CN112602703B - 一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗材料的保存领域，尤其涉及一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用。本发明依据发明人前期冬眠模式动物研究发现的冷适应机制及专利WO2019/040359 A1进行延伸，通过药物调控FOXO1的入核来提高供体细胞、组织或器官体外冷保存效果。以角膜冷保存为例，在本发明的新型角膜保存液加用C6 ceramide、Apigenin和Pi的冷保存策略下，角膜内皮细胞存活更佳，死亡率仅为2.5％，且角膜通透性增加。保障了角膜离体冷保存的质量，为成功开展移植手术提供更多可选角膜供体。而冬眠冷适应基于在不同组织和不同物种中均有效，这提示我们可以依据此对不同种属、不同器官进行保存液的改良开发。
Description
技术领域
本发明涉及医疗材料的保存领域，尤其涉及一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用。
背景技术
器官移植技术自19世纪50年代发明以来，经过不断的创新发展，器官移植的术式不断丰富，器官移植的供体范围不断扩大，器官移植受者的生存率不断提高。但现有器官捐献远不能满足巨大的移植供体需求，如何利用好有限的器官资源尤为重要。器官保护液的器官静态冷保存(static cold storage，SCS)技术的迅速发展，使器官保存进一步摆脱了时间和地域的限制，从此器官保护的发展进入了崭新的纪元，极大推动了器官移植事业的进展。
一个常见的临床应用例子是为有效保存新鲜角膜开发出的角膜保存液。1947年McCarey发现将角膜置于M-K液中4℃保存4天仍完好如新鲜角膜。之后有学者在M-K液中加入硫酸软骨素等化学物质发展出K-Sol、CSM和Dexsol等保存液。1990年，在将K-液与Dexsol组合并加入链霉素形成现在最广泛使用的中期角膜保存液Optisol GS。根据实验数据显示其可保持角膜活性达12天。之后也有其他改良的保存液诸如陈氏保存液的出现，但保存效果都不能和Optisol相比较。
以Optisol GS为代表的现有的器官保存液只能起到中期保存角膜的效果，在12天后角膜大体水肿模糊，内皮细胞出现大面积死亡脱落。这样冷保存后的角膜常常导致角膜移植手术失败。12天的保存期不能满足更大的眼库保存需求，亟需更优的角膜保存策略来满足。
目前的器官保存液缺少明确的保护机制指导，这样不利于保存液的改进，也局限了器官保存策略的使用范围。国内外尚未形成系统的冷保存理论体系，亟需探索出更好的冷保存机制来提高目前的冷保存策略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用，利用冬眠模式动物冷适应机制对现有器官保存液进行改良。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种药物在减少细胞、组织或器官在体外冷藏过程中的损伤中的应用，所述药物为可激活FOXO1蛋白进入细胞核的药物。
发明人发现非冬眠模式动物细胞受冷刺激则会产生线粒体的膜电位超极化应激反应，导致大量的活性氧自由基(reactive oxygen species；ROS)生成，并引起溶酶体的膜通透性增加，令蛋白酶泄漏及细胞内环境酸化，从而破坏细胞的骨架结构及正常功能，造成蛋白变性聚集或降解；这些亚细胞冷应激反应可以用药物调控，减少非冬眠物种的细胞、组织和器官在体外冷藏过程中的损伤。此项发现已申请专利WO 2019/040359 A1，科研论文发表于Cell(DOI：10.1016/j.cell.2018.03.010)。
在本发明中，发明人从冬眠模式动物细胞实验上发现了FOXO1转录通路是细胞自发冷适应的一个重要通路。在非冬眠动物模型中此通路仅在年轻的个体中保留，在成年个体中则被天然抑制。我们发现通过药物激活FOXO1蛋白进入细胞核，即能使培养细胞、离体小鼠胰岛细胞团和离体大鼠角膜得到更好的冷保存效果。
上述发现针对的是FOXO1转录通路在离体细胞、组织甚至复杂器官的冷保存技术中的潜在应用潜力。其它潜在应用领域包括损伤保护、再生和抗衰老等。此项发现与专利WO2019/040359 A1相比，针对的是不同的细胞机制，二者没有显而易见的转化联系。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物包括但不限于C6 ceramide或Apigenin。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述组织包括但不限于角膜。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用为将所述药物加入到角膜保存液中用于角膜的保存。
