CN110973121B

CN110973121B - 一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法

Info

Publication number: CN110973121B
Application number: CN201911422036.8A
Authority: CN
Inventors: 王键
Original assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Baiwosi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN110973121A

Abstract

本发明公开了一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：5~15份二甲基亚砜、5~20份海藻糖、2~8份雌二醇、65~80份DMEM高糖培养基。本发明所述的组织冻存液最大程度地降低了单纯使用DMSO和基础培养基所引起的毒性，并保证了良好的冻存效果，雌二醇能够减少脂肪组织冻存中的冻存损伤，提升细胞活性，提高冻存效果，雌二醇对于脂肪组织活率具有很大的提升作用，在测试中分别测定原组织、冻存一个月、三个月、六个月以及一年后的平均细胞活率分别为99.57%、96.24%、95.78%、92.33%、90.15%，复苏后的组织在清除冻存液后可以直接应用于临床移植，在美容外科方面具有重要价值。

Description

一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法。

背景技术

自体脂肪美容已越来越成为美容外科的一种美容方式，自体脂肪美容指的是通过负压吸引的方法把身体某一部位多余的脂肪给吸出来，然后将其填充至身体的其他部位，以达到特定效果。自体脂肪来源广泛，可以一次抽脂、多次使用，而且能减轻客户再次抽脂带来的痛苦和经济负担，抽取出来的多余脂肪可以利用低温冷冻技术将其放置于超低温冰箱中保存，需要的时候再进行复苏用于美容外科手术，所以体外进行组织的冻存就变得极其重要。

但是当前该冻存技术的配方主要为二甲基亚砜（DMSO）和基础培养液，DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，DMSO也是一种毒性物质，它作为抗冻剂的同时也会对脂肪组织产生毒性作用，致使移植脂肪组织时出现细胞成活率低、坏死与吸收率低、感染等问题。海藻糖是一种非还原性糖，自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有很好地保护作用，其中也包括脂肪等新鲜组织，海藻糖可以很好地缓和DMSO带来的毒理性影响。本发明可通过检测组织形态及组织中干细胞活率来确定冻存效果，冻存效果好细胞活率高，反之。为了获得最佳的冻存效果，开展有效的冻存方法和探求最优冻存液配方是本领域的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种女性脂肪组织用的冻存液及其制备方法和冻存方法，本发明所述的冻存液具有良好的冻存效果，冻存后细胞活率高。

本发明解决其技术问题采用以下技术方案：

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：5~15份二甲基亚砜、5~20份海藻糖、2~8份雌二醇、65~80份DMEM高糖培养基。

作为一种优选方案，所述的女性脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：8~12份二甲基亚砜、10~15份海藻糖、3~7份雌二醇、70~75份DMEM高糖培养基

作为一种优选方案，所述的女性脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：10份二甲基亚砜、12.5份海藻糖、5份雌二醇、72.5份DMEM高糖培养基。

