261 용액은 기존의 저온보존액보다 우수한 세포 보존 능력을 가지며, 세포를 이용하는 다양한 분야에서 효율적이고 안정적인 세포 보존기술을 제공할 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 세포의 저온보존에서 보존용기를 회전하거나 반전시키기 위한 장치 예를 나타낸다.

도 2a는 저온보존 방식을 달리한 HDF세포의 저온보존에서 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 2b는 저온보존 방식을 달리한 CHO세포의 저온보존에서 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 2c는 저온보존 방식을 달리한 HaCaT세포의 저온보존에서 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 3a은 미생물 내지 동물 유래 가수분해물이 포함된 저온보존액을 사용하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 3b는 식물 유래 가수분해물이 포함된 저온보존액을 사용하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 3c는 가수분해물 함유 저온보존액을 사용한 HDF세포의 저온보존에서 보존 24시간 후의 생세포 내 ATP 함량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 효모 가수분해물이 농도별로 포함된 저온보존액을 사용하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 5a는 효모 가수분해물 함유 저온보존액에 알파-토코페롤, 아데노신-5-트리포스페이트(ATP)을 농도 별로 첨가하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 보존기간 동안의 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 5b는 효모가수분해물과 덱스트란(Dextran)이 함유된 저온보존액을 사용한 HDF세포의 저온보존에서 보존기간에 따른 세포의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 6은 효모가수분해물 함유 저온보존액에 아데노신-5-트리포스페이트를 농도 별로 첨가하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 세포 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 효모가수분해물 함유 저온보존액에 알파-토코페롤, 덱스트란, 아데노신-5-트리포스페이트를 첨가한 KUL261과 현재 시판되고 있는 HTS, UW용액을 이용하여 HDF세포를 저온보존하였을 때 보존기간 동안의 세포 생존율을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도8 은 효모가수분해물 함유 저온보존액에 알파 토코페롤, 덱스트란, 아데노신-5-트리포스페이트를 첨가한 KUL261과 현재 시판되고 있는 HTS, UW용액을 이용하여 HDF세포를 저온보존한 후 다시 세포 배양을 실시하여 구한 세포 배양곡선을 비교하여 나타낸 그래프이다.

Claims

(1) 세포; 및 단백질 성분을 함유하는 가수분해물을 함유한 배지로 구성된 보존액을 용기에 넣는 단계; 및 (2) 상기 용기를 저온에서, 회전 또는 반전하는 단계를 포함하는, 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 세포는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 세포는 동물의 장기나 조직에서 유래하는 1차 배양 세포 또는 확립된 세포주인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 가수분해물은 미생물, 동물 또는 식물 유래의 단백질 성분을 함유하는 가수분해물인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 가수분해물은 효모, 젤라틴, 카제인, 알부민, 락트알부민, 콜라겐, 목화, 완두콩, 벼, 대두, 밀 및 옥수수의 가수분해물 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 가수분해물의 농도는 0.01 내지 30%(w/v)인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지 (minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지 (α-MEM), 맥코이스 (McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL (Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스 (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 및 이들의 혼합 배지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것 을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항 또는 제 7항에 있어서,

상기 배지는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)과 F-12(nutrient mixture)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 보존액은 항산화제, 삼투 조절제 및 에너지 공급원 중에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 첨가한 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항에 있어서,

상기 항산화제는 알파 토코페롤(비타민 E), 알파 토코페롤 아세테이트, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니돌, 부틸화 하이드록시퀴논, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이드록시시쿠마린, 에틸 갈레이트, 프로필 갈레이트, 옥틸 갈레이트, 라우릴 갈레이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 트리하이드록시부틸로페논, 디메틸페놀, 레시틴, 조효소 Q10, 에탄올아민 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,

상기 항산화제의 농도는 1 내지 1000 uM 인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항에 있어서,

상기 삼투 조절제는 덱스트란, 염화 나트륨, 포도당, 소르비톨, 자일리톨, 만니톨, 덱스트로스, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산나트륨 및 글라이세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항 또는 제 12항에 있어서,

상기 삼투 조절제의 농도는 1 내지 500 mg/ml 인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항에 있어서,

상기 에너지 공급원은 아데노신-5-트리포스페이트(ATP), 글루코스, 말토스, 만노스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 9항 또는 제 14항에 있어서,

상기 에너지 공급원의 농도는 1 내지 100 mM 인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 보존액은, 0.01내지 30%(w/v)의 효모 가수분해물을 포함한 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)과 F-12(nutrient mixture)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지에 1 내지 1000 uM의 알파토코페롤, 1 내지 500 mg/ml의 덱스트란 및 1 내지 100 mM의 아데노신-5-트리포스페이트(ATP)를 첨가한 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 저온은 0 내지 25℃ 인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
제 1항에 있어서,

상기 회전 또는 반전은 1 내지 30 rpm 의 속도인 것을 특징으로 하는 세포의 보존 방법.
미생물, 동물 또는 식물 유래의 단백질 성분을 함유하는 가수분해물을 함유한 배지에 항산화제, 삼투 조절제 및 에너지 공급원 중에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 첨가한 세포 보존 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 가수분해물은 효모, 젤라틴, 카제인, 알부민, 락트알부민, 콜라겐, 목화, 완두콩, 벼, 대두, 밀 및 옥수수의 가수분해물 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지 (minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지 (α-MEM), 맥코이스 (McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL (Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스 (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 및 이들의 혼합 배지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 항산화제는 알파 토코페롤(비타민 E), 알파 토코페롤 아세테이트, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니돌, 부틸화 하이드록시퀴논, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이드록시시쿠마린, 에틸 갈레이트, 프로필 갈레이트, 옥틸 갈레이트, 라우릴 갈레이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 트리하이드록시부틸로페논, 디메틸페놀, 레시틴, 조효소 Q10, 에탄올아민 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 삼투 조절제는 덱스트란, 염화 나트륨, 포도당, 소르비톨, 자일리톨, 만니톨, 덱스트로스, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산나트륨 및 글라이 세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 에너지원은 아데노신-5-트리포스페이트(ATP), 글루코스, 말토스, 만노스, 갈락토스 및 프럭토스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.
제 19항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포 보존 조성물은, 0.01 내지 30%(w/v)의 효모 가수분해물을 포함한 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)과 F-12(nutrient mixture)를 1:1(v/v)로 혼합한 배지에 1 내지 1000uM의 알파토코페롤, 1 내지 500mg/ml의 덱스트란 및 1 내지 100mM의 아데노신-5-트리포스페이트(ATP)를 첨가한 것을 특징으로 하는 세포 보존 조성물.