本发明同时提供一种角膜保存液，所述角膜保存液以1L计算，包括以下组分：
氨基酸
维他命
无机盐
其他组分
所述角膜保存液的pH＝7.3±2，渗透压＝300±50mOsm。
进一步地，以角膜保存为例，发明人对现有主流角膜冷保存液Optisol GS的配方进行优化，得到新型角膜保存液，能让大鼠角膜内皮细胞从12天的保存期限延长到28天。冷保存28天后的角膜仍能成功移植到受体大鼠中。
作为本发明所述角膜保存液的优选实施方式，所述角膜保存液中还包括C6ceramide、Apigenin或蛋白酶抑制剂混合物Pi。
所述蛋白酶抑制剂混合物Pi中的组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：
胃酶抑素(或天冬氨酸蛋白酶抑制剂，Pepstatin A)：1-20μM；
亮抑酶肽(或丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂，Leupeptin)：2-40μM。
更优选的，所述蛋白酶抑制剂混合物Pi还含有以下组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：
苯丁抑制素(或贝他定，Bestatin)：5-50μM；
E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)：1.5-30μM；
抑肽酶(或抑蛋白酶肽，Aprotinin)：0.08-2μM；
AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐)：10-100μM。
具体的，所述蛋白酶抑制剂混合物Pi中含有以下组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：
胃酶抑素1μM；
亮抑酶肽2μM；
苯丁抑制素5μM；
E-64 1.5μM；
抑肽酶0.08μM；
AEBSF 100μM。
本发明还提供一种离体角膜冷藏保存方法，包括以下步骤：
(1)取角膜前通过角膜缘造口向前房注射C6 ceramide或Apigenin溶液；
(2)取角膜保存于角膜保存液中，所述角膜保存液预先添加C6 ceramide、Apigenin或Pi。
进一步的，发明人应用冬眠模式动物冷适应原理在不同组织、不同种属细胞进行探索，得到能应用于不同组织、不同器官的通用冷保存策略。
作为本发明所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述角膜保存液为权利要求5中所述角膜保存液。
作为本发明所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述Ceramide或Apigenin溶液的溶剂为山羊血清。在临床应用的场景中，溶剂应改用灭菌灭毒的人血清或血清替代品。
作为本发明所述离体角膜冷藏保存方法的优选实施方式，所述Ceramide溶液中Ceramide的浓度为1-50μM/μL，所述Apigenin溶液中Apigenin的浓度为0.1-10μM/μL。
本发明的有益效果：
本发明依据发明人前期冬眠模式动物研究发现的冷适应机制及专利WO2019/040359A1进行延伸，通过药物调控FOXO1的入核来提高供体细胞、组织或器官体外冷保存效果。在本发明的新型角膜保存液加用C6 ceramide(以下简称为C6)、Apigenin和Pi的冷保存策略下，角膜内皮细胞存活更佳，死亡率仅为2.5％，且角膜通透性增加。保障了角膜离体冷保存的质量，为成功开展移植手术提供更多可选角膜供体。而冬眠冷适应基于在不同组织和不同物种中均有效，这提示我们可以依据此对不同种属、不同器官进行保存液的改良开发。
附图说明
图1：4周龄大鼠角膜与6月龄大鼠角膜的PI染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)。