作为一种优选方案，所述的女性脂肪组织冻存液由以下重量份物质组成：5份二甲基亚砜、10份海藻糖、5份雌二醇、80份DMEM培养基。

本发明还提供了一种女性脂肪组织冻存液的制备方法，包含以下步骤：

（1）将海藻糖溶解于DMEM培养基，过滤；

（2）加入雌二醇溶解完全加入到无菌容器中；

（3）用移液管加入二甲基亚砜摇匀即可，将冻存液置于0~6℃冰箱保存。

作为一种优选方案，所述过滤用细菌过滤器过滤。

本发明还提供了一种女性脂肪组织冻存方法，包括以下步骤：

（1）将脂肪组织样本无菌处理后置于40~60ml离心管中；

（2）用生理盐水对脂肪组织进行清洗后离心，使用20~30ml移液管将离心管下层生理盐水清洗液吸弃2~4次；

（3）将冻存液与脂肪组织混匀，后将其先置于-25~-15°C冰箱20~40min再转移至-90~-70°C超低温冰箱中。

作为一种优选方案，所述生理盐水与脂肪组织的体积比为0.8~1.2：1。

作为一种优选方案，所述离心条件为：1200~1800r/min离心2~5min。

作为一种优选方案，所述冻存液与脂肪组织的体积比为0.8~1.2：1。

本发明的有益效果：（1）本发明所述的女性脂肪组织的冻存液由二甲基亚砜、海藻糖、雌二醇、DMEM高糖培养基组成，二甲基亚砜是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，二甲基亚砜也是一种毒性物质，它作为抗冻剂的同时也会对脂肪组织产生毒性作用，致使移植脂肪组织时出现细胞成活率低、坏死与吸收率低、感染等问题，海藻糖是一种非还原性糖，自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有很好地保护作用，其中也包括脂肪等新鲜组织，海藻糖可以很好地缓和DMSO带来的毒理性影响，雌二醇可以促进脂肪干细胞的增殖，而脂肪组织中含有大量的脂肪干细胞，雌二醇能够减少脂肪组织冻存中的冻存损伤，提升细胞活性，提高冻存效果，雌二醇对于脂肪组织活率具有很大的提升作用；（2）本发明所述的组织冻存液最大程度地降低了单纯使用DMSO和基础培养基所引起的毒性，并保证了良好的冻存效果，在测试中分别测定原组织、冻存一个月、三个月、六个月以及一年后的平均细胞活率分别为 99.57%、96.24%、95.78%、92.33%、90.15%，复苏后的组织在清除冻存液后可以直接应用于临床移植，在美容外科方面具有重要价值。

附图说明

图1为脂肪组织切片油红染色结果图，其中A为新鲜组织切片，B为实施例1冻存一个月后切片，C为实施例1冻存三个月后切片，D为实施例1冻存六个月后切片；

图2为冻存一年后脂肪组织离心图，其中A为新鲜组织冻存一年后脂肪组织离心图，B为实施例1冻存一年后脂肪组织离心图，C为对比例3冻存一年后脂肪组织离心图。

图3为冻存一个月脂肪组织复苏后50小时的生长曲线，其中A为实施例1冻存一个月脂肪组织复苏后50小时的生长曲线，B为对比例3冻存一个月脂肪组织复苏后50小时的生长曲线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：10份二甲基亚砜、12.5份海藻糖、5份雌二醇、72.5份DMEM高糖培养基。

所述的女性脂肪组织冻存液的制备方法，包含以下步骤：

（1）将海藻糖溶解于DMEM培养基，细菌过滤器过滤；

（2）加入雌二醇溶解完全加入到无菌容器中；

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：5份二甲基亚砜、20份海藻糖、2份雌二醇、80份DMEM高糖培养基。

实施例3

实施例3与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：15份二甲基亚砜、5份海藻糖、8份雌二醇、65份DMEM高糖培养基。

实施例4

实施例4与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：10份二甲基亚砜、10份海藻糖、4份雌二醇、76份DMEM高糖培养基。

实施例5

实施例5与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比不同，其它都相同。

一种女性脂肪组织冻存液，由以下重量份物质组成：15份二甲基亚砜、10份海藻糖、6份雌二醇、69份DMEM高糖培养基。

对比例1

对比例1与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比中不含有二甲基亚砜，其它都相同。

对比例2

对比例2与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比中不含有海藻糖，其它都相同。

对比例3

对比例3与实施例1不同之处在于，女性脂肪组织冻存液的配比中不含有雌二醇，其它都相同。

为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：

将实施例1~5、对比例1~3所配制的冻存液每组冻存脂肪组织4份，将脂肪组织样本无菌处理后置于50ml离心管中；用生理盐水对脂肪组织按照体积比1:1进行清洗后在1500r/min下离心3min ，使用25ml移液管将离心管下层生理盐水清洗液吸弃3次；将冻存液与脂肪组织按照体积比1:1混匀，后将其先置于-20℃冰箱30min再转移至-80℃超低温冰箱中。

1. 复苏各时段细胞平均活率。

新鲜组织样本处理：将部分新鲜（6小时以内）的脂肪组织清洗后用油红对复苏后的组织切片染色，干细胞制备后使用台盼蓝染色计算细胞活率。

复苏脂肪组织方案1：冻存脂肪组织1个月后对分别对8个样本脂肪进行复苏，然后用油红对复苏后的组织切片染色，干细胞制备后使用台盼蓝染色计算细胞活率。

复苏脂肪组织方案2：冻存脂肪组织3个月后对分别对8个样本脂肪进行复苏，然后用油红对复苏后的组织切片染色，干细胞制备后使用台盼蓝染色计算细胞活率。

复苏脂肪组织方案3：冻存脂肪组织6个月后对分别对8个样本脂肪进行复苏，然后用油红对复苏后的组织切片染色，干细胞制备后使用台盼蓝染色计算细胞活率。

复苏脂肪组织方案4：冻存脂肪组织1年后对分别对8个样本脂肪进行复苏，然后用油红对复苏后的组织切片染色，干细胞制备后使用台盼蓝染色计算细胞活率，见表1；图1为实施例1冻存一个月、三个月、六个月和新鲜组织切片的油红染色图，从图1，可以看出，冻存组与新鲜组无明显差异，证明冻存效果理想。

表1 细胞平均活率/%

通过表1可看出，实施例1为最佳实施方式，具有最高的细胞活率，随着冻存时间的延长，细胞活率也相对下降，其中实施例1~5下降的幅度不大，其中实施例1的细胞活率接近新鲜组织，对比实施例1~5可知，不同的女性脂肪组织冻存液配比复苏后具有不同的细胞活率，其中实施例1为最佳实施方式，具有最佳配比；对比实施例1与对比例1~3可知，雌二醇、二甲基亚砜、海藻糖对于提高复苏后的细胞活率具有显著作用；其中雌二醇的影响最大，其次是二甲基亚砜、海藻糖。

2.将新鲜组织、实施例1、对比例3的脂肪组织样品就行复苏，置于38°C水浴锅摇床中不断摇晃直至溶解完全，然后1500r/min离心3min，离心结束进行拍照，并与新鲜脂肪样本进行比较，见图2；

由图2可以看出，A中刚处理完的新鲜脂肪组织中液态油基本被吸除干净，而B、C中经过冻存后有部分脂肪组织由于冰冻损伤造成脂肪细胞破裂，从而产生了少量液态油；而B与C相比较，虽然冻存时间一样，但B中产生的液态油明显少于C，这表明雌二醇能减少脂肪组织冻存中的冰冻损伤，提升细胞活性，提高冻存效果。

3.将实施例1与对比例3的脂肪组织冻存一个月后进行复苏，并且实时跟踪了50小时干细胞生长情况，得出生长曲线见图3，可以看出，实施例1的生长速度明显优于对比例3，可见，雌二醇对于提升生长速度具有显著作用。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims

1.一种女性脂肪组织冻存液，其特征在于，由以下重量份物质组成：10份二甲基亚砜、12.5份海藻糖、5份雌二醇、72.5份DMEM高糖培养基；

所述的女性脂肪组织冻存方法，包括以下步骤：

（1）将脂肪组织样本无菌处理后置于40~60ml离心管中；

（2）用生理盐水对脂肪组织进行清洗后离心，使用20~30ml移液管将离心管下层生理盐水清洗液吸弃2~4次；所述生理盐水与脂肪组织的体积比为0.8~1.2:1；

（3）将冻存液与脂肪组织混匀，后将其先置于-25~-15°C冰箱20~40min再转移至-90~-70°C超低温冰箱中；所述冻存液与脂肪组织的体积比为0.8~1.2:1。

2.权利要求1所述的女性脂肪组织冻存液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）将海藻糖溶解于DMEM培养基，过滤；

（2）加入雌二醇溶解完全加入到无菌容器中；

3.根据权利要求2所述的女性脂肪组织冻存液的制备方法，其特征在于，所述过滤用细菌过滤器过滤。

4.一种使用权利要求1所述的女性脂肪组织冻存液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将脂肪组织样本无菌处理后置于40~60ml离心管中；

5.根据权利要求4所述的女性脂肪组织冻存液的使用方法，其特征在于，所述生理盐水与脂肪组织的体积比为0.8~1.2:1。

6.根据权利要求4所述的女性脂肪组织冻存液的使用方法，其特征在于，所述离心条件为：1200~1800r/min离心2~5min。

7.根据权利要求4所述的女性脂肪组织冻存液的使用方法，其特征在于，所述冻存液与脂肪组织的体积比为0.8~1.2:1。