图2：4周龄大鼠角膜与6月龄大鼠角膜的FOXO1染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图3：6月龄大鼠角膜前房注射C6前后的FOXO1染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图4：6月龄大鼠角膜前房注射Apigenin前后及复温后的FOXO1染色结果图；其中DAPI：细胞核(蓝色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图5：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optisol、Optiosl加用C6、Optiosl加用C6及Pi保存液、新型角膜保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存3周后FOXO1染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图6：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optisol、Optiosl加用C6、Optiosl加用C6及Pi保存液、新型角膜保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存3周后的角膜内皮细胞死亡率。
图7：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optisol、Optiosl加用C6、Optiosl加用C6及Pi保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存3周的角膜通透性结果。
图8：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optiosl加用C6及Pi保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存4周后FOXO1染色结果图，其中，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图9：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optiosl加用C6及Pi保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存4周的角膜通透性结果。
图10：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在Optiosl加用C6、新型角膜保存液、新型角膜保存液加用C6、新型角膜保存液加用C6及Pi冷保存4周后的角膜内皮细胞死亡率。
图11：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在新型角膜保存液加用Apigenin、新型角膜保存液加用Apigenin及Pi冷保存3周的FOXO1染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图12：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在新型角膜保存液加用Apigenin、新型角膜保存液加用Apigenin及Pi冷保存3周的FOXO1染色结果图；其中，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)，Phalloidin：F-actin(粉色)，FOXO1蛋白(绿色)。
图13：6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在新型角膜保存液、新型角膜保存液加用Apigenin、新型角膜保存液加用Apigenin及Pi冷保存3、4周后的角膜内皮细胞死亡率。
图14：新鲜角膜、6月龄大鼠角膜前房注射C6和山羊血清后在新型角膜保存液、新型角膜保存液加用Apigenin、新型角膜保存液加用Apigenin及Pi冷保存4周后角膜作为供体移植后观察3周大体图。
图15：2月龄小鼠胰岛细胞在1640、调整保存液、调整保存液加用Apigenin和调整保存液加用C6中冷保存5天后染色结果，DAPI：细胞核(蓝色)，PI：死亡细胞(红色)。
图16：人胰腺蛋白提取液胰岛素测量值。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1激活FOXO1使年轻的角膜具有更好的冷适应能力
取4周龄大鼠角膜与6月龄大鼠角膜于商品化Optisol GS保存液中4℃保存3周。结果如图1所示，发现相较于6月龄大鼠角膜4周龄大鼠角膜内皮细胞死亡更少，说明年轻的个体角膜组织具有更好的冷适应能力。
发明人前期研究结果显示FOXO1蛋白进入细胞核是冬眠模式动物冷适应的重要机制(具体参见专利WO 2019/040359A1，及Jingxing Ou等人的文献《iPSCs from aHibernator Provide a Platform for Studying Cold Adaptation and Its PotentialMedical Applications》，公开日：2018.05.03，DOI：10.1016/j.cell.2018.03.010)。通过免疫荧光染色我们发现(图2)，在4周龄的新鲜角膜中FOXO1处于入核状态，而6月龄的角膜中FOXO1主要存在于胞质中。这表明FOXO1可能与年轻的大鼠角膜具有更好的冷适应能力相关。
实施例2C6 Ceramide和Apigenin可激活成年大鼠角膜FOXO1入核
角膜移植的供体来源主要为成年人和老年人，是否能通过激活FOXO1，让成年角膜获得年轻个体角膜的冷适应能力。对此，发明人成功筛选C6 ceramide(简称C6)和Apigenin两种药物。
发明人向6月龄大鼠的眼球前房注射C6 ceramide(C6，浓度20μM/μL，溶剂山羊血清)和Apigenin(浓度4μM/μL，溶剂山羊血清)两种药物，发现在注射C6后，大鼠角膜内皮细胞能激活FOXO1入核并在冷刺激后入核信号得到加强(图3)。而注射Apigenin后并不会导致FOXO1入核，在冷刺激后入核信号激活FOXO1入核，复温后仍保持微弱入核效应(如图4)。
因此，发明人设计使用C6 ceramide和Apigenin两种药物激活FOXO1入核，增强成年大鼠角膜的冷适应能力。
实施例3新型角膜保存液配方
发明者根据冬眠期间代谢特点，以极性中性氨基酸、碱性氨基酸、水溶性维生素为主，对现有保存液组分进行调整，以满足冷保存期间细胞正常生理需求。改进新型角膜保存液组成如表1。
表1新型角膜保存液(MCM)配方
实施例4新型角膜保存液配方
本实施例的新型角膜保存液组成如表2。
表2新型角膜保存液(MCM)配方
实施例5新型角膜保存液配方
本实施例的新型角膜保存液组成如表3。
表3新型角膜保存液(MCM)配方
实施例6新角膜冷保存策略
依据新型角膜保存液配方我们配制新鲜新型角膜保存液，并结合冷适应激活剂Apigenin和C6调试最佳的保存策略。具体过程如下：
(1)激活剂C6的保存策略
通过角膜缘造口经前房注射0.5μL C6溶液(浓度10μM/μL，溶剂山羊血清)，90分钟后取角膜保存于冷保存液中。冷保存3周、4周后，通过免疫荧光染色评价冷保存结果。
本实施例的冷保存液为在实施例3中制备得到的新型保存液的基础上，添加20μMC6，及发明人前期发明专利WO2019/040359A1中使用的蛋白酶抑制剂混合物Pi，蛋白酶抑制剂混合物Pi中各组分在冷保存液中的最终浓度分别为：胃酶抑素1μM；亮抑酶肽2μM；苯丁抑制素5μM；E-64 1.5μM；抑肽酶0.08μM；AEBSF 100μM。
结果如图5所示，使用新型角膜保存液及新型角膜保存液加药组别的角膜内皮细胞死亡率低于Optisol及Optisol加药组。与不使用C6药物组别对比，在使用了C6药物后死亡角膜内皮细胞减少。而C6联合Pi组别对比C6组别角膜内皮细胞保留较好的六边形结构，特别是Optisol加用C6组中F-actin出现降解。
通过计数PI阳性细胞数占视野内总细胞数的方法统计各组死亡率，结果如图6所示，发现Optisol保存3周死亡率近乎100％，使用C6和Pi药物后，挽救了许多内皮细胞，死亡率分别为18.9％和8.5％。而使用新型角膜保存液死亡率较使用Optisol组低，其中新型角膜保存液加用C6和Pi组死亡率为0.18％。
为对比角膜通透性，我们记录经角膜观察“A”字符图片。结果如图7所示，使用新型器官保存液加C6和Pi组的角膜在冷保存3周后仍能保持一定的通透性，新型器官保存液加C6次之，而Optisol的各组别角膜水肿模糊，不可见清晰字母“A”。这预示了其应用前景。
为更进一步检测其效果，挑选3周冷保存效果较好的组别，延长其冷保存的时间。如图8所示，使用Optisol组角膜内皮细胞基本死亡，而新型角膜保存液组在使用了C6药物后，死亡细胞减少，联合Pi使角膜内皮细胞保留较好的六边形结构。而新型角膜液加用C6组F-actin呈团块状。
通透性对比可见使用新型角膜保存液的角膜在4周后仍能保持一定的通透性，而Optisol加用C6及Pi组和新型角膜保存液加用C6组角膜下观察字母“A”则边缘模糊难辨(图9)。
我们统计了死亡内皮细胞的比例，结果如图10所示，发现新型角膜保存液加用C6及Pi组冷保存4周后效果最佳，其角膜内皮细胞死亡率约为14.3％。
(2)激活剂Apigenin的保存策略
通过角膜缘造口向前房注射0.5μL Apigenin溶液(浓度4μM/μL，溶剂山羊血清)，20分钟后取角膜保存于实施例3中制备得到的新型保存液中(预先添加4μM Apigenin及Pi)。冷保存3周、4周后，通过免疫荧光染色评价冷保存结果。
在C6结果的基础上，我们设置新型角膜保存液加用Apigenin、新型角膜保存液加用Apigenin及Pi进行对比。结果如图11所示，在使用了Apigenin药物后，角膜内皮死亡细胞减少。联合Pi组具有更好的角膜内皮六边形结构。而新型角膜保存液加用Apigenin角膜内皮出现部分破损。
进一步我们延长冷保存时间至4周。结果如图12所示，在使用了Apigenin药物后，细胞核呈饱满形态，PI阳性细胞明显减少，联合Pi更使角膜内皮细胞保留较好的六边形结构。而新型角膜保存液加用Apigenin组细胞核呈轻微固缩形态。
通过统计(图13)，新型角膜保存液加用Apigenin和新型角膜保存液加用Apigenin和Pi在3周均有较好的保存效果。而到4周时，新型角膜保存液加用Apigenin和Pi死亡率仅为2.5％。
我们使用C6或者Apigenin再联合Pi的保存策略保存6月龄大鼠角膜4周后进行角膜移植手术。术后观察结果发现(图14)，在移植后1周内，移植角膜片慢慢愈合，至第三周时，新鲜的角膜片完全愈合并透亮；使用Optisol冷保存4周的角膜片萎缩，发白，瘢痕愈合；使用C6联合Pi的保存策略4周的角膜轻度混浊，但大体良好；使用Apigenin联合Pi的保存策略4周的角膜轻度混浊，但仍有较好的透亮度。
综上，发明者利用冬眠模式动物冷适应原理开发出新型角膜冷保存策略。新型角膜保存液加用C6或者Apigenin再联合Pi均具有较好的冷保存效果，其中新型角膜保存液加用Apigenin和Pi组4周保存效果最佳，角膜内皮细胞死亡率仅为2.5％，且能进行移植手术，术后有较好的透亮度。
实施例7基于冬眠冷适应机制保存液在不同组织、不同种属均有效
发明人初步探索发现此冷保存策略在不同组织、不同种属细胞的保存效果，结果发现C6和Apigenin在不同组织、不同种属均可达到提高冷保存效果。
提取小鼠胰岛，将其置于4℃冷保存。以现有较常用的1640培养液作为对照组。结果如图15所示，在1640中胰岛细胞大量死亡，而基于冬眠机制调整保存液(MM)中胰岛细胞死亡更少。而加用C6和Apigenin的胰岛，死亡细胞进一步减少。
发明人通过对人胰腺进行冷保存。在24小时和48小时两个时间点取50mg胰腺组织提取蛋白，通过化学发光法检测胰岛素含量。结果如图16所示，与临床上经典的UW保存液相比，在24小时和48小时两个时间点经本发明MM保存液冷保存的胰腺胰岛素含量更高，MM保存液的保存效果更好。
这说明我们的冬眠机制在不同组织、不同种属均有应用前景。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种药物在减少细胞、组织或器官在体外冷藏过程中的损伤中的应用，其特征在于，所述药物为含有保存液且可激活FOXO1蛋白进入细胞核的药物，其中，所述保存液以1L计算，包括以下组分：
氨基酸
维他命
无机盐
其他组分
所述保存液的pH＝7.3±2，渗透压＝300±50mOsm。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物包括C6 ceramide或Apigenin。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述组织包括角膜。
4.一种角膜保存液，其特征在于，所述角膜保存液以1L计算，包括以下组分：氨基酸
维他命
无机盐
其他组分
所述角膜保存液的pH＝7.3±2，渗透压＝300±50mOsm。
5.根据权利要求4所述的角膜保存液，其特征在于，所述角膜保存液中还包括C6ceramide、Apigenin或蛋白酶抑制剂混合物(Pi)，所述C6ceramide的添加量为20μM，所述Apigenin的添加量为4μM；所述蛋白酶抑制剂混合物(Pi)中的组分及各组分在最终角膜保存液中的浓度分别为：胃酶抑素1-20μM；亮抑酶肽2-40μM。
6.一种离体角膜冷藏保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取角膜前通过角膜缘造口向前房注射C6 ceramide或Apigenin溶液；
(2)取角膜保存于角膜保存液中，所述角膜保存液预先添加C6 ceramide或Apigenin，所述角膜保存液为权利要求4中所述角膜保存液。
7.根据权利要求6所述的离体角膜冷藏保存方法，其特征在于，所述角膜保存液中还预先添加有Pi。
8.根据权利要求6所述的离体角膜冷藏保存方法，所述C6 ceramide或Apigenin溶液的溶剂为山羊血清。
9.根据权利要求6所述的离体角膜冷藏保存方法，所述C6 ceramide溶液中Ceramide的浓度为1-50μM/μL，所述Apigenin溶液中Apigenin的浓度为0.1-10μM/μL。
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